Biología Molecular y Citogenética - PDF

3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos 3. A plicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos 3.1. Ácidos nucleicos 3. Los ácidos nucleicos (ácido desoxirribonucleico o ADN, y ácido ri- bonucleico o ARN) son químicamente muy similares. La estructura primaria de ambos son polímeros lineales compuestos de monómeros llamados nucleótidos. El ADN es el material genético de todos los organismos celulares, aunque el ARN tiene esa función en muchos virus. En las células, la in- formación almacenada en el ADN se usa para gobernar las actividades celulares a través de la formación de mensajes de ARN. 3.1.1. Estructura y composición química A) COMPONENTE BÁSICO: BASES NITROGENADAS Son moléculas heterocíclicas, con varios átomos de nitrógeno, forma- das bien por un anillo único (pirimidina) o por dos anillos condensados (purina). Las purinas características de los ácidos nucleicos son ade- nina (A) y guanina (G), ambas presentes en los nucleótidos del ADN y ARN. Las pirimidinas características de los ácidos nucleicos son la citosina (C), la timina (T) y el uracilo (U). La C está presente en los nucleótidos que componen tanto al ADN como al ARN, mientras que la T sólo forma los nucleótidos que componen al ADN y el U, únicamente los nucleótidos que componen al ARN. 53 Biología molecular y citogenética B) COMPONENTE NEUTRO: AZÚCARES El azúcar siempre es una pentosa (monosacárido con 5 átomos de car- bono), bien la D-ribosa o la D-desoxirribosa. La pentosa que compone el nucleótido es la D-ribosa para el ARN y la D-desoxirribosa en el caso del ADN. Los nucleótidos que contienen ribosa se denominan ribonucleótidos, mientras que los que contienen desoxirribosa, desoxirribonucleótidos. La unión de una base nitrogenada y la pentosa produce un nucleósi- do, mediante un enlace covalente denominado N-glucosídico que se forma entre el C-1’ de la pentosa y el N-1 de las pirimidinas o bien el N-9 de las purinas. Si la base nitrogenada se une a una ribosa da lugar a los ribonucleósidos, y si, por el contrario, lo hace a una desoxirribosa genera los desoxirribonucleósidos. C) COMPONENTE ÁCIDO: FOSFATOS El fosfato inorgánico (Pi), mezcla de las especies químicas resultan- tes de la disociación de la molécula de ácido fosfórico, aparece como anión a pH ácido, como dianión a pH fisiológico y como trianión a pH alcalino. En la célula, el fosfato se encuentra tanto en forma libre (Pi) como formando parte de numerosos compuestos orgánicos, resulta- do de un enlace éster entre el fosfórico y un grupo hidroxilo (alcohol); entre ellos se encuentran los nucleótidos. La unión de un grupo fosfato a un nucleósido da lugar a una molécula de nucleósido monofosfato o nucleótido que son los componentes de los ácidos nucleicos. El fosfa- to se une al nucleósido mediante un enlace éster con el -OH del carbo- no 5’ de la pentosa. Los nucleótidos son moléculas ácidas, ya que el grupo fosfato se ioniza en medio acuoso. Cadenas de ácidos nucleicos o polinucleótidos Los nucleótidos se unen mediante enlaces fosfodiéster para dar lugar a cadenas de ácidos nucleicos o polinucleótidos. Dicho enlace tiene lugar entre el C-5’-fosfato de un nucleótido y el C-3’-hidroxilo del si- guiente nucleótido. La unión sucesiva de nucleótidos mediante enlace 3,5-fosfodiéster genera un polinucleótido polarizado; es decir, con extre- mos diferentes. 54 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos Por un lado de la cadena se encuentra un extremo 5’-fosfato y, por el otro, un extremo 3’-hidroxilo. Si la cadena es de ribonucleótidos, se genera un polirribonucleótido o cadena de ARN, mientras que si la ca- dena se forma con desoxirribonucleótidos se origina un polidesoxirri- bonucleótido o cadena de ADN. Los nucleótidos que constituyen las cadenas de ADN contienen las bases A, G, T y C; mientras que los que forman las cadenas de ARN están constituidos por las bases nitrogenadas A, G, C y U. Por consenso universal, la secuencia de nucleótidos en una cadena de polinucleótidos se escribe en dirección 5’ → 3’, y el orden exacto de nucleótidos o se- cuencia de la cadena se considera la estructura primaria de los ácidos nucleicos. Una propiedad característica de las bases púricas y pirimidínicas, debi- da a su carácter aromático, es que, en el espectro de absorción, a pH = 7, se observa un fuerte pico de absorción de la luz en el ultravioleta (UV), con un máximo cerca de 260 nm para todas ellas. Los nucleótidos no sólo son importantes como «bloques de construc- ción» de los ácidos nucleicos, también tienen funciones por sí mismos. La mayor parte de la energía que utiliza un organismo vivo, en un mo- mento determinado, proviene del nucleótido trifosfato de adenosina (ATP). El trifosfato de guanosina (GTP) es otro nucleótido de enorme importancia en las actividades celulares, al unirse a diversas proteínas (llamadas proteínas G) y actuar como «interruptor» para iniciar sus actividades. 55 Biología molecular y citogenética 3.2. ADN 3.2.1. Estructura primaria del ADN Corresponde a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido puesto en línea. La información genética está contenida en el orden exacto de las bases nitrogenadas que componen los nucleótidos, y si se modifica alguna de estas bases o su orden se alterará la información. 3.2.2. Estructura secundaria del ADN En células eucariotas se encuentra como una doble cadena de poli- desoxirribonucleótidos (ADN double strand, ADNds). Las dos cadenas giran alrededor de un eje de simetría imaginario y forman una estruc- tura helicoidal, la «doble hélice del ADN». En la hélice del ADN, la co- lumna hidrofílica de desoxirribosa-fosfato de cada cadena está en el exterior de la molécula, mientras que las bases nitrogenadas hidrófo- bas se orientan hacia el interior. La relación espacial que se genera por el giro entre las dos cadenas de la hélice crea un surco mayor (ancho) y uno menor (estrecho). La doble cadena tiene tres características: Es antiparalela; es decir, el extremo 5´ de una se asocia con el ex- tremo 3’ de la otra. Es complementaria. Las bases nitrogenadas de una de las cadenas se unen, mediante puentes de hidrógeno, a las de la otra cadena, de manera que A siempre se une a T, y G a C. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos de una cadena define y complementa la secuencia de nucleótidos en la otra. Los pares de bases (pb) se mantienen 56 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos unidos mediante 2 enlaces de hidrógeno entre A y T, y 3 entre G y C. El apareamiento específico de bases entre las cadenas de ADN sustenta las reglas de Chargaff: en cualquier muestra de ADNds, la cantidad de A es igual a la cantidad de T, la cantidad de G es igual a la de C, y la cantidad de purinas es igual a la de pirimidinas. Forma un giro helicoidal dextrógiro o levógiro. La mayoría del ADN en las células es una hélice dextrógira. El patrón de difracción por rayos X del ADN indica que las bases apiladas están separadas por un espacio regular de 0,36 nm a lo largo del eje de la hélice. La hélice da un giro completo cada 3,6 nm; por lo tanto, hay alrededor de 10,5 pb por giro. Esto se denomina forma B del ADN, forma nor- mal presente en la mayoría del ADN celular y que se corresponde con la descrita por Watson y Crick en 1953. 3.2.3. ADN circular El ADN mitocondrial y el de células procariotas se encuentra en forma de molécula circular, sin extremos (no hay interrupción de los enlaces fosfodiéster). Es posible encontrarlo en forma relajada o superenrolla- da y más compacta, donde la hélice del ADN (ya enrollada) gira sobre sí misma (superenrollada) y genera una superhélice. El superenrollamien- to se produce debido a la acción de unas enzimas conocidas como topoisomerasas (porque cambian la topología del ADN), que mediante el corte transitorio de una (topoisomerasa I) o ambas cadenas (topoi- somerasa II) introducen un aumento o disminución (superenrollamien- to positivo o negativo, respectivamente) en el número de vueltas de hélice. El ADN circular superenrollado permite la compactación para ocupar menos espacio en la célula; también permite que posiciones le- janas en la secuencia se aproximen, además de regular la accesibilidad a la información genética y la expresión génica, al mantenerse inaccesi- ble para factores de transcripción. 57 Biología molecular y citogenética 3.2.4. Niveles de empaquetamiento del ADN Debido a la longitud del ADN genómico en células eucariotas (alrede- dor de 2 metros/célula) es necesaria su compactación, de manera que quepa dentro del núcleo. El ADN se asocia con nucleoproteínas (histonas y no-histonas) para formar la cromatina y dar origen a los cromosomas. Nucleosoma. Las histonas11 son proteínas con carga positiva a pH fisiológico. Esta propiedad les permite asociarse a la molécula de ADN (de carga negativa). Dos moléculas de histona se asocian para formar un octámero (2 moléculas H2A, 2 H2B, 2 H3 y 2 H4, organizadas en un tetrámero H3-H4 y dos dímeros H2A-H2B). Un segmento de ADNds de unos 146 pb se enrolla dando 1.65 vueltas al octámero para formar el nucleosoma. Los diferentes fragmentos de ADN presentes en el núcleo se asocian a diversos octámeros y forman una cadena de nucleosomas conocida como «cuentas de collar». Entre cada nucleosoma queda un segmento de ADN, de aproximadamente 55 pb, denominado ADN enlace o linker. La fun- ción del nucleosoma es condensar el ADN. El ADN linker se asocia, con otra histona (H1, o histona de unión) que interacciona con la región de entrada y salida del ADN en torno al octámero, ayudando al empaquetamiento del ADN, lo que facilita la formación de una estructura, llamada solenoide. Solenoide. Estructura generada cuando los nucleosomas se com- pactan para formar un polinucleosoma de 6 unidades mediante interacciones entre las H1 de cada nucleosoma. El solenoide forma una hebra de 30 nm, conocida como cromatina; esta puede encon- trarse activa (o no compactada) y recibe el nombre de eucromatina. La cromatina inactiva se encuentra compactada y se la conoce como heterocromatina. 11 El extremo aminoterminal de las histonas puede unirse, de manera reversible, a grupos acetilo, metilo o fosfato, lo que se conoce como modificaciones epigenéticas; la adición de estos grupos modifica la unión de las histonas al ADN y, así, regula la disponibilidad de la información génica. 58 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos Asas cromatínicas. La fibra de 30 nm se pliega y condensa aún más, formando asas amplias y superenrolladas, las cuales se an- clan sobre proteínas y dan lugar una hebra de 300 nm de grosor. Cromosoma condensado. Formado por compactación de las asas cromatínicas. Posee 700 nm de espesor y es visible durante la interfase. Cromosomas mitóticos. Las cromátides hermanas visibles en la metafase de la mitosis representan la última etapa de la organiza- ción del ADN. 3.2.5. Desnaturalización y renaturalización del ADN La desnaturalización es la pérdida de la estructura helicoidal (secun- daria) característica de la molécula de ADN. El proceso ocurre por la rotura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas, lo que ocasiona la separación de las dos cadenas antiparalelas sin que se altere la estructura primaria (los enlaces fosfodiéster no resultan afectados). Puede ocurrir por exposición de los ácidos nucleicos a agentes quí- micos o físicos, enzimas (topoisomerasas, girasas y helicasas) y cambios de pH (un pH extremadamente básico o ácido puede des- naturalizar el ADN; sin embargo, también puede dar lugar a rotura de enlaces fosfodiéster, y, por lo tanto, a pérdida de estructura primaria). La temperatura es el agente desnaturalizante más representativo debili- tando las fuerzas estabilizadoras de la doble hélice. La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la que se ha desna- turalizado el 50% de las moléculas de ADN de la muestra que se está calentando. Representa el punto en que la energía aplicada es suficien- te para romper la mitad de los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las 2 cadenas de ADN12. 