Análisis y Editando Genes de Plantas Transgénicas PDF

Análisis y Editando Genes de Plantas Transgénicas Prof. Agustín González Ruiz, PhD Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas Biotecnología de Plant...

Análisis y Editando Genes de Plantas Transgénicas Prof. Agustín González Ruiz, PhD Universidad Interamericana de Puerto Rico Recinto de Bayamón Departamento de Ciencias Naturales y Matemáticas Biotecnología de Plantas BIOL 6007  Descripción General del Análisis de Plantas Transgénicas Se pueden utilizar varias líneas de evidencia juntas para evaluar si las plantas son verdaderamente transgénicas y si el transgén de interés se expresa exitosamente. Las plantas originales provenientes de un experimento de transformación se denominan generación T0. Cuando las plantas T0 se cruzan o se auto polinizan, producen progenie T1, y así sucesivamente.  Análisis de Plantas Transgénicas Luego de que se producen las plantas transgénicas, es fundamental que se comprendan su composición genética, así como las características bioquímicas y fenotípicas de las nuevas plantas. Es importante confirmar que los transgenes están completamente integrados en el genoma y cuántas copias están presentes. Se emplean diversos análisis de DNA, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa (qPCR), el análisis de transferencia Southern (DNA) y la secuenciación del DNA para comprender la transgenicidad. También se espera que el DNA transgénico se herede en la progenie. Es importante caracterizar la expresión genética. A menudo se estima mediante análisis de transcripción por PCR de transcripción reversa (RT-PCR), qRT-PCR y análisis de transferencia Northern (RNA). En última instancia, queremos saber cuánto recombinante intacto se traduce a proteína, que luego se puede medir cuantitativamente utilizando ELISA, o semi- cuantitativamente con análisis de transferencia Western (proteína).  PCR para la Corroboración de Plantas Transgénicas Si las plantas sobreviven a la selección de antibióticos y expresan un gen informador, entonces se podría simplemente realizar una PCR en eventos T0 e ir directamente al análisis de la expresión génica y los ensayos posteriores. La técnica de PCR regular se realiza para amplificar el gen marcador o el DNA del gen de interés para evaluar si realmente está presente en la muestra. La ventaja de la PCR es que no necesita mucha muestra y es fácil aislar algunos nanogramos de DNA de muchas plantas para la PCR. La desventaja de la PCR es que no necesita mucha muestra y la contaminación del DNA objetivo puede dar un resultado falso positivo. Adicionalmente, si Agrobacterium no se purga de la planta de interés después del cultivo junto con antibióticos, puede dar un resultado falso positivo en transgénicos putativos T0.  PCR para la Corroboración de Plantas Transgénicas En algunas especies y sistemas de selección, Agrobacterium se mata por completo; pero en otros sistemas. puede sobrevivir para atormentar a los investigadores y darles falsas esperanzas. En la PCR, si el transgénico da una banda en un gel y el control no transgénico (negativo) no muestra una banda, entonces la conclusión general es que el supuesto transgénico es realmente transgénico, pero los investigadores generalmente desean mayor garantía. Una manera de obtener esta mayor garantía es analizar la contaminación por Agrobacterium. Además de agregar cebadores de PCR a la reacción para amplificar el transgén, se pueden incluir cebadores de PCR que amplificarían un gen específico de Agrobacterium si está presente. La presencia de la banda transgénica en el gel, y la ausencia de una banda de Agrobacterium, es una evidencia más fuerte de la transgenicidad. Pero, en los T0, incluso este ensayo de PCR no informa sobre los números de copias del transgén. Polymerase Chain Reaction Electroforesis 7  Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) También conocida como reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), es una técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Monitorea la amplificación de una molécula de DNA dirigida durante la PCR (es decir, en tiempo real), no al final, como en la PCR convencional en donde se debe correr una electroforesis con la muestra para verificar la amplificación del gen de interés. Dos métodos comunes para la detección de productos de amplificación en el PCR a tiempo real son: 1. colorantes fluorescentes no específicos que se intercalan con cualquier dsDNA. 