Material de estudio C: Replicación de ADN PDF

Material de estudio C. Resumen: Replicación de ADN Ramo: Biología Molecular Profesor: Dr. Yusser Olguín Introducción El ADN es considerado el plano fundamental de un organismo, ya que la secuencia de nucleótidos del ADN contiene toda la información necesaria para formar las estructuras primarias de...

Material de estudio C. Resumen: Replicación de ADN Ramo: Biología Molecular Profesor: Dr. Yusser Olguín Introducción El ADN es considerado el plano fundamental de un organismo, ya que la secuencia de nucleótidos del ADN contiene toda la información necesaria para formar las estructuras primarias de todos los ARN y proteínas celulares. El ADN codifica las enzimas y, por lo tanto, influye indirectamente en la síntesis de todos los demás componentes celulares. La información almacenada en la secuencia de nucleótidos del ADN se transmite de una generación de células a la siguiente sin errores y de manera incorrupta. La formulación de la estructura del ADN por Watson y Crick en 1953 fue acompañada de una propuesta para su auto-duplicación. El proceso de duplicación del ADN se llama "replicación", y es un proceso biológico que ocurre en todos los organismos vivos antes de la división celular. La replicación resulta en la producción de dos moléculas de ADN hijas idénticas copiadas originalmente del ADN parental. Cada hebra de la doble hélice de ADN puede servir como plantilla para la síntesis de una nueva hebra, formando así ADN duplicado. Watson y Crick propusieron que la replicación del ADN implica la ruptura de los enlaces de hidrógeno débiles que mantienen unida la doble hélice, seguida por la rotación y separación de ambas hebras de polinucleótidos. Cada hebra separada actúa como plantilla, ya que contiene la información requerida para la síntesis de la otra hebra. Cada base de la hebra plantilla atrae el nucleótido complementario disponible dentro de la célula, produciendo así réplicas de la molécula de doble hélice. La química de la síntesis de ADN El proceso de replicación del ADN, en el cual una cadena de plantilla de ADN se copia en una cadena complementaria, en ella, la polimerización de la nueva cadena de ADN es llevada a cabo por una enzima llamada ADN polimerasa. Los bloques de construcción añadidos a una cadena hija en crecimiento son nucleótidos individuales, específicamente 2'-desoxirribonucleótidos. El proceso de adición de nucleótidos ocurre a través de un ataque nucleofílico. El grupo 3'-OH de la cadena de ADN en crecimiento ataca al grupo alfa fosfato de un nucleótido entrante, lo que resulta en la formación de un enlace fosfodiéster entre la cadena hija en crecimiento y el próximo nucleótido. El grupo 3'-OH del nucleótido recién añadido queda expuesto en el extremo de la cadena en crecimiento y puede atacar al siguiente nucleótido de la misma manera. La energía necesaria para esta adición proviene de la ruptura del enlace de alta energía entre los fosfatos β y γ del nucleótido entrante. La subsiguiente hidrólisis del pirofosfato impulsa la reacción en dirección hacia adelante, asegurando así la continuidad del crecimiento de la cadena de ADN. Modos de replicación del ADN Se describen tres posibles modelos de replicación del ADN: conservadora, dispersiva y semiconservadora. 1. Replicación Conservadora: La molécula original de ADN permanece intacta y se genera una nueva molécula de ADN hija completamente nueva. 2. Replicación Dispersiva: Se producen dos moléculas de ADN con secciones tanto de ADN antiguo como nuevo intercaladas a lo largo de cada hebra. 3. Replicación Semiconservadora: Cada hebra del ADN parental actúa como plantilla para la síntesis de una hebra hija complementaria. Este modo de replicación produce moléculas con ADN antiguo y nuevo compuesto por una hebra antigua y una hebra recién sintetizada. La replicación semiconservadora fue confirmada por el experimento de Meselson y Stahl en 1958. En este experimento, las bacterias E. coli fueron cultivadas en un medio que contenía isótopos de nitrógeno pesado (15N) y luego transferidas a un medio con isótopos de nitrógeno ligero (14N). Al analizar el ADN de las bacterias después de uno y dos ciclos de replicación, se observó que el ADN tenía densidades intermedias y ligeras, lo que confirmó que cada molécula hija retenía una hebra del ADN parental y una hebra nueva, apoyando el modelo semiconservador de replicación. Enzimas de la replicación Polimerasas de ADN Procariotas 1. Polimerasa de ADN I (Pol I): Descubierta por Arthur Kornberg en 1956, es una enzima monomérica con actividades de polimerización 5' → 3', exonucleasa 3' → 5' (prueba de lectura) y exonucleasa 5' → 3' (remoción de cebadores). Tiene una baja tasa de error y es capaz de realizar múltiples pasos de polimerización sin liberarse de la plantilla. 2. Polimerasa de ADN II (Pol II): Involucrada principalmente en la reparación del ADN. 3. Polimerasa de ADN III (Pol III): Es la principal enzima de replicación en procariotas, con alta procesividad y fidelidad. Requiere el factor de proliferación de células nucleares (PCNA) para una alta procesividad. Polimerasas de ADN Eucariotas 1. Polimerasa α: Tiene actividad de primasa y es responsable de iniciar la síntesis de ADN con cebadores de ARN. No tiene actividad de corrección de errores (proofreading). 2. Polimerasa δ: Enzima procesiva involucrada en la síntesis de la cadena líder y rezagada. Tiene actividad exonucleasa 3' → 5' para corrección de errores. 3. Polimerasa ε: Similar a la polimerasa δ en términos de actividad y procesividad, pero se cree que está involucrada en la reparación del ADN y la replicación de la cadena líder. 