Resumen de Estructura y Metabolismo de Ácidos Nucleicos PDF

Laura Mohedano Redondo TEMA 2: ESTRUCTURA Y METABOLISMO DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Dogma central de la biología molecular Fue propuesto por Crick y establece una relación biológica entre...

Laura Mohedano Redondo TEMA 2: ESTRUCTURA Y METABOLISMO DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Dogma central de la biología molecular Fue propuesto por Crick y establece una relación biológica entre ADN, ARN y proteínas. La información fluye de un nivel más complejo (ADN) a uno más simple (ARN) y después a las proteínas. El flujo de información en las células es constante, por lo que al conjunto de transcripción-traducción se le llamará proceso de expresión génica. Moléculas implicadas: - ADN: Almacena y transmite información genética. Se encuentra en eucariotas en el núcleo (sobretodo) y en las mitocondrias. - ARNm: Transfiere el mensaje genético del núcleo al citoplasma. - Proteínas: Son el producto final. Implicadas en la estructura celular aparte de en los procesos químicos de la célula. Procesos: 1) Replicación: Ocurre en el núcleo. Es el proceso mediante el cual se obtienen dos moléculas hijas idénticas a la parental. Es mediada por las ADN polimerasas. 2) Transcripción: Ocurre en el núcleo. A partir de una parte del ADN se obtiene ARN. Mediada por las ARN polimerasas. 3) Traducción: Tiene lugar en el citoplasma. Consiste en la obtención de aminoácidos (que darán lugar a la proteína) a partir del mARN sintetizado previamente. Componentes y estructuras de los ácidos nucleicos. Formados por nucleótidos, que están formado por un Pi y un nucleósido. A su vez, los nucleósidos están formados por: Pentosa: Ribosa (RNA) o desoxirribosa (DNA). La diferencia se encuentra en el grupo hidroxilo del C2, que en el caso de la desoxirribosa solo hay un H. El ADN almacena información genética y el ARN no, puesto que el grupo OH es más estable. En la posición C5, se une el fosfato inorgánico. En C1 se une a la base nitrogenada, con el C9 de la base. Bases nitrogenadas: Purinas (A,G) y Pirimidinas (C, T, U) => Son apolares o hidrófobas pero presentan dipolos que son muy importantes para la formación de enlaces de hidrógeno (débiles) entre ellas. Formación de los elementos de los AN: 1- Nucleósidos: Se da un enlace N-glucosídico (covalente) en C1 del azúcar y el C9 en purinas (enlace 1-9) y el C1 en pirimidinas (1-1). Son cadenas homogéneas al seguir un patrón establecido. 2- Nucleótidos: El fosfato se une por enlace fosfoester (covalente) en el C5. 3- Polímeros de nucleótidos: Los nucleótidos se unen por enlaces fosfodiéster en dirección 5´-3´ => 5’ del primer nucleótido que no comparte fosfato y 3’ del ultimo nucleótido que Laura Mohedano Redondo comparte fosfato. ¡! Siempre el grupo fosfato C5, al C3 de la siguiente pentosa. Las cadenas de nucleótidos obtienen direccionalidad Características de los AN: - HIDROFILIA: El ADN y ARN son cadenas polinucleótidas solubles en agua debido a los grupos fosfato, aunque las ribosas también tienen carácter hidrofílico (-OH). Forman enlaces de hidrógeno con el agua. - CARÁCTER ÁCIDO Y CARGA NEGATIVA (PH FISIOLÓGICO): Los nucleótidos tienen carácter ácido debido al Pi, ya que los demás elementos (azúcar y BN) presentan carácter neutro. El plegamiento del ADN se debe gracias a esta carga negativa que le permite la interacción iónica con las histonas (ricas en Arg y Lys). - RIGIDEZ: Debido mayoritariamente al enlace fosfodiéster. - ABSORCIÓN DE LA LUZ ULTRAVIOLETA: Hay una absorción de longitud de onda igual para todas las BN, siendo esto útil en laboratorio para diferenciar los ácidos nucleicos de las proteínas, ya que los ácidos tienen el pico de absorción en 260nm y las proteínas en 280nm. Gracias a la absorción podemos saber cuánto ADN hay. - VISCOSIDAD - LONGITUD/DIÁMETRO: El ADN tiene una doble hélice que le otorga la capacidad de formar unas cadenas muy largas y finas sin perder estructura, por lo que cuando lo condensamos en grandes cantidades será viscoso al tacto. (Molécula larga pero estrecha, con capacidad de crear enlaces de hidrógeno). El ADN es más grande que el ARN. - ESTABILIDAD QUÍMICA: o En condiciones de acidez resisten lo mismo, si es acidez fuerte se rompe todo, pero si es débil se rompen las purinas. o En un medio básico los enlaces fosfodiéster del ARN se rompen antes debido a su grupo –OH. o Es decir, el grupo hidroxilo del ADN aporta estabilidad, por eso almacena información genética. o Resistencia a temperaturas bastante heterogéneas. ADN: Funciones: 1- Portar la información genética. 2- Programar en el tiempo y especio la biosíntesis ordenada de los componentes de la célula, dependiendo de los cambios que sufra el ADN se determinarán los distintos proceso. Esto va a determinar de la producción de proteínas, de si la célula se divide… 3- Definir la individualidad de un organismo. No es solo diferente la información que lleva, sino la forma de expresar esa información. *Participa en la replicación, que nos permite una división celular correcta, y sufre una transcripción mediante la cual formamos ARN y con el que se formarán las distintas proteínas. Características: Þ Desoxirribosa Þ A,G,C y T Þ Gran tamaño (lo que da la viscosidad) Þ Localizada: Núcleo, mitocondria y cloroplastos (¡! Hay muchas mutaciones en el ADN mitocondrial) Laura Mohedano Redondo Þ Molécula bicatenaria Þ Doble hélice dextrógira Estructura: Fue descubierta por Watson y Crick basándose en: (lo de negrita) o Molécula Bicatenaria o Carácter hidrofílico – hidrofóbico -> B. Nitrogenadas hacia el interior o Cadenas antiparalelas Mediante los análisis químicos obtenemos las REGLAS DE CHARGAFF, las cuales se cumplen en cualquier molécula bicatenaria de ADN: § A-T y C-G en proporción 1:1 § Purinas-Pirimidinas en proporción 1:1 § Aminobases (A+C) – Oxobases (T + G) en proporción 1:1 CONSECUENCIAS. Molécula bicatenaria – BN hacia dentro – Antiparalela - Única posibilidad de unión es A:T y C:G CONCEPTO COMPLEMENTARIEDAD DE LAS BASES NITROGENADAS Por otro lado, debemos saber: - Componentes hidrofílicos: Desoxirribosa y Pi, los grupos fosfato hacia el exterior de la estructura - Componentes hidrofóbicos: BN, hacia el interior Por último, mediante la difracción de rayos X podemos saber que el ADN tiene repetición periódica de estructuras y presenta una estructura en aspa -> estructura en hélice. “Estructura helicoidal con doble periocidad a lo largo del eje” PERIOCIDAD: Cadenas antiparalelas. Se podía deducir que los grupos fosfato se encontraban hacia el exterior de la estructura. Las cadenas antiparalelas es la única posibilidad estructural. ENLACES DE HIDRÓGENO: Están presentes entre dos BN (A-T, C-G). Son perpendiculares al eje y presentan siempre la misma distancia. *La desnaturalización del DNA implica la ruptura de los puentes de hidrógeno pero NO la de los enlaces fuertes covalentes (N-glicosílico, éster...). Implica una perdida de estructuras 3a y 2a dejando la 1a. **El DNA es capaz de renaturalizarse y ser funcional. Sentido biológico de la complementariedad: A. La complementariedad de las bases permite al organismo no cometer errores en la replicación. B. Que las bases estén en el interior de la molécula supone una protección de estas para que no formen otros enlaces, de ataques químicos. C. La duplicación genética de las 2 hebras facilita la corrección de errores tras la replicación. En la doble hélice hay un momento que al dar la vuelta se genera un hueco -> surco mayor è Permite la interacción del ADN con factores de transcripción. Al seguir girando en la hélice se forma otro hueco más pequeño -> surco menor. Laura Mohedano Redondo B-ADN: Estructura de doble cadena antiparalela y helicoidal con doble periodicidad. Doble hélice dextrógira en la que repiten pares de bases. Puentes de hidrógeno: perpendiculares al eje y paralelos entre ellos N- glucosídicos ANTI. Otras conformaciones del ADN: CRUCIFORME U HORQUILLA: Ocurre en regiones palindrómicas (se lee igual las hebra leída de derecha a izquierda que de izquierda a derecha) con un eje de simetría binaria. Un eje de simetría binaria= a partir de un punto de la hebra, son complementarios entre ellos. Puede ser de 2 tipos: - Puntual: Las bases son complementarias entre ellas según te alejas del eje de simetría a derecha e izquierda. - Discontinuo: Hay una secuencia aleatoria que forma el eje de simetría. Laura Mohedano Redondo --> PALÍNDROMO o La secuencia de dos hebras es la misma o Hay una complementariedad interna de bases (misma hebra) o Se adopta una estructura cruciforme, si el eje es continuo o puntual se forman cruciformes sin bucle y si el eje es discontinuo se forman cruciformes con bucle. o Las señales de reconocimiento son: factores de transcripción y enzima de restricción. o El ADN monocatenario y el ARN dan lugar a horquillas (también pueden tener o no bucles) H-ADN (ADN- TRIPLEX): - Es una triple hélice formada en regiones de DNA con una alta concentración de C y T. - 3 hebras de DNA se unen con puentes de hidrógeno de Hoogsteen – funcionalmente son idénticos a los normales. - La 4º hebra forma un bucle. INCISO: Todos los enlaces de hidrógeno de Hoogsteen son todos aquellos que no pertenecen a la molécula de ADN que establecieron Watson y Crick, sino serían enlaces de hidrógeno de Watson y Crick. La 4º hebra forma un bucle. Función: Regulación de la expresión génica – represión de la transcripción. Se encuentras en proteínas que regulan la expresión génica. G4-ADN: - Región del ADN rico en secuencias CG. - Existen 4G de una misma hebra que se unen mediante puentes de hidrógeno de Hoogsteen. (Forman una especie de cuadrado) - Las estructuras que obtenemos son muy estables. Localización: Cerca de regiones promotoras y en los telómeros de los cromosomas. Función: Regular la meiosis y los procesos de recombinación. Propiedades del ADN: ESTABILIDAD: - Unión entre BN por los enlaces de hidrógeno -> mantienen unidas las hebras. - Apilamiento de las bases mediante las fuerzas de van der Waals -> Ocurren interacciones inespecíficas entre los anillos. Es una interacción inespecífica entre BN de misma hebra. Las bases quedan hacia el interior (protección de la secuencia). - Interacciones con el agua “efecto hidrófobo” -> los fosfatos y azucares interaccionan con el medio acuoso y hay poca repulsión entre los fosfatos ACCESIBILIDAD: - Surco menor y mayor: Permite el acceso de moléculas externas a las BN y la interacción con proteínas que reconocen las bases. o Antiparalelismo y puentes de hidrógeno o Moléculas externas, acceso a las bases o Interacción proteínas- reconocimiento de bases - Debido a la regularidad de la disposición, las enzimas siempre actúan de la misma forma. Los procesos de replicación son sencillos y las reparaciones también (gracias también a la hebra complementaria). o Proceso de replicación sencillo y fiel (apertura y molde) o Reparación de mutaciones y daños (detección y hebra continua) Laura Mohedano Redondo - Protección de la información genética o porque las BN están hacia el interior. --> Función: El DNA es la molécula idónea para ser la molécula portadora de la información genética Laura Mohedano Redondo NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE ORDEN SUPERIOR DEL ADN: Tamaño: El ADN es una molécula extremadamente extensa y tiene que caber en un espacio relativamente pequeño, que es el núcleo celular. El genoma humano si se dispusiese en doble hélice sería demasiado largo y ocuparía demasiado espacio, es por eso por lo que el ADN se pliega y se enrolla para reducir el espacio que ocupa. El ADN presenta distintos niveles de organización según el momento del ciclo celular en el que se encuentre. Condensación: Þ SUPERENROLLAMIENTO: Se enrolla sobre sí mismo gracias a las topoisomerasas, haciendo que por tanto la molécula pierda tamaño longitudinalmente, y creando una tensión negativa, que tenderá al superenrollamiento y tenderá a una forma más estable. Þ EMPAQUETAMIENTO: Plegamiento del ADN a través de la interacción con proteínas. Este proceso se llama empaquetamiento y supone un proceso de condensación. Tipos de proteínas: - Histonas: H1, H2A, H2B, H3 y H4. Se colocan entre las hebras del ADN. - No histónicas: Realizan la misma función que las anteriores, pero son otras proteínas. 