2. sondas de DNA específicas de secuencia que consisten en oligonucleótidos marcados con un indicador fluorescente, que permite la detección solo después de la hibridación de la sonda con su secuencia complementaria. Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) Los pasos para la reacción de RT-PCR: 1. Se utiliza un fragmento de oligo (T) como cebador para unirse a la cola poli (A) de 3’ de cada mRNA. 2. La transcriptasa reversa usa el mRNA como templado para sintetizar cadenas de cDNA. 3. El híbrido de RNA-cDNA resultante se separa aumentando la temperatura. 4. Un cebador específico del gen se une a su secuencia complementaria. 5. La DNA polimerasa produce la hebra de DNA complementaria, a partir del sitio de unión del cebador. 6. Las hebras se separan aumentando la temperatura y el ciclo de PCR es repetido. 7. La cantidad de copias de DNA se puede visualizar mediante electroforesis. 11 Transferencia Southern (Blot) Transferencia Northern (Blot) Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 14 Preparación de Muestras para Western Existen numerosos métodos de alteración celular para preparar la muestra para la transferencia Western. Normalmente, cuando se trata de células de mamíferos, se puede eliminar la membrana celular mediante lisis con detergente, lisis por congelación / descongelación, homogeneización mecánica o sonicación. Luego de la extracción, la muestra de proteína se hierve en una solución que contiene colorante de seguimiento (bromofenol azul), agente reductor de disulfuro (beta-mercaptoetanol) y detergente (SDS). El calor desnaturaliza la proteína, el beta-mercaptoetanol evita la reformación de los enlaces disulfuro, y el SDS cubre a la proteína con una carga negativa. 15 Transferencia Western (Blot) El “buffer” de transferencia para transferencias Western Blot, llamado Towbin buffer, es Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8.3, generalmente con metanol al 20% (vol / vol). En ocasiones se agrega SDS a este buffer, generalmente en el rango de 0.1 a 0.25%. Estructura de los Anticuerpos 17 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) es un ensayo bioquímico que utiliza anticuerpos y cambios de color mediados por enzimas para detectar la presencia de antígenos (proteínas, péptidos, hormonas) o anticuerpos en una muestra determinada. La técnica ELISA tiene un alto grado de sensibilidad y especificidad. Esto se debe a que utiliza reacciones entre anticuerpos y antígenos altamente específicos. 18  Análisis de datos ELISA El proceso de análisis de datos de ELISA es un proceso de dos pasos: 1. Preparación y análisis de un conjunto de datos / estándar de muestras conocidas. Esta serie de datos de absorbancia conocidos, que representan las concentraciones, se utilizan para crear un curva estándar. 2. Preparación de los datos de las muestras "desconocidas". Para cada medición obtenida, la curva estándar se utiliza para encontrar la concentración de sustancia correspondiente. El análisis de datos se realiza utilizando una herramienta bioinformática como Labware LIMS. Eso implica el cálculo de una relación molar de analito en muestras y controles. Que no es sólo es cuestión de mirar los resultados de la curva y decir sí o no. La validación de datos es realizado para garantizar la integridad de sus resultados. 19 Tipos de ELISA 20 Tecnología de Silenciamiento Genético El silenciamiento genético a menudo se considera similar a los “knockdown” de genes. Cuando los genes se silencian, su expresión se reduce. Por el contrario, cuando los genes son eliminados (knockdown), se borran por completo del genoma del organismo y, por lo tanto, no tienen expresión. El silenciamiento de genes se considera un mecanismo de eliminación de genes, ya que los métodos utilizados para silenciar genes, como RNAi, CRISPR/Cas9 o siRNA, generalmente reducen la expresión de un gen en al menos un 70%, pero no lo eliminan por completo.  