4. Polimerasa γ: Exclusiva de las mitocondrias, responsable de la replicación del ADN mitocondrial. 5. Otras polimerasas: Incluyen polimerasas β, ζ, y η, que están involucradas en la reparación de daños en el ADN. Otras Enzimas Importantes 1. Helicasas: Desenrollan las moléculas de ADN para permitir la replicación. Requieren ATP para romper los enlaces de hidrógeno entre las bases nucleotídicas. 2. Primasa: Cataliza la formación de cebadores de ARN necesarios para iniciar la síntesis de ADN. En procariotas, la primasa está codificada por el gen DnaG. 3. Proteínas de Unión a Cadena Sencilla (SSB): Se unen a las cadenas sencillas de ADN para protegerlas y prevenir que se vuelvan a unir. 4. Ligasas: Cierran los huecos en la columna de fosfodiéster del ADN, esenciales para unir los fragmentos de Okazaki en la replicación de la cadena rezagada. 5. Topoisomerasas: Catalizan la eliminación de superenrollamientos positivos formados por delante de la horquilla de replicación para permitir la separación continua de las hebras de ADN. Estas enzimas trabajan de manera coordinada para asegurar que la replicación del ADN sea precisa y eficiente, garantizando así la estabilidad genética de las células. Mecanismo Catalítico El sitio activo de la ADN polimerasa I tiene una forma complementaria a los pares de bases de Watson-Crick. Aunque el ADN de doble cadena se encuentra principalmente en la conformación B, los tres pares de bases cercanos al sitio activo asumen la conformación A. Esto resulta en un surco menor más ancho y poco profundo que permite a las cadenas laterales de las proteínas formar enlaces de hidrógeno con los átomos de N3 de las bases púricas y O2 de las bases pirimídicas, que de otra manera serían inaccesibles. Transferencia de Nucleótidos Las ADN polimerasas comparten un mecanismo catalítico común para la transferencia de nucleótidos. Sus sitios activos contienen dos iones metálicos, usualmente Mg²⁺, que están ligados por dos cadenas laterales de aspartato. El ion metálico B está ligado a los tres grupos fosfato del dNTP (nucleótido de desoxirribonucleósido trifosfato) unido, mientras que el ion metálico A forma un puente entre el grupo α-fosfato de este dNTP y el grupo 3'-OH del cebador. Se presume que el ion metálico A activa el grupo 3'-OH del cebador para un ataque nucleofílico sobre el fosfato 5'. El ion metálico B orienta su grupo trifosfato unido y protege electrostáticamente sus cargas negativas, así como las cargas adicionales en el estado de transición que lleva a la liberación de pirofosfato (PPi). Actividad Exonucleasa La actividad exonucleasa 5' → 3' de la ADN polimerasa I se encuentra en un dominio estructural distinto de la enzima y puede separarse de la enzima mediante un tratamiento con proteasas leves. Cuando se elimina la actividad exonucleasa 5' → 3', el fragmento restante mantiene la actividad de polimerización y se denomina fragmento grande o fragmento de Klenow. Funciones de la ADN Polimerasa I 1. Reparación del ADN: La enzima repara el ADN dañado. El ADN dañado es escindido endonucleóticamente en el lado 5' de la lesión, activando así la actividad exonucleasa 5' → 3'. Mientras se excisa este ADN dañado, la polimerasa I simultáneamente llena el hueco resultante de cadena sencilla mediante su actividad de polimerasa. 2. Traducción de Huecos (Nick Translation): La actividad combinada de exonucleasa 5' → 3' y de polimerasa de la polimerasa I puede reemplazar los nucleótidos en el lado 5' de un hueco de cadena sencilla. Estas reacciones efectivamente traducen el hueco hacia el extremo 3' de las hebras de ADN sin cambiar la molécula de ADN de otra manera. 3. Eliminación del Cebador de ARN: La actividad exonucleasa 5' → 3' de la polimerasa I elimina el cebador de ARN en el extremo 5' del ADN recién sintetizado, mientras que su actividad de polimerasa llena el hueco resultante. Este resumen cubre los aspectos clave del mecanismo catalítico de la ADN polimerasa I, incluyendo la importancia de los iones metálicos y las funciones específicas de la enzima en la replicación y reparación del ADN DNA Pol-II La ADN polimerasa II (Pol II) tiene una masa de 90 kDa. Esta enzima posee actividad de polimerización 5' → 3' y actividad exonucleasa 3' → 5'. Su tasa de polimerización es de aproximadamente 40 nucleótidos por segundo. La Pol II también llena los huecos y parece facilitar la síntesis de ADN dirigida por plantillas dañadas. Aunque tiene una baja tasa de error, su velocidad es demasiado lenta para ser útil en la síntesis normal del ADN. A diferencia de la Pol I, la Pol II carece de actividad exonucleasa 5' → 3'. DNA Pol-III La ADN polimerasa III (Pol III) es la principal enzima replicativa en E. coli. Es una holoenzima muy grande (>600 kDa) y altamente compleja compuesta por 10 subunidades diferentes. La polimerasa central está compuesta por tres subunidades: α, ε y θ. La subunidad α contiene el sitio activo para la adición de nucleótidos, la subunidad ε tiene actividad exonucleasa 3' → 5' y elimina los nucleótidos incorrectamente añadidos, y la subunidad θ es una proteína accesoria que estimula la función de ε. La holoenzima Pol III consta de 10 subunidades: α, ε, θ, τ, γ, δ, δ', χ, ψ y β. La subunidad β forma un dímero en forma de anillo alrededor del ADN y mantiene la polimerasa central cerca del extremo 3' de la cadena en crecimiento, funcionando como una "abrazadera" que puede deslizarse libremente a lo largo del ADN, maximizando así la procesividad de la enzima. Las cinco subunidades del complejo γ (γ, δ, δ', χ y ψ) median la carga y descarga de la abrazadera β durante la síntesis. DNA