1- Doble hélice: Fase G1 –> S se descondensa. Esta disposición permite la transcripción y la replicación. 2- Fibra de 10 nm, collar de cuentas o estructura nucleosomal: Se empaqueta el ADN utilizando histonas. Las histonas formarán un octámero compuesto por 2H2A, 2H2B, 2H3 y 2H4. - El DNA interacciona con sus cargas negativas con las cargas positivas de las histonas - La histona H1 participa en este proceso “sellando” la unión del ADN a las otras histonas. - El ADN ocupará 6 veces menos espacio en esta forma. - Cada vuelta de ADN al octámero está compuesta de unos 200 pb. 3- Fibra de 30 nm o solenoide: Se produce un superenrollamiento de la estructura anterior formando hexágonos (6 nucleosomas por vuelta) de collares de cuentas con las H1 orientadas siempre hacia el eje de la estructura. El ADN en esta forma es 40 veces más pequeño que en la original, aunque su diámetro aumenta. - El diámetro es de 30nm. - El eje central es el alineamiento de H1 4- Eucromatina: Se produce un superenrollamiento del solenoide gracias a un esqueleto de proteínas no histónicas. La tensión negativa no lo obtenemos por un exceso de giro, sino porque el solenoide interaccciona por distintos puntos con una placa de proteínas básicas. El solenoide presenta sitios de unión a este esqueleto proteico en diferentes partes, y para adaptarse a estas uniones se superenrolla y forma bucles. - Parece que cada bucle forma una unidad de transcripción (gen o conjunto de genes que se transcriben en las mismas condiciones). Es decir, los genes para las proteínas que participan en un solo proceso están presente en un solo asa - A estas alturas el ADN es 600 veces más pequeño. 5- Heterocromatina: En este estado NO ocurre la transcripción. Vuelve a haber un superenrollamiento con proteínas no histonas y el ADN es unas 50.000 veces más pequeño. Se forma por la condensación de la eucromatina. Por la condensación de la hetercromatina se forma el cromosoma metafásico. Laura Mohedano Redondo 6- Cromosoma metafásico: Se forma por un superenrollamiento de la heterocromatina. Laura Mohedano Redondo ADN MITOCONDRIAL: o Presenta un único cromosoma que se repite varias veces y suele tener un punto de unión con la MMI o Hay desde 200 hasta 2000 copias del mismo CR por célula – dentro de cada mitocondria unas 10 copias. o El ADN que contienen estos CR es bicatenario circular. o No posee intrones – genes unidos uno detrás del otro: se transcribe todo, no hay splicing alternativo. o No repetitivo y codificante (93%) o Posee 37 genes, de los cuales: 2 rARN, 22 tARN y 13 proteínas implicadas en la cadena respiratoria. ARN Es la molécula intermediaria de la expresión genética (paso intermedio entre ADN y proteínas). Funciones: 1. Transmitir la información genética § mARN: desde núcleo al citoplasma. § tARN: codones del mARN formen proteínas. 2. Soporte estructural de orgánulos: rRNA – Ribosomas. 3. Regulación como: miRNA y siRNA (ARN interferente), ribointerruptores. 4. Actividad enzimática: Ribozimas – moduladoras post-traduccionales. Características: - Azúcar: Ribosa - BN: A, G, C y U. - Tienen menor tamaño que el ADN, pero los tamaños del ARN son bastante más variables. - Molécula monocatenario y lineal. A veces aparece en el ARN el llamado apareamiento intercatenario, que es similar a lo que vimos del ADN en forma de cruz -> formación de una estructura secundaria. - Se localiza en núcleo o citoplasma - No sigue las leyes de Chargaff porque no es bicatenario. Tipos de ARN: - MicroRNA (miRNA) - RNA pequeño de interferencia o RNA de silenciamiento (siRNA) - RNA pequeño nuclear (snRNA) - RNA citoplasmático pequeño (scRNA) - Ribointerruptores - Ribozimas. - RNA orgánulos (mitocondria y cloroplastos mARN: Se forma en el núcleo, pero actúa en el citoplasma - transportar la información genética entre estos 2 puntos. Es siempre una estructura lineal, por lo que carece de estructura secundaria. *La característica común de este ARN es que siempre tiene: 5´ CAP + PoliA 3´ Entre el ADN y el mARN hay un ARN intermedio, el hmARN (sin procesar). tARN: En el citoplasma. Activa y posiciona aminoácidos en la transcripción para que formen parte de la cadena polipeptídica. Su forma activa es su estructura de L invertida. Tiene estructuras secundaria en forma de trébol, con las siguientes partes: - Extremo 3´: Donde se produce la unión de aminoácidos - Brazo II -> Anticodón: Interacciona con el mARN y está compuesto por 3 nucleótidos. Laura Mohedano Redondo - Brazos I: Ribotimidina + Pseudouridina. - Brazo III: Dihidrouridina. - Brazo IV: 3 a 5 nucleótidos NO emparejados. rARN: Es el encargado de generar los ribosomas (unión del rARN con proteínas), que son los que aportan soporte estructural a la traducción. Los ribosomas formados por 2 subunidades una 40s y otra 60s en eucariotas. DNA RNA COMPOSICIÓN Desoxirribosa Ribosa (Ribosas, Bases Nitrogenadas) A, G, C, T A, G, C, U ESTRUCTURAS Doble hebra Hebra sencilla (Hebras, Estructura) Doble hélice* Lineal ** FUNCIONES Almacenar Expresión génica Conservar Regulación Transmitir Enzimas Principalmente doble hélice , además, Z- DNA, H- DNA, 4G- DNA, cruciformes Posibilidad de formar doble hélice por complementariedad de bases intracatenaria Laura Mohedano Redondo TEMA 3: REPLICACIÓN DEL ADN INTRODUCCIÓN La replicación es el proceso mediante el cual se originan 2 moléculas de ADN hijas a partir de una parental. Las células hijas tendrán como objetivo pasar la información genética de generación en generación. Ocurre en el núcleo durante la fase S del ciclo celular, esta fase tiene asociada la meiosis y la mitosis. Durante la replicación podemos encontrar procesos asociados: mutaciones, recombinaciones (meiosis) y reparaciones. *Una vez que ha comenzado el proceso de replicación y por consiguiente la división de la célula y la duplicación del genoma, siempre han de acabar estos procesos, no pueden quedarse a medias. CARACTERÍSTICAS § Carácter semiconservativo. Cada hebra progenitora sirve de molde para la síntesis de su hebra complementaria. ADN hijo está compuesto por 1 hebra parental y 1 de nueva síntesis. Esto lo descubrieron Meselson y Stahl, mediante la marcación de nucleótidos con nitrógeno radiactivo. o Conservativa: la doble hélice original permanece y se origina una doble hélice completamente nueva. o Dispersa: las cadenas de las moléculas hijas de ADN tienen fragmentos de la molécula madre y fragmentos nuevos § El inicio es multifocal: Hay distintos focos de origen de la replicación para acelerar el proceso. Esto es característico de eucariotas. Existen muchos orígenes concretos para su inicio. Sin embargo, es un inicio no autoiniciador porque la polimerasa necesita un cebador. § NO autoiniciadora: Se vale de los primers o cebadores para empezar el proceso à Enzima reconoce el extremo 3’-OH libre. § Síntesis es simultánea, secuencial y bidireccional - Simultanea: Una vez abierta la hélice se sintetiza en ambas hebras a la vez de forma independiente. - Secuencia: Se hace NT a NT (de uno en uno) - Bidireccional: Síntesis hacia los dos lados debido al antiparalelismo de las hebras. § Síntesis es semidiscontinua: en dirección 5´-> 3´, por lo que una de las hebras se sintetizará con fragmentos de Okazaki, que son muchos fragmentos pequeños que al final se unen. o Una lo hace de manera continua. o Otra lo hace de manera discontinua, formando los fragmentos de Okazaki. Laura Mohedano Redondo REQUERIMIENTOS o Sustratos: dNTP -> desoxinucleótidos. o Cofactores: Mg2+ o Molde de plantilla: hebra de ADN o Cebadores: Oligonucleótidos de ARN o Enzimas: ADN polimerasas: § α: actividad primasa y polimerasa (RNA polimerasa, sintetiza cebador) Síntesis de las hebras (ADN polimerasa 5´→3´) y del cebador (ARN polimerasa 5´→3´) § ε y δ: actividad polimerasa y exonucleasa. Sintetizan las hebras en dirección 5´→3´ y las corrigen en la dirección contraria § β: actividad polimerasa -> reparación. o Proteínas de unión a cadena simple: SSB (Single strand binding proteins) Mantienen las hebras separadas. Son proteínas de unión a cada una de las hebras para evitar que se vuelvan a formar los enlaces de hidrógeno y así poder replicar la cadena. En eucariotas se llaman: proteínas A de replicación. o Proteínas iniciadoras: helicasas, topoisomerasas, ligasas, nucleasas… PROTEÍNAS INICIADORAS - Helicasas: Participan de la apertura de las hebras y consume ATP – rompen los enlaces de hidrógeno. - Topoisomerasas: Encargadas de romper la tensión negativa que se produce durante el proceso. Eliminan el superenrollamiento, para poder seguir abriendo la doble hélice. - Ligasas: Unen los fragmentos de Okazaki entre ellos. - Nucleasas: Se ocuparán de la eliminación de cebadores (Exonucleasa 5’ -> 3’) POLIMERASAS Las polimerasas son las enzimas encargadas de sintetizar ácidos nucleicos (ADN y ARN). Pueden actuar de varias maneras dentro de la misma molécula, y sus acciones pueden tener lugar todas en el mismo centro activo o en centros activos diferentes. Se dividen en función al producto, si el producto es DNA, se necesita cebador. La dirección de síntesis es siempre 5 -́ 3.