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Bioquímica 1º Cuatrimestre Bioquímica y Biología molécular 1º Veterinaria UCM a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 TEMA 4. ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN DEL GENOMA...

Bioquímica 1º Cuatrimestre Bioquímica y Biología molécular 1º Veterinaria UCM a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 TEMA 4. ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN DEL GENOMA ÁCIDOS NUCLEICOS Son polímeros largos y lineales construidos a partir de 4 tipos de monómeros: nucleótidos: azúcar (pentosa; en DNA desoxirribosa y en RNA ribosa) + base (purinas: A, G; y pirimidinas: C, T en DNA y U en RNA) unida al átomo C1 del azúcar= nucleósido + fosfato. Para formar las cadenas de RNA o DNA, los nucleótidos se enlazan por medio de enlaces fosfodiéster o nucleotídicos para formar polinucleótidos cuyo sentido viene definido por los 2 carbonos que intervienen en este enlace. La unión es una esterificación que se realiza entre el grupo fosfato situado en posición 5' de un nucleótido y el grupo hidroxilo que se encuentra en el carbono 3' de otro nucleótido. Es una reacción de condensación, liberándose H2O. Representación esquemá?ca y abreviadas de la estructura de los ácidos nucleicos: Las cadenas de ácidos nucleicos pueden ser representadas por abreviaturas (pApGpCpT, pAGCT, AGCT) Tienen direccionalidad (se escriben en dirección 5 '→ 3') y los dos extremos son diferentes: uno =ene un grupo P+átomo C5' del azúcar y el otro extremo =ene un hidroxilo libre+C3' del azúcar. La secuencia de las bases es el contenido de información del ácido nucleico. DNA celular consta de dos hebras helicoidales de polinucleótidos enrolladas en torno a un mismo eje. El RNA consta de una sola hebra, pero se puede plegar sobre si misma formando estructuras complejas. En términos moleculares, gen: sec.nucleotídica que contiene la info.necesaria para la síntesis de un producto final. GENOMA Es el conjunto total de material genético hereditario presente en un organismo (en los ácidos nucleicos, DNA y RNA); contiene la info. biológica necesaria para la construcción, funcionamiento y perpetuación de las células. DNA: información genética estable transmitida entre generaciones. RNA: copia transitoria de esta información. EUCARIOTAS PROCARIOTAS (animales, plantas, levaduras y hongos) (bacterias) El material gené=co nuclear eucariota está distribuido El material gené=co en procariotas se encuentra en la en unidades que con=enen 1 moléc. lineal muy larga de región nucleoide. Una única molécula de DNA circular, dsDNA, asociada con proteínas (histonas y no histonas). asociada con proteínas de unión a DNA, cargadas Incluye tanto el material existente en el núcleo, como el posi=vamente (ligeramente) y similares a las histonas. de las mitocondrias y cloroplastos. Incluye la región nucloide y los plásmidos. GENOMA PROCARIOTA El genoma procariota está formado por el cromosoma del nucleoide y por los plásmidos. El cromosoma del nucleoide es una molécula de DNA bicatenario, circular y flexible, mucho más grande que la bacteria en sí, por lo que adapta una estructura terciaria de superenrollamiento (compactación), facilitada por enzimas girasas y topoisomerasas, y proteínas tipo histonas (falsas histonas), que enrollan y desenrollan el ADN según las necesidades de la célula (en replicación y transcripción debe desenrollarse al inicio y enrollarse al final). GENOMA EUCARIOTA DNA NUCLEAR DNA DE ORGÁNULOS Organizado en varias moléc.lineales (cromosomas). Genomas de mitocondrias y cloroplastos tienen caract. Humano: aprox.3.000 millones bp en 23 pares procariontes por su descendencia de bacterias libres que de cromosomas de las células somáticas. formaron simbiosis con el precursor de la célula eucarionte. Cromatina: material cromosómico disperso y DNA mitocondrial: única moléc. DNA circular de desordenado en los períodos de no división celular. organización compacta (- algunos eucariotas inferiores: Cromosoma: moléc. DNA altamente compactada. lineal y con zonas no codificantes), con gran diversidad de Cada uno de los cuerpos en que se organiza la tamaño, organización y complejidad génica. Algunas prot. cromatina del núcleo en las divisiones celulares. mitocondriales son codificadas por genes nucleares. DNA del cloroplasto: bicatenario y circular, de tamaño mayor que el de la mitocondria. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 La organización dinámica del núcleo de la célula en subcompartimentos, con actividades biológicas distintas, representa un importante determinante de la función celular. Por un lado, el genoma tiene que estar protegido de modificaciones no controladas que pudieran comprometer su función, y tiene que ser replicado y segregado de forma fiable durante la división celular y la meiosis. Por otra parte, tiene que ser notablemente plástico para permitir la lectura, procesamiento, mantenimiento y transferencia de la información codificada en la secuencia de ADN según sea necesario para que la célula pueda adoptar diferentes estados funcionales. La ejecución de programas celulares está estrechamente vinculada a la regulación de la expresión génica, que a su vez requiere cambios correspondientes en la organización de la cromatina. El DNA mitocondrial presenta una serie de caracterís?cas que lo diferencian del ADN nuclear: Herencia materna: la madre transmite su genoma mitocondrial a todos sus hijos, pero solamente las hijas lo pasarán a todos los miembros de la siguiente generación. No sufre recombinación durante la reproducción y no se reciben las mitocondrias de los padres (destrucción de las mitocondrias del espermatozoide). Alta velocidad de mutación: el mtDNA presenta una tasa de mutación espontánea X10 a la del DNA nuclear. Todo esto lleva a que las mitocondrias se deterioren con la edad como consec. de la acumulación de mutaciones. Poliplasmia: consiste en el elevado número de copias de mtDNA que existen en cada mitocondria y por extensión en cada célula. Cada mitocondria contiene entre 2 y 10 moléculas de este DNA circular. Se pueden encontrar entre 1.000 y 10.000 copias de mtDNA dependiendo del tejido. Heteroplasmia: posibilidad de presentar más de un tipo de genoma mitocondrial dentro de una célula o individuo, debido a mutaciones que se pueden dar en el genoma mitocondrial (perjudiciales o no. Heteroplasmia en genomas mitocondriales: cuando se fertiliza un óvulo maduro, todas las mitocondrias de la célula diploide resultante son de origen materno. Si parte de estas mitocondrias maternas tienen una mutación, la distribución al azar de las mitocondrias durante las divisiones celulares posteriores producen células hijas con diferente número de mitocondrias mutantes; es decir con diversos grados de heteroplasmia. Estructura de la croma?na-cromosomas eucariotas La cromatina está compuesta de fibras de DNA protegidas por proteínas y pequeñas cant. RNA de pequeño tamaño. El DNA se asocia fuertemente con proteínas: No histonas; constituyen el armazón proteico de los cromosomas. Son: topoisomerasas, polimerasas, prot.reguladoras, otros enzimas nucleares. Histonas: proteínas de pequeño tamaño con elevado contenido de aa básicos; hay de cinco tipos (H1, H2A y H2B, H3 y H4). Están muy conservadas a lo largo de la evolución y sufren modificaciones covalentes por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, etc. DNA eucariota se enrolla alrededor de histonas: nucleosomas (1r nivel empaquetamiento). Nucleosoma Unidad básica estructural de organización de la cromatina y constituye el primer nivel de empaquetamiento del DNA eucariótico del DNA eucariótico. Cada nucleosoma contiene 8 moléculas de histonas (2 copias de cada una) que forman el núcleo proteico: las histonas se disponen en un entorno central alrededor del cual se enrolla la molécula de DNA (contacto histona-DNA en regiones ricas en A=T); las colas (extremos aminotermianles de las histonas) se disponen al exterior y serán susceptibles de modificaciones covalentes. Un nucleosoma típico está asociado a 200pb de DNA, enrollándose alrededor del núcelo proteico 146pb en vueltas de sobre hélice (cuentas de rosario) y el resto como nexo de unión entre nucleosomas (DNA ligador o de enlace; unido a H1). A medida que el ADN se va organizando en pequeños nucleosomas, incrementa el grado de empaquetamiento hasta llegar a la cromatina: 1r nivel: el enrollamiento del DNA alrededor del núcleo proteico del nucleosoma hace que se compacte 7 veces. 2º nivel: los nucleosomas adoptan una disposición helicoidal formando una serie de capas apiladas consiguiéndose una compactación de 100 veces (fibra de 30 nm). Niveles superiores: el DNA se asocia con proteínas no histonas: algunas ayudan a mantener su estructura (cohesinas y condensinas) y otras regulan la expresión de genes específicos. En el último nivel de plegamiento la longitud del DNA se compacta 10.000 veces. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 ESTRUCTURA GÉNICA Tanto los genes para RNA (exclusivamente se transcriben a RNA) como los genes para proteínas (se transcriben a mRNA, que se traducen a proteínas), contienen dos regiones: Región reguladora: contiene DNA regulador que precede al gen propiamente dicho (puede estar muy alejado). Este DNA es imprescindible para que el gen se transcriba, ya que es donde se produce la señal que indica que el gen se debe transcribir y delimita entre la región intergénica (contiene secuencias no codificantes: no se transcriben ni se traducen y suelen contener secuencias repetidas) y la intragénica, ya que también indica dónde se debe iniciar la transcripción, diferenciando los extremos del gen (intrones o exones) del DNA intergénico. Región estructural: contiene intrones (secuencias de DNA no codificante, que se transcribe, pero no se traduce) y exones (secuencias de DNA codificante, que se transcribe y se traduce). Tras la transcripción, se produce una maduración postranscripcional en la que se eliminan los intrones del RNA y se unen los exones, formando el RNA maduro, que en el caso del RNAm después se traduce en proteínas. Además, la secuencia intrónica de un tipo celular puede ser exónica en otro tipo celular, según cómo sea el corte y empalme del ARN (maduración postranscripcional), permitiendo que a partir de un mismo gen se puedan sintetizar numerosas proteínas. De esta forma, en términos moleculares, un gen (en el genoma nuclear eucarionte) es la secuencia de DNA (incluyendo exones, intrones y regiones reguladoras no codificantes) necesaria para la producción de un producto génico funcional (RNA o proteína). La longitud total del DNA, el número de genes y número de cromosomas, no están directamente relacionados con la complejidad de un organismo ya que la mayor parte del DNA eucariota es no codificante. Composición del genoma humano Solamente una pequeña fracción incluye genes que codifican proteínas (1-2 % exones). El significado biológico de las secuencias no codificantes no está, aún, del todo claro: Algunas regiones del DNA par=cipan directamente en la regulación de la expresión de los genes (promotores, señales de terminación, etc) Algunas regiones del DNA codifican para pequeños RNA reguladores con funciones poco conocidas Algunas regiones del DNA pueden no tener u=lidad (piezas de genes no deseados, restos de infecciones virales…) Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 TEMA 5. REPLICACIÓN DEL DNA La visión actual de la transmisión de la información genética acepta el dogma central de la genética molecular. Donde: el ADN contiene la información codificada (genoma), que se transmite de generación en generación mediante la replicación de la molécula. Además, a través de la transcripción, la información del ADN se copia en forma de ARN, cuya información se puede traducir en proteínas. Además, existe la transcripción inversa del ARN en ADN en los retrovirus (ARN genómico sirve de molde para formar, gracias a la catálisis de transcriptasas inversas, una hebra de ADN complementario que, al eliminarse el ARN, hibrida con una hebra de ADN complementaria y se introduce en el núcleo eucariota para transcribirse y formar nuevos ARN víricos) y en los eucariotas (función de telomerasas). La REPLICACIÓN DEL DNA es el proceso celular por el que se ob=ene una copia de todas las moléculas de DNA presentes en la célula con un alto grado de fidelidad y velocidad. Es decir, a par=r de una molécula de DNA parental se sinte=za una nueva, originándose dos moléculas hijas de secuencia idén=ca a la del DNA original El DNA con=ene la información necesaria para generar un nuevo individuo y es transmi=da entre generaciones. Los errores en la replicación pueden llevar a la pérdida de una función biológica, y esos cambios se heredan. El tamaño de los genomas y la velocidad de las divisiones es muy grande. Además la replicación del DNA presenta 3 carácterís6cas fundamentales: 1. Semiconserva?va Cada cadena del DNA progenitor actúa de molde para la síntesis de una nueva cadena. El resultado son dos moléculas de DNA hijas, cada una con una cadena nueva y otra progenitora. 