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Replicazione del DNA La replicazione è SEMICONSERVATIVA, scoperto nel 1958 grazie a Meleson e Stahl grazie ad esperimenti con azoto pesante e leggero. Si parte da un filamento parentale stampo (giallo) che viene copiato in un filamento di nuova sintesi (rosso), e così...

Replicazione del DNA La replicazione è SEMICONSERVATIVA, scoperto nel 1958 grazie a Meleson e Stahl grazie ad esperimenti con azoto pesante e leggero. Si parte da un filamento parentale stampo (giallo) che viene copiato in un filamento di nuova sintesi (rosso), e così via per le diverse replicazioni. Il mattoncino per la replicazione è il deossinucleotide trifosfato. La nuova catena nascente sarà antiparallela rispetto a quella utilizzata come stampo. Sono necessari enzimi per far si che si riesca a formare il legame tra nucleotidi (legame fosfodiesterico). Vi sono meccanismi perchè venga assicurata una replicazione fedele. La replicazione ha una forte processività dunque ci mette poche ore. Sono necessarie varie molecole accessorie per assistere l’enzima nella replicazione. DNA POLIMERASI = è l’enzima che per l’appunto polimerizza la catena di DNA. Per essere copiato il DNA deve prima essere denaturato, così che ogni filamento possa fornire da stampo, dunque ci sono almeno due polimerasi attive durante la replicazione. Vedremo poi che in realtà ce ne sono addirittura 3. La DNA polimerasi richiede un PRIMER , o innesco, poichè non può sintetizzare nuovo DNA se non è presente un ossidrile in 3’ libero che possa fare da innesco ai nuovi nucleotidi. Questo è una piccola sequenza di nucleotidi in grado di appaiarsi al filamento stampo. Deve appaiarsi perfettamente alla DNA polimerasi per riuscire a polimerizzare ed appaiarsi nucleotidi liberi. La polimerasi usa come substrato il DEOSSIRIBONUCLEOTIDE TRIFOSFATO, in quanto sfrutta la rottura del fosfato per trarre l’energia necessaria alla AG = 3,5 polimerizzazione. }7k¥ Si forma un legame tra l’ossidrile in 3’ e il fosforo in alpha. Viene rilasciato un ? pirofosfato con rilascio di energia che , permette la formazione del legame assieme alla rottura del legame fosfodiesterico. Keq -105 La direzione di polimerizzazione è 5’-3’, ovvero aggiungo sul 3’ nuovi nucleotidi. AG =3, 5 3,5 è l’energia per la formazione del legame. 3,5 per la rottura del fosforo beta e gamma. In tutto quindi 7kcal/mol con una costante di 10^5. ANALOGHI DI NUCLEOTIDI Alcuni farmaci si basano proprio sulla generazione di molecole che possono essere usate dalla DNA polimerasi che non riesce a discriminarle pensando siano nucleotidi naturali. Ad esempio nel caso della bromodeossiuridina BrdU, che si riesce a legare come se fosse un timina. Ha un bromo al posto del metile. Questa può essere incorporata nel DNA nascente, ma il metile non interagisce con legami a H e può essere sostituito con un Br. Per quanto riguarda invece farmaci chemioterapici vengono usati analoghi dei nucleotidi che bloccano la produzione di DNA, per far si che non si possa produrre altro DNA tumorale, ma hanno effetti collaterali anche sui tessuti normali. Uno di questi farmaci é la citosina arabisonide AraC, che al posto del desossiribosio ha un arabinosio, questo viene visto dalla DNA polimerasi come un nucleotide, ma poi il 3’ è posizionato in modo sbagliato e non riesce a formare nuovi legami. Una volta inserito si blocca. L’aciclovir è una molecola che si trova nei farmaci che bloccano l’attività della DNA polimerasi: sono i farmaci antivirali che costituiscono una terapia più specifica senza effetti collaterali. Aciclovir può essere utilizzata contro Herpex Simplex ed Herpex Zooster, il trattamento può essere via orale o