12 Una muestra de ADN con alto contenido en G y C tiene mayor Tm que una con alto contenido en A y T, ya que G y C están unidas por 3 puentes de hidrógeno, mientras A y T lo están por 2. 59 Biología molecular y citogenética El ADN desnaturalizado puede renaturalizarse si se retira gradualmente el agente desnaturalizante. Así, si una solución de ADN, desnaturaliza- da por calentamiento, se enfría lentamente, las 2 cadenas se vuelven a asociar por complementariedad de sus bases. 3.3. ARN Ácido nucleico más abundante en la célula eucariota (10 veces más que ADN). Suele ser monocatenario (una sola cadena, ARNss). Contiene uracilo en lugar de timina. La pentosa que constituye sus nucleótidos es la ribosa (la presencia del grupo -OH en su C2’ provoca que sea una molécula químicamente inestable). Estructura primaria. Determinada por la secuencia lineal de sus ribonucleótidos, que se escriben siempre en dirección 5’-3’. Estructura secundaria. Viene dada por el apareamiento de secuen- cias complementarias en la misma cadena de ARN (asociación intracatenaria parcial) o por asociaciones intercatenarias, en el caso de los ARNds de ciertos virus. Estructura terciaria. No siempre se forma, sólo cuando las condi- ciones celulares propician la interacción entre bases nitrogenadas de diferentes regiones de una misma molécula de ARN. 3.3.1. Tipos de ARN ARN heterogéneo nuclear (transcrito primario o ARNhn), de alto peso molecular. Es el producto inicial de síntesis de la ARN poli- merasa en el proceso de transcripción. En el núcleo de células eucariotas actúa como precursor de los demás tipos de ARN del ci- toplasma. Su fragmentación para formar otros tipos de ARN supone 60 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos la maduración o procesamiento del ARN. En células procariotas actúa directamente como molde para la síntesis de proteínas, sin necesidad de maduración o modificaciones postranscripcionales. ARN mensajero (ARNm). Sirve de molde para la síntesis de pro- teínas en la traducción, ya que contiene la información génica para la formación de uno (o varios) polipéptidos. Se localiza en el citoplasma y su longitud es variable según la proteína para la que codifique; contiene, además, las señales necesarias para el inicio y terminación de la traducción. En eucariotas presenta caracterís- ticas especiales: en su extremo 5’ muestra una capucha (cap) y en el extremo 3’, una cadena de poliadeninas (cola poliA) de longitud variable. Estas modificaciones aumentan la vida media de la mo- lécula en el citoplasma y permiten su disponibilidad en el proceso de traducción. Las moléculas de ARNm procariota son policistróni- cas, es decir, portan información para la síntesis de varias proteínas distintas. Las moléculas de ARNm eucariota son, por el contrario, monocistrónicas, llevan información para la síntesis de una única proteína. ARN ribosómico (ARNr). Forma parte de los ribosomas, en los que se realiza la síntesis de proteínas. Sus estructuras secundaria y ter- ciaria presentan un plegamiento complejo que le permite asociarse tanto a las proteínas de los ribosomas como a otros ARNr y partici- par en el proceso de síntesis proteica. ARN de transferencia (ARNt). Se conocen unos 32 distintos y se encuentran en todas las células. Intervienen en la síntesis de proteínas, ya que van unidos a un aminoácido que liberarán en el ribosoma durante la traducción. Su estructura secundaria pre- senta un plegamiento complejo (en «hoja de trébol») que da lugar a 4 horquillas y 3 bucles o lazos; donde se encuentran zonas con apareamiento de secuencias complementarias y otras sin aparea- miento de ellas, y en donde se pueden distinguir regiones críticas, como la de unión al aminoácido (extremo 3’, que termina con una secuencia 5’-CCA-3’), el brazo donde se ubica la secuencia del an- ticodón que reconoce los codones del ARNm, el brazo D que es el sitio de unión de la enzima encargada de unir el aminoácido corres- pondiente al extremo 3’ y el brazo T, sitio de unión al ribosoma. Se pliega tridimensionalmente en una estructura terciaria en forma de L. Contiene hasta un 10% de bases distintas a las habituales. 61 Biología molecular y citogenética ARN pequeño nuclear (ARNsn). Presente en el núcleo eucariota, implicado en procesos de maduración del ARNhn (ARN hetero- géneo nuclear, agrupa a todos los tipos de ARN que acaban de ser transcritos; son moléculas de diversos tamaños). En tal proceso, se asocia a proteínas, formando ribonucleoproteínas pequeñas nu- cleares (RNPsn) que se encargan de eliminar intrones (fragmentos de ARNhn que no aparecen en el ARNm). Así, cuando se une al precursor del ARNm para eliminar intrones se forma un complejo ARN-proteína de gran tamaño, visible al microscopio electrónico, y que se denomina espliceosoma. Enzimas de ARN (ribozimas). Funcionan como catalizadores bio- lógicos. Poseen, al igual que enzimas, un sitio activo, uno de unión para el sustrato y uno de unión para un cofactor que puede ser un ion metálico. siARN. Moléculas de ARNds de 20-25 nucleótidos. La interferencia del ARN (iARN) es un fenómeno por el cual, pequeñas moléculas de ARNds, inhiben la expresión génica de manera secuencia-es- pecífica. Existen varios tipos de ARN interferentes, entre ellos los shARN (short hairping RNA) que, a su vez, dan lugar a los siARN (small interfering RNA). El siARN se une a una secuencia comple- mentaria del ARNm; esta unión produce la degradación enzimática del ARNm en células eucariotas. Micro ARN (miARN). Moléculas de ARNss de 21-23 nucleótidos, encargadas de regular la expresión génica. Se unen a una secuen- cia complementaria del ARNm y bloquean la traducción. El miARN no es totalmente complementario a la secuencia del ARNm; en este caso, el ARNm no se degrada, pero tampoco puede utilizarse para la síntesis proteica. Algunas zonas de molécula del ARN pueden tener secuencias complementarias. La complementariedad oca- sional de bases da origen a estructuras en horquilla, formaciones típicas, en las cuales parte de la cadena de ARN es complementaria y origina puentes de hidrógeno. Si las regiones complementarias están separadas por una secuencia no complementaria, en el ex- tremo de la horquilla se forma un bucle (loop o asa de bases). 62 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos 3.4. El fujo de la información genética 3.4.1. Replicación Proceso por el que 1 molécula de ADN se duplica para dar lugar a dos moléculas de ADN hijas idénticas; es decir, conservan la misma secuencia de bases que la original. Se produce en la fase de síntesis (S) del ciclo celular y es un hito obligado para la división celular. Su objetivo es el de conservar la información genética. La síntesis de cadenas de ADN se lleva a cabo en dirección 5’ → 3’ tanto en eucariotas como procariotas. A este proceso se le llama poli- merización, y consiste en la unión de un dNTP (desoxirribonucleótido) complementario a la hebra molde. Es semiconservativa. En cada replicación, una molécula de ADN recién sintetizada conserva una de las cadenas originales y la otra es sintetizada de novo. Es bidireccional en eucariotas, ya que, a partir del sitio de origen, se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos, con dos puntos de crecimiento, las horquillas de replicación. En organismos euca- riotas, debido al gran tamaño del ADN, existen múltiples orígenes de replicación (sitios Ori), por lo que a la replicación se la considera multifocal. Los sitios Ori son secuencias específicas ricas A y T y controlan la replicación de una unidad de ADN (replicón). La presen- cia de bases A:T facilita la separación de las hebras y la formación de la burbuja de replicación. En los cromosomas bacterianos y ví- ricos existe un origen único de replicación por molécula de ADN; este sitio Ori permite la replicación de todo el ADN circular, es decir, la replicación es monofocal. 63 Biología molecular y citogenética La replicación siempre se produce en sentido 5’ → 3’, y el extremo 3’-OH libre es el punto a partir del cual se produce la elongación del ADN. Como las hebras tienen que crecer de forma simultánea a pesar de que son antiparalelas, la cadena que se sintetiza en el sentido en el que avanza la horquilla de replicación se denomina hebra adelantada, líder o conductora (leading strand), y se sintetiza de forma continua, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario (3’ → 5’) al avan- ce de la horquilla se denomina hebra rezagada o retrasada (lagging strand)13, y su síntesis se realiza de forma discontinua o en fragmentos (fragmentos de Okazaki; cuya longitud suele variar entre 1.000-2.000 nucleótidos en bacterias y entre 100-400 nucleótidos en eucariotas). 3.4.1.1. Enzimas que participan en la replicación Helicasa: encargada de separar las dos hebras del ADN mediante la rotura de los puentes de hidrógeno entre bases nitrogenadas. Ocasiona superenrollamientos positivos a los lados de la burbuja de replicación. Proteínas de unión a cadena sencilla (SSB, single strand DNA binding proteins en procariotas, y RPA, Replication Protein A en eu- cariotas): evitan la formación de puentes de hidrógeno entre las dos cadenas separadas por la helicasa. Topoisomerasas: isomerasas que actúan sobre la topología del ADN (vid. supr.), pueden cortar o formar enlaces fosfodiéster ya sea en una de las hebras (topoisomerasa I) o en ambas (topoiso- merasa II). La escisión selectiva permite al ADN liberar la tensión de la contorsión, y deshacer el superenrollamiento, que, en caso de persistir, detendría la replicación. Así, se permite el acceso a todas las enzimas involucradas en la replicación. Primasa: sintetiza pequeños fragmentos de ARN de 8-10 nucleó- tidos: cebadores o primers, complementarios a un fragmento de ADN. La unión de los cebadores al ADN proporciona el extremo 3´ necesario para que la ADN polimerasa (que no puede añadir 13 Para disponer de una cierta longitud de ADN molde para continuar, hay que esperar a que la horquilla de replicación avance. 