́ La ADN polimerasa cataliza la reacción donde se sintetiza el enlace fosfoester entre el grupo hidroxilo del carbono 3 ́ del azúcar y el grupo fosfato en posición alfa del nucleótido trifosfato, liberando 2 grupos fosfatos (pirofosfato). La pirofosfatasa rompe el enlace que existe entre la molécula desprendida. La energía que se desprende permite a la polimerasa colocarse en una posición más avanzada y añadir una nueva base nitrogenada complementaria por el mismo proceso. CARACTERÍSTICAS COMUNES DE LAS POLIMERASA: 1) Mismo mecanismo de acción para la introducción de NT (nucleótidos). Utilizan el mismo mecanismo para la unión de nucleótidos. Dejando libre un extremo OH del nucleótido, por lo que solo se podrá unir un nucleótido mediante un fosfato. 2) Síntesis siempre en dirección 5´ -> 3´ Sólo trabajan en esta dirección por la forma de unir los nucleótidos, que deja libre el extremo 3’ al que solo se va a poder unir un extremo 5’. 3) Se sirven de cofactores para su funcionamiento. Laura Mohedano Redondo CARACTERÍSTICAS DIFERENCIADORAS 1) Molde = ADN o ARN. 2) Producto = ADN o ARN. *Es siempre complementario y antiparalelo a la cadena molde. 3) El uso o no de cebador = ARNpolimerasa no necesita. 4) Actividad asociada: Todas son polimerasas, pero pueden tener más actividades asociadas (asociadas a otras subunidades adicionales). 5) La velocidad de síntesis (número de NT que puede poner por segundo). Sintetiza 1000 nucleótidos por segundos. 6) Procesividad (número de NT que es capaz de sintetizar una polimerasa unida al molde). Es el número de nucleótidos incorporados antes de que la ADN polimerasa se separe del molde. En eucariotas la procesividad aumenta gracias a las proteínas abrazaderas. 7) Tasa de error. De manera normal, la ADN polimerasa comete un error entre 10000 y 100000. Sin embargo, si además tiene actividad 3 é xonucleasa, el error se reduce entre 100 y 1000 veces. TIPOS DE POLIMERASAS Las ADN polimerasas más importantes en las células eucariotas son: ALFA ADN POLIMERASA: tiene actividad primasa y polimerasa. Tiene 4 subunidades. - La síntesis de las hebras lo hace en sentido 5 3 ́.́ (polimerasa). - La síntesis de un pequeño cebador en el mismo sentido. - A partir de dicho cebador copia una pequeña parte de nucleótidos. - No tiene actividad de corrección de pruebas pero es necesaria para iniciar todo el proceso. - Es un híbrido de ADN y ARN. GAMMA ADN POLIMERASA: está presente en las mitocondrias. Tiene actividad polimerasa. - Actúa en la replicación del ADN mitocondrial. - Actúa como exonucleasa en mitocondrias. BETA ADN POLIMERASA: tiene actividad polimerasa de reparación. - Es la única polimerasa que no participa en la replicación. - Su actividad se basa en la reparación del ADN. DELTA Y EPSILON POLIMERASA: tiene actividad polimerasa y exonucleasa. - Se encargan de la síntesis de las hebras. - Tienen actividad exonucleasa, correctora de errores. - Polimerizan hebras en sentido 5 3 ́.́ - Delta, sintetiza la hebra retardada. - Épsilon, sintetiza la hebra continua. - No sintetizan cebadores. La ADN polimerasa es de gran tamaño y su estructura permite a la doble hélice encajar de forma perfecta. Tiene actividades asociadas: o Actividad 3 e ́ xonucleasa: está implicada en la eliminación de un nucleótido mal emparejado. Se produce en la dirección 3 -́ 5.́ Esta actividad se localiza en un centro activo diferente al de la polimerización. Laura Mohedano Redondo o Actividad 5 e ́ xonucleasa: está implicada en la eliminación secuencial de nucleótidos en dirección 5 -́ 3 ́ y en la eliminación de cebadores. Esta actividad se localiza en un centro activo diferente al de la polimerización. Nomenclatura: Polimerasa de …. (lo que sintetiza)…dirigida por …cebador. (La última solo en bacterias). ACCIÓN Y DIRECCIÓN DE SÍNTESIS El objetivo de la ADN polimerasa es la síntesis de una nueva hebra mediante la síntesis de los enlaces fosfodiéster entre 2 nucleótidos de la misma cadena. El 1ºNT libre (cadena de nueva síntesis) tiene el extremo 3’OH libre. El NT que vamos a introducir (2º NT) es trifosfato. Ocurre un ataque nucleofílico (ruptura de un enlace covalente mediante una desestabilización) por parte del 1NT sobre el 2NT. Esto libera energía suficiente como para que se forme un enlace fosfodiéster por parte de la ADN polimerasa. Específico: El 3’OH libre de NT1 rompe la unión entre Pα y el Pβ ==> OH unido a Pα mediante enlace fosfoéster. Esto es catalizado por la ADN polimerasa. Para estabilizar la conexión – hacerla irreversible – actúa la pirofosfatasa rompe un pirofosfato (Palpha y Pgamma) y libera energía. Esta energía es aprovechada por la ADN polimerasa para avanzar a la próxima posición. Laura Mohedano Redondo 1- Cadena molde para sintetizar 2- Cuando en el molde aparece una G, posibilidad de ataque nucleofílico 3- Se enfrentan los fosfatos a los OH de la cadena previa provocándose el ataque nucleofílico 4- Rotura del enlace entre el fosfato alfa y fosfato beta 5- Una pirofosfatasa rompe el enlace pirofosfato entre beta y gamma para liberar energía 6- La polimerasa avanza a la próxima posición Laura Mohedano Redondo ADN POLIMERASAS CARACTERÍSTICAS *NTP: NUCLEÓTIDOS TRIFOSFATO - Mecanismo de acción: centro activo diseñado para que solo si hay complementariedad de bases se orienten correctamente - Ataque nucleofílico y dirección de síntesis 5’ -> 3’. - A pH fisiológico de los dNTPs presenta carga negativa y necesitan de Mg2+ (cofactor) para estabilizar al dNT entrante. - Los grupos 2’OH de los NTPs producen una incompatibilidad estérica en la DNA polimerasa que no permite el ataque nucleofílico por 3’OH - El ritmo de catálisis de la DNApol se reduce drásticamente dependiendo del par de bases. Preferencia por los pares G:C (Todas) y A:T (DNApol) o A:U (RNApol) - Los dNTPS son los únicos que pueden llevar a cabo el ataque nucleofílico - Preferencia por los pares G:C y T:A. ACTIVIDADES ASOCIADAS: Depende de los centros activos que presente. § ARN polimerasa – actividad primasa: síntesis de cebadores. § Actividad 3’ Exonucleasa – Exonucleasa (3’->5’) – Actividad correctora de pruebas, eliminación de enlaces fosfodiéster. está implicada en la eliminación de un nucleótido mal emparejado. Se produce en la dirección 3 -́ 5 ́. Esta actividad se localiza en un centro activo diferente al de la polimerización. o Eliminación de un NT. o Eliminación en dirección 3’->5’ o Centro activo diferente o Corrección de errores – misma enzima que lo ha sintetizado lo corrige. § Actividad 5’ Exonucleasa – Exonucleasa (5’->3’) – Actividad de reparación. está implicada en la eliminación secuencial de nucleótidos en dirección 5 -́ 3 ́ y en la eliminación de cebadores. Esta actividad se localiza en un centro activo diferente al de la polimerización. PROCARIOTAS. o Eliminación secuencial de NT ; Eliminación en dirección 5’->3’ o Centro activo diferente o Eliminación de cebadores. o Corrección de errores y daños en el ADN – como los producidos por rayos UVA. VELOCIDAD, PROCESIVIDAD - Velocidad de 1000 NT/segundo en procariotas. - Múltiples orígenes de replicación aumentan la velocidad de síntesis. - La PROCESIVIDAD es el número de NT que puede sintetizar la ADN polimerasa sin separarse del molde. Encontramos distinta procesividad según la polimerasa, y esta aumenta mediante el uso de abrazaderas (PCNA). TASA DE ERROR - DNA Polimerasa: 1 por cada 104-105 NT Laura Mohedano Redondo - DNA Polimerasa + 3’ Exonucleasa: 102-103. Laura Mohedano Redondo TIPOS DE ADN POLIMERASAS α Polimerasa Síntesis de hebras Primasa Síntesis de cebador Inicia la síntesis. δyε Polimerasa Síntesis de hebras: DNApol, exonucleasa Exonucleasa 3’ Corrección β Reparación. (No interviene en la replicación) - DNApol γ - Mitocondria. Polimerasa Síntesis de hebras Exonucleasa 3’ Corrección OTRAS PROTEÍNAS IMPLICADAS o Proteínas iniciadoras: provocan una rotura de la doble hebra (se rompen los enlaces), debido a la generación de tensión negativa o Helicasas, implicadas en la apertura de las hebras con ATP. A costa de ATP buscan el punto de rotura y rompen enzimáticamente los enlaces de hidrógeno. o Proteína de replicación A: mantiene las hebras abiertas o Topoisomerasas: alivian la tensión de torsión de los superenrollamientos. o Abrazaderas, PCNA: asociadas a la ADN polimerasa delta y epsilon. Aumentan su procesividad. o Nucleasas: son exonucleasas 5 -́ 3.́ Eliminan los cebadores. o Ligasas: unen fragmentos de ADN. PROCESO GLOBAL DE LA REPLICACIÓN La primera fase es la iniciación. Comienza con la actuación de las proteínas iniciadoras en el ADN molde (la región del ADN donde existen una secuencias ricas AT) Con ella, la helicasa abre las hebras formando una burbuja y abriendo la horquilla de replicación. La segunda fase es la elongación. La ADN polimerasa alfa sintetiza el cebador y una pequeña secuencia de ADN (30 nucleótidos) a partir de la cual, se unen las ADN polimerasas épsilon y delta para la síntesis del resto de la cadena. Finalmente la última fase es la terminación. Ocurre cuando se unen dos burbujas de replicación. Es necesario la eliminación del cebador y sustituirlo por ADN para unirlos después. Laura Mohedano Redondo INICIACIÓN FORMACIÓN DEL COMPLEJO DE INICIACIÓN Tiene su origen en el lugar donde comienza la síntesis. El replicador es la región del ADN reconocida por las proteínas iniciadoras. Presenta dos zonas, una secuencia rica en AT y otras que contienen palíndromos. La unión de la proteína a las secuencias iniciadoras genera una torsión del ADN, de manera que permite que la región rica en AT pueda sufrir una abertura entre las dos hebras. Posteriormente la helicasa y otras proteínas terminarán por abrir la horquilla de replicación. La región AT presenta enlaces de hidrógeno de fuerza menor ya que tienen solo dos enlaces. Es por ello, que esta zona sufre la abertura. Posteriormente se produce el reclutamiento de las proteínas implicadas en el proceso. El inicio se produce gracias a la participación de la ADN alfa primasa. Encontramos una región del ADN llamada REPLICADOR => Es una zona rica en AT (donde ocurre la apertura inicial de la hebra) y con secuencias iniciadoras, que van a ser reconocidas por la proteína iniciadora (iniciadores inducen una tensión superhelicoidal negativa que flexiona las cadenas para producir una desnaturalización local). Una vez abierta la hebra se reclutan las enzimas que formarán el complejo de iniciación para que se lleve a cabo la siguiente fase. ELONGACIÓN FORMACIÓN DEL REPLISOMA: las proteínas van avanzando y van desenrollando el ADN sin copiar y enrollando el ADN copiado. El replisoma engloba al conjunto de proteínas: helicasas, ADN polimerasas y proteína de replicación A. Se sintetiza el cebador y posteriormente las nuevas hebras. o En la hebra continua el sentido de la síntesis y de apertura es la misma. o En la hebra retardada el sentido es diferente. Se forman en ella los fragmentos de Okazaki. ACCIÓN DE LAS TOPOISOMERASAS: liberan la tensión del superenrollamiento. o TIPO I: corta una de las hebras. o TIPO II: corta las dos hebras. MADURACIÓN DE LOS FRAGMENTOS DE OKAZAKI: presentan un fragmento de ARN que tiene que ser sustituido por las nucleasas que eliminan el cebador con una actividad exonucleasa 5 3 ́.