cutanea, tramite una pomata. L’aciclovir è una molecola che presenta una guanina ma è sprovvista di zucchero. Se la cellula è infetta dal virus esso esprime degli enzimi virali tra cui HVS-1 timina chinasi, che fosforila l’ossidrile; ci sono altri enzimi che terminano la fosforilazione generando una molecola con una guanina e 3 fosfati. La polimerasi utilizza la molecola prodotta per sintetizzare il nuovo filamento. Gli enzimi virali fosforilano una molecola che può esser inserita nel DNA ma mancando l’anello e dell’ossidrile in 3’ la sintesi viene bloccata e muoiono le cellule infettate dal virus e non le altre cellule. (Cfr topi transegenici);  STRUTTURA paragonata a una mano destra, in cui si distinguono: dita, palmo, pollice. Il PALMO è dove avviene la reazione di polimerizzazione. Possono entrare indipendentemente tutti i nucleotidi poi ci sarà un sito catalitico diverso per ogni nucleotide. Contiene dunque il sito catalitico, ed è quindi associato al neo-DNA, mentre lo stampo a singolo filamento viene piegato in modo da non passare fra pollice e dita. È caratterizzato da betafoglietti. Quando entra dunque avviene un controllo di fedeltá. Deve avvenire una reazione tra fosfato alpha e ossidrile in 3’ del primer. Per formare il nuovo legame infatti il nuovo nucleotide deve trovarsi in posizione e distanza corrette. Uno dei fattori determinanti é quindi la formazione di legami a idrogeno tra le basi, che determina la giusta angolazione, e serve dunque a testare il giusto appaiamento. La concentrazione di ribonucleotidi nel nucleo è 10 volte maggiore di quella dei d-ribonucleotidi del DNA. Sebbene 10 volte più concentrati dei dNTP, i rNTP vengono incorporati a velocità 1000 volte minore. Motivo: il sito attivo della DNA Pol è troppo piccolo per accogliere il 2’-OH. Due amminoacidi discriminatori interagiscono con lo zucchero: se uno dei due muta in uno amminoacido più piccolo, DNA Pol riduce fortemente la sua capacità discriminatoria nei confronti dei rNTP. Esiste dunque una regione con aminoacidi discrimatori, ovvero sequenze aminoacidi che che formano delle interazioni di Van Der Walls con la regione ciclica dello zucchero. Questi permettono di porre i nucleotidi alla distanza necessaria per la formazione del legame. La presenza dell’OH nel caso del ribosio per esempio impedisce di polimerizzare. Non si formano così legami a idrogeno e il nucleotide esce subito. Il processo avviene a velocità elevate. La DNA polimerasi deve posizionare in modo preciso l’ossidrile in modo da formare correttamente il legame fosfodiesterico. La struttura nel sito catalitico forma una curva grazie a interazioni con lo scheletro del DNA. Se potesse appaiarsi in modo casuale potremmo avere l’inserzione di un nucleotide saltandone uno. Il ripiegamento invece fa si che il nucleotide arrivi parallelo permettendo di entrare, il successivo è invece posizionato in modo che non possa appaiarsi, riducendo notevolmente la possibilità di errore. Questa struttura ripiegata è dunque necessaria per il corretto appaiamento del nucleotide in modo che ci sia sempre solo un nucleotide disponibile entrante, per appaiamento di base dopo base. Il palmo é caratterizzato da beta foglietti che interagiscono con lo scheletro. Ogni DNA può essere replicato, non va alla ricerca di sequenze specifiche, può replicare qualunque DNA basta ci sia l’innesco. È necessario nel sito catalitico degli ioni bivalenti metallici (Mg2+ e Zn2+). Servono fer facilitare l’interazione. Servono a spostare le cariche di idrogeno e ossigeno in modo che il fosfato in alpha possa essere attaccato dall’ossigeno carico negativamente. Se non sono presenti questi ioni la DNA polimerasi non funziona. Nello specifico : - Il primo ione è importante per spostare la carica dell’idrogeno e generare un ossigeno negativo; - Il secondo ione sposta le cariche di un altro ossigeno così che il fosfato in α possa essere disponibile per l’attacco nucleofilo; Gli ioni magnesio sono essenziali anche per fare le pcr.  