64 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos nucleótidos si no existe un extremo 3´libre) lleve a cabo su acción. Los cebadores son degradados, luego, por nucleasas Rnasa H1 y sustituidos por ADN por acción de otra ADN polime- rasa. Para la síntesis de la hebra conductora se requiere un único cebador en el lugar de origen de la replicación. Para la hebra retarda- da, se requiere un cebador para cada fragmento de Okazaki. Rnasa H1: encargada de retirar los cebadores de ARN durante la síntesis de fragmentos de Okazaki y en los procesos de reparación del ADN. FEN1/RTH1 o endonucleasa flap 1 (flap endonuclease 1), se en- carga de remover el ribonucleótido 5’ del fragmento de Okazaki. El Nick (falta de enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos adyacentes) resultante es sellado por la ADN ligasa. Ligasa: cataliza la formación del enlace fosfodiéster entre nucleóti- dos contiguos. Telomerasa: ribonucleoproteína14 con actividad ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa) capaz de sintetizar una determinada secuencia de ADN que permite el alargamiento de los telómeros (extremos de los cromosomas eucariotas). ADN polimerasa: principales enzimas en este proceso. Son capa- ces de sintetizar nuevas cadenas de ADN a partir de una hebra patrón o molde y las unidades estructurales correspondientes (desoxirribonucleótidos). Añade los nucleótidos en dirección 5’ → 3’ siempre y cuando haya un extremo 3’ disponible. Como consecuen- cia de esto, la dirección en la cual leerá la cadena molde de ADN será 3’ → 5’. En eucariotas se han descrito 5 ADN polimerasas involucradas en la replicación del ADN, cada una con una actividad específica: α, β, γ, δ y ε. La polimerasa α (ADNpol α o primasa) inicia la síntesis del ADN me- diante la formación de un cebador ARN. Las polimerasas δ y ε (ADNpol 14 Entre sus subunidades se incluyen la subunidad catalítica transcriptasa inversa (TERT), altamente conservada, la subunidad ARN (TERC o TER), que provee el molde para la síntesis del ADN telomérico, y un set de proteínas específicas de cada especie. 65 Biología molecular y citogenética δ y ADNpol ε) son responsables de la mayor parte de la elongación de ambas hebras del ADN. La polimerasa β (ADNpol β) no interviene en la replicación, sino que está involucrada en la reparación de errores o daños en el ADN. La polimerasa γ (ADNpol γ) lleva a cabo la replica- ción del ADN mitocondrial. De las 5, sólo 3 tienen actividad exonucleasa-3’ (ADNpol δ, γ y ε), es decir, son capaces de corregir los errores cometidos al incorporar nu- cleótidos a la hebra que se está sintetizando, eliminando el nucleótido equivocado y añadiendo el correcto. A diferencia de los eucariotas, en la maquinaria para la replicación de los procariotas, sólo 3 enzimas participan en la síntesis del ADN. La po- limerasa I es la única que tiene actividad exonucleasa 5’ y 3’. 3.4.1.2. Fases de la replicación a) Inicio Las zonas del ADN donde se producen burbujas de replicación no son aleatorias; existen secuencias (de unos 300 pb) que indican los lugares precisos donde ha de comenzar la replicación. Tales sitios son ricos en A y T. El proceso necesita, en primera instancia, que las dos cadenas del ADN se separen. Para ello, la helicasa se une a la cadena de ADN e hidroliza los puentes de hidrógeno. La apertura de la doble hélice hace que las cadenas simples adquieran inestabilidad, compensada por unión de proteínas estabilizadoras RPA. Como ya hemos comentado (vid. supr.), la ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis a partir de desoxirribonu- cleótidos libres; necesita que la primasa sintetice un cebador, a partir del cual incorporará los nucleótidos en forma complementaria a las bases de la cadena molde. b) Elongación Proceso por el que la ADN polimerasa añade nucleótidos, uno a uno, complementarios a la cadena molde y a medida que avanza la hor- quilla; en esta función es ayudada por el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA). La función del PCNA es mantener la ADN 66 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos polimerasa en contacto con la cadena molde. Una vez presente la maquinaria de inicio, la horquilla avanza, aumentando la tensión por delante de la cadena. Para evitar que esta tensión impida el avance, las topoisomerasas (I y II) cortan enlaces fosfodiéster de la doble hélice y vuelven a unirla. En la cadena líder, la síntesis se realiza en forma conti- nua y, en la cadena retrasada, en forma discontinua. En la síntesis dis- continua, para la formación de cada fragmento de Okazaki, se requiere de un cebador intercalado entre los fragmentos; en la cadena continua es necesaria la presencia de un solo cebador. El proceso de elongación es similar en eucariotas y procariotas. c) Terminación Cuando la ADNpol δ llega al extremo del fragmento de ADN, sucede el desacoplamiento de todo el replisoma y finaliza la replicación. Uno de los pasos cruciales en este proceso final es completar la síntesis de la cadena retardada y unir los fragmentos de Okazaki. Es lo que se denomina maduración, y requiere la eliminación de cebadores (por medio de FEN1/RTH1 y RNasa H1), elongación del fragmento de ADN adyacente para rellenar el espacio que queda (por acción de ADNpol δ o ADNpol ε) y unión de los extremos resultantes para formar una cade- na continua (por acción de la ADN ligasa I). d) Replicación de los telómeros Constituye la fase final del término de la replicación. Los telómeros, se- cuencias repetidas de 1-5 unidades T y G en una de las cadenas, y, por lo tanto, C y A en la complementaria, están situados en los extremos de los cromosomas eucariotas. La dinámica de replicación, que requiere de un primer para polimerizar, no permite completar la copia de los extremos de la hebra retrasada, al no poderse situar un cebador más allá del final de la secuencia. Así, al retirar todos los cebadores de las hebras retrasadas recién sintetizadas, en cada una de las dos molécu- las de ADN, uno de los extremos queda más corto. En la replicación de los telómeros actúan las telomerasas. Estas sólo están presentes en células somáticas, tejidos fetales y en ciertas células madre. 67 Biología molecular y citogenética 3.4.2. Transcripción Síntesis de una cadena de ARN complementaria y antiparalela, a la secuencia de nucleótidos de una de las cadenas de ADN (cadena molde) que, por lo tanto, tiene una secuencia de nucleótidos idéntica a la cadena opuesta (cadena no molde, informativa o sin sentido), con la salvedad de que la T se sustituye por U en el ARN. Las secuencias de ADN que se copian en la transcripción se denominan genes. 3.4.2.1. Estructura del gen La mayoría de genes en procariotas están organizados en operones o conjunto de genes situados en el mismo fragmento de ADN, que se transcriben como una unidad y generan varios productos funcionales que participan en una vía metabólica común. En eucariotas, se trans- cribe ―generalmente― un solo producto génico (unidades transcrip- cionales monocistrónicas). Los genes eucariotas están constituidos por secuencias reguladoras y codificantes. El sitio de inicio de transcripción se conoce nucleótido +1, y conforme se dirige al extremo 3’ la numeración aumenta. Esta di- rección, donde se encuentran las secuencias codificantes del gen (exo- nes), se conoce como corriente abajo. En la dirección opuesta, hacia el extremo 5’, (corriente arriba), la numeración se indica con signo negativo, y es donde se encuentran la mayoría de regiones reguladoras. La región codificadora también contiene secuencias que no serán tradu- cidas (intrones). El ARNhn es el producto inmediato de la transcripción y consiste en un ARN, que contiene secuencias intrónicas y exónicas, cuyos ex- tremos 5’ y 3’ no han sufrido ninguna modificación. El producto final, ARNm maduro, ARNr y ARNt, se produce por modificaciones en el transcrito primario. En procariotas, el ARN recién sintetizado no sufre modificaciones postranscripcionales y se utiliza para la traducción de forma inmediata. 68 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos Las secuencias de ADN que regulan la expresión del producto génico son promotores15. El promotor basal es la secuencia mínima requerida para la unión de la maquinaria basal de transcripción y para la ARNpol II (ARN polimerasa II). Aunque existe mucha diversidad entre los pro- motores reconocidos por la ARNpol II, el estudio de muchas regiones promotoras de diferentes genes permite determinar las secuencias que aparecen con mayor frecuencia y establecer lo que se denomina se- cuencias consenso o ideales. Una de ellas es la región conocida como iniciador (Inr) localizada entre -3 y +5. La secuencia consenso caja TATA (compuesta de 8 pb A-T) se encuentra en la mayoría de promotores y se localiza de -31 a -25 pb hacia el extremo 5’ del punto de inicio (único elemento que se lo- caliza en dirección relativamente fija con respecto al punto de inicio). Los promotores que carecen de caja TATA se denominan TATA menos. El DPE (downstream promoter element) es un elemento común en los promotores TATA menos, se localiza de +28 a +32. 15 A los promotores se les unen proteínas reguladoras conocidas como factores transcripcionales (transcriptional factors, TF), cuya función es regular (aumentar o disminuir) la tasa de transcripción. 69 Biología molecular y citogenética Algunos promotores basales son fuertes, como la mayoría de los ubi- cados en genes procariotas y virales (la maquinaria de transcripción basal se une de forma eficaz y la tasa de transcripción es elevada). Otros son débiles, como la mayoría de promotores de genes euca- riotas, con un inicio de transcripción menos frecuente, por lo que re- quieren secuencias accesorias contenidas en promotores proximales, localizadas generalmente a menos de 200 pb corriente arriba del sitio de inicio. Otras regiones reguladoras que ayudan a los promotores débiles a ini- ciar la transcripción son los promotores distales, que generalmente se encuentran a más de 200 pb río arriba (región 5’) del sitio de inicio de la transcripción, aunque también se han localizado hacia el extremo 3’ (corriente abajo)16. Los potenciadores o secuencias amplificadoras (enhancers) son secuencias cortas que potencian o aumentan la transcripción del gen, de manera cooperativa con otras secuencias reguladoras, y alteran la estructura del ADN, ya que inducen superenrollamiento en la zona del promotor basal y aumentan la unión de TF, lo que implica una aproxi- mación física entre ambos y una flexibilidad en la molécula de ADN, y favorece el inicio de la transcripción. Por otra parte, los silenciadores (silencers) son secuencias cortas de nucleótidos de dos tipos: elementos silenciadores o elementos de re- gulación negativa (negative regulation elements, NRE) y pueden actuar modificando la estructura de la cromatina y evitando que los genes sean activados, reclutando factores transcripcionales represores y evitando que factores transcripcionales inductores se unan al ADN, alterando el proceso de corte y empalme del ARNhn y evitando su ma- duración o creando señales que bloquean la traducción, e inactivando así la expresión génica. La acción de un potenciador o un silenciador puede inhibirse por la pre- sencia de secuencias aisladoras, cuya función es bloquear la transmi- sión de la señal de un sitio a otro en el ADN e impedir el silenciamiento. 16 Las regiones que controlan la transcripción de un gen no necesariamente tienen que estar cerca de la región codificadora. Estas regiones son mucho más complejas y pueden activar o desactivar genes. 70 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos La mayoría de potenciadores o silenciadores actúan sobre el promotor vecino, sin ser específicos de un determinado gen. 3.4.2.2. Tipos de ARN polimerasa (ARNpol) Sintetiza una cadena de ARN en dirección 5’ → 3’. Esta enzima actúa de manera continua durante toda la transcripción: primero sobre el sitio de inicio indicado en el promotor basal, continúa en la secuencia codificadora y finaliza en una secuencia de terminación. En las células eucariotas los genes son transcritos por 3 tipos de ARNpol: I, II y III. Cada una reconoce promotores y TF con característi- cas específicas. La ARNpol I reside en el nucleolo, donde transcribe los genes que codifican para ARNr. La ARNpol III se encuentra en el nu- cleoplasma y es la encargada de la síntesis de los ARNt. La ARNpol II también se encuentra en el nucleoplasma y sintetiza las moléculas de ARNhn. 