2. Simultánea, secuencial y bidireccional La separación de hebras progenitoras en cada origen, avanza en ambas direcciones: bidireccional. En cada ori se produce la apertura local de la doble hélice y comienza simultáneamente la síntesis de las dos hebras, alargándose por adición secuencial de nucleó=dos. Las moléculas circulares de DNA bacteriano =enen un único origen de replicación Los cromosomas lineales de eucariotas =enen varios orígenes de replicación 3. Dirección 5’—> 3’ y semidiscon?nua Las dos cadenas nuevas de DNA siempre se sinte=zan en la dirección 5’—>3', siendo el grupo 3’ -OH libre de la desoxirribosa el punto de elongación del DNA. Como el DNA está cons=tuido por una doble hélice an=paralela: si las dos cadenas de DNA se sinte=zasen de forma conanua a medida que se desplaza la horquilla de replicación, una se sinte=zaría en dirección 3’—>5’. De manera que una de las cadenas de DNA se sinte=za en forma de segmentos cortos (100-1000nt): fragmentos de Okazaki. Resultando en dos =pos de síntesis según la dirección: Hebra conductora se sinte=za de forma con=nua en la misma dirección que el mov. horquilla de replicación. Hebra rezagada se sinte=za de forma discon=nua en dirección opuesta a la del mov. horquilla de replicación. DNA ES SINTETIZADO POR DNA-POLIMERASAS Catalizan la adición consecu=va de desoxirribonucleó=dos 5’-monofosfato (dNMP) al extremo 3’-OH de la cadena de DNA naciente (polimerización). Requerimientos: 1. Molde: la reacción de polimerización esta dirigida por una cadena molde de DNA según las reglas de apareamiento de bases (A=T y G≡C). 2. Cebador o primer: la DNA polimerasa sólo puede unir dNTPs nuevos sobre una cadena preexistente. Los cebadores son segmentos nucleoadicos complementarios a la hebra molde con un grupo 3'-OH libre al cual pueden añadirse nuevos dNTPs; son a menudo oligonucleó=dos de RNA que son sinte=zados por enzimas especializadas (primasas). 3. Sustrato: se u=lizan cuatro =pos de desoxirribonucleó=dos 5'-trifosfato: dATP dGTP, dTTP y dCTP (en conjunto: dNTPs), y cofactores: para una ac=vidad óp=ma se requiere la presencia de Mg2+, asociado a los dNTPs. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 Estructura: Las DNA polimerasas =enen un estructura común, la mayoría posee una gran hendidura compuesta por tres dominios que se asemejan a una mano: Dominio “dedos”: posiciona los dNTPs en relación con la hebra molde, con un grado de fidelidad extraordinario. La unión del dNTP entrante induce un cambio conformacional en el que el dominio del dedo en la DNA polimerasa se cierra sobre el nucleó=do, formando un bolsillo en el que sólo cabe el nucleó=do correcto. Los pares de bases incorrectos quedan excluidos del si=o ac=vo de la DNA polimerasa. El dominio del “pulgar” funciona en el posicionamiento y translocación del DNA, manteniendo en su lugar el dúplex de DNA que se alarga. La hoja β que comprende el dominio de “la palma” es donde se encuentra el centro ac=vo de la enzima, que cataliza la transferencia de los grupos fosforilo El DNA se sitúa a lo largo de la palma en un surco creado por “los dedos” y “el pulgar”. Mecanismo: El mecanismo catalí=co para la adición de un nuevo nucleó=do por la DNA polimerasa u=liza dos iones Mg2+, que están coordinados con los grupos fosfato del nucleó=do trifosfato entrante, el grupo 3’-OH libre de la cadena en síntesis, y tres residuos Asp, dos de los cuales están altamente conservados en todas laS DNA polimerasas. El ión Mg2+ representado en la parte superior facilita el ataque del grupo 3’-OH al fosfato α del nucleó=do trifosfato; el otro ión Mg2+ facilita el desplazamiento del pirofosfato. Ambos iones Mg2+ estabilizan la estructura del estado de transición. Las RNA polimerasas u=lizan un mecanismo similar. DNA ES DEGRADADO POR NUCLEASAS Las nucleasas se pueden clasificar en: desoxirribonucleasas o DNasas (específicas para DNA) y ribonucleasas o RNasas (específicas para RNA); que =enen ac6vidad: Endonucleasa: comienzan a degradar los ácidos nucleicos en posiciones internas específicas de la cadena, reduciéndola a fragmentos cada vez más pequeños. Salvo excepciones, degradan DNA de cadena doble. Exonucelasa: degradan los ácidos nucleicos desde un extremo de la molécula. Muchas actúan sólo en una dirección 5’—>3' ó 3’—>5', eliminando nucleó=dos del extremo 5' o del 3' respec=vamente. Salvo excepciones, degradan DNA de cadena doble o sencilla. La mayoría de las DNA polimerasas presentan una actv.exonucleasa 3’—>5', en un centro ac=vo independiente de la actv.polimerasa, que =ene una función correctora de la síntesis del nuevo DNA (corrección de pruebas). Esta ac=vidad nucleasa permite hidrolizar el nucleó=do incorrecto situado en el extremo 3' del DNA. Cuando se incorpora un nucleó=do incorrecto, la velocidad de la polimerasa se retrasa significa=vamente, facilitando así la transferencia del extremo 3‘, con el nucleó=do desapareado, al si=o exonucleasa 3‘ de la polimerasa que cataliza la eliminación del nucleó=do incorrecto antes de con=nuar con la polimerización. Posteriormente el extremo 3‘ se coloca de nuevo en el si=o ac=vo de la polimerasa, y con=nua su ac=vidad de síntesis de DNA en la dirección 5' →3'. Esta ac=vidad exonucleasa 3’—>5' mejora en gran medida la fidelidad de la replicación del DNA. REPLICACIÓN EN PROCARIOTAS La replicación del DNA requiere polimerasas con elevada procesividad (nº medio de nucleó=dos añadidos consecu=vamente antes de que la polimerasa se disocie del DNA molde). La disociación y reasociación de la DNA polimerasa limita la velocidad global de polimerización: a mayor procesividad, mayor velocidad de síntesis. DNA POLIMERASA I La DNA polimerasa I es un enzima cons=tuida por una sola cadena polipepadica que posee una ac=vidad polimerasa, una ac=vidad exonucleasa 3'→5' y una ac=vidad exonucleasa 5'→3' localizadas en dominios estructurales diferentes. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 DNA POLIMERASA III La DNA polimerasa III es mucho más compleja que la DNA polimerasa I. Se trata de una proteína mul=mérica con 10 =pos de subunidades diferentes: Subunidades α y ε: con=enen las ac=vidades polimerasa y exonucleasa, respec=vamente. Las subunidades α y ε asociadas a la subunidad θ forman el núcleo de la polimerasa (165000 Da). Subunidad β: cons=tuye la abrazadera del DNA para mejorar la procesividad. Se asocian 2 subunidades β con cada núcleo. Subunidades τ, γ, δ, δ’, χ, ψ: cons=tuyen el complejo de carga de la abrazadera (subunidad β). Este complejo se une a 2 polimerasas núcleo a través de 2 subunidades τ para formar la DNA polimerasa III. La DNA polimerasa III unida a 4 subunidades β cons=tuyen el holoenzima de la DNA polimerasa III (900000 Da) REPLISOMA: conjunto de proteínas de la replicación Al conjunto de proteínas relacionadas con la replicación (cada una con tareas específicas) se las denomina sistema DNA replicasa o replisoma: 1. Helicasas (DnaB): se trasladan a lo largo del DNA y separan las 2 cadenas de DNA u=lizando la energía química del ATP para que las hebras molde sean accesibles a la polimerasa. 2. Topoisomerasas (Dna girasa): relajan la tensión topológica de la estructura helicoidal del DNA que aparece por delante de la horquilla, causada por la separación de las 2 hebras. 3. Proteínas de unión al DNA (SSB): unión coopera=va al DNA de cadena sencilla. Estabilizan las hebras de DNA, impidiendo su renaturalización y el apareamiento de bases dentro de la misma cadena. 4. Primasas (DnaG): son RNA polimerasas especializadas que sinte=zan los RNA cebadores que =enen que estar unidos al DNA antes de que la polimerasa comience la síntesis. 5. DNA polimerasa III: replicación del DNA. 6. DNA polimerasa I: elimina los RNA cebadores (ac=vidad exonucleasa 5’—>3') y los remplaza por DNA. 7. DNA ligasas: sellan los huecos (enlace fosfodiéster roto) que deja la DNA polimerasa I después de eliminar el cebador en la hebra rezagada. Las funciones de todos los factores proteicos que forman el replisoma deben estar perfectamente coordinados y regulados en el =empo y en el espacio. ETAPAS DEL PROCESO DE REPLICACIÓN 1. INICIO DE LA REPLICACIÓN Es la etapa principal de regulación y control de la replicación; par=cipan, al menos, 10 proteínas diferentes. Implica el reconocimiento del origen de replicación (ori C): son si=os de unión para las proteínas que inician el proceso de duplicación del DNA. Las proteínas DnaA, abren y comienzan a desenrollar el DNA en puntos concretos del origen; además reclutan otras proteínas necesarias para que transcurra la síntesis de las nuevas cadenas. La helicasa (DnaB) con=núa desenrollando las dos hebras, mientras que las hebras separadas son estabilizadas por las proteínas SSB (unen DNA monohebra); proceso que requiere hidólisis de ATP. Por úl=mo, se une la DnaG (primasa) que sinte=zará los RNA cebadores. Se forman dos horquillas de replicación y se mueven en direcciones opuestas a lo largo del cromosoma circular. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 El inicio de replicación es la única fase que está regulada y se realiza una sola vez en cada ciclo celular. La regulación se lleva a cabo por me=lación del DNA y por interacciones con la membrana plasmá=ca bacteriana: El origen de replicación oriC está me=lado por la enzima Dam (Dam me=lasa): me=la la A de las secuencias 5’GATC 3’ presentes en oriC de E.coli. Tras la replicación, el DNA está semi-me=lado: hebras parenterales me=ladas y hebras de nueva síntesis no. El oriC semime=lado es “secuestrado” temporalmente en la mb.plasmá=ca (mecanismo desconocido). Tras unos minutos se libera de la membrana y debe ser de nuevo me=lado completamente por Dam antes de que la DnaA pueda unirse a las secuencias de 9 pb para iniciar de nuevo la replicación. 2. ELONGACIÓN DE LA REPLICACIÓN La etapa de elongación consiste en la síntesis de la cadena conductora y de la cadena rezagada: Síntesis de la cadena conductora: comienza con la síntesis de un cebador de RNA (10 a 60nt) por la Primasa DnaG en el origen de replicación. A con=nuación la DNA polimerasa III añade dNTPs al cebador. La síntesis de la hebra conductora transcurre con=nuamente al ritmo de avance de la horquilla de replicación. Síntesis de la hebra rezagada: se realiza de manera discon=nua: la primasa DnaG sinte=za un cebador para un fragmento de Okazaki. La DNA polimerasa III ex=ende el cebador hasta el fragmento de Okazaki anteriormente sinte=zado. Se sinte=za un nuevo cebador, próximo a la horquilla de replicación, y el proceso se repite. La replicación avanza de manera simultanea en ambas cadenas, por lo que hay una síntesis coordinada de las 2 cadenas por la misma holoenzima de DNA polimerasa III. La cadena que sirve de molde para la hebra rezagada forma un bucle que la sitúa en la posición adecuada para que tenga lugar la polimerización en sen=do 5'→3'. El proceso permite la síntesis de unos 1.000 nt por segundo en ambas hebras (conductora y rezagada). La DNA Pol III usa un juego de sus subunidades núcleo para la síntesis con=nua de la hebra conductora, mientras que el otro juego de subunidades núcleo circula entre un fragmento de Okazaki y el siguiente sobre el bucle formado por la hebra rezagada. Cuando un fragmento de Okazaki está completo, la DNA polimerasa I (u=lizando su actv.exonucleasa 5’—>3') elimina el cebador de RNA y lo reemplaza por DNA. El hueco que queda es sellado por la DNA ligasa, que cataliza la formación de un enlace fosfodiester entre un extremo 3’-OH libre al final de un fragmento y un extremo 5’-fosfato al comienzo del siguiente. 3. TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN La replicación del DNA en el genoma circular se inicia en el origen de replicación y transcurre de forma bidireccional hasta que las dos horquillas de replicación alcanzan una región terminal en la parte del cromosoma diametralmente opuesta al origen. La región terminal con=ene múl=ples copias de una secuencia nucleoadica denominada Ter (20-23 pb). Las sec. Ter del DNA son si=os de unión para la proteína Tus (Tus = Terminator U=liza=on Substance): “contra helicasa” que impide que se desenrolle el DNA e inhibe la ac=vidad helicasa de la proteína DnaB. La 1ª horquilla de replicación que topa con un complejo Tus-Ter queda detenida y la 2ª horquilla se de=ene cuando se encuentra con la 1ª horquilla ya detenida. La separación de hebra en la cara no permisiva permite que el ADN Ter interactúe específicamente con el dominio de bloqueo de Tus. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 Los pocos centenares de bases que quedan entre las dos horquillas son replicados a con=nuación mediante un mecanismo aún desconocido. El resultado son dos cromosomas circulares entrelazados (catenados). La separación de los cromosomas entrelazados requiere la acción de la Topoisomerasa IV. Los cromosomas separados serán segregados en las células hija en la división celular. REPLICACIÓN EN EUCARIOTA Los genomas procariotas son circulares, mientras que los de los eucariotas son lineales y mayores que los de las bacterias, organizados en estructuras nucleoproteícas (croma=na). Problema: la replicación de un cromosoma eucariota promedio (~150 millones pb) que transcurriera a par=r de un único origen de replicación, tardaría un mes en completarse. Por lo tanto la replicación en eucariotas es bidireccional y =ene lugar, de forma simultánea, a par=r de múl=ples orígenes de replicación (replicones), distribuidos a lo largo del cromosoma. Esto hace posible que la replicación de un cromosoma eucariota promedio sólo tarde unas horas en completarse. La terminación de la replicación de los cromosomas lineales incluye la síntesis de unas estructuras especiales (telómeros) en los extremos del cromosoma. La replicación se produce de forma coordinada con la división celular (Fase S). DNA POLIMERASAS (REPLICATIVAS) DE EUCARIOTAS DNA polimerasa α/primasa: heterotetrámero: la subunidad mayor con=ene la ac=vidad polimerasa (~180.000 Da) y la otra subunidad posee ac=vidad primasa. Sin ac=vidad exonucleasa 3’—>5'. Par=cipa en la síntesis de los cebadores DNA polimerasa δ: sinte=za la hebra discon=nua a par=r de los cebadores y posee ac=vidad exonucleasa 3’—>5' correctora de errores. DNA polimerasa ε: sinte=za la hebra con=nua a par=r de los cebadores, posee ac=vidad exonucleasa 3’—>5' y par=cipa en la reparación del DNA. En la replicación del DNA eucariota actúan otros complejos proteicos: RPA (Proteína de Replicación A): unen DNA de cadena sencilla (~ SSB). PCNA (Anageno Nuclear de Proliferación Celular): se encuentra en grandes can=dades en el núcleo de células en proliferación. PCNA aumenta la procesividad de las polimerasas δ y ε al poseer una estructura similar a la subunidad β de la DNA polimerasa III bacteriana (abrazadera). Complejo RFC (Factor de Replicación C): complejo de carga de abrazadera para PCNA 1. INICIO DE LA REPLICACIÓN El orden de ac=vación de los orígenes de replicación eucariotas depende en parte de la estructura de la croma=na en que se encuentran. En levaduras se han iden=ficado unos orígenes de replicación denominados secuencias de replicación autónoma (ARS) o replicadores (~150 pb) que con=enen secuencias muy conservadas ricas en A/T; presentan unos 400 replicadores repar=dos en 16 cromosomas. Los elementos ARS presentan una sec. central de 11 pares de bases (ACS) común y tres elementos adicionales B1, B2 y B3 que contribuyen a la función del origen. En todos los eucariotas el inicio de la replicación requiere un complejo proteico, denominado complejo de reconocimiento de origen (ORC), que se asocia al DNA uniéndose a varias secuencias específicas dentro del ARS y está regulado por proteínas de control del ciclo celular. Una vez unido ORC recluta otras proteínas, incluyendo a las MCM-DNA helicasas y a las primasas. Las proteínas que forman el complejo ORC inician la replicación en todos los eucariontes, desde las levaduras hasta los mamíferos pero los orígenes de replicación en otros eucariotas están mucho menos definidos que los elementos ARS de levaduras, estando, posiblemente, determinados por la estructura de la croma=na. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 2. ELONGACIÓN DE LA REPLICACIÓN 1. El heterohexámero Mcm2-7 ac=vo (actv.helicasa) rodea la cadena con=nua y desenrolla el dúplex mediante hidrólisis de ATP 2. La síntesis de los cebadores se realiza mediante Polα-primasa, que está anclada al complejo a través de Cå4 3. Polδ sinte=za la cadena retardada de forma discon=nua 4. Polε es reclutada a través de interacciones con el complejo y sinte=za la cadena con=nua (aunque puede ayudar la Polδ) 5. PCNA y RPA corresponden a la abrazadera y proteínas de unión a DNA monohebra respec=vamente 6. Tras la elongación un sist. nucleasas (FEN1+RNasaH1) elimina el RNA cebador de los fragmentos de Okazaki 7. DNAs Pol δ o ε elongan el DNA, rellenando el lugar que antes ocupaba el cebador 8. Por úl=mo la DNA ligasa une la mella 3. TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN En el organismo eucarió=co con DNA lineal, hay un problema en el final de la replicación: en cada ronda sucesiva de replicación las hebras nuevas son más cortas en 5’ que su molde, como consecuencia la longitud del cromosoma se va acortando progresivamente, en su dos extremos o telómeros. Telómeros: son regiones de DNA especializadas que se encuentran en los extremos de los cromosomas eucarió=cos lineales; protegen de la degradación del DNA, recombinación, y fusiones de los extremos del DNA, y son importantes para la arquitectura nuclear. Cons=tuidos por secuencias altamente repe==vas de DNA no codificante, formadas por cientos de copias dispuestas en tándem de una secuencia corta =po 5ʹ -TxGy-3’ en el extremo 3’ de una hebra y 5ʹ-CyAx-3’, en el 5’ de la hebra complementaria. La telomerasa es una ribonucleoproteína con ac=vidad transcriptasa inversa: añade secuencias de DNA repe=do al extremo 3’ de la cadena de DNA en la región de los telómeros usando RNA como molde. Tiene tres componentes: 1. TERT: componente proteico, subunidad catalí=ca con la ac=vidad transcriptasa inversa. 2. TERC: componente RNA de la teromerasa que actúa como molde. 