Le DITA servono a fare entrare i nucleotidi. Entrano in contatto con lo stampo, piegando di 90° il legame fosfodiesterico posto subito prima del sito catalitico, in modo da esporre solo la prima base dello stampo nel sito attivo. Il POLLICE non è coinvolto nella catalisi ma interagisce con il neo-DNA mantenendo l’innesco in posizione. PROCESSIVITÀ La catalisi è un evento rapido: 1000 basi /s nei batteri. Dipende dall’alta processività dell’enzima che corrisponde al numero di basi aggiunte al secondo. Il valore di questo parametro varia da poche basi a > 50000, a seconda della DNA polimerasi. Non dipende dalla velocità di sintesi, che è sempre la stessa (1 base/ms), ma dalla diversa probabilità di distacco della DNA Pol dallo stampo, in quanto la velocità di (ri) complessazione è il passaggio più lento (1 / s). La elevata processività dipende dalla facilità di scorrimento della DNA polimerasi sul DNA, che avviene in modo sequenza- indipendente, grazie alle interazioni elettrostatiche fosfati- pollice e solco minore- palmo. L’incorporazione di una base provoca un parziale rilascio dell’enzima (rottura dei legami a H nel solco minore), che permette un rapido avanzamento di una bp. La processività è fortemente aumentata dall’interazione fra la DNA Pol e una proteina a forma di anello, che circonda il DNA durante la sintesi. Il legame alla giunzione innesco viene mediato dallo stampo grazie a interazioni elettrostatiche. CORREZIONE DI BOZZE Ci possono essere tautomeri per le basi azotate che portano la DNA polimerasi a commettere un errore di 10^10, sebbene la probabilità sia 10^5. Questo perchè man mano che polimerizzazione avviene la correzione di bozza, ovvero quando vi sono nucleotidi sbagliati, allora la DNA polimerasi stacca questo nucleotide e mette quello giusto. Ha dunque attività esonucleasica 3’-5’. Questa attività è detta PROOFREADING. Se l’appaiamento è scorretto l’ossidrile non è più posizionato nella giusta posizione a livello del pollice, la giunzione stampo è destabilizzata. L’OH rimane con un orientamento che non favorisce il legame successivo, la DNA polimerasi elimina l’ultimo nucleotide e riparte. Questa attività non si trova nel sito catalitico, ma si trova proprio in un dominio diverso. Viene portato il filamento con la base sbagliata nel sito endonucleasico. Non riesce a collegare quello successivo. Nella stessa proteina va in un dominio diverso con strutture specifiche detto dominio esonucleasico. Dunque non è una piccola sequenza ma una regione importante. Avviene un cambio conformazionale con distacco del nucleotide singolo errato. FORMAZIONE PRIMER Nella cellula ci sono almeno due polimerasi. Nei procarioti vi sono la primasi e la DNA POL III. Viene prodotto un primer di RNA. Viene formata una piccola sequenza in modo che ci sia un -OH libero da parte della primasi, che essendo una RNA polimerasi può lavorare ex novo. Questa piccola sequenza prodotta può legarsi al DNA perfettamente e offrire un 3’ libero. Negli eucarioti vi sono la DNA pol alpha e la DNA pol gamme e epsilon. Serve un enzima che faccia prima un pezzo di RNA poi il DNA. Non si chiama primasi, la la polimerasi alpha ha comunque una subunità con attivitá primasi a è una polimerasi a che riescono a finire l’innesco con DNA, perché non possono usare RNA come primer. FORCELLA REPLICATIVA La replicazione del DNA procede contemporaneamente e in modo diverso sui due