Tecnología de Silenciamiento Genético Los métodos que usan el silenciamiento génico a menudo se consideran mejores que los genes inactivados, ya que permiten estudiar genes esenciales que son necesarios para que los modelos animales sobrevivan la alteración genética. Además, proporcionan una visión más completa sobre el desarrollo de enfermedades, ya que las enfermedades generalmente se asocian con genes que tienen una expresión reducida que ocurre en el curso de la vida de un organismo.  Técnicas de Silenciamiento Genético Transcripcional 1. Silenciamiento de transposones 2. Metilación de DNA dirigida por RNA 3. Impronta genómica Post-transcripcional 1. Interferencia de RNA (RNAi) 2. Silenciamiento de RNA 3. Terminación “Nonsense” Meiótico 1. Transfección 2. Silenciamiento meiótico de DNA no apareado  Silenciamiento de Transposones Es un producto de modificaciones de histonas que impiden la transcripción de un área particular de DNA. El silenciamiento transcripcional de los transposones es crucial para el mantenimiento de un genoma. El salto de los transposones genera inestabilidad genómica. Metilación de DNA Dirigida por RNA Los elementos transposables constituyen una proporción sustancial de la mayoría de los genomas de plantas. Debido a que son potencialmente altamente mutagénicos, los transposones están controlados por un conjunto de mecanismos cuya función es reconocerlos y silenciarlos epigenéticamente. Metilación de DNA Dirigida por RNA Los RNA desencadenantes pueden inducir la metilación del DNA a través de siRNA producidos mediante el procesamiento de estas transcripciones. Una vez activada, la histona H3K9 y la metilación del DNA tienen la función de promover la producción de RNA aberrante, tal vez por la RNA polimerasa IVa (PolIVa). La transcripción aberrante se transporta a un centro de procesamiento en el cuerpo de Cajal dentro del nucleolo, donde se hace de doble hebra por RNA Polimerasa dependiente de RNA 2 (RDR2). El dsRNA es procesado por DICER-LIKE 3 (DCL3) en pequeños RNA de interferencia (siRNA), que se incorporan a un complejo silenciador inducido por RNA (RISC) en asociación con Argonauta 4 (AGO4). Este complejo se dirige nuevamente al DNA en asociación con PolIVb, donde promueve modificaciones tanto en la histona como en el DNA. Estas modificaciones a su vez promueven la producción de RNA aberrante. Impronta Genómica (Genomic Imprinting) La impronta genómica es un fenómeno epigenético que hace que los genes se expresen de una manera específica del padre de origen. Descubrimiento de la Interferencia de RNA Silenciamiento génico por dsRNA Publicaciones Utilizando RNAi Mecanismo de Acción de los RNAi Mecanismo de Acción de los RNAi  Silenciamiento de Genes El silenciamiento de un gen endógeno debido a la presencia de un transgen o virus homólogo. La co-supresión puede ocurrir a nivel transcripcional o postranscripcional.  Efectos de la expresión de ARN sentido y antisentido de CHS en la pigmentación de flores en Petunia hybrida Las plantas de petunia (Petunia hybrida), diseñadas para albergar copias transgénicas adicionales del gen de pigmentación floral, chalcone sintasa (CHS), proporcionaron información adicional sobre los mecanismos de silenciamiento génico dependientes de la homología en las plantas. Estas plantas fueron modificadas para sobreexpresar CHS con el objetivo de intensificar la coloración púrpura de las flores. Sin embargo, las flores de estas plantas modificadas expresaron una gama dramática de pigmentación, que incluye púrpura intenso, patrones de púrpura y blanco, y flores que eran completamente blancas. La disección molecular de estas poblaciones transformadas reveló que en algunas líneas de plantas tanto las formas introducidas como las endógenas del gen CHS fueron Petunia