3. Desquerina: proteico, se encarga del ensamblaje entre TERT y TERC. El enzima con=ene su propio molde de RNA (TERC) con la secuencia repe=da CyAx adecuada para sinte=zar la hebra TxGy del extremo 3’ del telómero. Acción de la telomerasa: alarga el extremo 3’ saliente. El molde interno RNA de la telomerasa se aparea con la región 5ʹ-TxGy-3’ del DNA cromosómico en su extremo 3’ y añade residuos T/G al DNA por su ac=vidad transcriptasa inversa. La telomerasa se desplaza para reposicionar el molde interno y con=nuar la adición de más residuos T/G. Después de la extensión de la hebra 5ʹ-TxGy-3’ por la telomerasa la hebra complementaria CyAx es sinte=zada por el complejo polimerasa α-primasa. La eliminación del RNA cebador por las nucleasas (FEN1+RNasaH1) origina de nuevo un extremo saliente pero el telómero es más largo que el de par=da. La ac=vidad telomerasa está controlada por proteínas especiales TRFs (factor de unión a las repe=ciones teloméricas) para garan=zar que se fabrique una extensión de longitud adecuada en cada extremo cromosómico. En eucariotas superiores el extremo telomérico de cadena sencilla está secuestrado en una estructura especializada: Lazo o Bucle T que se asocia a un complejo de 6 proteínas: “Shelterina”. El bucle T se forma cuando el extremo 3’ libre del telómero (rico en G) se curva hacia atrás e invade la doble hélice. Los complejos de shelterina protegen a los extremos 3’ de los cromosomas haciéndoles inaccesibles a las nucleasas y a los enzimas que reparan roturas de doble cadena. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 En relación al envejecimiento y enfermedad: los telómeros contribuyen a mantener la estabilidad del genoma. Después de cada división de las células somá=cas los telómeros se acortan y, una vez que llegan a una longitud crí=ca, parece ser que contribuyen a desencadenar el deterioro asociado a la edad. La ac=vidad telomerasa disminuye con la edad en las células somá=cas en cada división: sólo es completa en las células germinales y se va perdiendo en las células somá=cas de los tejidos adultos. En las células cancerosas se ac=va la ac=vidad telomerasa y se man=ene constante. Mutaciones en el componente TERT o en la disquerina producen enfermedades congénitas que acortan la vida. La telomerasa es considerada la “enzima de la inmortalidad”. DAÑO EN EL DNA La estabilidad metabólica del DNA está mantenida por: 1. Un proceso de replicación muy exacto 2. Mecanismos que corrigen la información dañada en el DNA. El daño en el DNA es inevitable, las alteraciones del DNA se pueden producir como resultado de: Defectos de síntesis (errores de replicación: 1 error cada 106 -108 nt), etc Procesos espontáneos (desaminación y despurinación de nucleó=dos) Agentes ambientales (modificación química de nucleó=dos, radiación uv, oxidación...) El daño en el DNA puede llevar al bloqueo de la replicación o la transcripción, y conducir a una alta frecuencia de mutaciones, llegando a la muerte celular o una replicación incontrolada (células normales —> cancerosas). Es imprescindible repararlas porque la información gené=ca debe transmi=rse de manera intacta de célula a célula en la división celular, exis=endo sistemas de reparación para reconocer y reparar los daños en el DNA. Cuando no se reparan los daños en el DNA se producen mutaciones (cambios en la secuencia) que se clasifican en: Mutaciones por sus=tución Mutaciones por inserción Mutaciones por deleción Mutación silenciosa (en DNA no esencial o sin afectar la función del gen). ALTERACIONES FRECUENTES EN LAS BASES Desaminación Procesos Daños inducidos por Despurinación Reacción con reac=vos químicos espontánea oxida=vos la radiación Pérdida de Pérdida de bases Ácido nitroso (HNO2), aminas, Radicales La exposición a la luz grupos amino púnicas como agentes alquilantes (-CH3) libres: OH UV forma dímeros de consecuencia de la Adición de grupos me=lo o e=lo (hidroxilo) pirimidina, que pérdida de unión a varias posiciones en las bases distorsionan la entre las bases del DNA estructura del DNA y púnicas y la Muchos carcinógenos reaccionan bloquean la desoxirribosa, con bases del DNA, lo que transcripción o la dejado un si=o resulta en la adición de grupos replicación más allá apurínico en el químicos voluminosos a la del si=o del daño. DNA (AP) molécula de DNA Los errores no corregidos producen mutaciones que pueden tener como consecuencia la muerte celular y el cáncer (mutaciones en oncogenes, genes supresores de tumores y genes de reparación del DNA). En muchos casos, las mutaciones en genes que codifican las proteínas de revisión y reparación se asocian a =pos de cáncer hereditarios. SISTEMAS CELULARES DE REPARACIÓN DEL DNA La reparación del DNA es posible gracias a que la información gené=ca está almacenada en las dos cadenas complementarias: la lesión en una cadena es eliminada y reemplazada de forma precisa empleando la hebra complementaria como molde. Gracias a los sistemas de reparación, menos de 1 error de cada 1000 se transforma en mutación. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 Existen numerosos sistemas de reparación, muchos de los cuales son procesos con gran gasto energé=co: Reparación por Reparación de Reparación por Sist. de reparación de Reparación directa escisión de apareamientos escisión de bases rotura de doble hebra nucleó6dos incorrectos Consiste en la Sist. -complejo de los Uno de los +imp.: vía Dis=ngue la base Una de las mayores reparación de mecanismos de principal de errónea en la amenazas para la lesiones en el DNA reparación. reparación de muchas cadena hija, sin viabilidad celular porque sin sus=tuir ninguna Se u=liza para lesiones ambientales afectar a la cadena grandes segmentos de los base o nucleó=do reparar nucleó=dos como fotoproductos molde. cromosomas, y los cientos invir=endo la modificados cuyas (dímeros de T) y Se inicia con la de genes que con=enen, reacción química bases han sufrido bases modificadas intervención de las pueden perderse si no se responsable del daño menor. por exposición a proteínas MutS, repara la ruptura. daño en el DNA. Repara lesiones benzopirenos (humo MutL y MutH. Dos vías principales de Solo unos pocos frecuentes en el DNA de los cigarrillos, Emparejamient reparación: =pos de daño se (productos de fritos, ahumados…) Se o incorrecto es Recombinación reparan por desaminación de C, A encuentra en células reconocido por homóloga: la inversión directa. y G, oxidación de de todos los Mut S y se une información del Fotoreac=vación: purinas, bases organismos. +MutL y MutH. cromosoma mecanismo de alquiladas y dímeros El sistema NER: actúa MutH: homólogo que reparación de de pirimidina en en la reparación ac=vidad coincide con el dímeros de algunos org.). global del genoma, y endonucleasa dañado se u=liza para =mina inducidos 1º se escinden las en una ac=vidad de que corta la reparar la rotura. por UV= bases modificadas y reparación acoplada a hebra no Los