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Generazione Animali Transgenici ORGANISMI UTILIZZATI Per andare a generare mutazioni su proteine e vedere gli effetti che hanno Lievito C. Elegans Drosopila Zebrafish Xenopus Laevis Pollo Topo Più di come si fa a generare un modello trangenico andremo a vede...

Generazione Animali Transgenici ORGANISMI UTILIZZATI Per andare a generare mutazioni su proteine e vedere gli effetti che hanno Lievito C. Elegans Drosopila Zebrafish Xenopus Laevis Pollo Topo Più di come si fa a generare un modello trangenico andremo a vedere aspetti più generali, prendendo come esempio il topo: modello molto utilizzato per studiare geni legate a malattie umane in quanto mammifero. FINE I modelli transgenici sono generati al fine di: 1) Comprendere la funzione di un gene 2) Generare un modello di una patologia umana per studiare in dettaglio la patologia, come ad esempio la modificazione di un oncogene che porta al cancro 3) Sviluppare approcci terapeutici per patologie umane 4) Produzione di una proteina ricombinante in grandi quantità in bioreattori, che venga modificata il più vicino possibile alla proteina funzionale. Abbiamo visto come far produrre una proteina ricombinante da parte di batteri, e per alcune è molto adatto svilupparle in batteri, per altre che devono ricevere particolari modificazioni non possono essere sviluppate. GENETICAMENTE Si può studiare l’acquisizione di un gene attraverso l’acquisizione di una funzione. Si aggiunge del DNA ricombinante per sovrascrivere ed osservarne la funzione, oppure lo si aggiunge a una cellula che solitamente non lo esprime, per vedere se si attivano determinate funzioni. È possibile pensare di osservare la funzione di una proteina facendola esprimere in una cellula che solitamente non la esprime. Si può invece eliminare la funzione di una proteina o mediante ricombinazione omologa o geneticamente. Quando si parlerà di micro RNA parleremo anche di strategie, tecniche, usate per bersagliare direttamente RNA. TRASFORMAZIONE DELLA CELLULA RICEVENTE Modificazione del genotipo dovuta ad acquisizione del DNA esogeno, che viene detto TRANSGENE. Viene inserito nella cellula. Può avvenire attraverso TECNICHE diverse: TRASFEZIONE: metodi sia chimici che fisici per l’internalizzazione del DNA nelle cellule. Il DNA viene avvolto da lipidi cationici e la cellula lo fagocita, rimane protetto dal lisosoma ed entra nel nucleo. TRASDUZIONE: impaccamento del DNA all’interno di virus animali che si sono evoluti proprio per infettare le cellule bersaglio ed introdurvi il loro materiale. Con un retrovirus ad esempio si può far integrare del DNA esogeno nella cellula, ad esempio sostituendo con il gene di interesse delle parti nel DNA del virus che non servono per inglobare il DNA. La modificazione può avvenire in MODO: STABILE: il transgene si integra nel genoma dell’ospite e pertanto viene ereditato dalla progenie. Si trova in un cromosoma dunque viene ereditato durante la mitosi. TRANSIENTE: il transgene permane in forma extracromosomica nel nucleo per tempi relativamente brevi. Dunque il DNA entrato anche negli eucarioti può rimanere in forma episomica nel nucleo.  Entrano varie molecole di DNA. Una buona percentuale riesce a raggiungere il nucleo. Qui seguirà il legame tra il suo promotore e i fattori di trascrizione. A un certo punto le cellule si dividono. Dunque se dopo qualche divisione: Il DNA viene perso non avrò più il transgene, il DNA rimane in forma episodica viene trascritto il transgene, quando si dividono viene ereditato da una cellula piuttosto che un’altra, può andare a perdersi il DNA col transgene si è integrato nel genoma, verrà costantemente trasmesso alla progenie. Posso così ottenere una linea cellulare in cui fare esprimere il transgene. Si parla di modificazione stabile e non transiente. Nei primi giorni anche in forma episomica posso osservare la proteina, ma col tempo verrebbe persa. Si usano dei metodi di selezione ad esempio inserendo le solite resistenze come la Neomicina. INTEGRAZIONE NEGLI ANIMALI Il concetto è lo stesso. Bisogna fare si che il transgene si integri nel genoma. Se venisse inserito precocemente solo poche