hybrida "desactivadas" o silenciadas en diferentes grados, en un fenómeno que los autores denominaron co-supresión. Efectos de la expresión de ARN sentido y antisentido de CHS en la pigmentación de flores en Petunia hybrida Diseño de un Vector de RNAi Diseño de un Vector de RNAi Diseño de un Vector de RNAi  RNAi en Plantas Se han identificado 872 miRNA, pertenecientes a 42 familias, en 71 especies de plantas. Las plantas tienen sistemas de RNAi sistémicos que mueven las moléculas de RNAi entre las células vecinas a través de plasmodesmos. Aplicaciones de RNAi en Plantas Aplicaciones de RNAi en Plantas Aplicaciones de RNAi en Plantas  MicroRNAs Son moléculas de RNA cortas (20-25nt) traducido como molécula de RNA precursor. Regulación génica postranscripcional. mRNA objetivo para escisión o represión traduccional. Los miRNA son pequeñas guías endógenas de RNA que reprimen la expresión de genes. Difieren de siRNA en biogénesis no en funciones, aunque los mecanismos pueden ser diferentes. Escisión de mRNA cuando la complementariedad es extensa, reprimen la traducción cuando no. Muchos miRNA están integrados en intrones de genes que codifican proteínas y se transcriben junto con genes del huésped. miRNA puede expresarse de manera específica para el desarrollo del tejido.  Ventajas de Utilizar miRNAs en Plantas Simplifica la regulación a la disminución de la expresión génica. Mayor efectividad y sensibilidad a menor concentración. Alta especificidad. Se puede realizar simultáneamente experimentos en cualquier tipo de célula de interés. Puede ser etiquetado. Se puede considerar que las aplicaciones transgénicas de silenciamiento de RNA aprovechan los mecanismos naturales de regulación genética en el cultivo. Elimina los riesgos hipotéticos asociados con la presencia de proteínas nuevas o extrañas en las plantas de cultivo. Los efectos del silenciamiento de RNA son genéticamente dominantes y, como resultado, pueden introducirse fácilmente en cultivos híbridos. Editando Genes Utilizando CRISPR-Cas9 CRISPR significa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente intercaladas y proteína asociada a Cas9. Un sistema CRISPR-Cas9 básico consiste en una endonucleasa Cas9 y un pequeño RNA que guía a Cas9 al DNA objetivo.  Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Intercaladas Comparación de Publicaciones Utilizando CRISPR y RNAi  Sistema CRISPR-Cas9 CRISPR: Repetición Palendrómica Corta Agrupada Regularmente Interspaciada, una región en genomas bacterianos utilizada en la defensa patogénica. Cas: Proteína asociada a CRISPR, la enzima activa nucleasa de Cas9. Secuencia objetivo: los 20 nucleótidos que se incorporan al mRNA más la secuencia PAM, la secuencia objetivo es el DNA genómico. PAM: Protospacer Adarest Motif, secuencia requerida que debe seguir inmediatamente la secuencia de reconocimiento de gRNA.  CRISPR Las secuencias contienen fragmentos de DNA de virus que han atacado la bacteria. Estos fragmentos son utilizados por la bacteria para detectar y destruir el DNA de más ataques de virus similares. Una repetición palindrómica, secuencia de nucleótidos que son iguales en ambas direcciones. Cada repetición es seguida por un breve segmento de DNA espaciador de anteriores exposiciones a DNA extraño. Pequeños grupos de genes de Cas se encuentran junto a secuencias CRISPR. CRISPR / Cas es un sistema inmune procarionte que confiere resistencia a elementos genéticos extraños como los presente dentro de plásmidos y fagos. Proporciona una forma de inmunidad adquirida.  Cas-9 (CRISPR associated protein 9) Es un DNA guiado por RNA endonucleasas. Enzima asociada con CRISPR que juega un papel en la Adaptación del sistema de inmunidad, encontrado en bacterias Streptococcus pyogenes. Involucrado en el mecanismo CRISPR Tipo II Cas-9 (CRISPR associated protein 9) La proteína Cas9 tiene seis dominios: 1. REC I - responsable de la unión de la guía de RNA. 2. REC II - aún no se ha descifrado su función exacta. 3. Bridge Helix - (rico en arginina) es crucial para iniciar actividad de escisión tras la unión del DNA objetivo. 