filamenti. Nella cellula i 2 neo-filamenti vengono replicati contemporaneamente, perché i filamenti parentali vengono separati in modo che ognuno funga da stampo. La zona di separazione, dove avviene la sintesi dei 2 nuovi filamenti, è detta forcella replicativa (RF). La RF si sposta continuamente verso il DNA non ancora srotolato, assieme ai filamenti separati che fungeranno da stampo. L’antiparallelismo della doppia elica complica la replicazione simultanea dei due filamenti, poiché la DNA Pol può sintetizzare solo in direzione 5’-3’: solo uno dei 2 filamenti stampo può essere copiato in modo continuo, in direzione di apertura della forcella, ed è detto filamento guida o continuo (leading strand). Anche l’altro filamento deve essere sintetizzato dalla DNA Pol in direzione 5’-3’, cioè in direzione opposta a quella di apertura della forcella, quindi in modo discontinuo. E’ detto filamento lento o ritardato (lagging strand), perché la DNA Pol deve disporre di una certa quantità di stampo prima di iniziarne la sintesi. Qui i filamenti sono molto corti e sono detti frammenti di Okazaki. La sintesi di un frammento discontinuo dura fino al terminale 5’ del frammento precedente. Questi frammenti, detti frammenti di Okazaki, variano come lunghezza fra 1000 e 2000 basi nei batteri e fra 100 e 400 basi negli eucarioti. Subito dopo la loro sintesi vengono uniti in un filamento continuo, quindi sono degli intermedi di replicazione. La necessità di creare un innesco per la DNA Pol è fornita da un enzima speciale, detta primasi, in grado di sintetizzare de novo, cioè senza innesco, corti frammenti (5-10 basi) di RNA primer (innesco), poi utilizzati dalla DNA Pol. La frequenza di utilizzo della primasi sui due filamenti è ovviamente diversa: sul filamento guida viene utilizzata una sola volta, sull’altro tutte le volte che viene iniziato un frammento di Okazaki. Dato che ad ogni forca replicativa vengono sintetizzate milioni di basi, la sintesi del filamento lento può richiedere centinaia di migliaia di frammenti di Okazaki, ciascuno col suo primer. La primasi, a differenza delle RNA Pol, che sintetizzano gli altri RNA cellulari, non richiede sequenze specifiche per iniziare la sintesi del primer, ma si attiva solo in associazione con proteine specifiche della replicazione RIMOZIONE FRAMMENTI DI OKAZAKI - Nei procarioti c’è un sistema diverso che permette di eliminare gli innesti, i frammenti di Okazaki. La DNA polimerasi I interviene nella rimozione dei frammenti di Okazaki e poi la DNA polimerasi III polimerizza e allunga il DNA a partire dai frammenti. È la DNA polimerasi I ad avere un’attività -3’ esonucleasica che le permette di rimuovere i frammenti lasciando un 5’ libero che fa da innesto per poi chiudere i frammenti di DNA, sistema di chiusura con riparo del DNA. DNA polimerasi I: riempie gli spazi vuoti lasciati dai primer dopo averli rimossi; è DNA riparatore e rimuove i primer→attività esonucleasica 5’-3’ e 3’-5’; attività nucleasica; DNA polimerasi II: ripara il DNA→attività esonucleasica 3’-5’ DNA polimerasi III : si occupa della replicazione, correttore di bozze→attività esonucleasica 3’-5’; Uno dei primi enzimi che si rese disponibile da utilizzare nei laboratori non corrisponde esattamente a quello che c’è in natura: ha solo un frammento Klenow→è una parte della DNA polimerasi I utilizzata dai batteri. Può essere utilizzata anche in vitro. - Negli eucarioti il primer viene rimosso dal una RNAasi H che elimina le sequenze di primer a RNA consentendo di avere un ossidrile in 3’ che fa da innesco all’azione della DNA polimerasi. Questa RNAasi rimuove in modo specifico l’RNA appaiato con catene di DNA→rimuove tutto il primer eccetto il ribonucleotide