Pol-V La síntesis propensa a errores ocurre en E. coli y está relacionada con las funciones identificadas por mutaciones en los genes umuD y umuC, que abolen la mutagénesis inducida por UV. Estos genes forman el operón umuDC y su expresión es inducida por daño en el ADN. Sus productos forman un complejo umuD'2C, que consiste en dos subunidades de la proteína umuD truncada y una subunidad de umuC. Este complejo, conocido como ADN polimerasa V (Pol V), tiene actividad de polimerasa de ADN y es responsable de sintetizar nuevo ADN para reemplazar las secuencias dañadas por UV. Es la única enzima en E. coli capaz de pasar por alto los dímeros de pirimidina producidos por UV. ADN Polimerasas de Eucariotas Las polimerasas de ADN en eucariotas son más diversas y especializadas que en procariotas. Aquí se describen varias de las polimerasas eucariotas y sus funciones: 1. ADN Polimerasa α: Es una enzima multi-subunidad. Pertenece a la familia A de las polimerasas de ADN. Tiene actividad de primasa y es responsable de iniciar la síntesis de ADN mediante la creación de cebadores cortos de ARN. La subunidad más grande tiene actividad de polimerasa, pero carece de actividad de corrección de errores (proofreading), lo que la hace inadecuada para la síntesis de alta fidelidad. Tiene una procesividad moderada, capaz de sintetizar aproximadamente 100 nucleótidos. 2. ADN Polimerasa δ: Pertenece a la familia B de enzimas. No tiene actividad de primasa pero exhibe actividad de corrección de errores 3' → 5' exonucleasa. Es una enzima altamente procesiva cuando está asociada con el PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación). Es esencial tanto para la síntesis de la cadena líder como de la cadena rezagada durante la replicación. 3. ADN Polimerasa ε: También pertenece a la familia B de enzimas nucleares. Tiene actividad de corrección de errores 3' → 5' exonucleasa. Es altamente procesiva incluso en ausencia de PCNA. Es similar a la polimerasa δ en términos de función y estructura. 4. ADN Polimerasa γ: Pertenece a la familia A de enzimas. Se encuentra exclusivamente en las mitocondrias. Es responsable de la replicación del ADN mitocondrial. 5. ADN Polimerasa β: Pertenece a la familia X de enzimas. Está involucrada en la reparación por escisión de bases y tiene una baja fidelidad en la reparación del ADN. 6. ADN Polimerasa ζ: Involucrada en la reparación de dímeros de timina. 7. ADN Polimerasa η: Participa en la reparación de daños en las bases. Las polimerasas eucariotas trabajan de manera coordinada para garantizar la replicación precisa y eficiente del genoma eucariota, así como la reparación de daños en el ADN, asegurando así la integridad y estabilidad genética de las células eucariotas. Helicases Las helicasas son enzimas esenciales durante la replicación del ADN, ya que separan el ADN de doble hebra en hebras sencillas, permitiendo que cada hebra pueda ser copiada. Al desenrollar el ADN, forman la horquilla de replicación. El proceso de romper los enlaces de hidrógeno entre las bases de nucleótidos en el ADN de doble hebra requiere energía proveniente de la hidrólisis de ATP o GTP. Las helicasas suelen ser multimericas, a menudo en forma de hexámeros, que usan su estructura multimerica para proporcionar múltiples sitios de unión al ADN. Se cree que tienen una conformación que se une al ADN de doble hebra y otra que se une al ADN de hebra sencilla. La alternancia entre estas conformaciones impulsa el motor que funde el dúplex de ADN, requiriendo la hidrólisis de ATP. Normalmente, una molécula de ATP se hidroliza por cada par de bases que se desenrolla. Las helicasas pueden funcionar con una polaridad particular, es decir, pueden ser helicasas 3' → 5' o 5' → 3'. Clasificación de las Helicasas Las helicasas se han clasificado en cinco superfamilias: 1. Superfamilia I: Incluye helicasas como UvrD (E. coli, reparación de ADN), Rep (E. coli, replicación de ADN), PcrA (Staphylococcus aureus, recombinación), Dda (bacteriófago T4, iniciación de la replicación) y RecD (E. coli, reparación recombinacional). Las helicasas de ARN también pertenecen a esta familia y juegan un papel durante la replicación del ARN viral. 2. Superfamilia II: Incluye enzimas como rec Q (E. coli, reparación de ADN). 3. Superfamilia III: Consiste en helicasas codificadas principalmente por pequeños virus de ADN y algunos grandes virus de ADN nucleocitoplasmáticos. 4. Superfamilia IV, familia tipo DnaB: Incluye enzimas como DnaB (E. coli, replicación), gp41 (bacteriófago T4, replicación de ADN) y T7gp4 (bacteriófago T7, replicación de ADN). 5. Superfamilia V, familia tipo Rho: Incluye enzimas como la proteína Rho (E. coli, terminación de la transcripción). Las helicasas desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la integridad del genoma al facilitar la replicación y reparación del ADN, asegurando que las hebras de ADN estén disponibles para los procesos de síntesis y reparación. Primasas Las primasas son enzimas que catalizan la formación de cebadores de ARN necesarios para iniciar la replicación del ADN. Los cebadores son segmentos cortos de ARN complementarios a las hebras de ADN de cadena sencilla. La primasa es crucial en la replicación del ADN porque ninguna ADN polimerasa conocida puede iniciar la síntesis de una cadena de ADN sin un cebador inicial de ARN o ADN. Función y Características Función en Procariotas: En procariotas, el gen locus DnaG codifica para la enzima primasa, que es una ARN polimerasa. Función en Eucariotas: En eucariotas, la polimerasa α tiene una subunidad de primasa que sintetiza el cebador. La primasa desempeña un papel vital