cellule lo esprimerebbero. Si vuole avere qualcosa di stabile. Si può: 1) Introduzione del DNA nell' OOCITA FECONDATO, nella cellula uovo o in embrioni precoci => ci concentriamo qui 2) Utilizzo di CELLULE EMBRIONALI STAMINALI (ES) che sono derivate da embrioni preimpianto (blastocisti)—> ricombinazione omologa già trattata STORICAMENTE Jaenisch e Mintz, 1974: Primo esperimento con DNA virale di SV40 iniettato nel blastocele di embrioni preimpianto. Nascita di topi transgenici contenenti il DNA esogeno di SV40 integrato nel genoma. Harbers, 1981: Iniezione diretta di DNA virale nel citoplasma di cellule uovo fecondate, dunque nell’embrione precoce. => questo è ciò che si fa per la produzione ad esempio di topi transgenici. Si parla di pro-nucleo. Generalmente si utilizza un pronucleo maschile poichè è più grande, più visibile e dunque più facile. Si osservano i due nuclei aploidi che si stanno per fondere per generare l’omozigote. Si iniettano circa 2pl (pochissimo). Inserendo un DNA generalmente linearizzato, tagliato con enzimi di restrizione per togliere ciò che non serve, questo si inserirà nel genoma grazie a sistemi mediati da integrasi. Si fanno accoppiare i topi, si lava l’utero della topa il giorno dopo in modo che ci siano ancora gli ovociti. Si fa l’iniezione. Si aspetta in cultura di arrivare allo stadio di morula. Si impianta in una topa pseudogravida, tratta con ormoni per renderla pronta a ingravidarla. Hanno uteri bicorni che arrivano nella parte del dorso, così si effettua qui l’iniezione. Si ottengono dunque dei topi e si analizzano. COME È FATTO UN TRANSGENE Dove finisce il DNA inserito? Si può oggi indirizzare dove far entrare il transgene, ma utilizzando delle linee di topi particolari con delle sequenze specifiche per le integrasi. Ma in linea generale potrebbe andare ovunque nel genoma. Il transgene ha bisogno di: Promotore Fattori di Trascrizione cDNA Segnale di Poliadenilazione (può essere diverso da quello endogeno del gene, se ne usano di già caratterizzati o virali o il segnale dell’ormone della crescita bovino) IRES per seguire dove va, simula un CAP per reclutare EIF4G in modo che si leghi il ribosoma in questo punto. Non esiste nel nostro genoma ma dei virus lo hanno. La maggior parte dei topi trangenici sono stati fatti prendendo un pezzo di DNA e inserendolo nel genoma in modo semicasuale. Se si trova in un introne = non verrà espresso Sul promotore = influenza altri geni Intergenica = non ci sono altri geni In questo caso era stato iniettato un promotore e la EGFP, solo una piccola percentuale esprime il gene messo, dando fluorescenza. Questo può essere dovuta al fatto che o non si è integrato o è in una regione che non può esprimerlo. L’efficienza dell’inserzione è molto variabile, nonostante i tecnici possano essere molto bravi. Solo il 5/40% dei topi che nascono conterranno effettivamente il trangene. Per osservare quali lo hanno acquisito si utilizzano delle tecniche che abbiamo visto, oltre a utilizare fluorescenza se si è fornito EGFP,: Southern Blotting = si fa una piccola biopsia, si purifica il DNA, lo si digerisce con un enzima di restrizione e si fa l’analisi con una sonda, che vada ad esempio in regioni particolari si può osservare il transgene e non il gene endogeno, si scelgono solitamente regioni non presenti nel genoma. PCR = si scelgono dei primer, uno presente e uno non nella regione di codificazione del topo. Devono essere vicini. La PCR avviene solo nel gene che si vuole. Se sono troppo lontani si riesce ad amplificare ad esempio solo in transgene, e non quello genomico. La scelta dei tempi può essere anch’essa metodo di selezione. ESPRESSIONE del transgene: 1) Dipende dal tipo di promotore utilizzato 2) Dipende dal numero di transgeni che si sono integrati nel genoma (le molecole di DNA tendono a formare multimeri testa-coda prima dell' integrazione) 3) Dipende dalla regione cromatinica in cui si è inserito (effetto di posizione) Può essere influenzato da altri geni, influenzare altri geni, o inserirsi in regioni che durante lo sviluppo quando la cromatina è aperta ma che poi diventano eterocromatina impacchettandosi e non permettendo l’espressione del transgene. Dunque