covalente attaccato al nucleotide di inizio del DNA. La rimozione del primer lascia un piccolo gap a cui si lega la DNA polimerasi riempiendolo fino a che non si ricostituisce il doppio filamento integro. Rimane però un’interruzione di un legame fosfodiesterico, NICK, tra l’estremità 3’ OH e l’estremità 5’ fosfato del filamento riparato. LIGASI = dopo la che la RNA polimerasi ha agito, bisogna chiudere il filamento. Intervie l’enzima DNA ligasi che utilizza ATP o NAD per formare un intermedio di AMP-enz Tutte le DNA polimerasi conosciute possono solo allungare un DNA o RNA preesistente (primer) e sono incapaci di iniziare una catena. I due filamenti del DNA duplex sono di polarità opposta ma tutte le DNA polimerasi catalizzano l’aggiunta di nucleotidi alla terminazione 3’-ossidrile di una catena nascente, pertanto i filamenti possono crescere solo in direzione 5’-3’. Le DNA polimerasi sono incapaci di aprire il DNA duplex al fine di separare i due filamenti che devono essere copiati. Dunque la denaturazione avviene ad opera di un enzima specifico: ELICASI. Questo può separare in entrambe le direzioni e non è polarizzata dunque. Necessita di ATP per rompere i legami a idrogeno. La struttura è simile a una ciambella per rompere i legami a idrogeno. È formata da 6 subunità identiche dal punto di vista proteico ma diverse per interazioni con ATP, ADP o nessuno dei due (2ATP, 2ADP e 2 senza). Queste si dispongono come una ciambella con un poro al centro di dimensioni di 13Å, dunque può avvolgere solo un filamento di DNA alla volta, perchè il doppio sarebbe troppo grande (20Å). Vi sono dei loop proteici senza strutture secondarie ben identificabili, nè alpha elica nè beta foglietto. Un anello per poter avvolgere deve prima aprirsi e poi chiudersi. Serve dunque un caricatore, loader, che serve per aprire e avvolgere il filamento singolo, dunque deve essere DNA già denaturato. La prima denaturazione verrà dunque fatta da altri enzimi. Una volta formata la bolla il caricatore può avvolgere le elicasi. Attaccata all’elicasi si trova la PRIMASI. È portata per sintetizzare il primer di pochi nucleotidi di DNA. Viene idrolizzato ATP permettendo di girare, in modo da svolgere il DNA. Man mano che viene utilizzato ATP questo viene poi ricaricato. Si formano così i loop proteici che tirano il DNA. Man mano che viene denaturato per far si che non si riavvolga dall’altra parte, agiscono le TOPOISOMERASI, per srotolare il filamento e permettere di procedere evitando superavvolgimenti. La II taglia i filamenti di DNA utilizzando ATP e facendo passare l’altro in mezzo.  Il DNA in ambiente fisiologico tenderebbe poi a rinaturarsi, dunque man mano che passa l’elicasi, si posizionano delle proteine al singolo filamento : SINGLE STRAND BINDING PROTEINS, che impediscono appunto che il DNA rinaturi. Agiscono per interazioni elettrostatiche con la carica negativa del DNA. Agiscono fino a che non passa poi l’elicasi. L’enzima deve sintetizzare lunghe catene di DNA, sarebbe in un certo equilibrio dinamico, quindi si lega e stacca ripetutamente, e andrebbe così a colpire sulla processività dell’enzima negativamente. Quindi sia in eucarioti che procarioti, la DNA polimerasi viene tenuta legata al suo stampo dalla così detta SLIDING CLAMP. Anch’essa è un anello che accomoda al suo interno DNA a doppio filamento. Lega la DNA polimerasi, mantenendola in posizione e permettendole di posizionarsi esattamente all’ossidrile in 3’ disponibile del primer, trovando il punto preciso graze al suo caricatore. È composta da: - 3 subunità nei fagi - 2 subunità per eucarioti e procarioti Sono regioni ripetute a 6 con diametro di 30Å, per questo riesce ad accomodarsi il doppio filamento (20Å). Negli eucarioti può essere nominata a volte PCNA (proliferating cell nuclear antigen), nome dato notando che fosse molto presente durante la proliferazione del DNA. Anche in questo caso c’è un loader, che usa ATP, apre momentaneamente l’anello e lo riavvolge attorno al doppio filamento di DNA Il loader ha un dominio proteico che interagisce nel punto in cui finsce il doppio filamento e inizia quello singolo, dunque riconosce dove si è fermata la primasi. Apre l’anello, riconosce il DNA a doppio filamento, la DNA polimerasi identifica il leader e la sliding camp dunque lo avvolge dietro, così la polimerasi ha lo spazio per mettersi in modo diverso staccando il loader. Così si ha lo spazio per far cadere l’ossidrile in 3’ nel sito catalitico. La sliding clamp è una proteina che si lega a molte altre proteine, alcune necessarie per la replicazione, come gli CHAPERON per il reclutamento degli istoni e i sistemi di riparo in modo da costituire il nucleosoma su cui si avvolge il DNA. OLOENZIMA = è il complesso che viene richiamato per il primer. I due filamenti vengono sintetizzati contemporaneamente per ridurre il tempo di permanenza del DNA come singolo filamento più fragile: una sua rottura fortuita spezzerebbe di fatto il cromosoma (riparo molto difficile). I due filamenti sono detti continuo e discontinuo. Quest’ultimo è generato dai frammenti di Okazaki. L’oloenzima viene reclutato a livello del primer, che deve quindi essere già sintetizzato. Le DNA polimerasi sono 3 e vicino al caricatore, legate dalle proteine TAU, che sono inflessibili e le legano. Il REPLISOMA è il complesso di RNA e proteine durante la sintesi del DNA. Man mano che la elicasi apre la doppia elica, scorrendo sul filamento lagging, il filamento leading viene copiato rapidamente, mentre l’altro viene mantenuto a singolo filamento. A intervalli più o meno regolari viene sintetizzato su questo filamento un innesco, quindi un frammento di Okazaki da parte della Pol III, rilasciata dal frammento precedente, ma non dall’oloenzima. Il modello è detto a trombone perché il laccio a singolo filamento, che si forma sul filamento lento, aumenta e cala di dimensioni durante la sintesi, mimando il movimento di un trombone. In associazione con l’elicasi, la primasi aumenta la propria affinità per il DNA di circa 1000 volte, sintetizzando così un primer. È la debole interazione primasi-elicasi, che permette di regolare la lunghezza dei frammenti di Okazaki.  Negli eucarioti ci sono dunque 3 diverse DNA Polimerasi che agiscono alla forcella replicativa: DNA pol alpha/primasi, pol delta pol epsilon Ognuna di queste ultime due su un diverso filamento (non ancora chiaro quale), ma le proteine che ne coordinano l’azione sono ancora poco conosciute Perchè devono essere 3 le polimerasi legate al Loader? Vediamo che l'elicasi con la primasi ha formato il primer, poi il loader è pronto appena il primer è terminato ad inserire la nuova polimerasi Nel frattempo l'altro frammento di okazaki si sta sintetizzando, non può utilizzare quindi una sola polimerasi per queste 2, gliene servono altre. Ricapitolando: Il filamento discontinuo forma un'ansa, è ripiegato, per il discontinuo ha 2 DNA pol alternate, quindi così riesce a mantenere la stessa velocità del continuo. Eucarioti Il filamento continuo viene sintetizzato dall' pol epsilon, il discontinuo delta, poi abbiamo la sliding clamp detta CNA e RF-C. Nell’ultimo anno sono andati a marcare con fluorescenza la alpha, la epsilon. È la delta e sono andati a vedere per quanto tempo rimangono agganciate ai siti per il DNA. La alpha solo un minuto, la epsilon cinque. I tempi di legame sono quindi molto diversi in base alle diverse polimerasi.  