Cours Biologie Moléculaire et Génie Génétique (PDF) 2017-2018

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE Département des Sciences Agronomiques et Biotechnologies Biologie Mo...

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE Département des Sciences Agronomiques et Biotechnologies Biologie Moléculaire etGénie Génétique Niveau : Licence 3 en Biotechnologie Microbienne et végétale Dr. Nehal Fatima Année : 2017-2018 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Module : Biologie Moléculaire et Génie génétique - Introduction Partie I : Biologie moléculaire 1. L’ADN, Support de l’information génétique 2. Structure des acides nucléiques 3. Propriétés physicochimiques de l’ADN 3.1 La solubilité 3.2 La densité 3.3 La charge 3.4 Propriétés spectrales 4. La Réplication de L’ADN 5. Expression de l'information génétique 5.1 La transcription 5.1.1 La transcription chez les procaryotes 5.1.2 La transcription chez les eucaryotes 5.1.3 Maturation des ARNm 5.2 La traduction 5.2.1 Le code génétique 5.2.2 Les ribosomes 5.2.3 Rôle des ARNt dans la traduction 5.2.4 La traduction chez les procaryotes 5.2.5 La traduction chez les eucaryotes 5.2.6 Modifications post-traductionnelles 5.3 Régulation de l’expression génétique 5.3.1 Régulation de la transcription a. Contrôle négatif de la transcription (Répression et induction) b. Contrôle positif de la transcription c. Contrôle de l’expression génétique par atténuation 5.3.2 Régulation traductionnelle 6. Techniques de base de biologie moléculaire 6.1 Extraction et purification des acides nucléiques Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 6.2 Dosage des acides nucléiques 6.3 Electrophorèse 6.4 Marquage des acides nucléiques 6.4.1 Marquage des sondes a. La nick translation b. Le multiamorçage au hasard ou multirandom priming c. Marquage d’oligonucleotides de synthèse 6.5 Hybridation des acides nucléiques 6.5.1 Types d’hybridation a. Hybridation d’ADN sur support solide : Southern Blot b. Hybridation in situ c. Hybridation sur chromosome d. Hybridation sur colonies de bactéries, sur plage de lyse e. Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction de l’ADN (RFLP). 6.6 Réaction de polymérisation en chaines (PCR) 6.7 Séquençage 6.7.1 Méthode de Sanger 6.7.2 Technique chimique de Maxam et Gilbert Partie II : Génie génétique 1. Outils enzymatique du génie génétique 1.1 Les nucléases a. Les endonucléases 1.2 Les polymérases a. ADN polymérase I et fragment de klenow b. ADN Taq polymérase et autres ADN polymérases thermostables c. Transcriptase reverse ou inverse ou retrotranscriptase RT d. ARN polymérase 1.3 Ligases 1.4 Phosphatases 1.5 Kinases 2. Vecteurs de clonage et analyse des banques 2.1 Vecteurs de clonage 2.1.1 Propriétés des vecteurs de clonage Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 2.1.2 Différents vecteurs de clonage a. Les plasmides b. Les phages c. Les cosmides d. Les chromosomes artificiels bactériens e. Les chromosomes artificiels de levures f. Vecteurs navettes et d’expression 2.2 Types de banques et source d’ADN 2.2.1 Banques ADN 2.2.2 Banques d’ADNc 3. Criblage des banques génomiques 3.1 Criblage par antibiotique 3.2 La méthode de sélection blanc-bleue 3.3 Criblage par hybridation 3.4 Criblage par complémentarité 3.5 La méthode de coupure avec des enzymes de restriction 4. Production d’insuline par génie génétique. Références bibliographiques Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Introduction La biologie moléculaire parfois abrégé Bio mol ou BM est une discipline scientifique au croisement de la génétique, de la biochimie et de la physique dont l’objet est la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la cellule au niveau moléculaire qui permettent la conservation et la perpétuation de la structure vivante au niveau du génotype. Le terme Bio mol utilisé pour la première fois en 1938 par Warren Weaver, désigne également l’ensemble des techniques de manipulation d’acides nucléiques (ADN, ARN), appelée aussi techniques de génie génétique. Pour cela,les techniques d’étude et de modification des gènes et de leur expression font partie intégrante de la biologie moléculaire. La biologie moléculaire est une discipline scientifique qui décrit la manière dont l’information génétique est conservée, transmise et exprimée. Le génie génétique est un «ensemble de techniques permettant d'identifier et d'isoler, de modifier et de transférer de façon contrôlée du matériel génétique». Il s'agit donc d'un outil aux applications extrêmement variées et qui permet en particulier d'intervenir avec précision sur le patrimoine génétique des êtres vivants. Pratiquement, cette méthodologie permet d'identifier un gène spécifique parmi les nombreux gènes d'un organisme. D'abord amplifié afin qu'il soit plus facile d'accès, le gène peut ensuite être découpé et isolé des autres molécules d'ADN. Il peut enfin être réinséré dans une molécule d'ADN d'origine différente, permettant ainsi de transférer de l'information génétique d'une cellule vers une autre. Le résultat obtenu est un ADN recombiné. Le génie génétique permet également d'apporter des modifications à des gènes (mutagenèse dirigée) qui, par conséquent, produiront des protéines modifiées. Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Partie I : Biologie moléculaire 1. L’ADN, Support de l’information génétique L’information génétique est transmise sous deux formes d’une génération à l’autre: Soit sous la forme d’un œuf fécondé (reproduction sexuée) qui reçoit un exemplaire de chaque gène parental. Soit sous la forme d’une cellule fille (reproduction asexuée) qui reproduit à l’identique la cellule-mère. Le travail pionnier de Fred Griffit, en 1928 sur le transfert de la virulence du pathogène Streptococcus pneumoniae, communément appeler pneumocoque est l’expérience qui prouva que l’ADN était bien le matériel génétique : Griffit découvrit que s’il faisait bouillir des bactéries virulentes et les injectait à des souris, celles-ci n’étaient pas infectées et qu’on ne pouvait retrouver aucun pneumocoques chez les animaux. Quand il injectait un mélange de bactéries virulentes tuées et de bactéries non virulentes tuées et de bactéries non virulentes vivantes, les souris mouraient. De plus, on pouvait isoler des bactéries virulentes de ces souris mortes. Griffit donna à ce changement de bactéries non virulentes en pathogène virulents, le nom de transformation (Figure 1). Ceci suggère donc qu'il existe chez les bactéries Lun "facteur ou principe transformant", Probablement résistant et libéré par la chaleur, Susceptible d'être intégré par d'autres bactéries comme les bactéries R Et qui leur confère de façon héréditaire de nouvelles propriétés génétiques (comme la virulence). Nature de ce matériel? Oswald Avery et ses collègues déterminèrent par la suite quel constituant des pneumocoques tués par la chaleur était responsable de la transformation de Griffit. Ces chercheurs détruisirent sélectivement les constituants d’extraits purifiés de Pneumocoques virulents (cellules s), au moyen d’enzymes hydrolysant l’ADN, l’ARN ou les protéines. Ils exposèrent par la suite des souches non virulentes (Souches R) aux extraits traités. La transformation des bactéries non virulentes n’avait plus lieu que si l’ADN avait était hydrolysé, ce qui suggérait que l’ADN portait l’information requise pour la transformation (Figure 2). 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 1: Expérience de Griffith (1928). Figure 2: Expérience de Avery McLeod et McCarty (1944). 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Les expériences d'Hershey et Chase (1952) réalisées indiquant que l’ADN était le matériel génétique d’un virus bactérien. D’Hershey et Chase marquèrent l’ADN du virus à l’aide du p32 et les protéines de la capside à l’aide de 35S. Ils mélangèrent le bactériophage radioactif avec E.coli et incubèrent le mélange pendant quelques minutes. La suspension fut alors agitée violemment dan un mixeur pour détacher toutes les particules du phage adsorbées. Après centrifugation, la radioactivité dans le surnagent (où se trouvait les virus) et dans le culot fut mesurée.. On retrouva les protéines radioactives en grande partie dans le surnagent, tandis que l’ADN marqué aun32P était resté dans les bactéries. Puisqu’il y avait injection de matériel génétique et production de particules T2, L’ADN était forcément la molécule porteuse de l’information génétique de T2. Figure 3: Expérience d'Hershey et Chase (1952). Les bactéries infectées par des virus aux protéines marquées (32P) ne deviennent pas radioactives mais celles infectées par des virus à l’ADN marqué (35S) le devienne. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 2. Structure des acides nucléiques Les travaux de Kornberg révélèrent que les précurseurs de l'ADN étaient des nucléotides riches en énergie (dNTP, dCTP, dTTP, dGTP). Chaque nucléotide est composé d'acide phosphoriques (3), base azotée (A, T, C, G) et un pentose (2'-désoxy-β- (2' -D-Ribose). La liaison formée entre deux phosphates donne un anhydride avec une liaison très riche en énergie, et la liaison entre le groupement acide du phosphate et l'hydroxyle du sucre donne une li liaison ester. La liaison formée entre le sucre et la base est une liaison osidique de type β-N- glycosidique. Figure 4:: Formes du phosphate et les liaisons formées. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 5 : A- Les pentoses qui rentrent dans la composition des acides nucléiques (ADN, ARN).B-Numérotation d'un sucre, le prime (') est ajouté dans la numérotation pour la distinguer à celle des bases. Figure 6 : Les cinq bases azotées de l'ADN et l'ARN (Purines [A et G], Pyrimidines [C, T et U]. Il existe par ailleurs des bases puriques modifiées : - Dans l’ADN, on trouve par exemple, la N6- méthyladénine - Dans les ARN (en particulier les ARNt), on trouve par exemple, la N7- méthylguanine et l’hypoxanthine. Et des bases pyrimidiques modifiées : - Dans l’ADN, la plus commune est la N5-méthylcétosine. - Dans les ARN, on trouve, entre autre bases peu communes, la pseudouracile et la dihydrouracile. Les acides désoxyribonucléiques sont de très grandes molécules composées de deux chaines polynucléotidiques enroulées l'une autour de l'autre pour former une double hélice régulière (La forme B a un diamètre de 2,47 nm). 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 7:: Structure détaillée de la double hélice de l'ADN (forme B). Un tour d'hélice recouvre environ 10.5 pb (34 Å). Le squelette de chaque brin est formé de sucre et de phosphate. Les bases azotées sont projetées vers l'intérieur de la molécule mais restent accessibles au solvant par les deux sillons (petit et grand sillon). La stabilisation de la double hélice s'effectue par des liaisons liaisons chimiques faible et non covalentes à la fois internes et externes: 1- Liaisons hydrogène entre les bases. 2- Interactions hydrophobes et électroniques entre les bases 3- Interactions des groupements sucre et phosphate avec le milieu aqueux (interactio (interactions hydrophiles). Cette stabilité n'entraîne pas une rigidité de la molécule d'ADN et celle celle-ci peut adopter des conformations différentes selon les régions. Plusieurs conformations correspondant à des sens d'enroulement différents ou des pas différents ont été trouvées, les principales étant : 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 8 : Structure détaillée de la double hélice de l'ADN (forme B). Un tour d'hélice recouvre environ 10.5 pb (34 Å). Le squelette de chaque brin est formé de sucre et de phosphate. Les bases azotées sont projetées vers l'intérieur de la molécule mais restent accessibles au solvant par les deux sillons (petit et grand sillon). 3. Propriétés physico-chimiques physico de l'ADN Les liaisons hydrogène et les interactions hydrophobes qui maintiennent la structure en double hélice sont des forces faibles et des quantités relativement petites d'énergie peuvent séparer les deux brins, un processus appelé dénaturation. 3.1 La Solubilité L’ADN ’ADN est un polyanion dont les sels de sodium sont solubles dans l’eau en formant des solutions à viscosité élevée. Les alcools et en particulier l’éthanol, précipitent les molécules d’ADN sous forme agglomérats en longues fibres. 3.2 La densité La densité des molécules d'ADN est telle qu'on peut les séparer par ultracentrifugation dans des gradients de densité (chlorure de césium). 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 9 : Détermination de la densité de l’ADN par ultracentrifugation dans un gradient de densité. 3.3 La charge La charge de ces molécules à pH physiologique est négative et directement proportionnelle à leur longueur (nb de nucléotides). Charge dont la contribution est uniquement du au groupement phosphates (à ce pH les bases ne portent aucune charge). Cette propriété est utilisée pour les séparer par électrophorèse. 3.4 Propriétés spectrales - Le spectre tre d'absorption de l'ADN natif n'est pas identique à celui du même ADN dénaturé par la chaleur (chauffage à 100°C) ou par l'urée ou encore à pH très alcalin. L'ADN dénaturé a une absorption à 260 nm plus élevée que l'ADN natif, d'un facteur 1,6. Cette pro propriété est appelée l'effet hyperchrome ou hyperchromicité. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima - L'absorption de l'ADN natif, à 260 nm, en fonction de la température (courbe de fusion), présente l'allure d'une sigmoïde : le point d'inflexion de cette courbe, qui correspond à la demi-variation variation d'absorbance, est la température de fusion de la molécule, notée Tm. - Lors d'un refroidissement lent, l'absorption suit la courbe de fusion en sens inverse. Lors d'un refroidissement rapide, l'absorption ne suit pas la courbe de fusion en ssens inverse mais une autre courbe qui n'aboutit à la même valeur originale de l'absorption, mais à une valeur plus élevée : c'est le phénomène d'hystérésis. d' - Il faut noter que la température de fusion Tm est dépendante de la force ionique du milieu et qu'elle elle diminue lorsque cette dernière augmente (dans des milieux où [NaCl] > 1M). - La valeur de la température de fusion Tm est d'autant plus élevée que le pourcentage de bases G + C est grand. Figure 10 : Propriétés spectrales de l’ADN natif et dénaturé. dénaturé 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 4.Réplication de L’ADN La réplication de l’ADN est un mécanisme très important elle permet la duplication du patrimoine génétique pour obtenir 2 exemplaires, chacun transmis à une des deux cellules filles lors de la division cellulaire. La réplication a donc lieu avant la division cellulaire. Ce mécanisme doit être le plus fidèle possible, pour que le patrimoine génétique qui va être transmis aux cellules filles soit le plus parfaitement identique à celui de la cellule mère. En effet, la survie à court terme de la cellule et de l’organisme dépend de la prévention de la modification de son ADN, puisque les modifications peuvent conduire à des évènements extrêmement délétères : mutations, associées à certaines pathologies (cancer). Cependant, à long terme, il peut y avoir des mutations qui entraineront l’évolution de l’espèce. La réplication de l’ADN est un mécanisme cellulaire semi conservatif : sur la double hélice d’ADN de la cellule fille, un des deux bras provient du brin parental et l’autre est synthétisé lors de la réplication par polymérisation (brin fils). Chaque brin parental est lu dans le sens 3’ 5’ et sert de matrice à la synthèse d’un brin complémentaire et anti- parallèle, appelé brin fils ou brin néosynthétisé, synthétisé dans le sens 5’ 3’. Pour cela les deux brins parentaux doivent se séparer, une rupture des liaisons hydrogènes est donc nécessaire. Figure 11 : Schéma récapitulatif de la réplication 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 4.1REPLICATION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI) -L’ADN parental, où chacun des deux bras sert de matrice pour synthétiser le brin anti- parallèle. Séparation des deux brins (dénaturation) : pour passer à un état simple brin et le rendre accessible aux enzymes de la polymérisation. Il est aussi appelé ADN matrice. -Les dNTP (dATP, dCTP, dTTP et dGTP) rentrent dans la réaction sous forme triphosphate, et sont intégrés dans le brin sous forme monophosphate : le relargage du pyrophosphate apporte l’énergie nécessaire à la réplication. -Les ions Mg2+ stabilisent les dNTP en les protégeant d’une hydrolyse enzymatique et sont également importants pour l’ADN polymérase. -Les enzymes suivantes : - Les hélicases, à l’initiation de la réplication - Les topoisomérases - Les ADN polymérase - Les primases Les enzymes utilisées :   Les hélicases Elles permettent aux deux brins de l’ADN parental de se séparer en supprimant les liaisons hydrogène entre les bases qui se font face. Le déplacement le long de l’ADN parental nécessite une énergie (hydrolyse des molécules d’ATP en ADP et Pi).Après elles, des protéines se positionnent : les protéines SSB, qui se lient à des simples brins, pour éviter la renaturation spontanée de l’ADN. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 12:Enzyme intervenant pendant la réplication  Les topoisomérases Les topoisomérases modifient l’état d’enroulement (+ ou -) de la molécule d’ADN. Chez la bactérie, la topoisomérase est la gyrase bactérienne (TOP2). Plusieurs étapes : 1) Coupure transitoire de l’ADN 2) Libre rotation de l’ADN 3) Ressoudure de l’ADN (= ligation), toujours par la topoisomérase Il existe deux types de topoisomérases : - Les topoisomérases I n’agissent que sur un seul brin de l’ADN et ne nécessitent donc pas d’ATP - Les topoisomérases II agissent sur les deux brins de l’ADN, et nécessitent de l’ATP pour maintenir les deux fragments d’ADN. Chez les procaryotes, la gyrase bactérienne est une topoisomérase II. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Les topoisomérases agissent derrière l’action de l’hélicase, qui induit des surenroulements positifs (en avançant) qui vont super vriller la double hélice d’ADN. La gyrase va supprimer ces surenroulements positifs et introduire des surenroulements négatifs. Cette action est simultanée aux hélicases et permet une bonne accessibilité aux enzymes de la réplication à la molécule d’ADN. Figure 13 : Les différents états de l’ADN  Les ADN polymérases Elles permettent la synthèse du brin fils par polymérisation en utilisant un brin de l’ADN parental comme matrice. L’activité ADN-polymérasique est la synthèse de l’ADN dans le sens 5’ 3’ dans la chaine du brin en cours de synthèse. Cette activité nécessite une initiation : démarrage par une amorce de nucléotides. Pour la réplication, l’amorce est un ARN synthétisée par polymérisation par une primase (ARN polymérase). L’ADN-polymérase se positionne sur l’extrémité 3’OH pour polymériser de l’ADN dans le sens 5’ 3’ après incorporation successive de nucléotides. La synthèse se fait de manière complémentaire et anti parallèle à l’ADN parental. Lors de la formation de la liaison phosphodiester, il y a libération de deux pyrophosphates qui s’hydrolysent en deux phosphates inorganiques. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima La survie de la cellule à court terme dépend de la fidélité de la réplication. Cette haute-fidélité nécessite plusieurs mécanismes de vérification des nucléotides : - Avant addition covalente du nucléptide : Le dNTP entrant est celui qui possède la meilleure affinité et un état énergétique optimal. A ce moment il y a une transconformation de la polymerase : elle change de conformation pour vérifier la bonne géométrie de la paire de base. Après addition covalente du nucléotide : activité exonucléasique (= fonction d’édition) de la polymérase : correction des erreurs d’appariement en 3’ 5’ par clivage entre deux nucléotides adjacents en bout de chaine. L’ADN polymérase a une activité exonucléasique dans le sens 3’ 5’. C’est une fonction primordiale dans la réplication, qui est possédée par toutes les ADN polymérases dans le sens 3’- 5’. C’est un mécanisme qui concourt à l’augmentation de la fidélité de la réplication. L’enzyme se modifie pour retirer la mauvaise liaison, l’emmène au niveau de son site catalytique P (site de polymérisation), et la détruit. Chez E. Coli, on retrouve trois ADN polymérases : les ADN polymérases I II, III. L’ADN polymérase III ne fonctionne pas seule mais est associée à un complexe multimérique appelé holoenzyme. Holoenzyme ADN pol III est l’enzyme majeure, qui réalise la synthèse de l’ADN (des brins fils). La 2eme enzyme qui intervient dans la réplication chez la bactérie est l’ADN POL I, qui possède en plus une activité exonucléasique 5’- 3’ permettant la dégradation des amorces d’ARN. L’ADN pol III a une activité ADN polymérasique dans le sens 5’-3’ et une activité de correction exonucléasique dans le sens 3’-5’. L’ADN pol I a trois activités : deux identiques à l’ADN pol III et une activité exonucléasique dans le sens 5’-3’. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima  primases Les primases sont des ARN polymérases ADN-dépendante : elles synthétisent les amorces d’ARN et sont dites ADN-dépendantes car elles se servent de l’ADN comme matrice.L’amorce d’ARN se fait dans le sens 5’ 3’ du sens de la chaine en cours de synthèse. Les primases sont capables de synthétiser de courtes séquences d’ARN (de 4 à 12 ribonucléotides) qui sont ensuite utilisées comme amorces par l’ADN polymérase réplicative. Chez E. Coli, la primase et l’hélicase forment un seul complexe appelé le primosome. Figure 14 : Schéma représentant le primosome 4.2MECANISME DE REPLICATION 1. Initiation de la réplication Chez E. Coli, il n’y a qu’un seul chromosome, et environ 4,6.106 paires de bases. Il existe une seule origine de réplication (appelée oriC : environ 245 pb), contenant des séquences répétées riches en A et T. C’est ici que se fixent les protéines d’amorçage, qui initient la réplication par l’ouverture locale de la double hélice d’ADN. Localement on va avoir le passage à la forme simple brin, c’est l’oeil de réplication. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima A partir de là se propage la réplication. C’est une propagation bidirectionnelle. On a deux fourches de réplications : une à droite et l’autre à gauche du point d’initiation. Les deux fourches progressent jusqu'à avoir deux molécules d’ADN double brin. On obtient donc un chromosome pour chaque cellule filles (donc deux au total), le plus fidèle possible au chromosome bactérien de la cellule mère. Chacune des deux cellules filles possède un chromosome à deux brins, qui correspondent à un brin synthétisé et à un brin parental. Figure 15: Mécanisme de réplication bidirectionnelle RAPPEL DEROULEMENT DE LA REPLICATION: - Hélicases - Gyrase - Protéine SSB pour éviter la renaturation et maintien de la structure sous une forme facile d’accès aux enzymes. Inhibent les structures en épingle à cheveux. - amorces d’ARN : primase + hélicase = primosome  synthétisées par la primase en 5’-3’ 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 2. Réplication des 2 brins d’DN parentaux La synthèse des brins fils se fait par l’ADN polymérase III. L’activité enzymatique se fait toujours dans le sens 5’- 3’. Le sens de propagation de la réplication doit s’effectuer dans le sens d’ouverture de la boucle d’ADN, c'est-à-dire dans le sens 5’- 3’. La réplication est donc discontinue sur un des deux brins. On distingue un brin dit avancé et un brin dit retardé : - Pour le brin avancé, la synthèse de l’ADN se fait dans le sens d’ouverture de la molécule d’ADN, donc dans le sens de propagation de la fourche de réplication. C’est le brin continu. - Pour le brin retardé ou discontinu, la synthèse d’ADN se fait dans le sens contraire de l’ouverture la molécule d’ADN : l’ADN polymérase n’exerce son activité polymérasique seulement dans le sens 5’-3’ de la chaine en cours de synthèse, or sur ce brin d’ADN, le sens de propagation de la fourche de réplication est 3’-5’. La synthèse de ce brin est donc discontinue. Elle va s’effectuer de manière rétrograde, à partir de multiples fragments d’ARN. On obtient donc de multiples fragments d’ADN (fragments de 1000 à 2000 nt), appelés fragments d’Okazaki. Figure 16: Mécanisme de réplication des deux brins chez les procaryotes 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Comment s’effectue la synthèse simultanée des deux brins ? Il existe un modèle démontré chez la bactérie et qui semble aussi être démontré pour les cellules eucaryotes. Chez la bactérie : mise en jeu de deux molécules d’ADN polymérase III qui travaille en même temps au niveau de la fourche de réplication : une qui synthétise de manière continue le brin avancé et l’autre qui synthétise de manière discontinue le brin retardé. Le brin d’ADN parental, qui sert de matrice au brin d’ADN retardé, forme une boucle pour repositionner l’amorce de façon à ce que l‘allongement du fragment d’Okazaki par l’ADN polymérase se fasse dans le sens 5’-3’ mais aussi dans le sens de propagation de la fourche de réplication. Processivité de l’enzyme : La processivité est donc la capacité de polymériser sur une longue distance.L’ADN polymérase III est naturellement peu processive : elle a tendance à synthétiser spontanément de l’ADN sur une courte distance et à se dissocier aussi spontanément de l’ADN parental. Cela est en adéquation avec la synthèse du brin discontinu : synthèse d’un fragment, puis détachement et synthèse d’un autre fragment.Mais sur le brin continu, l’ADN polymérase III doit synthétiser sur une longue distance. L’ADN POL III est donc maintenue au brin d’ADN parental par un collier coulissant (clamp). Pour E. Coli, c’est la sous-unité β du complexe holoenzyme qui joue le rôle de clamp. Cela permet à l’ADN POL III de rester associer au brin parental. La vitesse de réplication procaryote est de 500 et 1000 nt/s, ce qui permet à la réplication du chromosome bactérien de se faire en 40min. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 17 : Phénomène de processivité Figure 18 : Schéma récapitulatif de réplication chez les procaryotes 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Finition des brins d’ADN « fils » : Pour finir, il faut : - Eliminer l’amorce ARN - Remplacer les amorces d’ARN par de l’ADN - Transformer le brin discontinu en un brin continu Pour avoir un fragment d’ADN continu, l’ADN POL I se positionne au niveau 3’OH d’un fragment d’Okasaki et comble la lacune qui le sépare de l’amorce d’ARN suivante. Dès qu’elle va rencontrer l’amorce d’ARN, de par son activité exonucléasique 5’-3’, elle hydrolyse cette amorce d’ARN et continue, de par son activité ADN-polymérasique, à synthétiser de l’ADN à partir du fragment d’Okasaki précédent. Elle remplace ainsi l’amorce d’ARN en ADN. La dernière étape consiste à relier ces fragments d’ADN grâce à une enzyme, appelée ADN ligase, qui permet la création d’une liaison phosphodiester entre 2 nucléotides adjacents. On obtient alors un fragment continu. Quand la synthèse d’ADN est terminée, les 2 fourches de réplication vont se rencontrer (car l’ADN est circulaire. Il y a alors séparation des 2 doubles hélices par la gyrase. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 19 : Finition des brins d’ADN 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 5.. Expression de l'information génétique 5.1 Transcription La transcription est le premier processus de régulation utilisé par les cellules, tissus et organismes pour faciliter et contrôler les programmes complexes de l'expression génétique, le métabolisme cellulaire, et le développement des tissus et les organes. On appel transcription la synthèse de brin d'ARN dont la séquence est dictée par celle de la molécule d'ADN correspondante. Les trois principaux types d'ARN connus sont: - ARN messager (ARNm) : Spécifie les codons. - ARN de transfert (ARNt): Spécifie les anticodons. - ARN ribosomique (ARNr): Constituant de ribosomes et impliqué dans la synthèse des protéines. Chez les procaryotes ces ARN sont synthétisées par une seule ARN polymérase. Chez les eucaryotes elles sont synthétisées par trois types types de polymérases, ARN pol I, ARN poIII, et ARN pol III (Tableau 1). La réaction nécessite un brin d'ADN qui sert de modèle, les nucléosides trois phosphate (ATP, GTP, CTP, UTP) et Mg++. Tableau 1 : Les ARN polymérases chez les cellules eucaryotes Gene : Le gène est l'unité fonctionnelle de l'information génétique. Il est constitué d'un ensemble de nucléotides qui contient toutes les informations nécessaires pour transcrire un ARNm 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 20 : Structure général d'un gène chez les eucaryotes. (CRE (CRE [Cyclic AMP Responsive Elément], TRE [12- [12 O-Tetradacanoylphorbol 13-acetate acetate Responsive Element]: des éléments de réponse). Promoteur:: Site sur l'ADN d'une centaine de bases auquel l'ARN polymérase (ainsi que les facteurs d'initiation requis) se fixe pour commencer la transcription. Chez E. coli il ya environ 2000 sites promoteurs (4.8 x106 pb), elle sont qualifiés d'éléments cis. d’ coli Figure 21: Structure partielle de l'opéron lactose d’E. Figure 22 : Structure du promoteur bactérien. Les bactéries possèdent une seule ARN polymérase (l'enzyme minimale) capable à elle seule de synthétiser de l'ARN, elle est composée de quatre sous unités, chacune codée par un gène différent.La forme active de l'enzyme contient les sous-unités sous α2 ββ'ω ββ'ω-σ (PM ≈ 500000 Da). ). Parmi ces sous unités les polypeptides β, β' sont à l'origine de l'activité catalytique et constituent le site actif de la transcription, ce site ressemble à celui de l'ADN polymérase par le fait que sous sa forme active, il contient deux ions métalliques. métalliques. La sous unité σ aide à trouver un site promoteur ou' doit commencer la transcription. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 23 : Structure de l’ARN polymérase bactérienne. Chez les bactéries, il existe plusieurs formes alternatives de l'ARN polymérase, chaque unité σ particulière (σ32, σ54, σ70, σS et σE). La sous forme contient une sous-unité sous-unité σ70 est la plus grande forme (70 kDa). Ces éléments trans reconnaissent les séquences consensus de différents promoteurs et permettent une spécificité de l'initiation de la transcription. Cela permet de contrôler leur expression. Tableau 2 : Exemples de facteurs sigma chez E. coli 5.1.1.1.1 La transcription chez les procaryotes La synthèse de l'ARN, comme presque toutes les réactions biologiques de polymérisation comprend trois étapes: l'initiation, l'élongation, et la terminaison. A. Initiation L’ARN polymérase se lie au promoteur du gène. Les deux brins d'ADN se déroulent à cet endroit (formation de bulles de transcription) et la transcription commence 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 24 :Structure du promoteur bactérien. Figure 25 : Affinités relatives du core enzyme et de l’holoenzyme pour l’ADN. B. Elongation Une fois le duplexe temporaire est formé, la sous-unité sous σ se dissocie de l'holoenzyme et l'élongation de la chaine se poursuit sous la direction direction de la partie centrale de l'enzyme. Chez E. coli ce processus progresse à la vitesse d'environ 50 nucléotides/seconde à 37°C. Par la suite la polymérase parcourt le gène entier jusqu'à rencontrer une séquence dite de terminaison. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 26:: Elongation et direction de la synthèse. C.Terminaison Définie comme étant le processus conduisant à la dissociation de l’ARN polymérase à la fin de la transcription.Un aspect intéressent de la terminaison chez les bactéries est que la séquence de terminaison ci-dessus ci dessus est en fait transcrite en ARN. Cette dernière forme une structure en tige boucle par appariement de bases du même brin. L'ADN au niveau de la séquence de terminaison est inversé au centre duquel une zone non répétée est insérée Figure 27 :Formation du signal de terminaison de la transcription chez les bactéries. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Ces structures secondaires suivies d'une série d'uridines sont des terminateurs efficaces de la transcription. Des séquences riches en GC suivie par autres riche en AT sont aussi des sites spécifiques de terminaison. Ces régions qui ne nécessitent pas de facteurs additionnels sont nommées "terminateurs intrinsèques". D'autres types de terminateurs nécessitent des facteurs protéiques spécifiques. Chez E. coli la protéine Rho se fixe fortement à l'ARN (mais pas ni à l'enzyme ni à l'ADN), elle parcourt alors la chaine jusqu'au complexe ARN polymérase-ADN. Dés que l'ARN polymérase s'arrête à un site de terminaison Rho dépendant. Le facteur Rho favorise la libération de l'ARN et de l'enzyme positionnée sur l'ADN, terminant ainsi la transcription. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 28 : Terminaison de la transcription chez les bactéries par le facteur Rho 5.1.2.1.2 La transcription chez les eucaryotes La transcription chez les eucaryotes est prise en charge par des ARN polymérase très apparentées à celles présentent chez les procaryotes. Mais c'est un processus beaucoup plus complexe et il existe plusieurs différences notables: - La transcription chez les eucaryotes est prise en charge par 3 ARN polymérases (Pol I, II, et III) très apparentées à celles présentes chez les procaryotes. - La transcription au contraire de la traduction se fait au niveau du noyau. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima - Elle nécessite plusieurs facteurs d'initiation (facteurs généraux de transcription (FGT: TFII A, TFII B, TFII D (TBP, TAF), TFII E, TFIIH). - Remodelage de la chromatine par des protéines régulatrices et des enzymes de modification de la chromatine ----> > : changement de conformation lors de l'ouverture de la double hélice de l'ADN (ADN inclus dans les nucléosomes). - En plus des éléments cis (ex: TATA Box) il existe en plus du promoteur des autres séquences ou unités de contrôle :  Activateurs : Enhancers  Extincteurs: Silencers. Ces séquences peuvent être localisées dans la région régulatrice en 5', en amont du point d'initiation, mais aussi parfois à l'intérieur du gène ou même dans la région 3' en aval de la séquence codante Figure 29 :Les composants d'un promoteur eucaryote. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 30 : Contrôle de la transcription par un enhancer localisé en aval (downstream) du site de l'initiation de la transcription. L'ADN forme une loop pour faciliter le contacte de l'enhancer avec le complexe de l'initiation de la transcription par l'intermédiaire des facteurs de transcription. Comme chez les procaryotes, la transcription se fait en 3 étapes :initiation, élongation et terminaison. A.Initiation La reconnaissance du promoteur et la mise en place du complexe de pré initiation chez la plupart des pol II débute au niveau du TATA box , ce dernier est reconnu par TFI TFIID, plus précisément par la sous unité TBP (TATA box Binding Protein). rotein). D'autres sous unités de ce complexe sont appelées TAF (TBP associated factors) reconnaissent d'autres éléments du promoteur, tels Inr, DPE et DCE, bien que la liaison la plus forte soit celle entre TBP et TATA. Le complexe TBP-TATA TATA attire sur le promoteur d'autres facteurs généraux de transcription [TFIIA liaison du Pol II au promoteur (upstream), TFIIB liaison du Pol II au promoteur (downstream), TFIIF  accompagne Pol II dés qu'elle se fixe surle promoteur, TFIIE  essentiel pour l'élongation et la libération du Pol II du promoteur , et TFIIH il a un rôle dans la phosphorylation du CTD du Pol II et il a aussi un rôle dans l'élongation] et la polymérase elle même. La double hélice à ce niveau se sépare par l'intermédiaire du TFIIH en hydrolysant la liaison anhydride de l'ATP. La grande sous unité de pol II possède sur l'extrémité C-terminale C terminale une série de séquence répétée de 7 acides aminés (heptapeptide: ( Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro--Ser) appelée domaine 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima carboxy terminal (CTD)) ou la queue. Le nombre de répétitions dépond des espèces: 27 fois chez les levures, 45 fois chez la mouche Drosophila, et 52 fois chez l'homme. Chaque motif répété contient des sites de phosphorylation par des kinases spécifiques, notamment une qui est une sous unité de TFIIH. La régulation du niveau de phosphorylation du CTD de Pol II contrôle aussi les étapes ultérieures (élongation, maturation). Figure 31 :Formation du complexe dedémarrage Pol-II. Pol Figure 32 : Formation du complexe TFII-D TFII : Activation de la transcription. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima B.Elongation Dans l'étape de l'élongation la Pol II se débarrasse de la plupart de ses facteurs d'initiation, comme les FGT et le médiateur (requis pour atteindre des niveaux élevés de transcription in vivo:: car l'ADN est empaqueté sous forme de chromatine). De nouveaux facteurs appelés facteurs d'élongation vont les remplacer. Différents protéines sont supposées stimuler l'élongation comme la kinase P P-TEFb (phosphoryle des résiduss Ser de CTD, et active le facteur d'élongation hSPT5), TAT TAT-SF1, P- TEFb (stimule l'élongation par trois vois distinctes). Il existe aussi des facteurs d'élongation de type ELL (suppriment les arrêts temporaires de l'enzyme). Un autre facteur important dans l'élongation et n'a aucun rôle dans l'initiation est le TFIIS, ce facteur joue de rôle important le premier est de réduire les pause de la polymérase et le deuxième est de corriger les erreurs (mésappariements) par l'activité RNase. Comme l'initiation de la transcription, l'élongation se déroule en présence d'histones, ce qui fait appel à des facteurs facilitant la transcription en présence de chromatine. Le facteur FACT (facilitates Chromatin Transcriprion) rend la transcription sur type de matrice chromatine atine beaucoup plus efficace. C'est un hétérodimère de deux protéines, la première Spt16 se lie sur le module H2A/H2B et la deuxième SSRP1 se lie sur le module H3/H4 pour démanteler les nucléosome. Figure 33 : Elongation de la transcription. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima C. Terminaison La transcription se termine aux alentours de la séquence de polyadénylation transcrite. La protéine CPSF (Cleavage Factor) qui était associée à Cleavage and polyadenylation Specificity Factor l’ARN polymérase s’y lie. La perte de l’interaction CPSF/ARN polymérase déstabilise le complexe de transcription. Figure 34:: Terminaison de la transcription chez les eucaryotes. 5.1.3.1.3 Maturation des ARNm La maturation des ARNm prématurés se fait au niveau du noyau et entraîne des changements dans leur structure. -Addition Addition d'une coiffe (7mG) en 5' et d'une queue (poly A) en 3' pour la plupart des transcrits destinés à devenir des ARNm. Figure 35 : Ajout d’une coiffe de guanosine méthylée. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima -Ajout d’une queue poly-A poly A à l’extrémité 3’ (de 50 à 250 nucléotides d’adénine). Dès la fin de la transcription, avant même que l’ARN ne quitte le noyau. La polyadénylation facilite l’exportation des ARNm hors du noyau, les protège des dégradations une fois dans le cytosol et facilite leur traduction. Figure 36 : Mise en place de la queue poly-A poly en 3’ du messager. -Le transcrit eucaryotes contiennent des sections non codantes (les (les introns introns) et des sections codantes (les exons). L'épissage consiste à enlever les introns puis à recoller les exons. Les introns restent à l'intérieur térieur du noyau puis sont dégradés. L’épissage est catalyse par des snRNP (Small Particles) plus d’autres protéines. L’ensemble Small nuclear ribonucleotide Particles) constituant le splicesome.. Les RNP sont des structures multimoléculaires composées de protéines et de petits tits ARN.U1 et U2 se fixent d’abord sur le pre-messager, pre messager, puis U4 et u6 viennent interagir avec U1 et U2, ce qui rapproches les deux extrémités exonique. Puis 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima l’activité catalytique du splicesome permet de cliver la séquence intronique et de liguer les séquences exoniques. Figure 37:Les deux étapes de la réactioncatalytique d’épissage. Figure 38 :Catalyse et épissage par le complexe des snRNP U1, U2,U5,U4/U6 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 39: Les étapes d'assemblage du splicéosome. Figure 40 : Résumé des étapes de maturation de l’ARN des eucaryotes. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima L’épissage alternatif permet de générer des protéines différentes à partir d’un même gène. Figure 41 : Epissage alternatf. 5.2.2 La Traduction La traduction est parmi les événements les plus conservés chez tous les organismes, et les plus coûteuses en énergie. Dans la réplication et la transcription le transfert de l'information génétique nécessite une matrice d'ADN pour produire un acide nucléique (ADN, ARN), mais dans la traduction la matrice matrice est l'ARN et le produit final est une polypeptide ou protéine. Quatre composants principaux sont impliqués dans la traduction: 1- ARNm:: Cette macromolécule fournit l'information qui doit être interprétée par la machinerie de la traduction et constitue la matrice matrice pour la traduction. La région de l'ARNm codant la protéine est constituée d'une série ordonnée d'unités de trois nucléotides appelées codons (spécifient l'ordre des acide aminés). 2- ARNt:: Ils fournissent l'interface entre les acides aminés ajoutés à la chaine peptidique en croissance et les codons dans l'ARNm. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 3- Aminoacyl-ARNt synthétase: Ces enzymes couples des acides aminés avec des ARNt synthétase: ARNt spécifiques qui reconnaissent le codon approprié. 4- Ribosomes: Le ribosome coordonne la reconnaissance de l'ARNm par ch chaque ARNt et catalyse la formation de la liaison peptidique entre la chaîne polypeptidique en croissance et l'acide aminé chargé sur l'ARNt sélectionné. -La La synthèse de la protéine est centralisée au niveau des ribosomes. -Les Les ribosomes se déplacent dans le sens 5' vers 3' sur l'ARNm et synthétisent le polypeptide correspondant de l'extrémité NH2 terminale vers l'extrémité COOH terminale terminale. - La séquence de l'ARNm est décodée par groupe de trois nucléotides (codon) qui correspondent à un acide aminé particulier ou aux signaux d'initiation et de terminaison 4.2.1 Le code génétique Le code génétique établit une correspondance entre la matrice d'acides nucléiques et le polypeptide produit (Un acide aminé correspond à un codon). codon). Le code génétique est écris en ARNm plutôt qu'avec l'ADN. L'aspect le plus intéressant du code génétique est que certains acides aminés sont codés par plusieurs codons apparentés mais différents. Parmi un total de 64 codons, 4 sont dédiés à l'initiation l'initiati et à l'arrêt de la traduction. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 42 : Correspondance entre les triplets de bases de l'ARNm et les acides aminés et les non sens (codon stop). -Le Le codon AUG (code pour formyl-MET formyl ou MET) = codon d'initiation -Le Le premier nucléotide du premier codon détermine le cadre de lecture ouvert (ORF : Open Reading Frame). -Il Il y a 64 possibilités de combiner les nucléotides en codons (43).Comme il y a 20 acides aminés, il y a donc 44 codons supplémentaires :  3 correspondent à des codons stop ou non-sens: non UAA, UAG et UGA  les autres sont des synonymes qui codent pour différents acides aminé (Dégénérescence Dégénérescence du code génétique) génétique -Code UNIVERSEL:: c'est le même pour tous les êtres vivants sauf quelques rares exceptions.Cette caractéristique permet le transfert de gènes d'une espèce à l'autre = génie génétique. 5.2.2 Les ribosomes Une cellule en phase active de croissance possède des milliers de ribosomes. Ce sont les sites de synthèse protéique. Chaque ribosome est composé de deux sous unités 30S (unité Svedberg: unité de coefficient de sédimentation) et 50S, l'ensemble donne des ribosomes 70S. La machinerie de polymérisation des acides aminés est composée d'au moins 3 ARN et 50 protéines différentes. Les ARNm procaryotes possèdent un site de liaison au ribosome ((RBS) appelé séquence de Shine Dalgarno (S/D). Cet élément typiquement localisé 3 à 9 nucléotides en amont du codon d'initiation, il s'apparie avec la séquence complémentaire localisée sur l'ARNr 16S.La grande sous-unité sous contient le centre peptidyl-transférase ase qui est responsable de la formation des liaisons peptidiques. La petite sous-unité sous unité contient le centre de décodage dans lequel les ARNt chargés lisent ou décodent les codons de l'ARNm. Les sous sous-unités ribosomiques sont composées d'un ou plusieurs ARNr et et de nombreuses protéines 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 43 : Structure générale des ribosomes procaryotes. La figure montre la composition en ARNr et en protéines des différents sous unités, de même que la longueur des ARNr et le nombre de protéines ribosomiques. Tableau 3 : Structure comparée des ribosomes 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 5.2.3.2.3 Rôles des ARNt dans la traduction L'ARNt joue le rôle d'adaptateur entre les codons et les acides aminés qu'ils spécifient. Et l'ARNr en plus de son rôle structural des ribosomes en association avec des protéines, il a un rôle dans la fixation de l'ARNm (ARNr16S chez les procaryotes) et la formation des liaisons peptidique (activité peptidyl transférase de l'ARNr 23S chez les procaryotes).La liaison du tRNA à son acide aminé spécifique est catalysée par une enzyme: aminoacyl tRNA synthetase. Figure 44 : Structure de l'ARNt déchargée (sans (sans acide aminé). Cette structure dite en feuille de trèfle. L'acide aminé se fixe au niveau du ribosome du A terminal de l'extrémité acceptrice. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 45:: Réaction d’aminoacylation catlysée par une aminoacyl- aminoacyl-ARNt synthétase. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 5.2.4 Étapes de la traduction chez les procaryotes Au delà des aminoacyl-ARNt synthétases, des ARNt, les ribosomes, et les ARNm cette synthèse nécessite plusieurs protéines appelées : facteurs d'initiation, d'élongation et de terminaison, tandis que l'énergie est fournie par la molécule de GTP. Les structures différentes dans les ARNm procaryotes et eucaryotes impliquent des voies différentes pour ces événements. A. Initiation de la traduction Pour que la traduction soit initiée avec succès, trois événements doivent se produire 1- Le ribosome doit être recruté sur l'ARNm 2- Un ARNt initiateur chargé par N-formyl-Met doit s'insérer dans le site P du ribosome 3- Le ribosome doit être positionné de manière précise sur le codon d'initiation. Le N-formylmethionyl- ARNt initiateur se lie d’abord à la sous-unité libre 30S. Ensuite, l'ARNm se lie à la sous-unité 30S et se positionne correctement par des interactions à la fois avec l'extrémité 3' de l'ARNr 16S et avec l'anticodon fmét-ARNt. Finalement la sous-unité 50S s'attache au complexe Sous-unité 30S –ARNm.Le résultat de l'initiation est la formation d'un ribosome complet (70S) un niveau du site d'initiation de l'ARNm, avec le fMet- ARNtifMet occupant le site P, et un site A libre.Les aminoglycosides comme la streptomycine sont des antibiotiques largement utilisés contre les infections bactériennes comme la tuberculose. Ces antibiotiques inhibent la formation du complexe d'initiation 70S en bloquant l'assemblage des deux sous unités. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 46 :Le processus de l'initiation de la traduction chez les procaryotes. Figure 47:Formation du complexe d'initiation 70S. IF: initiation factor. A: Aminoacyl or acceptor site, P: peptidyl site, E: Exit site 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Chez les procaryotes trois facteurs d'initiation dirigent l'assemblage d'un complexe d'initiation. 1- Facteur d'initiation 3 : IF-3 : se lie à la petite sous-unité et l'empêche de s'associer avec la grande sous-unité libre, et favorise la liaison correcte de l'ARNm. 2- Facteur d'initiation 2 : IF-2c'est une protéine liant et hydrolysant la GTP (GTPase), il lie le GTP au fMet-ARNt initiateur pour faciliter sa liaison à la sous unité 30S et empêche la fixation de d'autre ARNt chargé. 3- Facteur d'initiation 1: IF-1c'est un facteur semble nécessaire à la libération du IF-2 et du GDP. Il empêche la fixation d'ARNt sur la partie de la petite sous-unité qui fera partie du site A. IF-1 peut aussi faciliter l'assemblage des deux sous-unités. B.