cromosomas se distorsión de la después se remplaza la transcripción, que mime=lada en unen, y la región no e doble hélice y se el nucleó=do. revisa el DNA justo el entorno de dañada del homólogo interrumpe la La escisión de las antes de ser la secuencia se u=liza como molde replicación a bases modificadas la transcrito. GATC, próxima para reemplazar la par=r del punto. cataliza un grupo de La vía general de al error. región dañada del DNA fotoliasas enzimas: DNA reparación de la Mut S y MutL cromosoma roto. u=lizan la glucosilasas= escisión de eliminan el Es "más limpia" que la energía de la luz 1. Reconocen las nucleó=dos es similar fragmento, de unión no homóloga y visible para lesiones y en todos los participa forma proceso de en el no suele causar excisión de nucleot romper los eliminan la base organismos. A conjunta, con mutaciones.. dímeros de afectada 1. Excinucleasa se ac=vidad Unión de los pirimidina, rompiendo el une al DNA en el exonucleasa y extremos no invir=endo la enlace N- si=o de una lesión helicasa. homólogos: los dos reacción de glucosídico entre y rompe la hebra El hueco se extremos rotos del dimerización. base y pentosa. de DNA dañada a rellena y sella cromosoma se pegan 2. Tras extraer la cada lado de la por una DNA de nuevo. base, una AP lesión. polimerasa y Este mecanismo de endonucleasa 2. El segmento de ligasa. reparación es elimina el resto DNA se elimina "desordenado" e del nucleó=do. con la ayuda de implica la pérdida de Estas enzimas una helicasa. nucleó=dos en el si=o eliminan parte 3. El hueco se de corte. de la hebra de rellena con la DNA alrededor DNA polimerasa del si=o AP. 4. La muesca 3. La DNA restante se sella polimerasa I con la DNA ligasa. remplaza el nucleó=do completo. (En procoridal 4. La DNA ligasa I En eucarista - otral prot. aparcamiento yreconocen el sella la mella. pueden para repor el int error) unirse y 7 23 Fig. + Reparación DNA y Cáncer Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 TEMA 6. TRANSCRIPCIÓN La transcripción es el proceso encargado de la síntesis de una molécula de RNA a par=r de la información gené=ca contenida en una región concreta de DNA de doble cadena (se desenrolla transitoriamente); está catalizado por RNA polimerasas dependientes de DNA (transcriptasas) en todos los organismos. El RNA obtenido =ene una sec.bases complementaria y an=paralela a la de la hebra molde de DNA. En la reacción intervienen dos iones Mg2+, unidos a los grupos fosfatos de los nucleósidos trifosfatos entrantes (NTP) y a tres residuos de Asp, que están muy conservados en las RNA polimerasas de todas las especies. ANALOGÍAS DIFERENCIAS entre replicación y transcripción 1. Ambos procesos requieren 1. En la replicación se copia el cromosoma entero= DNA hijo idén=co al DNA molde en estructura parental. Todas las moléculas de la célula se replican a la vez, y lo hacen una desenrollada, 4 nts 5'- sola vez durante el ciclo celular. trifosfato e iones Mg2+ Sin embargo, la transcripción es selec=va: no todos los genes se transcriben 2. La RNA polimerasa elonga a la vez durante la vida de la célula. una cadena de RNA por 2. Las RNA polimerasas no requieren un cebador para iniciar la síntesis: adición de unidades de comienza generalmente con un residuo ATP o GTP, cuyo grupo 5'-trifosfato ribonucleó=dos al extremo 3' no es cortado para liberar PPi, sino que se man=ene intacto durante toda la -OH de la cadena naciente. La transcripción. síntesis del RNA transcurre 3. La transcripción es asimétrica: solamente se transcribe una de las dos siempre en dirección cadenas del DNA para cada gen. 5’—>3‘ y la lectura del DNA 4. La transcripción u=liza ribonucleó=dos 5'-trifosfato (ATP, GTP, UTP y CTP) en en 3’—>5’. lugar de desoxirribonucleó=dos 5'-trifosfato (dATP , dGTP, dTTP y dCTP). La reacción global es: 5. La RNA polimerasa carece de ac=vidad correctora exonucleasa 3’—>5'. (RNA)n + NTP (RNA)n+1 + PPi (errores con menos consecuencias para la cél. que los de la transcripción). 3. Idén=cas reglas de 6. En la fase de elongación, el extremo en crecimiento de la nueva cadena de emparejamiento de RNA se aparea temporalmente con el DNA nucleó=dos: A=U y G≡C molde, originando una doble hélice híbrida 4. Fases de unión e inicio, RNA-DNA de ~ 8 pb de long. elongación y terminación El RNA en este dúplex híbrido se separa poco después de su formación. Orientación y nomenclatura de las cadenas en relación a la síntesis RNA En un gen, las dos hebras de DNA complementarias que lo forman =enen papeles diferentes en la transcripción y se definen por su función: molde y no molde. La cadena de RNA se sinte=za a par=r de la hebra molde y es idén=ca en secuencia (con U en lugar de T) a la hebra codificante (no molde). Ambas cadenas de DNA pueden codificar para proteínas, cada una codifica un nº de proteínas. TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS En procariotas y en orgánulos de eucariotas (mitocondrias y cloroplastos) se u=liza una sola RNA polimerasa para sinte=zar todos los =pos de RNA (mRNA, tRNA y rRNA). La enzima añade alrededor de 30 nt/s, con una tasa de error de 1 en 105 y elevada procesividad. La enzima completa (holoenzima), está formada por 5 subunidades principales α, β, β', ω y σ. Las subunidades α2, β, β', ω forman el núcleo de la enzima: o 2 subunidades α: ensamblan el núcleo de la enzima y se unen a sec.reguladoras en el DNA (regiones UP). o Subunidades β y β': cons=tuyen el si=o catalí=co de la elongación (ac=vidad polimerasa): β par=cipa en la formación de los enlaces fosfodiéster y β' se une al DNA molde y par=cipa en el inicio de la transcripción. o Subunidad ω: par=cipa en el ensamblaje de la holoenzima. Parece que protege a la polimerasa de la desnaturalización, siendo necesaria para devolver a la polimerasa a su estado na=vo. Para iniciar la transcripción, el núcleo de la enzima (α2, β, β', ω) requiere la unión débil de la subunidad σ (polipép=do independiente), que par=cipa reconociendo los si=os de inicio de la transcripción (sec. promotoras). Una vez lanzada la síntesis de RNA, la subunidad σ, se disocia del núcleo y la enzima con=nua la síntesis de RNA. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 ¿Cómo reconoce la RNA polimerasa las regiones de transcripción en el DNA? En el DNA existen sec. reguladoras específicas que indican el principio y el final de las regiones que se han de transcribir, así como la cadena que actúa de molde. La unidad de transcripción de un gen consta de tres regiones: promotor, sec. codificante y señal de terminación. El inicio de la transcripción =ene lugar cuando la RNA polimerasa, por medio de la subunidad σ, reconoce las secuencias específicas (promotores) y sin desenrollar el DNA se une a ellas; el reconocimiento se produce por medio de la interacción con diversos nucleó=dos del promotor en el DNA. PROMOTORES PROCARIOTAS Las secuencias no son idén=cas en todos los promotores, pero ciertos nucleó=dos se encuentran con más frecuencia que otros, aquellos que se repiten con mayor frecuencia cons=tuyen las sec. consenso del promotor. Teniendo en cuenta que la posición +1 en el DNA corresponde al primer nucleó=do que aparece en la molécula de RNA sinte=zada, las dos secuencias del promotor se corresponden con las regiones -10 (Prinbow box) y-35. Ambas secuencias son reconocidas por las subunidad σ de la RNA polimerasa. Además, en algunos promotores (genes con alta tasa de transcripción), desde la posición-40 a -60 existe una zona rica en A/T (elemento UP) que es reconocida por las subunidades α del núcleo de RNA-polimerasa. ETAPA 1: INICIO DE LA TRANSCRIPCIÓN POR LA RNA POLIMERASA DE E. COLI 1. La RNA polimerasa se une al DNA con una baja afinidad 2. Migra hasta llegar a una sec. promotora a la que se une con mayor afinidad gracias a la interacción específica del factor σ (unión específica a regiones -35 y -10 del promotor), formándo el “complejo cerrado” (DNA doble hebra intacto). 3. Empezando en la región -10 hasta la posición +2 o +3, la RNA polimerasa desenrolla unas 12-14 bases del DNA para formar el “complejo abierto”, que permite que tenga lugar la transcripción (subunidad β’). 4. El “complejo abierto” (DNA parcialmente desenrollado) deja al descubierto la hebra molde en el si=o de inicio. 5. Inicio de transcripción: ac=vidad polimerasa (subunidad ß). 6. Después de añadir aproximadamente 10 nucleó=dos, el factor σ es liberado de la RNA-polimerasa. ETAPA 2: ELONGACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN Durante la elongación, el núcleo de la RNA polimerasa se desplaza a lo largo del DNA: las subunidades β y β’ forman un canal interno donde acomodan unos 17-20 pb de DNA y con=ene el si=o ac=vo de la polimerasa. A medida que la RNA polimerasa se desplaza se desenrolla el DNA (ac=vidad helicasa propia de la RNA polimerasa), dejando al descubierto la hebra molde para la síntesis del RNA. Simultáneamente, el DNA se vuelve a enrollar por detrás de la enzima a medida que se transcribe el RNA (por acción de topoisomerasas). La RNA polimerasa man=ene en todo momento unos 17 pb desenrollados para formar una burbuja de transcripción que se va desplazando por el DNA. En la zona desenrollada se forma un híbrido corto de RNA-DNA (≈8pb de long.). La elongación transcurre a una velocidad de unos 50-90 nt por segundo. ETAPA 3: TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN TERMINACIÓN INTRÍNSECA La terminación está controlada por la presencia de secuencias específicas de terminación que aparecen en el extremo 3’ del RNA transcrito. La más frecuente es la presencia en el tránscrito de una región simétrica inver=da, rica en repe=ciones GC y seguida de 7 residuos U (favorece la disociación del RNA del molde). La transcripción del segmento con elevado contenido en G≡C favorece la formación en el RNA de una estructura en horquilla, las cual desestabiliza el híbrido RNA-DNA molde y termina la transcripción. Inmediatamente después se forma el dúplex de DNA y la polimerasa se libera del mismo. Este mecanismo no es universal. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-10009677 TERMINACIÓN DEPENDIENTE DE PROTEÍNA RHO (ρ) Algunas moléculas de RNA carecen de una secuencia rica en G≡C y otras no con=enen la repe=ción de U, de manera que la terminación de la transcripción en muchos de estos casos requiere la presencia de una proteína reguladora específica (ρ: rho). La proteína ρ está presente en el citosol en forma de hexámero, es una ATPasa muy ac=va con afinidad por el RNA monocatenario y que actúa como una RNA-DNA helicasa. 1. Rho se une al RNA monocatenario (formado y fuera de la burbuja) en una sec.específica (si=o rut: 50-90 nt). 2. Migra a lo largo del transcrito hasta alcanzar el complejo de transcripción. 3. Lo disocia de la RNA polimerasa y del molde de DNA (con gasto de ATP): se desconoce el mecanismo exacto por el que la proteína facilita la liberación del transcrito. En procariotas, el DNA molde empleado en la transcripción no está ïsicamente aislado de la maquinaria de traducción (no existe membrana nuclear-núcleo). La molécula de mRNA resultante de la transcripción ya es funcional, no experimenta transformaciones adicionales y se u=liza de inmediato como molde para la traducción. Por lo tanto, los procesos de transcripción y traducción están acoplados. Sin embargo, la mayoría de los tRNA y rRNA deben sufrir una maduración posterior (igual que RNA eucariota). TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS La transcripción en eucariotas es más compleja que en procariotas, ya que el genoma eucariota es más grande, con mucha más información y está agrupada en un número variable de cromosomas (dependiendo de la especie). Dependiendo del tejido o etapa del desarrollo, los genes que se van a transcribir son diferentes (proceso de mucha discriminación). La mayor parte del DNA está empaquetado por las histonas formando heterocroma=na pero para que tenga lugar la transcripción, la croma=na debe estar en estructura abierta. Además necesita varios 6pos de RNA polimerasas y éstas requieren de proteínas reguladoras adicionales: factores de transcripción para iniciarla. En la transcripción del mRNA se forma un producto primario: el hnRNA (RNA heterogéneo nuclear) que debe ser procesado para dar lugar a un mRNA maduro y funcional. La transcripción y la traducción se llevan a cabo en compar=mentos celulares dis=ntos. RNA POLIMERASAS DE EUCARIOTAS Los eucariotas =enen 3 RNA polimerasas diferentes (I, II y III): estructuralmente similares entre si y con la polimerasa bacteriana; diferenciándose en su especificidad hacia el molde y en su localización en el núcleo, además cada una =ene una función específica y actúan en diferentes secuencias promotoras, transcribiendo dis=ntos =pos de genes.