INIZIO REPLICAZIONE Bisogna considerare che la forca replicativa normalmente viaggia in entrambe le direzioni, quindi ve ne sono due di origini di replicazione. In particolare ce ne sono diverse lungo il DNA. BATTERI Vengono aperte le bolle replicative nel DNA. Le due forche di replicazione sono dette origini di replicazione. Viene detta REPLICATORE la sequenza nucleotidi a agente in cis sufficiente per dirigere l’inizio della replicazione, sono riconosciute dall’INIZIATORE, ovvero una proteina che dà inizio al processo e favorisce la denaturazione, per agganciare le elicasi riconoscendo sequenze specifiche. Ci sono tre origini di replicazione di cui parleremo, ovvero: - Escherichia Coli (oriC). - SV40 (un virus) origine di replicazione legata da il piantige - S. Cervisiae (cellula eucariota di un lievito). Origine di replicazione legata da orc. ESCHERICHIA COLI Ci sono 4 sequenze di 9 nucleotidi in cui si lega DNAa nell’origine di replicazione OriC dell’escherichia coli. Da notare che sono presenti molte T e A, dunque regioni con il minor numero di legami a idrogeno possibili, così da avere bisogno di meno energia per aprire questa regione. Sono sequenze ripetute che verranno aperte dall’INIZIATORE. Si porta a un ripiegamento del DNA in sequenze ricche di nucleotidi A e T e si rompono i legami a idrogeno. Arriverà così l’elicasi col suo replicatore che può così essere agganciata. Nei batteri l’elicasi può essere indicata come DNA B o DNA C. Dopo che un certo numero di molecole iniziatore (DnaA), complessate ad ATP, si sono legate ad OriC ed hanno aperto la doppia elica, vengono reclutate due elicasi (DnaB), complessate al posizionatore (DnaC). Una volta posizionate sul ssDNA, con rilascio di DnaC, le elicasi migrano verso le due opposte forcelle. Le elicasi richiamano prima le primasi, per la sintesi dei primer, poi il DNA Pol III oloenzima, alla giunzione innesco-stampo di ciascuna forcella, dando inizio alla sintesi dei due filamenti guida. Dopo. che ciascuna DNA Pol si è spostata di ~1000 basi, vengono sintetizzati i primer degli Okazaki. Ci sono due oloenzimi per i filamenti, portano la clamp e cominciano a replicare nelle due direzioni, così tutta la molecola circolare viene replicata. Ha un’unica origine di replicazione. Alla fine le due molecole figlie rimangono concatenate e quindi la toposiomerasi si occupa di separarle.  Il DNA dei batteri metilano il proprio DNA. Un enzima riconosce la sequenza, le due A di entrambi i filamenti vengono così metilate, in modo che non avvenga la replicazione più volte del necessario. Ogni circa 240bp trovo questa metilazione. Dopo la replicazione il DNA è dunque detto emimetilato. Quello di nuova sintesi non sarà metilato l’altro sì. La cellula dunque capisce che è stato replicato. Viene riconosciuta e legata la sequenza GATC. Viene legato dalla cenp an che lo tiene sullamembrana fino a quando non viene richiusa la cellula, poi le DAM che vanno a metilare il filamento di nuova sintesi In caso richiama delle metilasi che vanno a metilare al filamento di nuova sintesi, quindi il DNA è nuovamente metilato del tutto. Molecole che abbiamo visto nei procarioti: DNA a , orc o piantige, che riconosce il sito Elicasi e caricatore, ovvero DNAb ec Primasi, DNAg Le due polimerasi della replicazione, sempre 3 nei procarioti, la stessa sintetizza continuo e discontinuo, negli eucarioti abbiamo rispettivamente delta ed epsilon Pcna, sliding clamp Caricatore, la gamma  EUCARIOTI A differenza dei batteri con un’unica origine di replicazione, nell’uomo ci sono dalle 100000 origine di replicazione. In un cromosoma si possono dunque avere più origini di replicazione. Solo quando viene denaturato il DNA si formano