́ El hueco que queda es rellenado por las ADN polimerasas delta y épsilon. Una ligasa une ambos fragmentos por un enlace fosfodiéster. Encontramos 2 topoisomerasas (liberan la tensión) – tipo I (corta 1 hebra) y tipo II (corta 2 hebras). 1- Ocurre la síntesis del cebador mediante la ADN polimerasa α -> DNA polimerasa α con actividad extra A dirigida o primasa 2- La síntesis comienza en dirección 5’ -> 3’ por parte de la ADN polimerasa δ y ε. Encontramos una hebra (líder) que se sintetiza sin problemas y, otra hebra (retardada) que presenta una logística más compleja en la que se forman los fragmentos de OKAZAKI (pequeños paquetes de síntesis). Laura Mohedano Redondo 3- La maduración de los fragmentos de Okazaki ocurre mediante la acción de las nucleasas (eliminan los cebadores), ADN polimerasa δ y ε (rellena el hueco de los cebadores) y las ligasas (unen los fragmentos). Laura Mohedano Redondo TERMINACIÓN Consiste en el alcance de dos horquillas de burbujas diferentes. Al igual que los fragmentos de Okazaki participan las nucleasas, las ADN polimerasa delta y épsilon y las ligasas. El proceso acaba cuando 2 burbujas de replicación diferentes que van en direcciones opuestas se encuentran. La solución de relleno de la unión de todas las burbujas es la misma que en los fragmentos de Okazaki: - Nucleasas: Exonucleasa 3’ - eliminan los cebadores. - ADN polimerasa δ y ε: rellena el hueco de los cebadores. - Ligasas: unen los fragmentos. Por otro lado, también ocurre la REPLICACIÓN DE LOS TELÓMEROS. Los telómeros son la parte lineal de ADN del final de cada brazo del cromosoma. Son secuencias no codificantes repetidas y agrupadas, donde se unen las proteínas ligantes del telómero. La pérdida de los telómeros no tiene relevancia mientras tengamos un número suficiente de repeticiones. Los telómeros forman una caperuza protectora al final del telómero. Ahí termina la secuencia de ADN. Esto permite que entren en funcionamiento las maquinarias de reparación. El extremo 3 t́ iene un carácter cohesivo, en él existen nucleótidos desapareados. o La telomerasa es una transcriptasa inversa que extiende el extremo 3 ́ del telómero. El ADN 3 ́ adicional puede actuar como plantilla para un fragmento de Okazaki nuevo. La ligasa une la parte nueva que ha copiado la polimerasa con la parte que ya había copiado anteriormente. Sin esta corrección, los cromosomas se irían acortando con las replicaciones. El cómputo final es que ni se pierde ni se gana información al replicar los telómeros. o La telomerasa es una ribonucleoproteína que no usa el ADN como plantilla. Sus funciones a nivel fisiológico son: Þ Estabilización y mantenimiento de la integridad del cromosoma (evita la unión de unos cromosomas con otros y el aumento las probabilidades de recombinación) Þ Diferencias entre el extremo natural de la molécula de DNA y un extremo producido por rotura de la molécula. Esto permite que entren en funcionamiento maquinarias de reparación Los telómeros tienen una cadena más larga que la otra pero no hay espacio físico para que la primasa sintetice su cebador y, por lo tanto para que actúe la ADN polimerasa delta à NO se puede formar el último bucle para la síntesis de ese trozo del CR. Esto se soluciona mediante la telomerasa. Es una ribonucleoproteína que tiene función de transcriptasa inversa y procesiva (capaz de sintetizar mucho ADN sin realizar paradas). La telomerasa alarga el extremo del molde, permitiendo que se pueda terminar la síntesis del trozo que faltaba. En las células somáticas, las telomerasas no existen, y a este fragmento de 200 NT sobrante se le corta, lo que provoca el acortamiento progresivo de los telómeros, que se cree que es la causa del envejecimiento celular y por lo tanto de nuestro propio envejecimiento. Requisitos de la telomerasa: Un extremo 3’OH libre y un molde de ARN. Laura Mohedano Redondo Las telomerasas no aparecen en todas las células de nuestro cuerpo, solo en aquellas que necesitan dividirse de manera rápida y eficaz, como las células embrionarias o del desarrollo en general y en las células cancerígenas. Laura Mohedano Redondo REPLICACIÓN MITOCONDRIAL El DNA mitocondrial es circular, de doble banda, que se diferencian entre si: H: heavy (muy rica en bases púricas, que tienen mayor peso molecular) + L: light. La única zona NO codificante del ADN mitocondrial es el origen de replicación de la hebra L y está localizado en la hebra H. Esta zona es conocida como asa de desdoblamiento o bucle D. El cebador se sintetiza mediante una ARN polimerasa. La síntesis se lleva a cabo mediante la ADN polimerasa gamma y participan los SSB mitocondriales. No tiene lugar en la fase S. Tiene un avance unidireccional Es semiconservativa – solo hay replicación de una hebra inicialmente. NO es simultánea Es continua porque no hay fragmentos de Okazaki y bifocal, con dos focos de inicio Proceso: El ADN mitocondrial es un ADN circular que presenta una hebra H, rica en purinas y una hebra L. Para la replicación de ADN existe un punto que es el origen de la replicación (OH). Como molde se utiliza la hebra L para originar la H ,́ la nueva hebra complementaria. En esta región se forma el asa de desdoblamiento o bucle D. Esto sale del plano y deja libre a la cadena H inicial. Tras sintetizarse 2⁄3, aparece el origen OL y con ello se empieza a sintetizar la L ,́ utilizando como molde la hebra H original. Tras ello, las hebras se separan, y se forman dos cromosomas, uno con la hebra H ý L y otro con la hebra H y L ́. 1) La síntesis se inicia en el bucle D copiando la hebra L – el origen está en la hebra H. 2) El complejo reconoce el punto de origen de replicación de la hebra H (situado en la hebra L). 3) Comienza la síntesis de la hebra H, en sentido contrario la que íbamos antes (hebras antiparalelas). 4) Para finalizar la replicación el cebador es eliminado por una nucleasa y la ligasa une los fragmentos. Propiedades: - Semiconservativa - Secuencial - 2 orígenes. Laura Mohedano Redondo RESUMEN – SABER EXPLICAR EL PORQUÉ DE CADA COSA MECANISMOS DE REPARACIÓN DEL ADN Hay una serie de daños en el DNA causados por agentes químicos, intercalantes o la formación de dímeros de timina. Hay distintos tipos de reparación con distintas enzimas implicadas. Dímeros de timina: se forman por irradiación UV, que genera un enlace covalente entre dos timinas. La unión de las timinas es perjudicial para la célula, porque altera todo el proceso de replicación, transcripción... Es conveniente repararlo; se puede reparar por 2 vías: Reparación directa o luminosa: hay una enzima, la fotoliasa, que repara el daño. Provoca la ruptura del enlace covalente. Esta enzima necesita absorber luz, en oscuridad no funcionaría, para revertir el efecto de la luz UV. Por eso se conoce este proceso como reparación luminosa. Reparación por escisión de nucleótido: Si no hay luz se repara por escisión de nucleótido; consiste en eliminar la zona dañada, por una endonucleasa. Deja un hueco, que se rellena por la DNA polimerasa; cuando llega al punto en el que se encuentra con otro fragmento, una ligasa une ambos fragmentos; se obtiene el DNA reparado. Laura Mohedano Redondo TEMA 4: TRANSCRIPCIÓN DEL ADN INTRODUCCIÓN La transcripción del ADN es el primer proceso de la expresión génica, mediante el cual se transfiere la información contenida en la secuencia del ADN hacia la secuencia de proteína utilizando diversos ARN como intermediarios. Es decir, se sintetiza una molécula de ARN a partir de una hebra de ADN. Las secuencias de ADN son copiadas a ARN, durante la inferfase, mediante una enzima llamada ARN polimerasa que sintetiza un mARN que mantiene la información de la secuencia del ADN. El mARN será complementario (con U en vez de T) y antiparalelo al molde. La ARN polimerasa sintetiza en dirección 5´-3´ y para poder llevar a cabo el proceso necesitamos la descondensación de la cromatina => llegando al nivel estructural de la fibra de 10nm. Encontramos grandes diferencias entre procariotas y eucariotas: Procariotas Eucariotas Asociación espacial y temporal Separación espacial y temporal ADN se transcribe Todo (casi) Solo ADN codificante => 35% mRNA resultante Funcional NO funcional Solapamiento Maduración Compartimentos cel. Mismo en todo proceso Distintos durante proceso – transporte. RNA polimerasas 1 RNApol 3 + RNApol orgánulos CARACTERÍSTICAS 1- Carácter multifocal y secuencial: Multifocal => Encontramos muchos orígenes de transcripción, uno por cada gen que queremos transcribir. La información para la síntesis de los ARN está repartida entre ambas hebras de ADN. Secuencial => Se refiere a que los NT se insertan de 1 en 1. Primero se enlanzan y luego se forma el enlace fosfodiéster. 2- Carácter NO simultáneo: El solapamiento nunca ocurre a la vez; cuando están cerca las hebras o se transcribe una hebra o en la otra. Tiene que haber una región de nucleótidos lo suficientemente larga para que la maquinaria de transcripción no se vea afectada. 3- Carácter unidireccional: A partir del punto de origen de la transcripción la síntesis ocurre en un sentido 5’ -> 3’ Laura Mohedano Redondo GENES Un gen es el conjunto de regiones de ADN que codifican para un producto génico (ARN maduro de cualquier tipo: ARNr, ARNt o proteínas funcionales). Los genes están formados por secuencias codificantes – exones – y secuencias no codificantes – intrones y promotor. Consideramos como región reguladora (no se transcribe) al promotor y región estructural (se transcribe) a los exones + intrones. Mediante un proceso de transcripción generamos una cadena de mARN formada por exones+ intrones, y tras una maduración postranscripcional los intrones serán eliminados. - Las secuencias promotoras son las secuencias reguladoras que marcan el inicio de la transcripción. - Los exones presentan una función génica y serán el molde para la formación de proteínas. En los extremos del primer y último exón encontramos las UTRs (secuencias no codificantes) que contienen secuencias del ADN que regulan la transcripción y la traducción => La unión al ribosoma, tienen la secuencia de iniciación, … Las UTRs se transcriben pero no se traducen. Las UTRs no se eliminan durante la maduración. - Los intrones forman parte del transcrito primario pero son eliminados antes de traducción. SITUACIONES PARTICULARES Genes solapantes: Un fragmento de ADN forma parte de dos genes diferentes. En hebras distintas o en la misma hebra con diferente pauta de lectura. En los genes no solapantes, el ADN no se une. 1 gen = Varios productos génicos en la misma unidad transcripcional => ARNr. 1 gen = 2 Variantes => Splicing alternativo de mARN. 1 producto génico = Varios genes => Cadenas de la hemoglobina vienen de varios genes. 