3.4.2.3. Factores transcripcionales Proteínas que se unen al ADN en el promotor, potenciador o silenciador para el control de la expresión de genes, reconociendo una secuencia específica. TF generales o basales. Requeridos para el inicio de la transcrip- ción en todos los promotores basales. Se unen a la ARNpol para formar un complejo que rodea el sitio de inicio. Toman el nombre de la ARNpol con la que actúan y, junto con ésta, forman el aparato básico de transcripción. TF inducibles o tejido-específicos. Interactúan con el ADN de la misma manera que los generales, pero su función es reguladora y se unen preferentemente a promotores distales. Se sintetizan o activan bajo un estímulo y controlan la transcripción en tiempo y espacio. Un gen con un promotor que contenga secuencias reco- nocibles sólo por TF generales puede transcribirse en cualquier tipo celular y estos son los responsables de la expresión constitutiva de genes. 71 Biología molecular y citogenética 3.4.2.4. Proceso de transcripción Tiene lugar en núcleo. En el sitio de inicio, la molécula de ADN se se- para ―de forma transitoria― en 2 cadenas, lo que forma una burbuja de transcripción. Conforme la ARNpol avanza, el ADN ya copiado se vuelve a unir a su cadena complementaria, liberando el ARN como una cadena sencilla de nucleótidos. El reconocimiento del promotor basal, o preiniciación, se pone en mar- cha con la unión de la primera proteína del complejo TFIID a la caja TATA: proteína de unión específica de TATA (TATA binding protein, TBP). La TBP tiene la capacidad de unirse al ADN por el surco menor, lo que provoca una deformación en la estructura del ADN sin separar ambas cadenas. Es el componente clave en el posicionamiento de la ARNpol II y delimita la distancia desde el punto de inicio hasta la caja TATA17. El TFIIA controla la capacidad de unión de TBP al ADN y permite al TFIID reconocer la región que se extiende hacia el extremo 5’. El TFIIB es otro factor que se une de forma adyacente a TBP, específicamente en la secuencia del promotor basal BRE y proporciona mayor superficie de reconocimiento para el anclaje de la ARNpol II. El TFIIF es el medio de unión de la ARNpol II al complejo de transcripción. La proteína TFIIH tiene actividad helicasa y contacta con la ARNpol II, lo que le permite su anclaje a ésta. Inicio. La ARNpol II permanece en el promotor mientras sintetiza los primeros 9 enlaces nucleotídicos. Termina cuando la enzima co- mienza a alargar la cadena y abandona el promotor con el complejo de iniciación. Elongación. Requiere las proteínas TFIIE y TFIIH, que se unen co- rriente arriba de la ARNpol II, para que esta inicie su movimiento a lo largo del ADN abandonando el promotor basal. Una vez unida TFIIE, se pueden unir TFIIH, que continúa unido a la ARNpol II y tiene va- rias actividades: ATPasa, helicasa y cinasa, que puede fosforilar el dominio carboxiterminal de ARNpol II (implicado en el abandono del promotor basal e inicio de la fase de elongación). La ARNpol II 17 En promotores que carecen de caja TATA, la TBP puede incorporarse, por asociación, a otras proteínas que reconocen el ADN. 72 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos va sintetizando la cadena naciente de ARN, a medida que avanza sobre el ADN. Los nucleótidos se añaden de forma covalente al ex- tremo 3’OH. Terminación. Cuando se añade el último nucleótido a la burbuja de transcripción, esta se colapsa y se libera la ARNpol II. Es importante mencionar que existe una superposición de eventos, de tal manera que los procesos de elongación, terminación y maduración del ARNhn son simultáneos, por lo que cuando termina la transcripción ya existe un ARNm maduro y listo para transportarse al citoplasma. 3.4.2.5. Procesamiento del ARN El transcrito primario, o ARNhn, tiene que procesarse de diversas for- mas para su maduración antes de exportarse del núcleo. El proceso de maduración incluye la adición de un capuchón de guanina modificada en el extremo 5’, la poliadenilación del extremo 3’, el corte y empalme, además del proceso de edición que sucede sólo en algunos genes. Corte y empalme (splicing) Consiste en la remoción de intrones y el empalme de exones. Los exo- nes e intrones pueden empalmarse en más de una forma y generar variantes del ARNm por splicing alternativo. Intervienen ribonucleopro- teínas pequeñas nucleares (RNPsn) que se sitúan en los extremos de los intrones y se agrupan formando un complejo de «corte y em-pal- me»: espliceosoma, de forma que secuencia intrónica forma un bucle. La cadena de ARN se corta en la base del bucle y se empalman los extremos para dar lugar al ARNm maduro. b) Edición del ARN Forma de modificación postranscripcional del ARNm. En algunos casos genera el cambio de un aminoácido importante por otro o codo- nes de paro de la traducción y la generación de una proteína truncada. Sólo se presenta en ciertos genes, en algunos tejidos o en algunos tipos celulares. 73 Biología molecular y citogenética 3.4.3. Traducción Síntesis de una proteína de acuerdo a la información genética, em- pleando como molde una molécula de ARNm. Es uno de los procesos más complejos que se realizan en la célula. Interpreta la información contenida en el gen utilizando un código ge- nético a través del cual desarrolla la lectura de la secuencia de nucleó- tidos del ARNm. Se considera extremadamente exacta (con un error de 5 × 10 –4 por residuo de aminoácido) y rápida (incorpora, aproximada- mente, 15 aminoácidos por segundo, a 37°C). Consume gran cantidad de energía (un 80%, en forma de ATP y el resto de GTP). El modo de lectura del ARNm tiene como inicio el extremo 5’ y finaliza en el extremo 3’, así, crea una cadena peptídica partiendo del extremo N-terminal para terminar en el C-terminal. A la reacción principal se la conoce como polimerización; la adición secuencial de aminoácidos (según la información genética), mediante enlaces peptídicos. 3.4.3.1. Código genético Un gen contiene la información necesaria para transcribirse en un ARNm, que a su vez puede expresarse como una proteína. La forma en la que se codifica la información es en grupos de tres nucleótidos, lo que conforma un triplete, o codón, que representará un aminoácido. Así, al disponer de 4 bases diferentes, se tienen 64 combinaciones posibles de tres nucleótidos (43), 61 de los cuales codifican para aminoácidos y 3 marcan la terminación de la traducción. Este sistema de códigos se denomina código genético, y es utilizado por la célula para sintetizar proteínas a través del proceso de traduc- ción. Por lo tanto, la expresión de una proteína está dada por el orden en que se encuentran los nucleótidos en el ADN, que define la secuen- cia de aminoácidos que tendrá aquella. 74 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos El código genético es específico y continuo, ya que cada codón tiene un significado único y los códigos se leen de manera continua y li- neal; así, cada base pertenece sólo a un codón, de tal forma que no hay duplicación ni omisión de ningún nucleótido en la lectura, y por lo tanto no hay solapamiento. También se dice que es redundante pero no ambiguo. Hay aminoácidos codificados por más de un codón (ex- ceptuando los codones para metionina y triptófano), y, en general, en estos casos, los codones se parecen entre sí difiriendo únicamente en el tercer nucleótido, de manera que este nucleótido presenta una baja especificidad, lo que se denomina degeneración de la tercera base. Por esta razón, el código genético es degenerado, ya que, de los 64 codo- nes, 61 son utilizados para codificar a los 20 aminoácidos. Cuando un aminoácido puede ser traducido por 2, 3, 4 y hasta 6 codones diferen- tes, estos tripletes son conocidos como sinónimos, y no todos pueden ser reconocidos por el mismo anticodón, por lo que en estos casos se observan 2-3 ARNt distintos, que pueden transportar el mismo aminoá- cido, pero con diferentes anticodones. Los tres restantes o codones de terminación (UAA, UGA y UAG) terminan la traducción; es decir, mandan señales para detener el proceso de traducción e informar a la célula que la síntesis proteica ha finalizado. 3.4.3.2. Componentes del complejo traduccional La traducción ocurre en el citoplasma, con la formación del complejo traduccional, formado por 3 tipos de ARN: ARNm, ARNt y ARNr. Como ya hemos dicho (vid. supr.), el ARNm es una molécula de cade- na sencilla que porta la información genética almacenada en el ADN. Sus nucleótidos presentan una disposición en tripletes (codones) se- cuencial. El ARNt es el encargado de transportar aminoácidos hasta el ARNr, donde serán unidos, uno tras otro, mediante enlaces peptídicos. Para ello, contienen el anticodón, un triplete de bases en las posiciones 34, 35 y 36, que se une de manera complementaria al codón del ARNm, durante la síntesis proteica. 75 Biología molecular y citogenética El ARNr forma parte de los ribosomas, las organelas citoplasmáticas responsables de la biosíntesis proteica. Se denomina en base a su co- eficiente de sedimentación, medido en unidades Svedberg (S) y, así, en procariotas existen 3 ARNr distintos: 5S, 16S y 23S y en eucariotas 4: 5S, 5.8S, 18S y 28S. Los ribosomas están formados por dos subunidades: menor y mayor y tienen 3 zonas para los ARNt; el sitio A (centro A o aminoacilo), el sitio P (centro P o peptidilo), y el sitio E (centro de eliminación o salida). Los ARNt avanzan a través de estos sitios (de A a P a E) conforme entregan los aminoácidos durante traducción. El sitio A es el lugar por donde el aminoacil-ARNt entra al complejo, después transfiere este aminoácido al peptidil-ARNt en el sitio P y se genera el enlace peptídico. El centro catalítico donde se genera este enlace se localiza en la subunidad mayor. El sitio E es el lugar por donde saldrá del ribosoma el ARNt sin aminoácido. La interacción codón/anticodón ocurre en la subunidad menor. La in- terpretación de un codón requiere el principio de complementariedad de bases con el anticodón del aminoacil-ARNt correspondiente. El reco- nocimiento se da entre la complementariedad de las bases 1, 2 y 3 del codón con las bases 3, 2 y 1 del anticodón, respectivamente. Las bases tercera y segunda del anticodón forman puentes de hidrógeno con las bases primera y segunda del codón, lo que determina la especificidad de la interacción. Fenómeno de bamboleo. Se pueden formar pares de bases atípicos entre nucleótidos que no son A-U y G-C, en la tercera posición de un codón. Estas uniones presentan enlaces de hidrógeno diferentes a los observados en las bases primera y segunda, lo que hace que la interac- ción codón/anticodón es más débil. La formación de pares por bambo- leo no sigue las reglas «normales», pero sí sus propias reglas. Por ejemplo, una G en un anticodón se puede aparear con una C o U (pero no una A o G) en la tercera posición del codón. Reglas así asegu- ran que los codones se lean correctamente a pesar del bamboleo. 