le due forche replicative. Le origini sono circa separate da 30kbp. Non tutte sono attive nello stesso momento. Dunque una volta attivate le origini non possono ulteriormente essere attivate (contengono DNA neosintetizzato) Alcune origini sono replicate passivamente (per estensione della/e bolla/e adiacenti); e non verranno quindi attivate poiché “contengono” DNA neosintetizzato Anche in questo caso il DNA deve essere replicato una sola volta. Quando il DNA è ancora chiuso, viene portata l’elicasi e i un caricatori. L’origine di replicazione in fase G1 si presenta con ORC e le elicasi già pronte in quello che viene detto pre-RC (replication complex). I cromosomi devono essere replicati una sola volta o avremmo dei numeri sbagliati di cromosomi, aneuploidie. In fase G1 ci troviamo dunque in pre-RC. Bisogna passare a una condizione aperta. Questo passaggio è controllato dalle CDK. Questi sono enzimi kinasi che vanno a fosforilare enzimi e lavorano grazie a dei checkpoint. Fosforilano: serina, treonina e tirosina. All’inizio l’attività delle Cdk sono molto scarse. Nel punto del check-point della fase G1 si attivano aprendo così la forca replicativa. Il complesso non riesce ad attaccarsi alla forca di replicazione fintanto le Cdk sono attive, solo quando si abbassa l’attività si riforma il complesso pre-RC.  Le Cdk andando a fosforilare CDT e elicasi, che vanno a richiamare i primer. Dunque la CDK impedisce la formazione di nuovi complessi pre-RC e attiva i complessi pre-RC già assemblati. Quindi controlla il numero di replicazioni/ciclo. Tale controllo dipende anche dalla possibilità per le proteine che devono formare il complesso di pre-replicazione- di avere libero accesso al replicatore, e ciò è facilitato dall’assenza dell’involucro nucleare che dipende dall’attività CDK. L’attivazione del pre-RC porta all’assemblaggio della forca replicativa degli eucarioti: Una volta attivato il pre-RC vengono rilasciati e degradati i caricatori delle elicasi (Cdc6 e Cdt1). Vengono reclutate le polimerasi delta ed epsilon su entrambe le forche. Viene quindi reclutata la polimerasi alfa (la primasi) su entrambi i filamenti anticipati Ed infine su entrambi i filamenti la viene reclutata la pinza beta (PCNA) insieme con il caricatore della pinza (RF-C) Parte la sintesi dei filamenti anticipati Ed in seguito quella dei filamenti ritardato che coinvolge ancora il caricatore di (una nuova) pinza beta  Alla fine della replicazione i vari frammenti vengono poi uniti fra di loro. TELOMERI E TELOMERASI Riguarda solo il filamento lagging (ritardato): infatti l’ultimo primer, anche se comincia a partire dal primo nucleotide 5’ dello stampo, non può essere rimpiazzato da DNA polimerasi una volta rimosso. Questa situazione si ripresenta ad ogni nuova generazione, con progressivo accorciamento del cromosoma. Intervengono così le telomerasi. Il telomero è una regione ripetuta con sequenze caratteristiche, ricca di T e G. Non ha geni codificanti proteine ma viene comunque trascritto. Viene replicato dalla telomerasi, ovvero una ribonucleoproteina. Questa riesce a sintetizzare DNA su RNA. Queste sequenze ripetute riescono ad appaiarsi per complementarietà alla telomerasi, che dunque riesce a replicare più volte i telomeri. È detta trascrittasi inversa poichè utilizza RNA per allungare DNA. L’RNA si lega al telomero, copia, slitta e fa un altro pezzo. Non continua in eterno. Con l’invecchiamento diminuisce l’attività dei telomeri. Eccessiva attività può invece portare a cellule tumorali. Finita la replicazione il DNA, comunque, rimarrà una piccola porzione a singolo filamento che quindi si ripiega e si inserisce in una regione triplex, con tre filamenti ad ansa detta T.