en la replicación del ADN al proporcionar el punto de partida necesario para que la ADN polimerasa pueda extender la cadena de ADN en crecimiento. Sin la acción de la primasa, el proceso de replicación no podría iniciarse, lo que subraya su importancia en la biología molecular y la genética celular. Single-Strand Binding Proteins (SSB). Proteínas de unión a cadena sencilla Son proteínas esenciales que se unen a las hebras de ADN de cadena sencilla durante la replicación. Estas proteínas protegen las hebras de ADN de cadena sencilla y previenen que se vuelvan a emparejar o formar estructuras secundarias que podrían interferir con la replicación. Características y Funciones En Procariotas: En E. coli, las proteínas SSB son moléculas tetrámeras, lo que significa que están compuestas por cuatro subunidades. En Eucariotas: Las proteínas SSB en eucariotas son trímeras y se conocen como RPA (Proteína de Replicación A). Las SSB se unen al ADN de manera cooperativa, lo que significa que la unión de una subunidad facilita la unión de otras subunidades a lo largo de la hebra de ADN. Esta cooperación asegura una cobertura rápida y eficiente del ADN de cadena sencilla, estabilizándolo y permitiendo que la maquinaria de replicación continúe sin obstáculos. Las proteínas SSB son cruciales para mantener la integridad del ADN de cadena sencilla durante los procesos de replicación y reparación, asegurando que las hebras de ADN estén disponibles y protegidas mientras son copiadas o reparadas. Ligasas Las ligasas son enzimas que desempeñan un papel crucial en la replicación y reparación del ADN al cerrar los huecos en la columna de fosfodiéster del ADN. Estas enzimas son esenciales para unir los fragmentos de Okazaki formados durante la replicación de la cadena rezagada y para completar la síntesis de ADN en procesos de reparación. Clasificación y Mecanismo de Acción Las ligasas de ADN se dividen en dos clases según el cofactor que utilizan: 1. Ligasas que usan NAD⁺: Estas se encuentran únicamente en bacterias. 2. Ligasas que usan ATP: Estas se encuentran en eucariotas, virus y bacteriófagos. Mecanismo de Acción El mecanismo de acción de las ligasas de ADN ocurre en tres etapas: 1. Formación de un intermediario enzima-AMP: La enzima forma un enlace covalente con un residuo de lisina en la enzima y un AMP (adenosina monofosfato). 2. Transferencia del AMP al fosfato 5' del ADN: El AMP se transfiere al extremo 5' fosforilado de la cadena de ADN. 3. Ataque del grupo 3'-OH: El grupo 3'-OH del ADN ataca el enlace AMP-ADN, sellando la columna vertebral de fosfato y liberando AMP. Importancia Biológica Replicación: Las ligasas son esenciales para unir los fragmentos de Okazaki en la cadena rezagada. Reparación: Completan la síntesis de ADN en la reparación de daños en el ADN. Las ligasas de ADN son fundamentales para mantener la continuidad y estabilidad del genoma, facilitando tanto la replicación precisa como la reparación efectiva del ADN. Topoisomerasas Las topoisomerasas son enzimas esenciales que catalizan la modificación del estado topológico del ADN. Estas enzimas son cruciales para aliviar los superenrollamientos que se forman delante de la horquilla de replicación y para asegurar que la replicación y transcripción del ADN procedan sin impedimentos. Funciones Principales 1. Aliviar Superenrollamientos: Durante la replicación y la transcripción, el ADN tiende a formar superenrollamientos positivos delante de la horquilla de replicación. Las topoisomerasas cortan una o ambas hebras del ADN para liberar esta tensión y luego vuelven a unir las hebras, permitiendo que la replicación continúe sin problemas. 2. Cambiar la Topología del ADN: Las topoisomerasas pueden cambiar el número de vueltas de la doble hélice del ADN, lo que es esencial para procesos como la segregación de cromosomas durante la división celular. Tipos de Topoisomerasas 1. Topoisomerasa I: Hace un corte temporal en una sola hebra del ADN, lo que permite que la hélice gire y alivie la tensión antes de religar la hebra. No requiere ATP para su función. 2. Topoisomerasa II: Hace cortes temporales en ambas hebras del ADN para introducir o eliminar superenrollamientos. Requiere ATP para su actividad. Un ejemplo es la girasa de E. coli, que introduce superenrollamientos negativos en el ADN circular bacteriano. Importancia en la Célula Replicación del ADN: Las topoisomerasas son esenciales para prevenir el superenrollamiento excesivo del ADN durante la replicación. Transcripción: Alivian la tensión delante de la ARN polimerasa durante la transcripción del ADN en ARN. Segregación de Cromosomas: Participan en la segregación adecuada de los cromosomas durante la mitosis y meiosis. Las topoisomerasas son vitales para mantener la integridad y funcionalidad del ADN durante los procesos celulares fundamentales, asegurando que la replicación y la transcripción se realicen de manera eficiente y sin obstáculos. Modelos de Replicación del ADN Existen varios modos de replicación del ADN que aseguran la transmisión precisa de la información genética a las células hijas. Aquí se resumen los principales modelos: 1. Replicación Θ (Theta) Descripción: Este modelo se observó en estudios de replicación de ADN circular, como en bacterias. Proceso: La replicación inicia en un origen de replicación y procede bidireccionalmente creando una estructura de burbuja de replicación que se asemeja a la letra griega θ (theta). Resultado: Se producen dos moléculas de ADN hijas de doble hebra a partir de una molécula parental. 