1 gen = Variedad de polipéptidos => Reorganizaciones de los genes de las Ig à se expresan diferentes Ac para diferentes Ag. TERMINOLOGÍA, ORIENTACIÓN Y NUMERACIÓN Llamamos NT1 al primer nucleótido del ARN. A partir de este punto cualquier posición en dirección a la síntesis (5’ -> 3’) será +, mientras que cualquier posición en dirección opuesta (3’ -> 5’) será -. Cuando hablamos de la “secuencia de un gen de ADN” nos referimos a la hebra codificante, que es la hebra que tiene en sentido 5’-> 3’ la misma secuencia que el ARN transcrito. ¡! No es la que se está copiando , no es el molde. Salvo que ARN transcrito tiene nucleótidos y U’s en vez de T’s. Por lo que, la hebra codificante es la hebra complementaria a la que hemos transcrito. REQUERIMIENTOS Parecido a la replicación, solo hay que desnaturalizar parcialmente. o Sustratos: NTP. ¡! No son dNTP, y están fosfatados o Cofactores: Mg2+ o Molde o plantilla: hebra de ADN, solo una de las hebras, ya no son las 2 o Cebador: No es necesario – es la gran diferencia entre transcripción y replicación. Laura Mohedano Redondo o Factores de transcripción: Son iguales que las proteínas complementarias que ayudaban a la replicación a abrir las hebras y todo el proceso. Encontramos mayor numero porque está muy regulado. o ARN polimerasa: Síntesis en dirección 5’à3’. TIPOS DE GENES: Se clasifican en función de la ARN polimerasa que actúa. Tipo de gen Enzima Precursor Genes clase I ARN polimerasa I rARN hnARN -> mARN Genes clase II ARN polimerasa II ARNs pequeños tARN Genes clase III ARN polimerasa III rARN ARNs pequeños Genes orgánulos ARN polimerasa de orgánulos – en mitocondrias. Todos los tipos de precursores ARN POLIMERASA II: - Es la enzima encargada de síntesis del precursor de hnARN para sintetizar mARN. Además es capaz de formar pequeños ARN como el micro ARN implicado en la regulación génica. - Es una molécula muy grande, compuesta por 10-15 subunidades, de las cuales 3 son comunes con otras ARNpolimerasas y están encargadas del centro activo y de la unión con el molde de ADN. o Destaca también su dominio C terminal (cola CTD) que se sitúa en el punto de salida de la hebra de ARN sintetizada. o Es una cadena de 7 péptidos, heptapeptídica (humanos: 52 repeticiones) que puede sufrir fosforilación reversible. Tyr – Ser – Pro – Thr – Ser – Pro – Ser o La fosforilación reversible permite que la polimerasa tenga un estado de movimiento y otro de no movimiento (se fosforilan 2 serinas y una trionina). o Es necesaria para el paso de iniciación a elongación, para la adición del 5’CAP y para el acoplamiento del spliceosoma para el splicing alternativo. o Presenta puntos de unión para factores de transcripción. Es capaz de sintetizar todo el ARN de una vez => PROCESIVIDAD ELEVADA. PRODUCE MÁS ERRORES Y TIENE MENOS ACTIVIDAD CORRECTORA => No es totalmente necesaria la función correctora porque los mARNs se van a acabar eliminando y sus fallos tienen poca repercusión. ETAPAS DEL PROCESO Iniciación: formación de la burbuja de transcripción por el complejo de iniciación. o Reconocimiento del promotor por FT. Esto permite la unión de la ARN polimerasa. o Apertura de la hebra. o Unión de los dos primeros nucleótidos y síntesis de hasta 12 nucleótidos, generando un híbrido de ADN y ARN. Laura Mohedano Redondo Elongación: fosforilación del CTD y liberación del promotor. Esto permite el movimiento de la ARN polimerasa para poder seguir copiando. Terminación: comienza con la aparición de secuencias de terminación. Para la ARN polimerasa y libera por un lado, el ARN heterogéneo nuclear y la ARN polimerasa. Laura Mohedano Redondo PROCESO GLOBAL DE LA TRANSCRIPCIÓN: INICIACIÓN En esta fase se forma un complejo de iniciación cuando los factores de transcripción se unen a la ARN polimerasa. En la fase de iniciación, la enzima ARN polimerasa participa en su forma no fosforilada CTD 1) El factor de transcripción TBP, reconoce la secuencia TATA del promotor. Comienza con el reconocimiento de los promotores => secuencia de NT: TATA. A partir de esta secuencia, se comenzará a abrir la hebra, sin incluir la secuencia TATA en la burbuja de transcripción. 2) Simultáneamente, se unen TF2B y TF2D para que la ARN polimerasa en estado desfosforilado se una a la región. La apertura de la burbuja tiene lugar por la unión de la ARN polimerasa en estado defosforilado y una serie de FT. 3) Posteriormente, el TF2F y el TF2H se unen al complejo. Tienen actividad helicasa y permiten desenrollar y abrir la hebra. 4) En el mantenimiento de la hebra abierta participa la TF2E => molécula de unión a banda simple. Existen 2 hipótesis acerca de cómo tiene lugar este proceso: o Hipótesis secuencial: El complejo de iniciación se va formando de manera secuencial (unión secuencial de los FTs) - cada reacción es activada por la anterior, ocurre de manera separada de las otras y activa a la siguiente reacción. o Hipótesis holoenzima: La RNA polimerasa se une a todos los factores, formando la holoenzima. El modelo holoenzima parte de que el complejo ya está formado y solo necesita unirse al ADN para empezar a hacer su función. Cuando ya están todos unidos en forma de holoenzima se unen a la región promotora del DNA (va con todo, se une todo a la vez). 5) Tras esto, se forma el primer enlace fosfoester, emparejando el ADN molde con 12 nucleótidos de ARN, recién sintetizado. La formación de primer enlace fosfoester ocurre cuando hay dos nucleótidos libres que se han emparejado con el ADN molde en la posición +1 y +2. à No necesidad de cebadores. La iniciación incluirá la síntesis de los primeros 10-12 NT, ya que la ARN polimerasa los podrá unir sin tener que desplazarse a lo largo de la hebra, sino que lo hará inmóvil. => se forma híbrido ARN-ADN. **La cola CTD es importante en el proceso de elongación; en la iniciación la cola NO está fosforilada. ELONGACIÓN Comienza cuando comienza a moverse la ARN polimerasa, y para que esto ocurra deben cumplirse dos requisitos: o Fosforilación de la cola CTP – la ARN polimerasa puede moverse. o Liberación del centro promotor, que se hará mediante la unión de FT. 1) Fosforilación del CTD por el transcripción FT2H y P-TEFb. *El F2H también actuaba como helicasa. * FT: F2H y P-TEFb. Están implicados en la fosforilación de los residuos de Ser de la cola CTD. Al fosforilarse provoca la desunión de la polimerasa a los FT del complejo de iniciación y promueve el avance de esta para que siga leyendo la hebra de DNA. 2) Liberación del promotor, separación de ARN polimerasa y factores de transcripción de la región promotora. Se conoce como liberación del promotor, porque deja atrás la secuencia reguladora que tenia el DNA. 3) Burbuja de transcripción: la parte copiada se separa del ADN y sale de la región donde copia la polimerasa. Debe existir un desenrollamiento para que la burbuja pase y un enrollamiento de la doble hélice del ADN. La burbuja tiene que ir moviéndose; por lo que delante de la burbuja tiene que haber un desenrollamiento, que las hebras estén separadas para poder copiar la secuencia, y detrás de la burbuja tienen que haber un enrollamiento => tropoisomerasas. Laura Mohedano Redondo 4) En la elongación, favoreciendo el desplazamiento de ARN polimerasa, hay varios factores de elongación. Los factores de elongación son: - Actividad enzimática: ELL, CSB, S3 - Mantener el estado fosforilado: FT2H y P-TEFb - Procesividad: TF2S y DSIF TERMINACIÓN 1) Pausa de la ARN polimerasa II por la presencia de secuencias en la región terminadora o por la participación de proteínas terminadoras. 2) Desestabilización del híbrido ADN-ARN: por la presencia de una proteína parecida a rho. Encontramos una secuencia terminal en la parte no codificante, que dará la señal de STOP. Participarían según la hipótesis 2 proteínas: o Proteína terminal que se une a la hebra o Proteína similar a ρ: Desestabilizaría los puentes de hidrógeno de la burbuja de transcripción impidiendo la continuación de la síntesis. MADURACIÓN TODOS los transcritos primarios de ARN (eucarióticos) se procesan => No pueden llevar a cabo su función cuando acaban de ser sintetizados. Tipos de modificaciones: 1- Modificación covalente de nucleósidos 2- Eliminación y/o adición de NT en los extremos 3- División de la molécula en varios fragmentos 4- Eliminación de intrones El objetivo de estas modificaciones es: - Conferir estabilidad a la molécula finalpara proteger al ARN de las nucleasas - Permitir el plegamiento tridimensional (tARN y rARN) - Mejorar la funcionalidad para la traducción. Laura Mohedano Redondo MADURACIÓN DEL PRE-MRNA O HNRNA 1. MODIFICACIÓN DEL EXTR. 5´ PARA LA ADICIÓN DE UNA CAPERUZA. Función: Es una modificación covalente que protege a la molécula de las nucleasas (hidrolizarían el ARN). Actúa como señal para posteriores modificaciones (si no está presente no se dan las demás modificaciones), y es el punto de unión al ribosoma para la traducción (será lo que reconozcan los ribosomas). Tiene lugar durante la transcripción antes de que se sintetice el nucleótido número 30 y después del 12. En este proceso participa CTD. Su formación constituye la transición de iniciación a elongación. Presenta un enlace trifosfato no habitual en dirección 5 5 ́ ý una metilación. Etapas: A. Extremo 5’ trifosfato se desfosfrila à fosfatasa. B. Adición de GTP (guanililación - guanililtransferasa). C. Metilación (metiltransferasa): posición N7 de la guanosina. Caperuza Consiste en añadir GTP en dirección contraria al extremo 5’. Este extremo quedaría bloqueado. Se forma una modificación covalente, en dirección 5’ -> 5’. Esto ocurre durante la transcripción, casi al principio; antes del nucleótido número 30 y después del 12. Como está participando en el proceso la cola CTD se piensa que la adición de la caperuza está implicado en la transición I-E. Se produce una unión de 3 grupos fosfato. La unión que se da entre el GTP (guanina trifosfato) y el Pi del primer nucleótido es 5’- 5’. Es una unión atípica. A continuación, se metila el nitrógeno número 7 de la BN => Caperuza es una guanosina, con una BN metilada. Para unir el GTP se necesitan ciertas enzimas. § En primer lugar, tiene lugar la acción de una RNA fosfatasa, que provoca la eliminación de un grupo fosfato en posición gamma de un mRNA. Se defosforila. § A continuación, se une el GTP, se da la guanización, por la enzima guanidil transferasa. Provoca una unión entre el GTP y el extremo 5’. Hay que recordar que es una unión atípica. Tipos de caperuza: 0 àMetilación de guanina. Esta ya es funcional => NO presente en eucariotas. 