4. PAM - el dominio que interactúa confiere PAM especificidad; responsable de iniciar la unión a DNA objetivo. 5. Los dominios HNH y 6. RuvC son dominios de nucleasas que cortan ssDNA. Son altamente homólogos a los dominios HNH y RuvC encontrados en otras proteínas.  3 Tipos de Nucleasas Cas9 Cas9 de tipo salvaje (WT Cas9) puede romper un sitio específico del dsDNA, lo que resulta en la ruptura de doble cadena (DSB) y activación de la maquinaria de reparación. Se puede emplear para: 1. inserciones y/o eliminaciones. 2. mutaciones de reemplazo precisas. Cas9D10A Corta solo una hebra de DNA. Solo presenta actividad de nickasa. Especificidad objetivo cuando los loci son objetivo de emparejado complejos Cas9 diseñado para generar mellas (nicks) de DNA adyacente. dCas9 (Deficient Cas9) Nucleasa deficiente Cas9. Inactiva la actividad de escisión, pero no evita la unión del DNA. Herramienta de silenciamiento o activación genética. 3 Tipos de Nucleasas Cas9 Sistema CRISPR-Cas9 Las secuencias CRISPR se observaron por primera vez en bacterias y luego se identificaron en Arqueas. Los investigadores descubrieron que el sistema CRISPR-Cas9 sirve una defensa inmune adaptativa contra los virus invasores. Muchas bacterias y la mayoría de las arqueas capturan secuencias cortas del DNA viral para crear una biblioteca de segmentos de DNA del virus, o matrices CRISPR. Cuando los procariotas se vuelven a exponer al mismo virus o clase de virus, se utilizan matrices CRISPR para transcribir pequeños segmentos de RNA que ayudan a reconocer los invasores virales y, posteriormente, destruir el DNA viral con Cas9 o una endonucleasa similar.  Sistema CRISPR-Cas9 CRISPR-Cas9 se usa comúnmente en el laboratorio para eliminar el DNA e insertar una nueva secuencia de DNA en su lugar. Para lograr esto, los investigadores primero deben crear un pequeño fragmento de RNA llamado RNA guía, con una secuencia corta llamada secuencia guía que se une a una secuencia objetivo específica en el DNA genómico. La guía de RNA también puede asociarse con Cas9 (u otras endonucleasas como Cpf1). El RNA guía y la proteína Cas9 se administran a una célula de interés donde el RNA guía identifica la secuencia de DNA objetivo y Cas9 la divide. La maquinaria de la célula repara las hebras rotas insertando o eliminando nucleótidos aleatorios, dejando inactivo el gen objetivo. Alternativamente, se puede introducir una secuencia de DNA personalizada en la célula junto con el RNA guía y Cas9, que sirve como plantilla para la maquinaria de reparación y reemplaza la secuencia extirpada. Esta es una forma muy efectiva para eliminar un gen y estudiar sus efectos o reemplazar un gen mutado con una copia normal con la esperanza de curar una enfermedad. Tipos de CRISPRs  Editando Genes con ZFN y TALEN Los sistemas activadores de La nucleasa FokI como el transcripción tipo nucleasa efectora dominio de escisión de DNA y (TALEN) son una fusión de TALE se une al DNA mediante derivados de Xanthomonas spp. a una dedos de zinc (zinc-fingers) endonucleasa de restricción FokI. Cys2His2 diseñados. Al modificar las repeticiones de Los dedos de zinc específicos aminoácidos en los TALE, los usuarios reconocen diferentes tripletes pueden personalizar los sistemas de nucleótidos y dimerizan la TALEN para vincular específicamente el Nucleasa Fok (inducen DSB). DNA del DNA e inducir los ataques del DNA. Comparación Entre ZFN, TALEN y CRISPR-Cas9  Aplicaciones y Ventajas del Sistema CRISPR-Cas9 Aplicaciones: 1. KO de genes - Reemplazo de genes (secuencia de DNA quimérico). 2. Knock-in de fragmentos de DNA grandes (Ej. añadir GFP). 3. Mutagénesis dirigida para reproducir mutaciones puntuales o para repararlas. 4. Activación o represión de la transcripción génica. Ventajas: 1. Expresión regulada endógenamente (sin sobreexpresión) KO de genes es bastante fácil (aproximadamente 80% de eficiencia) sin expresión residual. 2. La destrucción de grandes fragmentos de DNA es más complicado. 3. No es necesario estabilizar la nueva línea celular.