2. Replicación en Círculo Rodante (Rolling Circle) Descripción: Este modelo es común en la replicación de ADN de algunos virus y plásmidos. Proceso: Un corte en una hebra de ADN circular genera un extremo 3'-OH y un extremo 5'-fosfato. La síntesis de la hebra líder puede proceder sin necesidad de un cebador, utilizando el extremo 3'-OH.  La hebra desplazada forma una cola larga que puede ser utilizada como plantilla para la síntesis de la hebra rezagada. Resultado: Se forma una molécula de ADN circular con una cola lineal que puede ser recircularizada. 3. Replicación del Bacteriófago ϕX174 Descripción: Este modelo es una variante de la replicación en círculo rodante, utilizada por el bacteriófago ϕX174. Proceso: El ADN de cadena sencilla del fago se convierte en una forma replicativa de doble hebra. La hebra líder se sintetiza de manera continua, mientras que la hebra desplazada sirve como plantilla para la síntesis de la hebra rezagada. Resultado: Se generan múltiples copias de la cadena sencilla del fago. 4. Replicación en Bucle D (D-loop) Descripción: Este modelo se observa en la replicación del ADN mitocondrial y cloroplastídico. Proceso: La síntesis de la hebra líder desplaza la hebra rezagada formando un bucle de desplazamiento (D-loop). La síntesis de la hebra rezagada comienza después de que la hebra líder ha progresado considerablemente. Resultado: Se producen dos moléculas de ADN de doble hebra. Estos modelos de replicación del ADN reflejan la diversidad de mecanismos que las células y los virus utilizan para duplicar su material genético, asegurando así la correcta transmisión de la información genética a las generaciones siguientes. REPLICACIÓN PROCARIOTA La replicación del ADN en procariotas, como en las bacterias, es un proceso altamente coordinado que asegura la duplicación precisa del genoma antes de la división celular. A continuación, se resumen los principales aspectos de la replicación procariota: Origen de Replicación Inicio: La replicación comienza en una secuencia específica del ADN llamada origen de replicación (oriC en E. coli). Caracterización: El origen de replicación en E. coli es un segmento de 240 pb que contiene múltiples secuencias repetitivas de 9 y 13 bases (llamadas 9-mers y 13-mers, respectivamente). Proteínas Involucradas: La proteína DnaA se une a las secuencias 9-mer y facilita la apertura de las secuencias 13-mer, lo que permite la unión de otras proteínas esenciales para la replicación. Iniciación de la Replicación Desenrollamiento del ADN: La helicasa DnaB, con la ayuda de la proteína DnaC, desenrolla el ADN en el origen, creando una burbuja de replicación. Estabilización de Cadenas Sencillas: Las proteínas de unión a cadena sencilla (SSB) estabilizan las hebras de ADN separadas y previenen su re-annealing. Síntesis de Cebadores: La primasa DnaG sintetiza cebadores de ARN necesarios para iniciar la síntesis de ADN. Elongación Síntesis de ADN: La ADN polimerasa III sintetiza nuevas cadenas de ADN en dirección 5' a 3'. La cadena líder se sintetiza de manera continua, mientras que la cadena rezagada se sintetiza de manera discontinua en fragmentos de Okazaki. Unión de Fragmentos de Okazaki: La ADN polimerasa I reemplaza los cebadores de ARN con ADN, y la ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki, completando la cadena rezagada. Terminación Sitios de Terminación: La terminación de la replicación ocurre en una región específica del cromosoma bacteriano llamada terminus. En E. coli, esta región contiene múltiples sitios terminadores (Ter) que funcionan en conjunto con la proteína Tus. Resolución de Intercatenaciones: Las topoisomerasas ayudan a resolver cualquier superenrollamiento o enlace entre las moléculas de ADN recién replicadas, asegurando que cada célula hija reciba una copia completa del genoma. Fidelidad de la Replicación Corrección de Errores: La ADN polimerasa III tiene una actividad exonucleasa 3' a 5' que permite la corrección de errores durante la síntesis de ADN. Adicionalmente, existen sistemas de reparación que corrigen errores no detectados por la polimerasa. Regulación de la Iniciación de la Replicación La regulación de la iniciación de la replicación es un proceso crítico que asegura que la duplicación del ADN ocurra en el momento adecuado y solo una vez por ciclo celular. A continuación se detallan los mecanismos clave de regulación en E. coli: Hemimetilación y Secuestro del Origen Metilación del ADN: E. coli metila las secuencias GATC en su ADN, lo que juega un papel crucial en la regulación de la replicación. Después de la replicación, las nuevas hebras de ADN son hemimetiladas, es decir, solo la hebra parental está metilada. Proteína SeqA: Esta proteína reconoce y se une a las secuencias hemimetiladas en el origen de replicación (oriC), secuestrando el origen e impidiendo que inicie una nueva ronda de replicación de inmediato. Relación ATP/ADP y Niveles de DnaA Niveles de DnaA: DnaA es la proteína iniciadora que se une al origen de replicación. La cantidad de DnaA y su estado de unión con ATP o ADP determinan su capacidad para iniciar la replicación. La forma de DnaA unida a ATP es activa y capaz de iniciar la replicación, mientras que la forma unida a ADP no lo es. Control de la Iniciación: La regulación de la replicación también se controla ajustando la proporción de DnaA-ATP a DnaA-ADP, así como la disponibilidad de sitios de unión a DnaA dentro del origen de replicación. Importancia de la Regulación Estos mecanismos aseguran que la replicación del ADN solo se inicie una vez por ciclo celular, evitando la re-replicación que podría llevar a aberraciones genéticas y comprometer la integridad del genoma. Síntesis de la Cadena Lider y la Cadena Rezagada