1 àMetilación de guanina + OH del primer NT del transcrito. mRNA (guanina-N7-)-metiltransferasa. 2 àMetilación de guanina + OH del primer y segundo NT. mRNA (nucleósido-2’-OH)- metiltransferasa. *** La función está relacionada con el sistema inmune. A priori los RNA de los agentes extraños no están metilados y los de los seres humanos si, es como una marca, una etiqueta, para diferenciar lo propio de lo extraño. 2. MODIFICACIÓN EXTR. 3´ PARA INCORPORACIÓN DE LA COLA POLI-A à POLIADENILACIÓN Es la poliadenilación del extremo 3 ́.Da estabilidad a la molécula y la protege de diversas enzimas que la hidrolizarían. Además determina la vida media y permite su transporte al citoplasma. A mayor longitud de poli-A mayor longevidad, suele estar compuesta por entre 40 y 250 adenosinas. Es importante para el transporte del mARN maduro al citoplasma - estabiliza. Su adición se produce en 2 pasos: a. ESCISIÓN DEL PRE-ARN: El corte se da mediante unas endonucleasas que cortaran la cadena en unos 30 NT posteriores a la secuencia consenso (AAUAAA) – esta secuencia indica el punto de colocación de la cola poliA. La zona que se corta es una pseudoterminación, porque la ARNpolimerasa ha copiado más nucleótidos de los necesarios para la formación del ARN maduro. Laura Mohedano Redondo b. POLIADNELIACIÓN DEL EXTREMO 3’: La poli-A-polimerasa, que es la única polimerasa que NO necesita molde introduce A consumiendo ATP. c. UNIÓN A PROTEÍNAS DE ESTABILIZACIÓN. 3. SPLICING: ELIMINACIÓN DE INTRONES Y EMPALME DE EXONES Es el proceso de eliminación de intrones y unión de exones. Los intrones contienen secuencias específicas que participan como un centro de ramificación o secuencia CURAY, con A adenina y dos centros de ayuste (centro de ayuste 5 ć on GU, guanina y uracilo y centro de ayuste 3 ć on AG, adenina y guanina). Los intrones presentarán 3 secuencias consenso, que son las que reconocerá el espliceosoma. El espliceosoma es un conjunto de 5 ribonucleoproteinas (un ARN nuclear pequeño y polipéptidos) nucleares pequeñas al intrón. Las ribonucleoproteínas forman un bucle que orienta las secuencias en el espacio en una posición idónea para su eliminación. Las secuencias consenso son las siguientes: - Centros de ayuste (CA): Son 2 y se encuentran en los extremos del intrón. Son = para todos los intrones del genoma. En el CA del extremo 5’ encontramos la secuencia GU, mientras que en el CA del extremo 3’ encontramos la secuencia AG. - Centro de ramificación (CR): Es una secuencia interna que se encuentra a unos 20/40 NT del CA 3’. Son específicos para cada intrón, aunque todos ellos tienen una A cerca del final => A participa en el ataque nucleofílico. Las REACCIONES DE TRANSESTERIFICACIÓN tienen 2 rupturas de enlaces gracias a los cuales se forman 2 enlaces nuevos. (NO gasto de energía: ruptura libera E y formación gasta E) 1) Escisión del extremo 5’ del intrón: Ataque nucleofílico de 2’OH Ataque nucleofílico del 2 O ́ H del adenilato del centro de ramificación al extremo 5 d ́ el intrón. Queda unido al intrón por enlace fosfodiéster atípico 5 -́ 2 ý se libera el exón 1 2) Escisión del extremo 3’ del intrón: Ataque nucleofílico del 3’OH exón. Ataque nucleofílico del 3 O ́ H del exón 1 libre al centro de ayuste 3.́ Se unen exones y se libera el intrón en forma de lazo. No hay consumo de ATP en esta etapa. El SPLICEOSOMA/AYUSTOSOMA está formado por pre-mRNA + ribonucleoproteínas nucleares pequeñas. Su función es la de orientar los grupos químicos del intrón de manera idónea para su eliminación. Los CA y CR son las secuencias reconocidas por el spliceosoma. Este complejo permite el acercamiento de los centros de ayuste y de los centros de ramificación del intrón. Descripción del proceso: - El primer ataque nucleofílico ocurre entre el CR y el 1-CA. El ‘OH de la adenina del CR rompe el enlace de fosfoéster entre intrón-exón => Se libera el 3’ del exón. Se libera energía que permite que el OH de la adenina de CR se una al Pi libre del extremo 5’ del intrón. Laura Mohedano Redondo - El segundo ataque nucleofílico el extremo 3’ del exón1 ataca al CA del exón 2 (también se puede ver como que ataca al extremo 3`del intrón) El producto es un mRNA con todos los exones unidos y, lazos intrónicos que serán eliminados. El SPLICING DIFERENCIAL O ALTERNATIVO se refiere a las opciones de maduración de un mismo ARN primario que dan lugar a diferentes mARN maduros. Este proceso ocurre mediante la regulación de las ribonucleoproteínas que anula CR o CA de exones, mediante la interacción con ellos que hacen que no sean reconocidos por la maquinaria de splicing. SPLICING APUNTES: Una vez formado la maquinaria de splicing, el 2’oh de la A de la secuencia consenso yakuray, va a producir un ataque nucleofílico entre el exón 1 y el exón 2, la energía liberada se une para que se una al ext 5’ del intrón. El extremo 3’oh del exón 1 ataque nucleofilicamente a lanion entre el intron y el exón, aunque queda libre el dosfato del exón 2 que se une al oh que ha producido el atqeu nucleofílico El grupo OH 2’ de una adenosina específica del intrón ataca el sitio de corte 5’, originando la estructura en lazo (lariat). El grupo OH 3’ del exón lleva a cabo un ataque nucleofílico contra el extremo 3’ del intrón, lo que origina su corte y la liberación de la estructura en lazo. Los exones son unidos. SPLICING ALTERNATIVO Laura Mohedano Redondo Fuentes de variabilidad disintas, a partir del mismo RNAm, se producen varios RNAm. Desde un hnRNA, tenemos una versión 1, con 4 exones; y otra versión dos con 3 exones Hay mecanismos de regulación con ribonucleoproteínas, que eliminan centros de ramificación / ayuste - Isoformas de la troponina T: isoformas alfa y beta - Muy típico en proteínas de versión soluble, puntos de unión a la membrana ¡! DESARROLLO DE SPLICING Laura Mohedano Redondo TEMA 5: TRADUCCIÓN INTRODUCCIÓN Es el paso de ARNm a proteína. El ARNm pasará al citoplasma, donde se encuentran los ribosomas que lo reconocerán gracias a la cola de poli-A y se leerá en dirección 5´-> 3´ (síntesis en dirección amino -> carboxilo). Es un proceso universal a excepción de las mitocondrias y algunas especies concretas. La traducción de ARN a aminoácido se realiza siguiendo el código genético. El ARN mensajero es monocistrónico, es decir, presenta un único sitio de inicio (AUG). El ARNm es monocistrónico => 1 ARNm da lugar a una proteína con contadas excepciones en humanos. No siempre el ARNm se traduce, depende de la regulación. De todos los RNA, solo los mensajeros pasan a ser proteínas. Los eucariotas generamos variabilidad mediante splicing (los procariotas leyendo de formas distintas una misma secuencia). FASES 1) Activación 2) Iniciación 3) Elongación 4) Terminación RESULTADO Durante la traducción y a partir de un primer codón o triplete (AUG) se produce la síntesis de un polipéptido siguiendo la lectura del mRNA de tres en tres. Cada codón o triplete codifica para un solo aminoácido, es decir, la traducción es específica. REQUERIMIENTOS - mARN para cada uno de los polipéptidos - Ribosomas: rARN + proteínas - Aminoácidos :incorporen a cadena - tARN: maduros y portadores de aa. - Sistema de traducción: código genético. - Energía + Enzimas - Factores de traducción para cada fase. El proceso tiene cuatro etapas: activación, iniciación, elongación y terminación. Laura Mohedano Redondo MAQUINARIA DE TRADUCCIÓN RIBOSOMAS 80S Está formado por 2 subunidades: o 60s: Subunidad grande. Lleva una actividad enzimática (peptidil transferasa) le permite la unión de aa. Está formado por 49 proteínas. Presenta varias partes: § Cresta. § Protuberancia central. § Tallo. § Valle, centro activo donde tiene lugar la actividad enzimática. Se localiza entre la cresta y la protuberancia central. § Sitio de translocación. Se localiza entre la protuberancia central y el tallo. § Sitio de salida de la cadena peptídica naciente. o 40s: Subnunidad pequeña. Presenta una hendidura que participa en la alineación del mARN. Está formado por 33 proteínas. Funciones 1- Orientar los sustratos para que se produzca el enlace peptídico 2- Alinear el ARNm en la iniciación 3- Controlar la fidelidad de la traducción para evitar los errores en la medida de lo posible 4- Intervenir en la terminación, sirve como soporte (se verá más adelante con detalle) Espacios a. A (Aminoacilo): Entrada de los aminocil-tARN. b. P (Peptidilo): Lugar donde se realiza la unión de la cadena a través del tARN. c. E (Exit): Salida del tARN después de liberar el aminoácido. Laura Mohedano Redondo TARN-AMINOÁCIDOS Los tARN presentan una estructura secundaria en forma de trébol. En el extremo 3 ́presenta el brazo aceptor. Es el sitio de unión del aminoácido. Brazo II: es el brazo anticodón. Brazo I, brazo III y brazo IV, están implicados en funciones estructurales, de reconocimiento... Presentan aminoácidos infrecuentes: o D: dihidrouridina. o Fi: pseudouridina. o ○ T: ribotimidina. ACTIVACIÓN DE AMINOÁCIDOS Para poder iniciar el proceso de traducción es necesario activar los aminoácidos mediante la unión: aminoácido + tARN. Esta unión es llevada a cabo mediante la aminoacil-tARN-sintetasa. La enzima implicada en el proceso es: aminoacil ARN transferente sintetasa. Presenta dos pasos: - Activación, con gasto de ATP, se une AMP al aminoácido y se forma el aminoaciladenilato. Se libera un pirofosfato. - Unión de un ARN transferente al aminoaciladenilato para obtener aminoacil ARN transferente por un enlace éster que tiene lugar mediante la unión del grupo hidroxilo 3 ́ del ARN transferente y el grupo carboxilo del aminoácido correspondiente. Se libera el AMP. - Existen 20 tipos de aminoacil ARNt sintetasas porque son específicas para cada aminoácido. 