Élongation Une fois le ribosome 70S assemblé, avec l'ARNt initiateur chargé au site P, la synthèse de polypeptide peut commencer. Trois événements clés doivent se produire pour l'addition correcte des acides aminés. 1- La liaison de l'aa-ARNt au niveau du site A en concordance avec le codon qui est exposé. 2- La réaction de transpeptidation. 3- La Translocation Vers Le Site P. Après la translocation (libération du site A) le ribosome est prêt pour un autre cycle de polymérisation. Deux protéines auxiliaires (facteurs d'élongation) contrôlent ces événements. Les deux facteurs utilisent la GTP comme source d'énergie pour accroître la vitesse et la précision du fonctionnement du ribosome. L'aminoacyl-ARNt est ramené au site A par le facteur d'élongation EF-Tu, ce facteur est lié à une GTP. L’activité GTPase est activée juste après l'établissement d'un appariement codon-anticodon correcte, et le EF-Tu-GDP sera libéré et converti en EF-Tu-GTP de nouveau par l'intermédiaire d'un deuxième facteur d'élongation appelé EF-Ts.Pour qu'une nouvelle élongation puisse se produire l'ARNt du site P doit se déplacer vers le site E et l'ARNt du site A doit ce déplacé au site P. En même temps l'ARNm doit se déplacer de trois nucléotides pour présenter le codon suivant. Cette phase finale d'élongation nécessitel’EF-G ou translocase et l'hydrolyse de GTP. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Le chloramphénicol c'est un antibiotique antibiotique inhibant la synthèse des protéines chez les bactéries. Il empêche le positionnement correcte de l'Amino-acyl-ARNt l'Amino ARNt dans le site A pour la réaction peptidyl transférase dans la grande sous-unité. sous Figure 48:Etape d'élongation de la synthèse protéique. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima C.Terminaison de la traduction La terminaison de la traduction se fait quand un codon stop (non-sens: UAA, UAG, et UGA) est atteint, les ARNt ne pouvant plus s'y fixer. Trois facteurs de libération RF (RF-1, RF-2, et RF-3) aident le ribosome à reconnaitre ces séquences et coupent le polypeptide attaché à l'ARNt terminal, libérant le produit fini. Par la suite les sous-unités se dissocient, elles peuvent alors former de nouveaux complexes d'initiation et recommencer le processus. Figure 49 :Étape de terminaison de la traduction. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 5.2.5 La traduction chez les eucaryotes Comme chez les procaryotes on distingue trois étapes dans la synthèse protéique chez les eucaryotes (initiation, élongation et terminaison). A.Initiation L'initiation est similaire à celle chez les procaryotes par plusieurs aspects. Les deux utilisent un codon d'initiation et un ARNt initiateur, et les deux font appel à des facteurs d'initiation pour former un complexe avec la petite sous-unité ribosomique qui lie l'ARNm avant l'ajout de la grande sous-unité. Néanmoins, les eucaryotes utilisent une méthode complètement différente pour reconnaître l'ARNm et le codon d'initiation. Chez les eucaryotes, la petite sous unité est déjà associée avec un ARNt initiateur. Au contraire des procaryotes la liaison de l'ARNt initiateur (chargé par une méthionine non modifié) à la sous unité 40S précède toujours l'association avec l'ARNm. La reconnaissance de l'ARNm fait appel à plusieurs facteurs auxiliaires. Le ribosome recruté au niveau de la coiffe 5' de l'ARNm scanne l'ARNm dans le sens 5' 3' jusqu'à atteindre la séquence de Kozak 5'CCAUGG3', cette séquence permet de connaître le codon d'initiation (AUG). Enfin, la grande sous unité du ribosome est recruté Après l'appariement de bases de l'ARNt initiateur avec le codon d'initiation. A la fin d'un cycle de traduction, le ribosome eucaryote se dissocie en ses sous-unités constitutives 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 50 : Formation du complexe d'initiation chez les eucaryotes. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima B.Élongation Une fois la le ribosome assemblé, avec l'ARNt initiateur chargé au site P, la synthèse du polypeptide peut commencer. Figure 51 : Élongation de la traduction chez les eucaryotes. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima C.Terminaison de la traduction Tous comme l'initiation et l'élongation, la terminaison de la traduction est contrôlée par une série d'attachement-relâchement de facteurs dans un ordre précis. Tableau 4 : Tableau comparatif de la traduction chez les procaryotes et les eucaryotes. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 5.2.6 Modifications post-traductionnelles Les principales modifications post-traductionnelles sont : - Phosphorylation (Ser, Thr, ou Tyr: important dans la transduction de signaux à travers les membranes. - L'élimination du formyl-méthionine ou méthionine par une enzyme spécifique (Met- aminopeptidase : MAP)se fait chez plus de 50% des protéines des deux types de cellules. Le N-formyl de la première méthionine est enlevé chez E. coli par une deformylase. - Clivage de chaine polypeptidique (Ex. L'insuline) - Glycosylation - Addition des lipides - Formation des ponts disulfures ou pont covalents (élastine, collagène). - Acétylation (≈ 100 protéines cytoplasmique ont un N-terminal acétylé), la réaction est catalysée par N-α- acétyle transférase (exemple: acétylation des histones). - Hydroxylation (hydroxylation des prolines et lysine) - Biotinylation:Addition de la biotine [vit B8] (coenzyme de quelques enzymes de carboxylation [transfert de CO2]). - Élimination des séquences surnuméraires au niveau protéique, ce processus est appelé l'épissage protéique et le peptide éliminé est nommé intéine. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 52 : Les principales modifications post-traductionnelles. post Bien que la protéine est constituée au départ d’une simple suite d’acides aminés, elle n’est fonctionnelle qu’après une phase phase de repliement qui lui donne sa structure tertiaire (tridimensionnelle). 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 53 :Repliement proteique. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 5.3.3 Régulation de l'expression génétique La régulation de l'expression génétique c'est un processus d'intérêt majeur pour toutes les cellules, elle permet d'économiser l'énergie et les ressources. Les cellules microbiennes ont divers mécanismes par lesquels régulent leurs activités en réponse au changement de l'environnement externe, afin d'optimiser ses fonctions principales (nutri (nutrition, croissance, résistance…etc.). Il y a deux modes majeurs de régulation dans les cellules: 1- Régulation de l'activité des enzymes présentes (post-traductionnelle). (post traductionnelle). 2- Régulation de la production des enzymes (transcriptionnelle ou post post- transcriptionnelle). Figure 54: Niveaux de régulation de l’expression. La régulation de l'activité enzymatique s'effectue par deux moyens principaux : 1- Le contrôle de la quantité d'enzyme : Des systèmes complexes modulent la quantité d'enzyme en réponse à des conditions changeantes (Exemple le cas des enzymes inductibles). 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 2- Le contrôle de l'activité enzymatique: L'activité enzymatique peut être directement modifiée par des modifications covalentes et conformationnelles, ou par des modifications non covalentes en modulant l'affinité des enzymes au substrat par des molécules ou sous-unités protéiques régulatrices. 5.3.1 Régulation de la transcription L'expression d'un gène peut être régulée à plusieurs étapes, la plus commune étant celle de l'initiation de la transcription. Il ya deux raison qui peuvent justifier cela. - Le coût en énergie et en ressources pour la transcription - La régulation lors de l'initiation est plus facilement réalisable. Il y a 2 modes distincts du contrôle de l’initiation de la transcription 1- Un contrôle constitutif qui dépend de la structure du promoteur 2- Un contrôle de régulation qui est sous la dépendance de protéines régulatrices Il ya deux types de protéines régulatrices : 1- Les activateurs (régulateurs positifs: augmente la transcription d'un gène) 2- Les répresseurs (régulateurs négatifs: diminue ou bloque sa transcription) A. Contrôle négatif de la transcription "Répression et induction" Répression: Activité de synthèse d'une enzyme empêchée lorsque le produit de la réaction est présent en excès. Induction: Production d'une enzyme seulement lorsque son substrat est présent. Opéron : c’est un ensemble de gènes transcrit en un seul ARNm polycistronique sous la direction d'un seul promoteur (le mot cistron désigne la plus petite unité génétique servant à une seule fonction). Les gènes d'un opéron donné sont soumis à un contrôle coordonné (système de contrôle remarquablement économique). Lorsque E. coli est cultivé dans un milieu de culture où le lactose est la seule source de carbone, la concentration cellulaire de trois protéines augmente. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 55 :Croissance bactérienne en présence de glucose g et de lactose.. Les gènes de l'opéron lac ont un fort niveau d'expression seulement en présence du lactose, et en absence du glucose (source de carbone et d'énergie préférée). Deux protéines régulatrices sont impliquées: - Un activateur appelé CAP (Catabolite Activator Protein), rotein), connue aussi par le nom de CRP (cAMP receptor protein). rotein). Le gène codant CAP au contraire du ce codant le répresseur est localisé sur un autre endroit sur le chromosome. Il se fixe sur le site CAP. - Le répresseur lac (codé par le gène lac I), il se fixe sur l'opérateur. d’ coli. Organisation de l'opéron lactose d’E. Figure 56:Organisation 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Le blocage de l'expression de l'opéron lactose en présence du glucose ou autre source d'énergie et de carbone facilement assimilable que le lactose est appelé la répression catabolique. L'une des conséquences de cette répression est la croissance diauxique ou triauxique (selon le nombre). L'opéron lac ne possède pas un promoteur fort (faible séquences consensus surtout la région -35) pour cette raison la fixation de l'ARN polymérase doivent être stimulée par une protéine d'activation spécifique (contrôle positif), appelé protéine réceptrice d'AMPc (CRP) ou protéine activatrice du catabolisme (CAP). En absence du glucose, les niveaux d'AMPc (synthétisée à partir de l'ATP par l'adénylate cyclase) augmentent, aboutissant à la fixation de la CRP à l'AMPc. Le complexe CRP-AMPc se fixe sur le site CAP. L'ADN subit alors une inclinaison de 90°, qui stimule la fixation des éléments trans de l'ARN polymérase aux éléments cis du promoteur pour augmenter le taux de la transcription de 50 fois. En absence du glucose et la présence du lactose, l'allolactose(β-D-galactopyranosyl– (1-6)- β-glucopyranose), une molécule inductrice synthétisée à partir du lactose (β, 1-4) par un réaction de transglycosylation se fixe sur le répresseur et l'inactive de sorte qu'il ne puisse plus se fixer à la séquence de l'opérateur. L'ARN polymérase activée par le complexe CRP- AMPc peut initier la synthèse de l'ARN avec un taux de transcription élevé. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 57 :Expression des gènes lac en présence/absence du glucose et le lactose. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima B. Contrôle positif de la transcription Dans ce type de contrôle, une protéine régulatrice active à la fixation de l'ARN polymérase d'où le terme positif. Un excellent exemple de ce type de contrôle est l'opéron malEFG (l'opéron du catabolisme du maltose) chez E. coli. En absence d'inducteur, ni la protéine activatrice, ni l'ARN polymérase ne peuvent se lier à l'ADN. La liaison d'une molécule inductrice dans ce cas là c'est le maltose à la protéine activatrice provoque un changement de sa conformation (protéine allostérique), à son tour, se lie auu site de fixation de l'activateur. Ceci permet à l'ARN polymérase de ce fixer sur le promoteur et commencer la transcription Figure 58:Mécanisme de contrôle positif de l'opéron malEFG EFG chez E. coli. C. Contrôle de l'expression génétique par atténuation L'atténuation dépend du fait que la transcription et la traduction sont étroitement couplées. Chez E. coli les opérons de biosynthèse des acides aminés (Ex. Tryptophane) sont contrôlés par ce mécanisme. L'opéron Trp est composé de cinq gènes adjacents coda codant les enzymes qui synthétisent le tryptophane. Ces gènes sont contrôlés par un répresseur et ne s'expriment qu'à l'épuisement de tryptophane (l'absence du tryptophane qui arrête la répression). 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Le phénomène d'atténuation contrôle la décision de transcrire un ARNm entier. Si les taux de tryptophane sont élevés, la plupart des transcrits terminent leur synthèse de façon prématurée (incomplète). Au contraire, si les taux sont insuffisants, la polymérase transcrit les gènes en entier. Une séquence leader de 161 161 nucléotides localisés en amont du premier codon du gène trpE, elle contient 4 régions (1, 2, 3, et 4). Cette séquence contient aussi deux codons pour le tryptophane, alors s'il ya manque de tryptophane la synthèse du peptide leader sera incomplet à cause du manque des ARNt chargés par le Trp. L'atténuation (l'arrêt de la transcription) dépond de la capacité de l'ARN à former des structures secondaires entre des régions complémentaires (2=3 ou 3=4). Si le tryptophane est abondant, le ribosome traduira la séquence séquence leader jusqu'au codon stop, le reste de l'ARNm leader forme une structure secondaire entre les régions 3 et 4 suivi par une séquence riche en uracile qui provoque finalement la terminaison. Si le tryptophane est absent ou en faible quantité, la synthèse synthèse du peptide leader sera incomplet. Le blocage du ribosome permet dans ce cas là la formation d'une autre structure secondaire (entre les régions 2 et 3), cette structure n'est pas un signal de terminaison de la transcription et empêche la formation du signal de terminaison. Ceci permet à l'ARN polymérase de transcrire tous les gènes de structure. L'opéron tryptophane chez E. coli. Figure 59 :L'opéron 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 60 :Processus de l'atténuation de l'opéron tryptophane d’E. d’ coli 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 5.3.2 3.2 Régulation traductionnelle 1. Inhibition de la lecture de l’ARN par RE en 5’ 2. Inhibition des facteurs de traduction (initiation, élongation, terminaison) 3. Régulation par les micro ARN Figure 61 : Régulation de la traduction par les micro ARN. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 6. Techniques de base de biologie moléculaire 6.1 Extraction et purification des acides nucléiques Toute étude de génétique moléculaire implique la disposition d'échantillon d'acides nucléiques. Les techniques d'extraction d'acides nucléiques sont relativement simples. Il convient simplement d'éviter toute destruction enzymatique ou mécanique. En effet les acides nucléiques qui sont stables dans la cellule intacte, deviennent très vulnérables à la digestion par les nucléases endogènes une fois la cellule lysée. Le protocole d’extraction d’ADN génomique à partir d’une culture bactérienne est basé sur le principe de la lyse alcaline. Après extraction, l’ADN est resuspendu dans 30 µl de TE et conservé à -20°C. L’ADN génomique est analysé par électrophorèse sur gel d’agarose à 1% (w/v). Le protocole d’extraction d’ADN est le suivant : 1. Transférer 1 ml d’une préculture d’une nuit à 37°C dans un tube eppendorf 2. Centrifuger 1 min à 13000 rpm 3. Eliminer le surnageant 4. Resuspendre le culot dans 500 µl d’une solution TE (10 mM Tris-HCl pH 8,1mM EDTA pH 8) 5. Ajouter 20 µl lysozyme (50 mg / ml) et incuber 30min à 37 °C 6. Ajouter 60 µl d’EDTA (0,5M pH 8) 7. Ajouter 10 µl Protéinase K (20mg/ ml) et incuber1 h à 37°C 8. Ajouter 100 µl SDS 10% et incuber 10 min à 50°C 9. Ajouter 350 µl d’acétate de potassium 3M pH 5,2 10. Mélanger délicatement par inversion du tube en incuber 10 min dans la glace 11. Centrifuger 10 min à 10000rpm 12. Transférer le surnagent dans un tube eppendorf neuf 13. Ajouter 1 volume d’isopropanol 14. Mélanger par inversion (jusqu’à apparition de l’ADN sous forme de filament) et laisser précipiter pendant 10 min à – 20 °C 15. Centrifuger 1min à 10000 rpm 16. Eliminer le surnageant 17. Ajouter 200 µl d’éthanol 70% pour laver l’ADN, sans aucune agitation 18. Centrifuger 10 min à 10000 rpm 19. Eliminer le surnageant 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima 20. Sécher le culot en inversant le tube sur un papier filtre pendant 10 min 21. Dissoudre le culot dans 20 µl TE. 6.2 Dosage des acides nucléiques Les pyrimidines et les purines absorbent fortement les UV à 260nm.Une unité de densité optique à 260 nm correspond à: - Une solution de DNA double brin à 50μg/ml. - Une solution de DNA simple brin ou RNA à 25μg/ml. C = A260 * DF * 100 Ces valeurs s'appliquent à des acides nucléiques parfaitement purs et en solution homogène. Pour vérifier la pureté de l'ADN il faut calculer : P (pureté)= A260 /A280 Une solution d'ADN est considérée pure si : 1.7 ≤ P ≤ 2 6.3 Electrophorèse Bien que la séquence des acides nucléiques détermine ses fonctions biologiques, la longueur de ces polymères constitue leur propriété physique la plus utile.Parmi les techniques les plus utilisées pour la séparation des acides nucléiques selon leur taille est l'électrophorèse. C'est une technique de bioséparation permettant la séparation des biomolécules selon leur charge et leur taille (ADN, ARN, protéines). Le terme électrophorèse vient de : électroce qui signifie énergie électrique et de phoresis (photo en grec) qui veut dire porter, avoir en soi. Les acides nucléiques en solution portent une charge négative à cause de l'ionisation de leurs groupements phosphate (macromolécules polyanioniques uniformément chargées). Ils se déplacent donc vers l'électrode (+). Toutes les séquences d'acides nucléiques ont un rapport charge/masse à peu près identique, quelle que soit leur longueur, parce que tous les nucléotides sont à peu prés de même masse (masse molaire moléculaire moyenne des nucléotides 330 g/mol). Suivant les théories de l'électrophorèse la mobilité μ dans un champ électrique au sein d'un gel doué de pouvoir de filtration est: Log μ= Logμo - Kr. C Log μo : La mobilité de la molécule en milieu liquide C: Concentration du gel Kr: Coefficient de retardement dû au gel (Lui même est en fonction de la masse moléculaire de la molécule). Deux sortes de matrice de gel sont utilisées: l'agarose et le polyacrylamide.Le gel agit à la manière d'un tamis moléculaire au travers duquel les molécules d'ADN en mouvement 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima doivent passer; les molécules de grande taille ont plus de difficulté pour passer à travers les mailles (pores) crées par le réseau des microfibres du gel et et vont donc migrer plus lentement que les petites molécules. La vitesse de migration de l'ADN est influencée par deux paramètres : - La masse moléculaire (nombre de pb) - La concentration du gel Il faut noter que la nature et la concentration du support de de l'électrophorèse sont en fonction de la taille des fragments à séparer. Tableau 5:: Taille des fragments à séparer selon la concentration du gel. Dans toutes les électrophorèses, des marqueurs de taille (ou de poids moléculaire) sont déposés et migrent parallèlement au DNA étudié. Une fois l'électrophorèse terminée, les molécules fluorophores, comme le bromure d'éthidium, qui se fixe à l'ADN en s'intercalant entre les bases. Les bondes d'ADN (regroupent toute les molécules d'ADN de taille identique) sont visualisées sous UV. Figure 62: Visualisation des bandes d'ADN sous UV. M:: marqueur de taille. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima La mobilité relative est le rapport entre la distance de migration d'une bande et la distance de migration du front de migration.La droite log(nombre de kb) = f(mobilité relative), permet de déterminer la taille d'une molécule d'ADN inconnue. Figure 63: Distance de migration en fonction du logarithme de la taille des fragments d’ADN. 6.4.4 Marquages des acides nucléiques Il existe deux grands types de marquages : Les marquages chauds:: le signal est lié à la radioactivité des sondes qui contiennent un ou plusieurs atomes radioactifs de courte période comme le phosphore 32 (P32) ou le soufre 35 (S35) ou le tritium (H3). Les marquages froids qui sont de deux types: soit la sonde est liée à un fluorochrome, soit à un ligand qui sera reconnu spécifiquement et avec une forte affinité par une moléculeréceptrice. 5.4.1 Marquage des sondes : Il existe en fait plusieurs stratégies pour marquer les sondes. On peut distinguer : -Nick translation -Multi-amorçage au hasard -Marquage Marquage des oligonucléotides NB : Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides qui permet de rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique que l’on désire étudier. Ce Cette réaction 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima fragment correspond à une réaction d’hybridation moléculaire sonde-fragment a- La Nick translation : La DNase I coupe aléatoirement les brins de l’ADN bicaténaire. Les extrémités 3’ ainsi libérées deviennent un site de fixation pour l’ADN polymérase I qui va : 1. Détruire l’ADN par son activité exonucléasique (dans le sens 5’→3’) 5’ 2. Resynthétiser (activité polymérasique) une nouvelle chaîne avec les nucléotides dont un au moins est radioactifs présents dans le milieu d’incubation enzymatique Figure 64 : Nick Translation. b- Le multi-amorçage amorçage au hasard ou multirandom priming : L’ADN bicaténaire est dénaturé par chauffage à 100°C afin de séparer les deux brins, puis refroidi brutalement pour empêcher que les deux brins ne se réassociassent. Chacun des deux brins est hybridé à 25°C au hasard avec des petites amorces (6 nucléotides). Les séquences de ces hexanucléotides sont différentes. C’est une combinaison de 4 nucléotides parmis 6 positions différentes ; ce qui donne 1024 séquences possibles et il y aura certainement quelques hexanucléotides qui s’hybriderons avec les deux d’ADN. L’enzyme ADN polymérase I, grâce à son fragment de Klenow, assure la synthèse des deux brins complémentaires dans le sens 5’→3’ 5’→3’ en utilisant les nucléotides triphosphates (AT (ATP, CTP, TTP et GTP) dont un est marqué. Les brins d’ADN néosynthétisés sont alors marqués. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 65: Amorçage au hasard. c- Marquage des oligonucléotides A partir d’une extrémité 5’OH on peur ajouter un phosphate marqué à l’aide d’une kinase et de λ 32P ATP. Il faudra au préalable obtenir l’acide nucléique avec un 5’OH. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 66 : Marquage d’oligonucléotide synthétique. 6.5 Hybridation des acides nucléiques L'hybridation est une propriété fondamentale des acides nucléiques qui repose sur les règles de complémentarité. Il est possible d'apparier des brins d'ADN ou ARN avec des oligonucléotides qui reconnaissent spécifiquement des séquences sur les brins d'ADN de manière antiparallèle et complémentaire. Ces oligonucléotides sont appelés sondes nucléiques. Pour le cas de deux brins complémentaires de la même molécule d'ADN (brins homologues) on parle de renaturation (hybridation à 100%). Chaque 1% de non homologie diminue la température d'hybridation (Th) de 1°C. L'hybridation moléculaire est utilisée surtout dans la détection de l'homologie entre les molécules d'ADN de sources différentes. La complémentarité dépendra de de la concentration en ADN et du temps. Ces deux derniers paramètres sont importants pour la rencontre entre les deux brins. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 67: Hybridation des acides nucléiques. La Tm est estimée en utilisant plusieurs formules, cela dépend de la: - Longueur du fragment (nombres de nucléotides). - Composition du milieu - Mis-appariement - Le contenu en C+G La formule de Wallace permet de déduire la Th des petits oligonucléotides (Ex. Les amorces). Formule de Wallace: Tm = 4 (C+G) + 2(A+T) ; Th = Tm-5 Tm Pour les oligonucléotides avec N < 100 nucléotides on utilise la formule suivante en tenant compte la concentration du sel, les mésappariements et la concentration de formamide: Tm = 16.6log[Na+] + 0.41(%(C+G))+ 81.5-(675/N)-%mismatch 81.5 %mismatch- 0.65% de formamide Dans les conditions réactionnelles standards la Tm pour les longs séquences (>100): Tm = 69.3 + 0.41(%(C+G)) 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima La formule globale: Tm = 81.5 + 16.6log[sel] + 0.41[%(C+G)] - % mis-appariement – (500/N) – 0.65%(formamide). Facteurs influençant l'hybridation - La concentration de l'ADN et le temps d'hybridation - La température d'hybridation - La force ionique - La complexité des séquences 6.5.1 Types d’hybridation L'objectif de l'hybridation est la détection de la présence d'un acide nucléique d'une séquence donnée par l’utilisation d’un fragment d’ADN complémentaire = sonde. Cela peut avoir lieu en solution ou sur support solide (immobilisation de la cible sur une membrane[nitrocellulose, nylon], sur verre, colonies bactériennes, chromosomes, plage de lyse...etc.). a. Hybridation d’ADN sur support solide : Southern blot La procédure de ce type d'hybridation est résumée en sept étapes.On peut aussi révéler la présence des séquences spécifiques dans les ARN (Northern Blot) et des protéines (Western Blot) utilisant le même principe. 1– Extraction de l'ADN 2– Digestion enzymatique (par les enzymes de restriction) 3– Electrophorèse du produit de la digestion 4– Transfert sur membrane 5– Hybridation avec une sonde spécifique marquée. 6– Lavages 7– Révélation 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 58:Southern Blot. b. Hybridation in situ (HIS) On appelle hybridation in situ (HIS) l'utilisation de sondes d'acides nucléiques pour mettre en évidence et localiser, dans des cellules ou des tissus, des séquences d'acides nucléiques, complémentaires de la sonde par leurs bases. L'HIS est un outil incomparable pour étudier l'expression des gènes. Elle est très proche, dans son principe, des Southern et des Northern blots et repose, comme eux, sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique (ADN ou ARN) marquée ée avec une séquence complémentaire d'acides nucléiques que l'on cherche à identifier et à localiser. Mais les Southern et Northern blot se font sur des broyats de tissus, alors que l'HIS s'effectue sur une coupe histologique de tissu, apportant ainsi des informations précises sur la localisation des acides nucléiques étudiés. c. Hybridation sur chromosomes (FISH) La FISH (Fluorescence in Situ Hybridization ) repose sur la capacité d'hybridation de deux brins d'ADN complémentaires. La région à étudier (située sur un chromosome préalablement légèrement dénaturé par traitement chimique pour le débarrasser des protéines associées) est repérée grâce à une sonde oligonucléotidique complémentaire. Certains de ces 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima nucléotides de cette sonde sont couplés à une molécule antigénique reconnue par un anticorps fluorescent. En utilisant diverses sondes, greffées à des antigènes différents, on peut ainsi visualiser simultanément plusieurs séquences sur un ou plusieurs chromosomes. Technique permettant de déterminer la position d'un fragment d'ADN dans le génome ; le repérage se fait par rapport au bras du chromosome (p:bras court et q:bras long) et par rapport aux bandes (mises en évidence par la coloration Giemsa) du chromosome. d. Hybridation sur colonie de bactéries, sur plage de lyse Ce type d'hybridation permet la détection parmi un grand nombre de bactéries ou de phages recombinants (plage de lyse) celle ou celui qui contient le fragment d'ADN cible. La réalisation de cette technique passe par les étapes suivantes: - Culture pure sur boite de Petri (colonies ou plage de lyse) - Transfert sur membrane de nylon ou de nitrocellulose - Lyse alcaline des bactéries et dénaturation de l'ADN - Fixation par la chaleur ou les UV - Hybridation avec une sonde marquée - Lavage - Autoradiographie - Localisation des clones d'intérêt. e. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de l’ADN (RFLP) La technique RFLP repose sur la digestion d'un DNA cible par une ou plusieurs enzymes de restriction. Ces fragments de restriction obtenus sont ensuite séparés selon leur longueur, par électrophorèse sur gel d'agarose et les fragments séparés sont hybridés avec un DNA sonde. 10 Biologie Moléculaire et Génie génétique Dr. Nehal Fatima Figure 69 : La technique RFLP. 6.6.6 Réaction de Polymérisation en Chaîne "PCR" La synthèse et le séquençage d’ADN ont permis l’émergence d’une méthode d’amplification de l’ADN appelée PCR (Polymerase ( eaction), à partir d’un gène (ou Chain Reaction), fragment) spécifique, de grand quantité d’ADN sont obtenues in vitro vitro. L’ADN polymérase copiant jusqu'à un milliardd de fois cette région cible « quantité suffisante pour être révélée ». Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point