con la PCR magari si osserva che c’è il transgene, ma magari non in tutte le linee che c’è si osserva l’espressione del gene. Queste linee comunque si mantengono e si scambiano tra i vari ricercatori. CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE DEL TRANSGENE Le caratteristiche molecolari della cromatina si estendono anche al transgene e ne causano l'inattivazione se la regione è eterocromatinica con presenza di istoni deacetilati e DNA ipermetilato. LCR (locus control region) sono elementi nei loci che possono convertire eterocromatina in eucromatina a livello del sito di integrazione. Sono interruttori generali. C’è CTCF che va a reclutare la coesina e porta i fattori di trascrizione uno accanto all’altro per facilitare l’espressione genica. Per prevenire effetti di enhancer che possono travarsi nella regione di integrazione si possono usare ISOLATORI. Spesso questi sono MAR (matrix-attachment region) che sono punti di aggancio dei cromosomi, grazie a ripiegamenti ed anse, alla matrice nucleare e separano i cromosomi in anse topologicamente indipendenti. Questo permette di isolare regioni di eterocromatina ed eucromatina. Oggi i ricercatori mettono ad esempio all’inizio e alla fine dei MAR, in modo che al regione sia isolata dal resto e non sia influenzata dai geni vicini. Inserisce delle LCR, che favoriscano ad esempio la cromatina aperta per permettere l’espressione del gene. Poi volendo si può usare un mini gene mettendo esoni ed introni. Avere anche gli introni può avere il vantaggio di una maggiore espressone della proteina, in La freccia gialla al primo esone che indica il sito d’inizio della quanto i fattori di splicing trascrizione. L’AUG è nel secondo esone, quindi AUG può essere in esoni rimangono legati agli esoni, e questi successivi al primo. All’ultimo esone c’è UAG, codone di stop, e nello facilitano il trasporto del DNA da stesso esone c’è anche AAUAAA, ossia il sito di polyA. nucleo a citoplasma. Non è necessario mettere del cDNA solo perchè è un transgene. Si ha la struttura classica di un gene che ormai sappiamo riconoscere. L’aggiunta di isolatori dunque aiuta ad esprimere questo gene, dato che finisce in parti del genoma in modo casuale. + ESPRESSIONE GENICA INDUCIBILE È utile utilizzare sistemi per attivare o spegnere l’espressione, per i più svariati motivi. Sistemi ricombinanti per l'induzione della espressione di un transgene mediante somministrazione di un composto atossico. Per potere avere un sistema negli eucarioti devo avere un sistema che: 1. NON deve interagire con promotori endogeni 2. Deve venire assorbito uniformemente dalle cellule di diversi tessuti, ad esempio poterlo amministrare con acqua 3. Deve avere un'emivita breve, perchè devo analizzarlo poi deve spegnersi. Ciò permette di utilizzarlo come un interruttore e passare rapidamente da ACCESO a SPENTO. 1. SISTEMA INDUCIBILE DI DERIVAZIONE BATTERICA Si basa sull’ operone della tetraciclina, simile a quello del lattosio. L'operone della tetraciclina può essere attivato dal legame del fattore di trascrizione tetR con alta affinità. La tetraciclina inibisce la crescita dei batteri a concentrazioni estremamente basse e tetR ha una alta costante di affinità per la tetraciclina pertanto bastano poche molecole per ridurne il legame al promotore. È molto efficiente perchè il legame con l’antibiotico si basa su affinità enorme, bastano proprio bassissime concentrazioni. Come lo uso per gli eucarioti? È un elemento dei procarioti, dunque di base non ci sono i domini di trascrizione necessari per la sua espressione, il meccanismo è molto diverso. Non può funzionare tale e quale in questo modo. Di fatto chi lo ha sviluppato non ha utilizzato il fattore di tracrizione endogeno. Utilizza la parte verde che è il fattore TetR, repressore, in grado di legare TetO, l’operatore, e la tetraciclina. Ha aggiunto un dominio di attivazione derivante da un virus eucariotico. È un fattore chimerico. I ricercatori dunque hanno fuso una porzione batterica, verde con dominio di legame al DNA e dominio per legare tetraciclina. Questo legato a un fattore per la trascrizione di un virus eucariotico. Diventa così un fattore di attivazione