20 aminoacil-tARN- sintetasas => 1 por cada aminoácido. Esto se debe a que la unió entre enzima-aminoácido es estructural y específica para cada aminoácido à aumento de la especificidad. La reacciones de la enzima necesitan energía, que se obtiene de la interacción del aminoácido con un AMP, que se origina de la hidrolisis de un ATP. La energía será usada entonces por la enzima para la unión del aminoácido con el extremo 3’OH del tARN y la liberación del AMP. Este paso es el más crítico del proceso y ocurrirá en el citosol, aunque para compensar posee sistemas de corrección antes y después de la unión del aminoácido. Laura Mohedano Redondo CÓDIGO GENÉTICO CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO - Universal, a excepción de las mitocondrias - Específico: para 1 codón solo hay un aminoácido o Cada codón del ARNm complementa con uno o más ARNt (anticodón). o Cada ARNt solo se asocia a un aa. o La existencia de tRNAs isoaceptores y la hipótesis del balanceo (flexibilidad “relativa” de la tercera unión) permiten que el código sea especifico y que cada codón o triplete codifique solo para un aminoácido. - No ambiguo. La lectura del mRNA es NO AMBIGUA, se produce de tal forma que los nucleótidos se “leen” de tres en tres. La lectura es: o Secuencial y continua o No solapada - Continuo. La lectura es secuencial de 5’ – 3’ - Degenerado: Encontramos sinónimos dentro del código genético – varios tripletes codifican para el mismo aa. CODÓN DE INICIACIÓN: AUG (metionina) CODONES DE TERMINACIÓN: UAA, UAG, UGA. *Cada codón son 3 nucleótidos y traduce para un aminoácido. La lectura del código genético presenta varias pautas de lectura. No está solapada, solo hay una pauta de lectura en eucariotas que siempre empieza por AUG. En eucariotas solo hay una pauta de lectura, los mRNAs son monocitrónicos y en procariotas pueden seguir varias pautas de lectura, son policistónicos (¹ AUGs iniciadores). Laura Mohedano Redondo Laura Mohedano Redondo HIPÓTESIS DE BALANCEO El número de codones que codifican para aminoácidos son 61, y tendrán 32 ARNt. La cifra de ARNt es menor a la de codones gracias a la hipótesis del balanceo del anticodón. La interacción entre el ARN transferente a través de la primera base del brazo anticodón con la tercera base del codón del mensajero se conoce como base fluctuante del balanceo. El emparejamiento puede ser normal o no normal, es decir, no tiene por qué seguir las reglas de apareamiento. Los dos primeros nucleótidos se unen por enlaces de Watson y Crick, mientras que la tercera tiene otro enlace, es decir, balancea. Es una interacción especial porque: Pueden existir interacciones no corrientes. Si el brazo anticodón presenta una U, podría unirse a una A (convencional) o a una G. o Si se une a la G se dice que el emparejamiento es de Hoogsteen, un enlace más débil. Una G se puede unir a una C o a una U. La interacción es más débil si es G-U. Existen nucleótidos infrecuentes, que dan los nombres de los brazos del ARN transferente. En este caso destaca la inosina, que puede estar en la primera base del brazo anticodón y establecer enlaces Hoogsteen con A, C y U. Hay 64 codones, con 3 parada y uno de inicio, pero solo codifican para 20 aminoácidos. Esto se explica por la hipótesis del balanceo. Hay ARN transferentes que reconocen muchos mensajeros y hay varios transferentes que reconocen al mismo mensajero. Varios ARN pueden interaccionar con el mismo codón, ya que los enlaces de los dos primeros NT del ARNt con el codón son enlaces de Watson y Crick (purina-pirimidina), pero el tercero puede no serlo. La consecuencia es que el mismo tARN pueda unirse a una cantidad mayor de codones, y por tanto se necesitarán menos tARN para cubrir las uniones a todos los codones necesarios. => REDUCCIÓN DE GASTOS ENERGÉTICOS. CARACTERÍSTICAS DEL PROCESO 1- No es ambigua: NO te puedes saltar un nucleótido. 2- Lectura secuencial 3- Lectura no solapada: Solo hay una pauta de lectura en eucariotas que siempre empieza por AUG. Laura Mohedano Redondo DIAPOSITIVAS: HIPÓTESIS DE BALANCEO Interacción específica 1 aa / 1 sintetasa - Reconocimiento enzima-sustrato: 1 centro activo / 1 aa - Enlace de Hidrógeno, I. Electroestáticas e hidrófobas, F. van der Waals Reconocimiento Sintetasa-tRNAs - Interacción con el centro activo y con varias zonas de la molécula de tRNA - 1 centro activo / Varios tRNAS Reconocimiento Codón-Anticodón - Los aa-tRNAs generados por las sintetasas no son suficientes para cubrir todos los posibles codones (4^3 = 64) codones, de los que 61 codifican para un aa Entonces, ¿Cómo se produce la especificidad? La hipótesis de balanceo contempla que 1 anticodón reconozca uno o varios codones explicando así como con 31 tRNAs se pueden “leer” los 61 codones que codifican para aminoácidos. La hipótesis del balanceo contempla que la tercera unión entre codón y anticodón ofrezca varias posibilidades. Así, la primera y la segunda unión son complementarias (A-U o C-G) y se forman enlaces de WyC mientras que, en la tercera unión la base del anticodón interacciona por WyC con su complementaria o por enlaces de Hoogsteen con otras, aumentando el número de codones compatibles por cada anticodón. Además, en el anticodón y en esta posición se puede producir una modificación post-transcripcional. Se es el caso aparece una inosina (modificación de la adenina por desaminación) y se aumentan el número de posibilidades. En este caso el anticodón (3’CGI5’) del aminoacil-tRNA de la alanina puede interaccionar con tres codones porque su tercera base balancea (Iosina es compatible con Uracilo, citosina o adenina) Laura Mohedano Redondo Teniendo en cuenta esta hipótesis un organismo (o mitocondria) necesita un mínimo de 31 tRNAs, sin tener en cuenta el iniciador de metionina, para cubrir las 61 posibilidades de codificación del código genético. El conjunto de tRNAs varía entre organismos e incluso entre núcleo y mitocondria Laura Mohedano Redondo PROCESO INICIACIÓN En el estado previo a la iniciación tenemos las subunidades ribosomales separadas y el ARN se encuentra como mARN maduro. La traducción empieza por el triplete AUG del mARN, por lo que el primer aminoácido de la cadena polipeptídica siempre va a ser METIONINA. En la iniciación, el ribosoma tiene que estar disociado. o La subunidad pequeña está asociada a eIF3 y eIF1. o La subunidad grande está asociada a eIF6. o Estos factores permiten a las subunidades estar separadas. En un primer momento: - mARN se une el factor 4 de iniciación (eIF-4). - El primer aminoacil-tARN (metionil-tARN) unido al factor 2 de iniciación (eIF-2), el cual va unido a su vez a GTP - Los ribosomas unidos a otros eIF Factores eucarióticos de Iniciación eIF: EIF4E se una a la CAP del mRNA y recluta a eIF4G y el eIF4A con actividad helicasa. Al complejo se une eIF4B que activa a eIF4A (deshace posibles horquillas) EIF2 que va siempre unido a GTP recluta al y detecta el correcto apareamiento codón-anticodón, momento en que se hidroliza el GTP a GDP y se libera el factor. EIF1, eIF1A, eIF3 y eIF5: Se unen a la subunidad pequeña y evitan su unión a la subunidad grande. También impiden la unión prematura del tRNA iniciador u otros tRNAs al “futuro” sitio A (eIF1 y eIF1A). EIF5B-GTP: Actúa tras la unión codón-anticodón que hace que se liberen eIF2-GDP, eIF1 y eIF5. Su unión al el tRNA iniciador permite la unión de la subunidad grande. Los 4 unión a CAP, y reconocimiento de la subunidad pequeña del ribosoma, eliminación de la estructura secundario. Se evita la unión del ribosoma a cualquier sitio que no sea la CAP, evitan la unión del subunidad grande , evitan la unión de transferentes al sitio A. Laura Mohedano Redondo INICIACIÓN 1- Formación del COMPLEJO TERNARIO DE PREINICIACIÓN: Ribosoma pequeño + mARN + metionil-tARN unión de la subunidad pequeña del ribosoma al ARN mensajero y al ARN transferente metionil. El ARN mensajero se une al factor 4 de iniciación (eIF4) y el metionil ARN transferente se une a eIF2 y a GTP. Ambos se unen a la subunidad pequeña del ribosoma y forman el complejo de preiniciación. 1. Asociación subunidad pequeña 40s con Met-tRNAimet 2. Reconocimiento CAP 3. Rastreo: movimiento de la subunidad pequeña sobre el mRNA 2- Unión del complejo con CAP del mARN: determina la dirección de traducción. 3- El complejo recorre la molécula hasta que detecta AUG: AUG de iniciación localizado en secuencia de Kozak. Secuencia de Kozak: 5’ GCCRCCAUGG 3’. La secuencia de Kozak contiene el codón de inicio con una purina en -3 y una guanina en +4. Cuando aparece AUG de la secuencia Kozak, el ribosoma reconoce la secuencia entera y para, de forma que el AUG se sitúa en el sitio P. Solo si se aparean codón de iniciación con el anticodón del Met-tRNAimet correctamente se da paso al la formación del complejo de iniciación. El GTP de eIF2 se hidroliza y se liberan eIF2, eIF1 y eIF5. --- FORMACIÓN DEL COMPLEJO TERNARIO 80S ----- 4- Reclutamiento y activación del eIF-5B (Actividad GTPasa). eiF-5 activa la actividad GTPasa de eiF-2: En presencia de eIF-5 ocurre la hidrolisis del GTP (del factor 2) que produce la liberación de todo los factores no necesarios para la traducción. 5- Reclutamiento de la subunidad grande del ribosoma. 6- Unión de la subunidad grande del ribosoma: Esta subunidad solo presenta afinidad con el proceso cuando se han liberado todos los factores. COMPLEJO TERNARIO DE INICIACIÓN: Ribosoma + metionil-tARN + mARN. 7- Liberación de factores. Laura Mohedano Redondo ELONGACIÓN: FACTORES EUCARIÓTICOS DE ELONGACIÓN EEF Consiste en la adición de aminoácidos por enlace peptídico. El proceso de elongación se repite en ciclo, estos son los proceso del principio: 1- Al sitio A se une un nuevo transferente (aminoacil-tRNA) que está unido al eEF1A - se une por complementariedad de bases codón-anticodón. 2- Cuando esta estructura se une al sitio A, si la unión es correcta se promueve una unión fuerte por complementariedad de bases, porque se hidroliza el GTP. 3- Se forma el enlace por la actividad peptidiltransferasa de la subunidad pequeña del ribosoma => enlace entre Met y el aminoácido recién llegado a A. 4- La llegada del factor eEF2 provoca el movimiento del ribosoma => translocación del ribosoma en dirección 5’ ->3’ (se mueve de codón en codón). 5- El tRNA que llevaba unida la metionina queda unido al sitio E sin la metionina – la cual se ha unido al 2º aminoácido por un enlace peptídico. 6- El tARN del sitio P pasa a A => lleva la Met unida al 2º aminoácido. 