76 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos 3.4.3.3. Fases de la traducción Activación de aminoácidos mediante acción de la enzima aminoa- cil-ARNt-sintetasa e hidrólisis de 2 moléculas de ATP, lo que permite que un aminoácido pueda unirse a su ARNt específico, y genere un aminoacil-ARNt18. Inicio de la síntesis de proteínas. No sólo implica el reconocimiento del codón de inicio (AUG, para me- tionina), sino que incluye todos los procesos para la formación del complejo traduccional y del primer enlace peptídico. El paso inicial es la unión de la subunidad menor al ARNm. A continuación, el ARNt iniciador entra directamente al sitio P y reconoce al codón AUG; los si- guientes entrarán por el sitio A. Ya realizada esta unión, la subunidad mayor forma el complejo ribosomal con la subunidad menor. La ini- ciación termina cuando el complejo está completo y formada la unión codón/anticodón. 18 Cada tipo de ARNt, al unirse al aminoácido, lleva antepuesto el nombre del aminoácido que transporta; por ejemplo, leucinil-ARNt para el que transporta leucina. Por otro lado, el ARNt unido al aminoácido compatible con él se designa aminoacil- ARNtAA, en donde «AA» corresponde a la abreviatura del aminoácido. Por ejemplo, leucinil-ARNtLeu, metionil-ARNtMet, etc. 77 Biología molecular y citogenética Elongación El crecimiento de la cadena polipeptídica implica la incorporación de nuevos aminoácidos, transportados por el aminoacil-ARNt corres- pondiente y adicionados al extremo carboxilo-terminal de la cadena en crecimiento mediante formación de un enlace peptídico, catalizada por la peptidiltransferasa. 78 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos Es una reacción que requiere de 3 pasos para añadir un aminoácido. a) Decodificación del aminoacil-ARNt en el sitio A. b) Transferencia del aminoácido al peptidil-ARNt. c) Desplazamiento del ribosoma. Cuando el aminoacil-ARNt se une al codón del ARNm de forma correc- ta, se genera una hidrólisis que libera un ácido fosfórico del GTP y lo convierte en guanosín difosfato (GDP), lo que permite que la cadena peptídica que contiene el peptidil-ARNt forme un enlace peptídico con el aminoácido que forma parte del aminoacil-ARNt, que se transforma en un nuevo peptidil-ARNt. La enzima que cataliza esta unión es la peptidil-transferasa. Después de esto existe otra hidrólisis de GTP, lo que permite un desplazamiento del ribosoma o translocación (tres nucleótidos hacia el extremo 3’ del ARNm). Este desplazamiento se da cuando el centro P queda ocupado por un ARNt sin aminoácido, colocando el ARNt sin aminoácido en el centro E, por donde sale del ribosoma. Se trata de un fenómeno cíclico, por lo que se realizará tantas veces como aminoácidos se añadan a la cadena peptídica en crecimiento. Terminación Se produce cuando el sitio A lee alguno de los codones de paro del ARNm. En esta fase, factores de liberación (RF) reconocen direc- tamente el codón de terminación. Estos RF requieren de una molécu- la de GTP para permitir que el polipéptido recién sintetizado se libere del complejo traduccional y, al mismo tiempo, permitir la disociación de la unión entre ARNr y ARNm. Una vez finalizada la síntesis de una proteína, el ARNm queda libre y puede leerse de nuevo. De hecho, es muy frecuente que antes de que finalice la síntesis de una proteína ya esté comenzando otra, con lo cual una misma molécula de ARNm está siendo utilizada por varios ribosomas de forma simultánea. Cuando esto se observa, a la estructura que se forma se le llama polirribosoma o polisoma. 79 Biología molecular y citogenética 3.4.4. Enzimas empleadas en Biología Molecular NUCLEASAS (fosfodiesterasas) Enzimas que se encargan de degradar ácidos nucleicos mediante hi- drólisis de los enlaces fosfodiéster que mantienen unidos a los nucleóti- dos. Tienen un papel fundamental en la replicación, reparación y otros procesos del ADN. De manera general, se pueden clasificar en función del tipo de ácido nucleico que escinden: las nucleasas cuyo sustrato es el ARN se denominan ribonucleasas (ARNasa), y las del ADN se conocen como desoxirribonucleasas (ADNasa). Existen algunas no específicas capaces de degradar tanto ADN como ARN. Otra clasificación muy usada es la que se basa en la acción de la en- zima. Si esta realiza su trabajo de manera progresiva, empezando por los extremos de la cadena de ácido nucleico (escinden nucleótidos uno a uno desde un extremo, sea en dirección 5’-3’, 3’-5’, o en ambas) se denominan exonucleasas. En contraste, si la ruptura ocurre en un punto interior de la cadena se llaman endonucleasas. La especificidad del sitio de corte de las endonucleasas varía. Existen tipos que pueden cortar en sitios inespecíficos, generando cortes relativamente aleato- rios con respecto a la secuencia. Contrariamente, hay endonucleasas muy específicas que solo cortan en ciertas secuencias, como las endonucleasas de restricción: endo- nucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de ADNds (de 4-8 nucleótidos o dianas o sitios de restricción) y cortan el ADN en esa secuencia o cerca de ella. En las bacterias constituyen un sistema de defensa al degradar el ADN ajeno (principalmente el procedente de virus), sin embargo, el ADN bacteriano es «inmune» a su acción, ya que está protegido por modificaciones químicas en las dianas de restric- ción mediante metilación de bases. Cada especie y cepa de bacterias tiene sus nucleasas específicas. Tipo I. El sitio de corte es al azar y se produce a bastante distancia (hasta 1.000 pb) del sitio de reconocimiento, gastando mucho ATP. Poseen actividad de modificación (metilación). 80 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos Tipo II («tijeras moleculares»). Cortan el ADN en sitios definidos (generalmente dentro de la diana de restricción) entre 4 y 8 pb de longitud. Estos sitios de corte son típicamente palindrómicos, es decir, reconocen secuencias que son leídas de la misma forma en ambas direcciones. Son las enzimas de restricción más simples ya que no requieren de ningún cofactor más que el magnesio para re- conocer y cortar las secuencias de ADN. Su precisión en reconocer y cortar secuencias simples en el ADN en posiciones precisas las hace una de las más empleadas e indispensables en la mayoría de las ramas de la Biología Molecular. Nomenclatura. Se emplean 3 letras, en cursiva, y un número romano. Las 3 letras corresponden al nombre científico de la bacteria de la que se han obtenido. La pri- mera es la inicial del género; las otras dos son las primeras letras de la especie. El número indica el orden en que se ha aislado la enzima en la misma especie. Cuando se ha aislado de una cepa concreta de una especie bacteriana, se añade una cuarta letra mayúscula que la representa. Por ejemplo, la EcoRI: E = género Escherichia; co = especie coli; R = cepa RV 13 y I = primera endonucleasa aislada de esta cepa. Tipo III. Compuestas por 2 subunidades, una es responsable del reconocimiento y la modificación del ADN, mientras que la otra se encarga del corte de la secuencia. Requieren dos cofactores para su funcionamiento: el ATP y el magnesio. Poseen dos sitios de reconocimiento asimétricos, translocan el ADN de una manera de- pendiente de ATP y lo cortan entre 20 a 30 pb adyacentes al sitio de reconocimiento. Tipo IV. Cortan ADN con marcas de metilación, están conformadas por varias subunidades diferentes que se encargan de reconocer y cortar la secuencia de ADN. Utilizan como cofactores GTP y mag- nesio divalente. Los sitios específicos de corte incluyen cadenas nucleotídicas con residuos de citosina metilada o hidroximetilada en una o ambas hebras. 81 Biología molecular y citogenética Tipos de corte de las endonucleasas de restricción II Extremos romos: el corte se produce en el mismo punto en las 2 cadenas, generalmente en el centro de la diana de restricción. Extremos cohesivos: cuando rompe la cadena en posiciones no simétricas. Esto genera, en cada extremo de la diana, sendas regio- nes monocatenarias cortas y complementarias entre sí, lo que hace que sean muy reactivos al poder adherirse a fragmentos de ADN que tengan secuencias de bases complementarias. La formación de extremos cohesivos es de gran interés en ingeniería genética, pues fragmentos generados con una misma endonucleasa a partir de dos ADN distintos pueden interaccionar mediante el empa- rejamiento de las bases de sus extremos cohesivos (dicha interacción no es posible entre extremos romos). Asimismo, pueden asociarse los fragmentos producidos por enzimas distintas que producen extremos compatibles. Debe resaltarse que, el producto de la reasociación de los dos fragmen- tos, en ninguno de los casos es idéntico al ADN de partida, ya que está formado por dos moléculas. La falta de enlace covalente entre los ex- tremos de fragmentos reasociados se indica con el nombre de «mella» o «muesca» (Nick). Ésta se puede cerrar o por la acción de las ADN ligasas, dando una molécula bicatenaria única. Patrones o Mapas de restricción. Diagrama de la molécula de ADN en donde se muestra los sitios de corte de las enzimas de restricción (en la práctica se utiliza una mezcla de varias). Constituye un mapa fí- sico del material genético de un individuo, y su uso está enfocado a la comparación con otros. 82 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos Los patrones de restricción también son usados para examinar el grado de variabilidad genética que existe en el seno de una pobla- ción. En cualquier individuo se producen mutaciones al azar. Si afec- tan a los genes estarán sometidas, en mayor o menor medida, a la selección natural, y lo más probable es que no sean transmitidas a la descendencia. Pero la afectación del ADN altamente repetitivo o ADN basura por mutaciones no está sometida al filtro de la selección natu- ral, y por tanto son transmitidas al azar. Como las mutaciones suceden a un ritmo constante, y dan como resultado patrones de restricción ligeramente diferentes19, pueden compararse los de distintos individuos de una población, y deducirse el grado de variabilidad con que cuenta. Puede también hallarse el grado de consanguinidad en una población, o la distancia genética (y evolutiva) que separa a diferentes poblaciones de una especie o la que separa a diferentes especies, de cara a recons- truir líneas evolutivas o clasificaciones taxonómicas. ADN POLIMERASAS. Permiten realizar copias de moléculas de ADN mediante replicación. Ligasas Unen 2 moléculas de ADN mediante formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos 3’ de una molécula y 5’ de la otra. Pueden reparar mellas en una de las cadenas de un ADNds mediante formación del correspondiente enlace fosfodiéster. Muy útiles en tecnología de ADN recombinante para unir fragmentos de ADN de distinta procedencia, previamente cortados por la misma enzima de restricción. También hay ligasas de ARN que permiten circu- larizar moléculas monocatenarias. Topoisomerasas Relajan la tensión de la doble hélice de ADN, próximas a las burbujas de replicación o de transcripción. 