Durante la replicación del ADN, la síntesis de las cadenas líder y rezagada se lleva a cabo de manera coordinada, pero con diferencias clave debido a la dirección antiparalela de las hebras de ADN y la dirección 5' a 3' en la que las ADN polimerasas pueden añadir nucleótidos. Cadena Líder Síntesis Continua: La cadena líder se sintetiza de manera continua en dirección 5' a 3', siguiendo la horquilla de replicación. Inicio: Un cebador de ARN es sintetizado por la primasa, y a partir de allí, la ADN polimerasa III añade nucleótidos de manera continua mientras avanza la horquilla de replicación. Cadena Rezagada Síntesis Discontinua: La cadena rezagada se sintetiza en dirección opuesta a la horquilla de replicación, lo que requiere la creación de múltiples fragmentos cortos de ADN llamados fragmentos de Okazaki. Inicio de Cada Fragmento: Para cada fragmento de Okazaki, la primasa sintetiza un cebador de ARN, que es extendido por la ADN polimerasa III. Unión de Fragmentos: Una vez que un fragmento de Okazaki ha sido sintetizado, la ADN polimerasa I elimina los cebadores de ARN y rellena los huecos con ADN. Finalmente, la ADN ligasa sella las brechas entre los fragmentos, uniendo la cadena de ADN rezagada en una hebra continua. Coordinación de la Síntesis Looping del ADN: La cadena rezagada forma un bucle para que la síntesis de ambas cadenas pueda ocurrir en la misma dirección física, a pesar de las direcciones opuestas de síntesis. Esto permite que la ADN polimerasa en la cadena líder y en la cadena rezagada trabajen en conjunto en la misma horquilla de replicación. Síntesis Concurrente de las Cadenas Líder y Rezagada Durante la replicación del ADN, las cadenas líder y rezagada se sintetizan de manera concurrente, a pesar de sus direcciones opuestas de síntesis. Este proceso es fundamental para la replicación eficiente del ADN. Mecanismo de Síntesis Concurrente Polimerasa Dimerizada: Un solo complejo de ADN polimerasa III, que actúa como un dímero, coordina la síntesis de ambas cadenas simultáneamente. Formación de Bucle: La cadena rezagada forma un bucle que permite que su síntesis ocurra en la misma dirección que la cadena líder, facilitando que ambas cadenas se sintetizan en paralelo mientras la horquilla de replicación avanza. Sincronización: Las dos moléculas de la polimerasa están vinculadas, lo que asegura que la síntesis de la cadena líder y la cadena rezagada esté sincronizada, de manera que el proceso de replicación ocurra de manera coordinada. Crecimiento y Reducción del Bucle Ciclo de Fragmentos de Okazaki: A medida que la polimerasa sintetiza un fragmento de Okazaki, el bucle en la cadena rezagada crece. Una vez que el fragmento es completado, la polimerasa se desplaza al siguiente fragmento, lo que hace que el bucle se reduzca temporalmente antes de formarse nuevamente. Finalización de Fragmentos Procesamiento de Fragmentos de Okazaki: Los fragmentos de Okazaki se unen mediante la acción de la ADN ligasa, y la síntesis de nuevos fragmentos continúa en un ciclo hasta que toda la cadena rezagada se completa. REPLICACIÓN EUCARIOTA La replicación del ADN en células eucariotas es un proceso complejo y altamente regulado que comparte similitudes fundamentales con la replicación procariota, pero con características únicas debido a la mayor complejidad del genoma eucariota. Características Generales Semiconservadora y Semidiscontinua: Al igual que en procariotas, la replicación del ADN en eucariotas es semiconservadora, lo que significa que cada molécula hija conserva una hebra de la molécula parental. La síntesis de la cadena líder es continua, mientras que la síntesis de la cadena rezagada es discontinua, produciendo fragmentos de Okazaki. Orígenes Múltiples de Replicación: A diferencia de los procariotas, que suelen tener un único origen de replicación, los cromosomas eucariotas tienen múltiples orígenes de replicación que permiten la replicación simultánea de diferentes regiones del ADN. Ciclo Celular Fases del Ciclo Celular: La replicación del ADN ocurre durante la fase S del ciclo celular. Esta fase es precedida por la fase G1, donde la célula se prepara para la replicación, y seguida por la fase G2, donde la célula se prepara para la mitosis. Control del Ciclo Celular: La progresión a través del ciclo celular es controlada por ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Estas proteínas regulan la iniciación y progresión de la replicación del ADN al activar o inhibir los complejos de pre-replicación formados en los orígenes de replicación. Iniciación y Elongación Complejo de Iniciación: En la fase G1, se ensamblan complejos de pre-replicación en los orígenes de replicación. Estos complejos incluyen la proteína de reconocimiento del origen (ORC), Cdc6, Cdt1 y el complejo MCM (minichromosome maintenance). Activación de la Replicación: La activación del complejo de pre-replicación requiere la acción de quinasas, como el complejo Dbf4-Cdc7 (DDK) y las CDKs de la fase S. Una vez activado, el complejo MCM actúa como helicasa, desenrollando el ADN y permitiendo la síntesis de nuevas hebras. Síntesis de las Nuevas Hebras: La polimerasa α inicia la síntesis de ADN, pero su procesividad es baja. Posteriormente, la polimerasa δ toma el relevo para continuar la síntesis en la cadena rezagada, mientras que la polimerasa ε se encarga de la cadena líder. Terminación y Procesamiento Licenciamiento de la Replicación: Un mecanismo conocido como "licensing" asegura que cada origen de replicación sea activado solo una vez por ciclo celular. Esto previene la re-replicación del ADN. Telómeros y Telomerasas: Los extremos de los