7- Hay un sitio A libre, donde tiene lugar la unión del tercer transferente. Laura Mohedano Redondo Laura Mohedano Redondo Laura Mohedano Redondo TERMINACIÓN Consiste en la liberación del polipéptido y la disociación del complejo. Cuando encontramos un codón de terminación (no es reconocido por ningún tARN) entra el eRF - factor de terminación que tiene GTP y actividad GTPasa. La entrada del factor en el sitio A provoca la hidrolisis de su GTP y la energía liberada se usará para romper el enlace del último aminoácido y el tARN que lo portaba. La liberación de la cadena polipeptidica produce la perdida de afinidad de todos los componentes de la traducción, que se liberan y se unen a los factores de iniciación (eIF). CODONES DE TERMINACIÓN: UAA, UAG UGA. POLIRRIBOSOMAS Conjunto de ribosomas asociados a una molécula de mRNA que realizan la traducción simultánea pero desfasada de una misma proteína. Laura Mohedano Redondo MODIFICACIONES POSTRADUCCIONAL Laura Mohedano Redondo TEMA 6: REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA. MODIFICACIONES EPIGENÉTICAS. La regulación de la expresión génica está relacionada con los procesos que ocurren en la transcripción y en la traducción. Está implicada tanto en la formación del ARN como de las proteínas. CICLO CELULAR Al analizar la expresión génica de una cels se está analizando lo que se está expresando en ese momento en esa cel (no se puede extrapolar a todo un organismo o a toda una vida). En la replicación puede haber una regulación de las proteínas de iniciación y del desenrollamiento del ADN por los replicadores. - En G1: Encontramos un punto de control de NO retorno, en el que hay un chequeo de las condiciones ambientales. Algunas células se quedan atascadas en G0 (reposo-quiescencia) y otras continuaran con la replicación. Actúan quinasas dependientes de ciclinas. - En S: Hay un control de la activación de los replicones (cada uno una sola vez por ciclo). o Secuencia ARS (autonomously replicating sequences) o ORS: proteínas ORC + Factores de competencia – reclutan proteínas MCM. - En G2: Encontramos un punto de control en el que se analiza la viabilidad celular. Algunas células quedarán atrapadas y otras pasarán a mitosis. Actúan quinasas dependientes de ciclinas. REGULACIÓN PRETRANSCRIPCIONAL Regulación pretranscripcional: se basa en el acceso de la maquinaria de transcripción al ADN (ya que si no accede no puede comenzar) y la regulación de los promotores. El acceso al ADN depende de tres factores: Nivel de condensación: la transcripción no puede ocurrir en estados de condensación superiores a la fibra de 10 nm. Reconocimiento del promotor: los promotores deben estar en zonas accesibles, es decir, o en la región internucleosómica u orientados a la superficie, si se localizan en el nucleosoma. Retirada de los nucleosomas: para permitir la libre interacción con factores de transcripción y ARN polimerasa. Se distinguen dos tipos de desensamblaje: o Parcial: retirada de H1, H2A y H2B. o Total: mediante la hidrólisis de ATP. La epigenética es el estudio del conjunto de cambios de patrón de expresión génica que no implican alteración de la secuencia del ADN que no son heredables. De forma más concreta, corresponde al conjunto de marcas moleculares y mecanismos que señalizan y perpetúan la actividad funcional de las diferentes regiones de la cromatina, a través de su estado de condensación. Laura Mohedano Redondo Es una regulación ejercida a nivel pretranscripcional que tiene consecuencias sobre el fenotipo y es importante para explicar la diversidad morfológica y funcional de las células que poseen un mismo genoma. La epigenómica es la parte de la genómica que trata el estudio de las marcas epigenéticas en una célula tipo determinada. METILACIÓN DEL ADN EN C Tiene lugar en las regiones donde se localizan los promotores. Los islotes CpG son secuencias CG, abundantes en regiones promotoras. Estas secuencias tienen transcripción activa, cuando están hipometiladas o inactivas cuando están hipermetiladas. En cáncer existen genes relacionados con la proliferación que están hipometilados y genes oncosupresores hipermetilados. En estas zonas, además, se pueden unir proteínas MeCP1 y MeCP2 que bloquean aún más la transcripción, impidiendo la acción de la polimerasa. Aparte, pueden asociarse proteínas que impiden la descondensación del ADN, favoreciendo que no exista transcripción. METILACIONES: Se metila la citosina en el C5 de as BN: - Promotores ricos en CG - Diferencia entre tejidos - No metilados: transcripción - Metilados: no transcirpción Se unen las proteínas al promotor cuando está metilado. Laura Mohedano Redondo ¡! Promotor metilado no hay transcripción METILACIÓN DE HISTONAS Hay dos mecanismos: o Metilación de residuos de Lys (K), de 1 a 3 por residuo. o Metilación de residuos de Arg (R), de 1 a 2 por residuo. Las variantes del número de metilaciones y el aminoácido en el que se producen determinan el silenciamiento del gen. No existe un patrón definido (si se metila, no ocurre una cosa determinada, esto va variando). Ejemplo: para un gen determinado, en H3 la metilación de Lys 4 y Arg 17 y Lys 36 activan la transcripción mientras que la metilación de Lys 9 y Lys 27 implica el bloqueo de la transcripción. ACETILACIÓN DE HISTONAS La acetilación se asocia a transcripción y la desacetilación a inhibición. Esto se debe a que las desacetiladas tienen cargas muy positivas y como el ADN tiene carga negativa se atraen. Por el contrario, cuando se acetilan, se pierde positividad y la atracción es menor entre la histona y el ADN. Laura Mohedano Redondo Un genoma con histonas no acetiladas está bloqueado , no se pueden deshacer; la heterocromatina tiene mas histonas desactivadas que la eucromatina que tiene histonas activadas El proceso de acetilación se lleva a cabo por la histona acetiltransferasa mientras que la desacetilación ocurre por la histona desacetilasa. Uno de los cromosomas X en mujeres está inactivo por este motivo. OTRAS MODIFICACIONES - Adición de radicales SUMO en arginina y lisina. - Fosforilación de serina. - Ubiquitinación de lisina. - Unión de ADP-ribosa. o Regulación transcripcional: aquí no solo se regula que la transcripción tenga lugar o no, sino la cantidad en la que esta ocurre si ocurre. La regulación la producen las secuencias promotoras y los factores de transcripción. o Factores de transcripción: son proteínas que regulan la expresión génica. Son distintas pero comparten función y regiones. Se unen por el surco mayor del ADN. La unión entre el ADN y los factores de transcripción se produce por numerosas interacciones pequeñas que conforman una interacción específica y fuerte. Los motivos de unión al ADN de los factores de transcripción son: - HTH: Hélice-giro-hélice. el motivo, presente en el factor de transcripción, tiene una hélice alfa seguida por una secuencia de aminoácidos sin estructura secundaria definida que da un giro para volverse a encontrar con otra alfa hélice. Una de las hélices alfa interacciona de forma directa con el surco mayor del ADN. - HLH: Hélice-bucle-hélice: el motivo, presente en el factor de transcripción, tiene dos hélices alfa separadas por un bucle. - Homeodominio. Es una variante de HTH. El motivo, presente en el factor de transcripción, tiene dos alfas hélices interaccionando con la primera, separadas por secuencias de aminoácidos sin estructura secundaria definida. - Dedos de Zinc: el motivo, presente en el factor de transcripción, tiene estructuras con 4 residuos aminoacídicos (2 histidinas y 2 cisteínas) que interaccionan con el Zinc. Esto permite que la secuencia de aminoácidos se doble asemejándose a un dedo. Contiene un alfa hélice y dos betas lámina. (se introducen entre los surcos mayores del DNA y cada montañita es una alfa hélice) - Cremallera de leucina: el motivo, presente en el factor de transcripción, tiene dos cadenas separadas que interaccionan entre sí por asociación de aminoácidos de leucina, dispuestos cada 7 aminoácidos. Si hay leucinas, puedo cerrar la cremallera, si no hay leucinas, puedo cerrar las cadenas. 7 leucinas por alfa hélice en una distancia regulada, de forma que pueden interaccionar entre ellas (en función de las condiciones externas). o Secuencias promotores: se distinguen tres tipos. - Basales: determinan cual es el inicio de la transcripción. Son la secuencia TATA donde se une TBP , BRE (blanquea la secuencia TATA) donde se une el TFIIB, INR (localizada en el punto donde se inicia la transcripción) donde se une TFIID, MTE, donde se une TFIID y DPE, donde une TFIID. - Proximales: se localizan más alejados del promotor basal (-30 y -200 NT). Regulan la frecuencia con la que ocurre la transcripción. Son las dos cajas GC y la caja C AAT. Laura Mohedano Redondo - Distales: están alejados del origen. Solo aparecen en genes inducibles y son específicas para cada gen. Regulan la eficacia del inicio de la transcripción. A ellas pueden unirse tres proteínas diferentes: § Potenciadores: aumentan la velocidad y la eficacia de la transcripción. § Silenciador o inhibidor: inhiben o ralentizan la transcripción. § Aislador: el promotor distal deja de participar en la transcripción. REGULACIÓN POSTRANSCRIPCIONAL o Procesamiento y transporte del ARN mensajero: Se regula el splicing alternativo, transcritos primarios que pueden dar a ARN mensajeros maduros distintos por la participación de proteínas de riboproteínas nucleares heterogéneas. o Transporte del ARN: Salida del ARN mensajero a través de los poros nucleares está determinado por condiciones ambientales, señales extrínsecas.... o Síntesis proteica y control de la traducción: Accesibilidad y estabilidad del mensajero, llevado a cabo por ribointerruptores, ribointerferencia y horquillas de ARN mensajero. Ribointerruptores: son secuencias presentes en el ARN mensajero (en la región 5 U ́ TR) que reconocen ciertos metabolitos específicos que regulan la actividad de dicho ARN mensajero. Ejemplo: en la traducción de genes del metabolismo de la riboflavina, cuando el ARN mensajero está libre ocurre la traducción, mientras que cuando está unido a FMN (derivado de la riboflavina) hay represión de la traducción. Ribointerferencia: a su vez llevado a cabo por ARNmi. o ARNmi (microARN): son ARN pequeños que se sintetizan de forma endógena (en el núcleo). Se expresan en determinados momentos y zonas para regular de forma fina la expresión génica. Se caracterizan por unirse al ARN mensajero por complementariedad de bases y con ello, bloquear la traducción o favorecer su degradación. Pueden tener más de una diana, no son específicos. Por ello, un solo ARNmi puede reprimir la traducción de toda una cascada de señalización. - Horquillas de ARNm: Ejemplo: ferritina. Se ocupa del almacén de hierro cuando está en exceso para evitar su toxicidad. La horquilla se forma en la región 5 U ́ TR. Cuando no hay hierro la IRP se une a la horquilla para impedir el inicio de la traducción del ARN mensajero de la ferritina. Cuando hay hierro, la IRP se une a él y se libera de la horquilla. Por ello, ahora sí que hay traducción de ferritina. Ejemplo: receptor de transferrina. En la región 3 U ́ TR hay horquillas a las que puede unirse en ausencia de hierro la proteína IRP. En este caso, la proteína estabiliza al mensajero para que ese mismo mensajero pueda dar lugar a más traducciones puesto que su eliminación es más lenta. Cuando hay hierro, la proteína IRP no está unida a la horquilla y por ello, el ARN mensajero se degrada más rápidamente. Hay menos receptor de transferrina. - Formación del complejo de iniciación de la traducción: Ejemplo: globinas. Si no hay grupo hemo (grupo prostético) se paraliza el inicio de la traducción por inhibición del factor eIF2. Con ello, no se sintetizan globinas. Laura Mohedano Redondo