19 Esta diferencia en el tamaño de los fragmentos, conocida como patrones polimórficos de endonucleasas de restricción (restriction fragment length polymorphisms, RFLP’s), pueden ser analizados por electroforesis 83 Biología molecular y citogenética La transcriptasa inversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa dependiente de ARN, que tiene como función sintetizar ADNds utilizando como molde ARNss, es decir, catalizar la retrotranscripción o transcripción inversa. El ADN que se sintetiza se conoce como ADN copia o complementario (ADNc). Esta enzima se encuentra presente en los retrovirus. La transcripción de ARN a ADN cuenta con unos pasos similares, pero no idénticos, a la transcripción normal. Cuando el ARNss del retrovirus entra en la célula, lleva consigo la transcriptasa inversa que, primero, sintetiza una hebra de ADN com- plementaria al ARN y se forma un híbrido ARN-ADN. A continuación, se degrada la hebra de ARN y se reemplaza por ADN, así el resultado es un ADNds que normalmente se integra en el genoma de la célula in- fectada. Este genoma integrado utiliza la maquinaria celular para trans- cribir sus genes y proteínas. Se puede usar para identificar cantidades muy pequeñas de ARN en la prueba conocida como RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction o reacción en cadena de la po- limerasa con transcripción inversa). Si se quiere cuantificar y detectar la cantidad de ARN de una muestra, se tiene que realizar, además, una PCR cuantitativa. Esta prueba es la que se usa para la detección del Sars-CoV-2, un virus de ARN. La desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) es una enzima nu- clear, una ADN polimerasa que cataliza la adición aleatoria de nucleóti- dos en el extremo 3’-OH del ADNss. Difiere de otras ADN polimerasas porque no requiere una hebra molde para la polimerización. Se expre- sa, principalmente, durante la maduración del sistema inmunitario en células de órganos linfáticos primarios y secundarios; es decir, precur- sores de linfocitos B en la médula ósea y precursores de linfocitos T en el timo. En patología tumoral se aprecia una intensa expresión en linfomas o leucemias linfoblásticas; también puede observarse inmu- notinción en células de leucemia mieloide aguda, y muy débilmente en casos de linfoma de Burkitt. El resto de neoplasias hematolinfoides no expresan TdT. La detección de la expresión nuclear de TdT por citome- tría de flujo es una técnica valiosa en la caracterización de leucemias y el seguimiento de enfermedad leucémica residual mínima. 84 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos 3.5. Extracción de ácidos nucleicos En solución, el ADNds se comporta como una estructura rígida, enro- llada de forma aleatoria, regida por las repulsiones electrostáticas de los pares de bases y el esqueleto de fosfatos cargados negativamente. Al pipetear, agitar o revolver se genera un flujo hidrodinámico que puede separar las 2 cadenas; cuanto más larga sea la molécula, más débil es la fuerza requerida para esta lisis. Por ello, obtener fragmentos de ADN genómico es fácil, pero conforme se requieran tamaños moleculares elevados (> 150 kb) la técnica se dificulta. 3.5.1. Elección del método de extracción Suele realizarse en función de criterios: Tipo de ácido nucleico a extraer: ADNss, ADNds, ARN total, ARNm o ARNr. Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plantas, procario- tas o virus. Fuente del ácido nucleico. Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído. 85 Biología molecular y citogenética 3.5.2. Fuente del ácido nucleico En teoría el ADN/ARN puede obtenerse de cualquier célula/virus que lo contenga con excepción de los eritrocitos, ya que son anucleados. Las fuentes posibles para extracción son: leucocitos (sangre), suero, plasma, biopsia, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido amniótico, esputo, semen, raspado bucal, folículo capilar, etc. Por acuerdos éticos, se prefieren las muestras no invasivas frente a cualquier tipo de biopsia. Durante la extracción de ácidos nucleicos, y en particular del ARN, que es una molécula más lábil ya que es de cadena sencilla, debe conside- rarse el uso de material nuevo, estéril, libre de ADNasas y ARNasas, y el uso de guantes para impedir la degradación de la muestra con nu- cleasas provenientes del ambiente (pelo, sudor, saliva, polvo), así como para impedir contaminación con ácidos nucleicos exógenos. Todo el proceso debe realizarse en frío; esto es, con los reactivos y muestras a 4°C antes y durante el proceso, conservando la muestra congelada hasta justo antes de iniciar la extracción. 3.5.3. Extracción de ADN Extracción por la técnica fenol-cloroformo. Es la técnica más emplea- da, por la cantidad y calidad del ADN obtenido. Se fundamenta en la lisis total de células y estructuras subcelulares mediante uso de deter- gentes, con posterior eliminación de proteínas por su extracción y de componentes lipídicos con solventes orgánicos. Esto deja al ADN puro listo para su separación por precipitación en soluciones alcohólicas. El primer paso es la homogeneización del tejido y lisis con detergen- tes (dodecil sulfato sódico, SDS). El procedimiento de lisis es crítico y debe ser lo suficientemente agresivo como para lograr la fragmenta- ción del tejido y la rotura de la membrana celular y nuclear, sin dañar 86 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos el ácido nucleico. La disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buffer de lisis, que contiene sales, un detergente y proteinasa K, que libera el ADN de las histonas y degrada proteínas celulares. En el caso de células con pared celular, como las vegetales, se prefiere el empleo de sonicadores, que, mediante ondas de sonido, rompen la pared celular y la membrana celular y nuclear. Cuando la extracción se lleva a cabo a partir de células de sangre pe- riférica, se recomienda el empleo de tubos con ácido etilendiaminote- traacético (EDTA) como anticoagulante (la heparina interfiere con las polimerasas o las enzimas de restricción). También es necesario retirar eritrocitos que contaminan la muestra; su lisis suele realizarse por adi- ción de una solución hipotónica a base de cloruro de amonio. La inactivación de nucleasas intracelulares previene la digestión enzimática de ácidos nucleicos, lo que permite lograr la obtención de fragmentos relativamente largos de ADN y ARN. La lisis e inactivación de las nucleasas se suelen llevar a cabo en el mismo paso, ya que la solución de lisis está compuesta por sales caotrópicas, como el EDTA, que secuestra cationes divalentes y, por lo tanto, inactiva las ADNasas. Al concluir la lisis e inactivación de nucleasas, se retiran los restos celu- lares (purificación). Los métodos de purificación de ácidos nucleicos combinan estrategias como la extracción/precipitación, la cromatogra- fía, la centrifugación, la electroforesis y la separación por afinidad. Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo, se utiliza una solución que tiene una relación 25:24:1 v/v para el fenol:cloroformo:alcohol isoamílico; generalmente se añade hidroxiquinolina al 0.1%, un inhibidor parcial de ARNasas, quelante débil de iones metálicos, y que ayuda a identificar la fase orgánica por el color amarillo que le confiere. El al- cohol isoamílico se emplea para reducir la espuma que puede gene- rarse al agitar esta solución. Esta solución desnaturaliza las proteínas (entre ellas las nucleasas) y mantiene la separación de la fase orgánica y acuosa tras la centrifugación de la muestra. La eliminación de pro- teínas y componentes no hidrosolubles del homogeneizado celular se efectúa con la formación de dos fases con propiedades de solubilidad particulares a) una fase orgánica (fenólica) en la parte inferior del tubo de precipitado que contiene lípidos, proteínas y detritus celulares, y b) una fase acuosa superior, que contiene los ácidos nucleicos y otras pequeñas moléculas hidrosolubles. En la interfase se ubican la mayor parte de las proteínas. 87 Biología molecular y citogenética El ADN en solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etanol), ya que los ácidos nucleicos son insolubles en soluciones alcohólicas. Para facilitar la precipitación también suelen añadirse cationes monovalentes (como sodio o potasio) con el fin de generar sales insolubles en alcohol de fácil precipitación. La precipita- ción se favorece incubando a bajas temperaturas (–20°C); una centri- fugación posterior permite la obtención de un botón (pellet) de ácido nucleico en el fondo del tubo, al decantar el alcohol. El pellet se lava con etanol al 70%, al menos, dos veces. El contenido de alcohol de esta solución (70%) mantiene al ADN precipitado, y el H2O (30%) permite la disolución de las sales presentes. Después de los lava- dos, se seca el botón, lo que permite evaporación del alcohol (espontá- nea o acelerada en un desecador). Inmediatamente después, el botón de ADN se disuelve en soluciones que aseguren su preservación, como agua estéril y libre de ADNasas, o soluciones amortiguadoras, como el buffer Tris EDTA (TE buffer). La cantidad de solución para disolver el ADN debe ser mínima para mante- ner una concentración adecuada del ácido nucleico que permita su em- pleo en técnicas posteriores, pero suficiente para lograr su disolución total. Para eliminar el ARN contaminante proveniente de la extracción, la solución de ADN se incuba por una hora a 37°C con ARNasas. Extracción de ADN por la técnica salting OUT. La principal diferencia radica en el empleo de una solución concentrada de sales en lugar de solventes orgánicos para lisis celular y extracción de proteínas. La adición de una solución saturada de sales provoca la agregación de proteínas y restos celulares, lo que permite su separación de los ácidos nucleicos. Generalmente, estas soluciones se preparan saturadas con NaCl. Una centrifugación, posterior a la adición de la solución concen- trada de sales, precipita los restos celulares y las proteínas, y deja libre el ADN en el sobrenadante, que se traspasa a un nuevo tubo para su lavado y precipitado. 88 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos 3.5.4. Extracción de ARN Se lleva a cabo para desarrollar estudios de expresión génica (análisis de niveles de ARNm), para el diagnóstico de enfermedades ocasiona- das por virus ARN o, en el caso de bacterias, para análisis de expresión de genes o validar la clonación del ADNc. Hay dos posibilidades: extracción de ARN total (ARNm, ARNr y ARNt) y extracción de ARNm. Es menos complejo y más barato la extracción de ARN total. Las células o tejidos se disgregan en una solución de tio- cianato de guanidinio para lisis e inactivación de ribonucleasas endó- genas, junto con fenol y cloroformo20. La solución fenólica empleada en la extracción del ARN es ácida (pH 5-6), para favorecer la extracción del ARN sobre la del ADN, ya que, a pH ácido, el ADN es retenido en la fase orgánica y en la interfase, dejando el ARN en la fase acuosa. El lisado celular se diluye en una solución alcohólica y se coloca en una columna de resina de intercambio aniónico. La resina consiste en pequeñas partículas de sílice con superficie hidrofílica, a la que se unen cantidades elevadas de grupos dietilaminoetanol (DEAE). La purificación se basa en la interacción de estos grupos DEAE, cargados positivamente, con los grupos fosfatos del ARN. Las proteínas y otros contaminantes son retirados con lavados. El pH y la concentración de sales de las soluciones amortiguadoras usadas en cada paso contro- lan la unión del ARN a la columna, que se eluye con soluciones iónicas acuosas. Consideraciones especiales al trabajar con ARN. Es una molécula sumamente lábil, por lo que la clave en la extracción es evitar su de- gradación por ribonucleasas propias de la célula. Los protocolos se basan en la rápida inactivación de ARNasas endógenas y en tomar precauciones para evitar la contaminación con ARNasas exógenas. Si es posible, se recomienda el empleo de pipetas y soluciones exclusivas para trabajar con ARN. El material de vidrio debe esterilizarse, mientras 20 El fenol y el cloroformo se utilizan en la extracción del ARN con los mismos fines que en la del ADN (formar las fases orgánica y acuosa, desnaturalizar proteínas e inactivar nucleasas). 