cromosomas eucariotas, llamados telómeros, son replicados por una enzima especial llamada telomerasa. Esta enzima evita el acortamiento de los telómeros, que ocurre debido a la naturaleza discontinua de la replicación de la cadena rezagada. Control de la Replicación del ADN en el Ciclo Celular El control de la replicación del ADN en el ciclo celular es un proceso crucial que asegura que la replicación del ADN ocurra de manera precisa y solo una vez por ciclo celular. A continuación se describen los mecanismos clave de este control en las células eucariotas: Fases del Ciclo Celular Fase G1: Las células sintetizan ARN y proteínas, preparando para la replicación del ADN y la duplicación de cromosomas durante la fase S. Fase S: Es la única etapa del ciclo celular donde ocurre la replicación del ADN. Fase G2: Después de la replicación, la célula se prepara para la mitosis. Complejos Ciclinas-CDK Complejos G1-CDK: Se expresan primero y preparan la célula para la fase S activando factores de transcripción que promueven la transcripción de genes necesarios para la síntesis de ADN. Complejo SPF (S-Phase Promoting Factor): Compuesto por ciclinas G1 asociadas a CDK, promueve la entrada en la fase S al fosforilar y regular proteínas necesarias para la replicación del ADN. Inhibición de la Replicación: Una proteína inhibidora llamada Sic1 bloquea la actividad de las ciclinas-CDK tipo B durante G1, impidiendo la entrada prematura en la fase S. Regulación por Degradación Proteica Degradación de Sic1: La ubiquitinación y degradación de Sic1 permite la activación del complejo de ciclina-CDK tipo B, desencadenando el inicio de la replicación del ADN al fosforilar proteínas asociadas con los orígenes de replicación. Prevención de la Re-replicación Fosforilación de Factores de Iniciación: Una vez que se inicia la replicación, los factores de iniciación son fosforilados, evitando la formación de nuevos complejos de pre-replicación hasta que la célula ha pasado por mitosis. Orígenes de Replicación en Eucariotas Los orígenes de replicación en eucariotas son sitios específicos en los cromosomas desde donde se inicia la replicación del ADN. A diferencia de los procariotas, que generalmente tienen un único origen de replicación, los cromosomas eucariotas contienen múltiples orígenes para asegurar que todo el ADN sea replicado en el tiempo limitado de la fase S del ciclo celular. Características Principales Múltiples Orígenes: Los cromosomas eucariotas son replicados a partir de múltiples orígenes que se activan en diferentes momentos durante la fase S. Unicidad de Activación: Ningún origen de replicación se activa más de una vez por ciclo celular, lo que asegura que cada segmento de ADN sea replicado solo una vez. Activación de los Orígenes Secuencia Conservada: En organismos como la levadura, los orígenes de replicación contienen secuencias conservadas a las que se une un complejo proteico llamado ORC (Origin Recognition Complex). Formación del Complejo Pre-replicación: Durante la fase G1, varios factores de iniciación, incluyendo Cdc6, Cdt1 y el complejo MCM, se asocian con el ORC para formar un complejo de pre-replicación en cada origen. Activación en la Fase S: La activación de estos complejos requiere la acción de quinasas específicas, como el complejo Dbf4-Cdc7 (DDK) y las ciclinas-CDK de la fase S, que fosforilan componentes del complejo pre-replicación para iniciar la replicación. Importancia Estos mecanismos aseguran una replicación eficiente y controlada del genoma eucariota, previniendo errores y manteniendo la integridad genética a lo largo de las divisiones celulares. La activación regulada de múltiples orígenes permite la replicación completa del ADN dentro del tiempo limitado de la fase S. Elongación Durante la fase de elongación de la replicación del ADN en células eucariotas, se lleva a cabo la síntesis continua de las nuevas hebras de ADN a partir de las plantillas existentes. Aquí se detallan los pasos clave: Iniciación de la Síntesis Polimerasa α: Inicia la síntesis de las hebras hijas pero, debido a su baja procesividad, esta enzima es rápidamente sustituida por otras polimerasas más eficientes. Polimerasa δ: La Polimerasa δ toma el relevo en la cadena rezagada, continuando la síntesis de ADN a un ritmo elevado. La procesividad de esta enzima se ve incrementada cuando se asocia con el antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA). Procesamiento de Fragmentos de Okazaki FEN1 y RNasa H: La enzima FEN1 (Flap Endonuclease 1) está asociada con la polimerasa δ y juega un papel crucial en la eliminación de los cebadores de ARN en los fragmentos de Okazaki. La RNasa H degrada la mayor parte del ARN cebador, excepto el ribonucleótido terminal, que es removido por FEN1. Unión por ADN Ligasa: Una vez eliminados los cebadores, la ADN ligasa sella los huecos, uniendo los fragmentos de Okazaki para formar una hebra continua de ADN. Modelos Alternativos para la Eliminación de Cebadores Modelo del Flap: La polimerasa δ desplaza el cebador de ARN, creando un flap que es posteriormente cortado por FEN1. Modelo de RNasa H: La mayor parte del cebador es removida por RNasa H, y el resto es procesado por FEN1 antes de que la ligasa cierre el ADN. Licenciamiento de la Replicación del ADN El proceso de licenciamiento de la replicación del ADN es fundamental para asegurar que cada origen de replicación en el ADN eucariota se active solo una vez por ciclo celular, evitando la re-replicación y asegurando la estabilidad del genoma. Mecanismo de Licenciamiento Fase G1: Durante esta fase, los orígenes de replicación son "licenciados" para la replicación