89 Biología molecular y citogenética que el material plástico debe ser nuevo y estéril, o bien enjuagarse con cloroformo, ya que la esterilización por autoclave no inactiva por com- pleto las ARNasas. Para la lisis celular suele optarse por la mecánica o enzimática. La mecánica se emplea con más frecuencia para tejidos frescos o células, usando un homogeneizador mecánico. La de tejido congelado es más laboriosa y se recomienda el uso de un homogeneizador eléctrico. La homogeneización del tejido se realiza, habitualmente, en una solución comercial fenólica con tiocianato de guanidinio. Por otro lado, la lisis enzimática se utiliza con más frecuencia para células que contienen envoltura o cápsula (bacterias y levaduras). Los métodos enzimáticos también pueden emplearse para tejidos eucariotas ricos en colágeno, con la finalidad de digerirlo antes de la lisis. Diferencias entre extracción de ADN y ARN ADN ARN Temperatura/pH de la Preferentemente Exactamente solución fenol-cloroformo 4ºC / 8.2 4ºC / 5-6 Tiocianato de Inhibidores de ARNasas guanidinio Agua libre de ARNasas DEPC Proteinasa K 10 μg/mL Homogeneizador Manual Eléctrico 3.5.5. Otros métodos de extracción Centrifugación en gradiente de cloruro de cesio. Sirve para la puri- ficación de ambos ácidos nucleicos, aunque su uso principal es el aislamiento del ADN genómico y plasmídico. Método preferido para elaboración de genotecas de ADNc, en las que se requiere ARN de alta pureza e integridad o para aislar ARN de tejidos con altos niveles de ARNasa endógena, como el páncreas. 90 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos Cromatografía por exclusión de tamaño. Se basa en la separación de ácidos nucleicos en función de su peso molecular, empleando una columna empaquetada con una matriz de gel de partículas po- liméricas orgánicas o de sílice; ambos materiales originan una red de poros hidrofílicos uniformes. Las moléculas de gran tamaño no penetrarán en los poros, por lo que migran más rápidamente que las de menor tamaño. Es el fundamento de la purificación en gel de agarosa de un ácido nucleico de determinado tamaño. Cromatografía de intercambio iónico (vid. supr.). Método que permite la concentración y purificación de ADN de calidad, de manera rápida. Los ácidos nucleicos interactúan con la resina de carga positiva de las columnas de intercambio iónico, por lo que el ácido nucleico cargado negativamente se retiene y permite que otras moléculas, como proteínas o lípidos, se eluyan primero, deján- dolos retenidos en la columna; se eluyen empleando condiciones que rompan su enlace (unión electrostática reversible) con los compuestos iónicos de la resina purificados, como un tampón de máxima salinidad y alto pH. Cromatografía de adsorción. Los ácidos nucleicos en solución se fijan, de forma selectiva, al sílice o vidrio21 en presencia de sales caotrópicas, mientras que proteínas, metabolitos y otros contami- nantes se eliminan mediante lavados. Posteriormente, los ácidos nucleicos se separan (desorción) con una cantidad adecuada de agua destilada o tampón TE. Purificación mediante nanopartículas magnéticas (MNP). Ofrece ventajas como el reducido tiempo de procesamiento, la ausencia de reactivos tóxicos, la facilidad en la separación y automatización, además de la separación del ADN de contaminantes y desechos celulares. El proceso de separación magnética, por otra parte, es simple, sin etapas de centrifugación y precipitación. Los equipos de extracción magnética comerciales y la automatización reducen, en gran medida, la carga de la operación manual. Entre las partículas utilizadas, las nanopartículas magnéticas de óxido de hierro (IONPs) son de especial interés por su baja toxicidad y alta biocompatibilidad. 21 Se utilizan membranas de lana de vidrio o perlas de sílice empaquetadas en columnas de polipropileno que se ajustan en tubos colectores tipo eppendorf. 91 Biología molecular y citogenética Usualmente suelen recubrirse con polímeros, agentes surfactantes, ligantes o materiales inorgánicos (sílice, carbono, metales preciosos u óxidos) que las protegen de la oxidación, las estabilizan y le dan la posi- bilidad de enlazarse con un determinado ente químico o biológico. Por otro lado, dichos recubrimientos potencian la habilidad de formación de un enlace entre la superficie de las partículas y el ADN debido a la intro- ducción de una pequeña carga iónica positiva que evita la agregación de las partículas magnéticas y facilita la interacción con este. 3.5.6. Manejo de muestras para estudios moleculares Selección de la muestra. Debe elegirse la muestra que contenga el ácido nucleico de interés. 1. Estudio de ácidos nucleicos de un individuo Análisis de la estructura genómica del individuo. Para este tipo de estudio la molécula de interés es el ADN genómico (ADNg). Todas las células de un individuo poseen el mismo genoma, de ahí que, la muestra pueda ser cualquier célula nucleada. Sin embargo, se ha de elegir la que involucre el procedimiento menos invasivo y de menor riesgo para el paciente. La muestra de elección es sangre periférica con anticoagulante. Las únicas células de este tejido que poseen núcleo son los leucocitos, a partir de los que es posible extraer ADNg. Estudio de la expresión génica de un individuo22. Aquí, la molécula de interés es el ARNm. La muestra de elección dependerá del tejido donde se exprese el gen de interés (si se expresa en leucocitos, la muestra será sangre periférica con anticoagulante; si lo hace en el 22 La expresión génica se regula de manera espacial y temporal. La regulación espacial es la base de la diferenciación celular; es decir, que los genes no se expresan en todos los tejidos, sino que cada uno expresa sólo los genes necesarios para llevar a cabo su función. La regulación temporal significa que la expresión génica depende del momento metabólico en que se encuentre el individuo. Por esto, el individuo, como tal, es el resultado de la expresión de sus genes en un momento determinado. 92 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos hígado, una biopsia hepática, y si se expresa en tejido tumoral, una biopsia del tejido sospechoso). 2. Detección de ácidos nucleicos exógenos ADN exógeno (como el procedente de bacterias y virus ADN). Constituye una herramienta útil para el diagnóstico molecular de enfermedades causadas por microorganismos. La muestra depen- derá de la historia natural del microorganismo. ARN exógeno. Práctica continua en investigación, y en casos es- pecíficos de aplicación clínica. La muestra de elección dependerá, al igual que en la determinación de ADN, de la historia natural de la partícula viral infectante. Toma de la muestra. Si la muestra es sangre periférica, no es indispen- sable el ayuno, ya que la ingesta no modifica la concentración ni estruc- tura de los ácidos nucleicos; sin embargo, es recomendable para evitar que una alta concentración de lípidos en la muestra interfiera con la extracción de los ácidos nucleicos. Uso de material libre de nucleasas. Uso de guantes y mascarilla. Limpieza total. Las bacterias, hongos y células muertas de la piel son fuentes ricas en ARNasas, por lo que se recomienda tomar las muestras en un ambiente higiénico, limpiar las superficies de traba- jo con agentes descontaminantes y utilizar inhibidores de ARNasas, como fenol, dietilpirocarbonato (DEPC) u otros agentes. Anticoagulantes. El EDTA, un quelante del calcio, es el empleado con más frecuencia. Otro muy común es el citrato de sodio. No se recomienda heparina, ya que puede interferir en procedimientos como la PCR. ADN o ARN de glóbulos blancos. Debe tomarse muestra de sangre periférica en tubo estéril con anticoagulante. La cantidad dependerá del método de extracción que vaya a emplearse y de la cantidad de ácido nucleico que se requiera. Para ADN, las muestras pueden guardarse a 4ºC hasta 5 días sin que le afecte de manera 93 Biología molecular y citogenética significativa. Para ARN, el procesamiento debe ser, de preferencia, de inmediato, para evitar degradación por ARNasas. ADN o ARN de suero. Se toma muestra de sangre periférica. Se deja a temperatura ambiente el tiempo mínimo necesario para la formación del coágulo (máximo, 20 minutos). Luego se centrifuga para separar el suero, y se transfiere a un nuevo tubo estéril. El suero se somete a extracción de ácidos nucleicos, o se almacena a –20ºC hasta su procesamiento. ADN o ARN de biopsias. Método invasivo que representa un riesgo para el paciente. Otros fluidos biológicos. En el caso de orina, líquido cefalorra- quídeo o líquidos de punción, es necesario tomar la muestra en recipientes estériles, con las precauciones indicadas. Preservación. Dirigida a la inactivación de nucleasas. El ARN es mucho más sensible a su acción que el ADN, por lo que los cuidados para su preservación suelen ser más estrictos. El ADN aislado puede mantenerse viable a 4ºC durante varias semanas, a –20ºC varios meses y a –70ºC años. Pueden utilizarse inhibidores de ADNasas, cuando el ADN sea la molécula en estudio, o inhibidores de ARNasas, cuando lo sea el ARN. Una recomendación es repartir la muestra, desde el momento de la toma, en varias alícuotas para evitar congela- mientos y descongelamientos repetidos que favorezcan la degradación de los ácidos nucleicos. Biopsias. Los cuidados en su manejo están dirigidos, princi- palmente, a la preservación del ARN, ya que los tejidos contienen ARNasas endógenas. Estas pueden inactivarse a baja temperatura, por lo que se recomienda el uso de nitrógeno líquido para congelar el tejido, inmediatamente después de su toma, y transportarlo en él hasta el sitio de su almacenamiento o proceso. Sin embargo, esta no siempre es una opción viable, por lo que existen soluciones en el mercado para preservar la integridad del ARN en tejidos, almace- nando la muestra a 4ºC hasta por un mes antes de aislar ARN. Fluidos biológicos. Siempre que la molécula de interés sea ARN, las muestras deben mantenerse a –70ºC o en nitrógeno líquido, hasta su extracción. 94 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos ADN de leucocitos. Las muestras de sangre pueden mantenerse a temperatura ambiente (15-25ºC) hasta 48 horas; a 4ºC varios días, o indefinidamente a –70ºC. Sin embargo, para garantizar la obten- ción de ADN de buena calidad, la extracción debe llevarse a cabo lo más pronto posible. ARN o ADN en suero. Mantenerlo a –70ºC o en nitrógeno líquido. Uso de métodos comerciales. Moléculas o sustancias que preser- van la integridad de los ácidos nucleicos, manteniendo las muestras a –20ºC, 4ºC e, incluso, a temperatura ambiente. Asimismo, se dis- pone de métodos comerciales para extracción de ácidos nucleicos de muestras no frescas, que ofrecen un rendimiento aceptable. Contaminación de muestras y degradación Cuando las muestras no se procesan o conservan adecuadamente, es posible obtener resultados no fiables. Falsos positivos. Cuando una muestra se contamina con otra, debido a un procesamiento inadecuado, dando como resultado de- tección de ADN o ARN ajenos a la muestra problema. Falsos negativos. Cuando el ADN o el ARN de una muestra se degradan por acción de las nucleasas, lo que los convierte en inde- tectables para el método utilizado. Trastornos o agentes infecciosos detectados por estudios moleculares Agentes infecciosos: VIH, VHB, VHC, virus del papiloma humano (VPH), Mycobacterium tuberculosis, etc. Enfermedades genéticas: fibrosis quística, distrofia muscular de Duchenne, anemia de células falciformes, etc. Polimorfismos génicos de predisposición o protección frente a enfermedades: apolipoproteína E en la enfermedad de Alzheimer, receptor β-3-adrenérgico en artritis reumatoide, etc. 95 Biología molecular y citogenética Enfermedades adquiridas, expresión de genes: ARNm de albúmi- na en cirrosis, ARNm de ApoA1 en enfermedad hepática, etc. Áreas de aplicación de los estudios moleculares Infectología: se utilizan ampliamente en identificación de virus y bacterias, por su elevada sensibilidad, especificidad y rapidez. Epidemiología: la detección de polimorfismos génicos de sus- ceptibilidad o protección en una población, mediante estudios moleculares, es de gran utilidad para implementar campañas de prevención. Asimismo, estos estudios han permitido identificar genotipos de microorganismos, endémicos de una región, para es- tablecer tratamientos específicos. Nutrigenómica y nutrigenética: el análisis molecular permite eva- luar la interacción entre genes y nutrientes. Farmacología: el conocimiento de los procesos fisiopatológicos moleculares ha contribuido al diseño de nuevos fármacos, con mayor especificidad y menor cantidad de efectos adversos. Terapia génica: las técnicas moleculares han hecho posible el surgimiento de alternativas de tratamiento a trastornos genéticos o adquiridos. 3.5.7. Calidad de ácidos nucleicos purificados Integridad de los ácidos nucleicos Finalizada la purificación, interesa saber si el ácido nucleico mantiene su tamaño original (integridad), o si se ha fragmentado durante el pro- ceso. La mejor forma de comprobarlo es mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (p/v). ADN genómico (ADNg). Se considera que una muestra de ADN es íntegra cuando su perfil en una electroforesis en gel de agarosa se 96 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos corresponde a una banda discreta. El nivel de degradación de una muestra está determinado por la pérdida de definición de la banda predominante y el acompañamiento de una estela o smear a lo largo del gel. ADN plasmídico. En cada una de las calles del gel donde se cargue, se observan 3 bandas de distinto tamaño que corresponderán a las tres formas principales con las que migra en función de su grado de enrollamiento. Son las formas circular o relajada, lineal de longitud completa y superenrollada o nativa; que migran con menor a mayor velocidad. ARN. Es normal que aparezca ligero smear, debido al ARNm (múlti- ples moléculas distintas con diferentes tamaños), 2 bandas nítidas correspondientes al ARNr y, a veces, una tercera banda, más débil, correspondiente a los ARNt. Pureza de los ácidos nucleicos Mediante espectrofotometría se puede determinar, además de la con- centración, la pureza de una muestra de ácidos nucleicos basándose en la capacidad de absorbancia a una longitud de onda determinada. Así, la concentración de la muestra se calcula teniendo en cuenta el valor de absorbancia obtenido a una longitud de onda de 260 nm. Mientras que la relación de absorbancias A260/280 y A260/230 se utilizan para evaluar la pureza. La relación A260/280 es muy estable. Los principales contaminantes de los ácidos nucleicos (proteínas y derivados fenólicos)23 tienen un máximo de absorbancia a 280 nm. La relación entre ambas absorban- cias proporciona una idea del grado de contaminación de la muestra. Se considera que un ADN de pureza óptima tiene un valor entre 1.8- 2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener, al menos, una relación A260/280 > 1.6. Un valor A260/280 < 1.6 indica posible contaminación por fenoles y proteínas. Una ratio A260/280 > 2.1 podría deberse a la presencia de ARN en la muestra. 23 La contaminación por proteínas se puede solucionar mediante el empleo de proteinasa K. Si es por fenoles, hay que repetir el proceso de purificación con cloroformo/alcohol isoamílico. 97 Biología molecular y citogenética A 230 nm se absorben contaminantes como sales caotrópicas, fe- noles o carbohidratos. En general, se considera que el ADN es puro cuando la ratio A260/230 se sitúa en torno 1.8-2.2. Una ratio < 1.8 se relaciona con presencia de contaminantes en la muestra. Cuanto menor sea esta ratio la presencia de contaminantes en la muestra será mayor. No obstante, esta relación es mucho más variable que la A260/280 y depende de factores como la concentración de ADN o la composición del tampón de resuspensión de la muestra. Para poder realizar una buena interpretación de los valores de absor- bancia obtenidos es importante indicar la composición del tampón de resuspensión, así como el protocolo de extracción utilizado. Concentración de ácidos nucleicos Cantidad de ácido nucleico por unidad de volumen de solución final. Según la ley de Lambert-Beer, hay una relación directa entre la 98 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos absorbancia de una solución y su concentración24. Dicha relación se establece en la ecuación: A = ε · c · l, en la que c corresponde a la concentración de la solución, l al paso óptico de la cubeta (camino óptico o longitud) en la que se realiza la medición y ε es el coeficiente de absortividad, característico para cada sustancia; indica la cantidad de luz absorbida por tal sustancia cuando se encuentra en disolución; cuanto mayor es el valor de ε, mayor es la capacidad de absorber luz y más sensible será la determinación. En el caso de los ácidos nucleicos, estos utilizan una modificación de la ecuación para calcular la concen- tración de la muestra, en la que el coeficiente de absortividad y el cami- no óptico se combinan y se utilizan como factor de conversión. Factor (f) = 1 / (ε · l); sustituyendo en la ecuación anterior: c = A / (ε · l), es decir: c = A · f; para una absorbancia medida a 260 nm en cubetas de 10 mm de paso óptico. El valor de f para los ácidos nucleicos: ADNds: 50 ng/µl (o 50 µg/ml) ADNss: 33 ng/µl (o 33 µg/ml) ARN: 40 ng/µl (o 40 µg/ml) Los valores de absorbancia de ácidos nucleicos se miden a 260 nm con el espectro normalizado. La medida de la absorbancia se realiza sobre una dilución purificada de la muestra. Se puede usar la misma dilución para calcular los cocientes y la concentración. Esta medida ha de estar incluida en el intervalo de medida lineal del espectrofotóme- tro. Si la lectura se encuentra por encima, habrá que hacer una dilución mayor de la muestra. 3.5.8. Mutaciones y polimorfismos Aún cuando los procesos de replicación del material genético son muy precisos, no son perfectos, por lo que pueden producirse errores que 24 Esta proporcionalidad entre absorbancia y concentración solo se cumple si la concentración de la sustancia no es muy elevada y la disolución es homogénea. 99 Biología molecular y citogenética generan cambios. Una mutación es una variación, espontánea o indu- cida, del genoma, un cambio permanente y heredable en la secuencia del ADN (nucleótidos), o en la disposición del ADN en el genoma. Un gen tiene un rango de mutación normal, que se expresa como el número de mutaciones nuevas por locus por generación; este rango es de aproximadamente 1 × 10 –6 mutaciones por locus por generación. Las mutaciones pueden clasificarse desde diferentes ángulos. Pueden ocurrir tanto en genes como en cromosomas, en un tejido somático o en un tejido germinal. Mutación germinal. Aquella que ocurre en la línea germinal, en una de las células sexuales (óvulo o espermatozoide). Este tipo de mutaciones inevitablemente pasará a la descendencia (en tanto la célula sexual participe de la fecundación). Las mutaciones ger- minales no dañan al individuo en sí mismo; es decir, un fenotipo completamente normal puede tener células mutantes en su línea germinal y solo se detectará en su descendencia. Existen, no obs- tante, mutaciones que afectan al cromosoma X y, como este se encuentra inactivado al azar en las hembras de mamíferos, pueden no expresar el fenotipo. Mutación somática. Aquella que ocurre en cualquier célula del cuerpo, excepto en células germinales, por lo que no se transmiten a la descendencia, sólo a las células que se originen a partir de ésta (las células idénticas de una población originada por mitosis a partir de una sola célula progenitora se denominan clones), y desaparece al morir el individuo. Si la mutación es dominante se expresará en el fenotipo de los organismos diploides. Si es recesiva no se expresará ya que quedará enmascarada por el alelo salvaje (dominante), una segunda mutación puede crear una mutación homocigota recesi- va, pero es un evento raro. Si la mutación se produce en un tejido cuyas células están en división, existe la posibilidad de que surja un clon mutante que descontrole la célula de tal forma que se pueda desencadenar una neoplasia. Si ocurre en una célula que no volve- rá a dividirse, su efecto será mínimo o nulo. 100 3. Aplicación de técnicas de extracción de ácidos nucleicos De acuerdo a la magnitud del material genético afectado, existen: Mutación puntual o génica25. Ocurre en un par de bases, o en un número reducido de bases adyacentes, y puede deberse a modifi- caciones químicas en el ADN, que cambian una base nitrogenada por otra diferente. Se detecta a nivel molecular, mediante secuen- ciación directa del fragmento alterado de ADN. De acuerdo a las bases sustituidas, pueden clasificarse como de transición (cambio de un nucleótido por otro de la misma clase; es decir, purina por purina o pirimidina por pirimidina), o transversión (cambio de un nucleótido por otro de diferente clase; es decir, purina por pirimidi- na o pirimidina por purina). También puede deberse a alteraciones durante el mecanismo de replicación del ADN, que provocan la in- corporación de una base errónea en una cadena sencilla de ADN. Una mutación puntual puede regresar a su secuencia original mediante una mutación compensatoria (reversión); es decir, la apa- rición de una segunda mutación que restaura parcial o totalmente el fenotipo normal. – Mutación por sustitución de bases. Se produce cuando, en una secuencia de ADN, se cambia un nucleótido por otro. – Mutación por pérdida de nucleótidos o deleción. Se produce cuando, en una secuencia de ADN, se pierde un nucleótido y no se sustituye por ningún otro. Esto modifica el marco de lectura abierta y, a partir de la mutación, la secuencia de aminoácidos. – Mutación por inserción de nucleótidos. Se produce cuando en una secuencia de ADN se introducen uno o más nucleótidos que no pertenecen a ella, modificando el marco de lectura abierta y alterando la secuencia de aminoácidos a partir del sitio de la mutación. Mutación por translocación de pares de nucleótidos complemen- tarios. Se produce cuando, en una secuencia, se da un cambio de una purina por otra purina o una pirimidina por otra pirimidina (en el caso de la transición) o de purina a pirimidina, o viceversa (en el de la transversión). 25 La frecuencia con la que suceden es del orden de 1 × 10–10/par de bases/división celular y 1 × 10–6/locus/generación. 101 Biología molecular y citogenética Mutación neutra. No tiene efecto sobre el fenotipo, ya que el cam- bio en la secuencia de nucleótidos genera tripletes que codifican para aminoácidos equivalentes. Mutación silenciosa. Aquella en la que, a pesar de que existe al- teración en la secuencia de nucleótidos, no provoca cambios en el aminoácido que codifica. Mutación sin sentido (nonsense). Aquélla en la que se cambia un c

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