mediante la carga del complejo de MCM (minichromosome maintenance) en el ADN. Este  proceso es facilitado por proteínas como Cdc6 y Cdt1, que colaboran con el complejo de reconocimiento del origen (ORC) para formar el complejo pre-replicativo (pre-RC). Activación en Fase S: Cuando la célula entra en la fase S, las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs) y la quinasa Dbf4-Cdc7 (DDK) activan el complejo MCM, iniciando la replicación del ADN. Prevención de la Re-replicación: Una vez que un origen ha sido utilizado para la replicación, el complejo MCM es desactivado o removido, lo que impide que el mismo origen sea reactivado dentro del mismo ciclo celular. Importancia del Control Este sistema de licenciamiento es crucial para la fidelidad de la replicación del ADN, asegurando que cada segmento del genoma sea replicado exactamente una vez por ciclo celular. Esto es esencial para mantener la integridad genética y prevenir aberraciones que podrían llevar a la inestabilidad del genoma o a enfermedades como el cáncer. El licenciamiento de la replicación del ADN es, por tanto, un mecanismo clave de control dentro del ciclo celular que coordina la replicación con otros eventos celulares para asegurar una división celular precisa y ordenada. Terminación de la Replicación, Telómeros y Telomerasas La terminación de la replicación del ADN, junto con la función de los telómeros y las telomerasas, son aspectos clave en la replicación del ADN en células eucariotas. Terminación de la Replicación Finalización en Orígenes: La replicación del ADN en eucariotas termina cuando las horquillas de replicación que se originan en diferentes orígenes se encuentran y se fusionan. Resolución de Estructuras: En las regiones terminales, se forman estructuras llamadas telómeros que necesitan ser adecuadamente replicadas y protegidas para evitar la pérdida de información genética. Telómeros Definición: Los telómeros son secuencias repetitivas de ADN no codificante situadas en los extremos de los cromosomas eucariotas. Actúan como "capuchones" protectores que previenen la degradación del ADN y la fusión de los extremos cromosómicos. Problema del Extremo: Debido a la naturaleza discontinua de la replicación de la cadena rezagada, una pequeña porción del ADN en el extremo de cada cromosoma no puede ser replicada, lo que resultaría en un acortamiento progresivo de los cromosomas en cada ciclo celular. Telomerasas Función: La telomerasa es una enzima que añade secuencias repetitivas al final de los telómeros, contrarrestando el acortamiento que ocurre durante la replicación. Composición: La telomerasa contiene una porción de ARN que sirve como plantilla para la síntesis de nuevas repeticiones de ADN en los extremos de los cromosomas.  Regulación: La actividad de la telomerasa es altamente regulada y es más activa en células germinales, células madre y células cancerosas, pero está reprimida en la mayoría de las células somáticas adultas. Importancia El correcto manejo de la terminación de la replicación, junto con la protección y extensión de los telómeros, es esencial para mantener la estabilidad genómica y prevenir el envejecimiento celular prematuro y enfermedades relacionadas, como el cáncer. Las disfunciones en estos procesos pueden llevar a inestabilidad cromosómica y contribuir a la oncogénesis INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN Los inhibidores de la replicación son compuestos o factores que interfieren con el proceso de replicación del ADN, y se utilizan tanto en investigación como en terapias para tratar enfermedades como el cáncer. A continuación se describen algunos de los principales inhibidores de la replicación del ADN. Tipos de Inhibidores Inhibidores de la Topoisomerasa: Mecanismo: Las topoisomerasas son enzimas que alivian la tensión del ADN durante la replicación. Los inhibidores de las topoisomerasas interfieren con su función, lo que resulta en roturas del ADN y la interrupción de la replicación. Ejemplos: Camptotecina (inhibe la topoisomerasa I) y Etopósido (inhibe la topoisomerasa II). Inhibidores de la Polimerasa: Mecanismo: Estos inhibidores se dirigen directamente a las ADN polimerasas, impidiendo la síntesis de nuevas cadenas de ADN. Ejemplos: Ara-C (citarabina), un análogo de nucleósido que se incorpora al ADN y bloquea la elongación de la cadena. Análogos de Nucleósidos: Mecanismo: Los análogos de nucleósidos se incorporan en el ADN en lugar de los nucleótidos normales, pero no permiten la elongación adecuada de la cadena de ADN, lo que resulta en la terminación prematura de la replicación. Ejemplos: 5-fluorouracilo (5-FU), utilizado en la quimioterapia contra el cáncer. Inhibidores de la Helicasa: Mecanismo: Las helicasas desenrollan el ADN para permitir la replicación. Los inhibidores de helicasa bloquean este desenrollamiento, deteniendo la replicación. Ejemplos: Los inhibidores de helicasa están en investigación y aún no se utilizan ampliamente en clínica. Uso en Tratamientos Cáncer: Muchos de estos inhibidores se utilizan en quimioterapia para matar células cancerosas que se dividen rápidamente al interferir con la replicación del ADN. Investigación: Los inhibidores de la replicación también son herramientas valiosas en la investigación para estudiar los mecanismos de la replicación del ADN. Consideraciones El uso de inhibidores de la replicación debe ser cuidadosamente controlado, ya que también pueden afectar a las células normales, especialmente aquellas que se dividen rápidamente, como las células de la médula ósea y las células epiteliales, lo que puede causar efectos secundarios significativos.