detto tTA. Si usano una serie di paia di basi del gene che si ha caratterizzato, con promotore specifico, e si pone all’inizio del cDNA chimerico che si è formato, poi si mettono le polyA. Iniettandolo nel pronucleo dell’ovocinta ci saranno topi transgenici che esprimeranno questo fattore ad esempio solo nelle cellule pigmentate. Si vuole poi accendere e spegnere un particolare gene, per l’appunto solo in queste cellule pigmentate. Si fa così un secondo gene transgenico a cui si lega tTA. Negli eucarioti si mette il fattore basale minimo, a cui si legano tutti i fattori di trascrizione fino all’RNA polimerasi. Così viene espresso il gene di interesse ma solo se viene espressa tTA. Dove è prodotta tTA si esprime il fattore blu. Quando tratto con tetraciclina si lega alla parte verde, non si può legare con l’operatore e si ferma la trascrizione. Può essere somministrata per via orale con acqua. Si generano: Il transgenico ad esempio il primo con tTA il secondo con il gene per la rhodopsina. Si accoppiano Si ottengono animali che portano entrambi i geni trangenici. Si attiva il fattore trangenico tTA. Il fattore di trascrizione si lega al tetO, si ha espressione solo nell’occhio. Dopo che si trattano gli animali con tetraciclina. Dando tetraciclina, pur esprimendo il fattore chimerico, questo è preso dalla tetraciclina, si blocca la trascrizione. 2. SISTEMA INDUCIBILE BASATO SU ESTROGENI Il recettore degli estrogeni solitamente è nel citoplasma. Quando si lega per l’appunto agli estrogeni, si sposta nel nucleo per far avvenire la trascrizione. Si può utilizzare un equivalente degli estrogeni, come il tamoxifene, farmaco per il tumore al seno, che si lega ai recettori a posto degli estrogeni, attivando la trascrizione. Questo è utilizzato ad esempio per andare a esprimere la Cre-Ricombinasi e indurre l’inibizione della trascrizione, o andando a togliere il codone di stop ad esempio di lac Z. Il sistema si basa sul fatto che i ricercatori hanno formato una cre-ricombinasi legata ai recettori degli estrogeni facendola rimanere nel citoplasma in assenza degli ormoni. Se si tratta con estrogeni, questo viene traslocata nel nucleo, portando Cre-ricombinasi nel nucleo, potendo così riconoscere i siti loxP. Il sistema dunque è anche utilizzato per far entrare nel nucleo enzimi. Si può sfruttare ciò che si trova in natura venendo a formare delle proteine di fusione, che in natura non esistono, e che possiamo regolare come meglio crediamo. Da tutte le informazioni che anche in futuro vedremo di proteine che modificano la conformazione, traslocano in diversi organelli, possiamo inventare una proteina che non esiste in natura ma che porta un enzima o una qualunque proteina di interesse all’interno di un organello sfruttando ciò che è stato studiato nel recettore, ad esempio dell’estrogeno. Trasloca nel nucleo solo quando è legato all’ormone. Insieme a questo si fa entrare l’enzima Cre ricombinasi. A = Cre ricombinasi entra nel nucleo sfruttando il dominio del legame per i fattori degli estrogeni trattenuto nel citoplasma finchè non si tratta con ormone. B = sono i due Tet. In assenza di tetraciclina il repressore si lega e reprime, mettendo la tetraciclina avviene la trascrizione. rtTa dal legame con la tetraciclina viene inibita l’espressione. I ricercatori oltre al dominio di attivazione della trascrizione, gli hanno fuso anche un dominio di repressione della trascrizione detto appunto rtTA. Ha lo stesso meccanismo: in assenza di tetraciclina il repressore si lega e reprime. Mettendo la tetraciclina e comincia a far esprimere. Sono dei sistemi molto versatili. C’è quindi grande varietà per modificare i genomi e controllare l’espressione. Il sistema degli estrogeni è meno utilizzato per accendere e spegnere, perchè essendo un promotore eucariotico questo potrebbe essere riconosciuto comunque e fare avvenire la trascrizione. Per questo solitamente per accendere e spegnere si usano quelli procariotici.  ALTRE SPECIE Molto meno efficienti del topo, dunque normalmente non si usano altri: 1) Solo 1% di efficienza mediante microiniezione in oociti ovini o bovini 2) Solo 8% di efficienza mediante retrovirus iniettato in uova già deposte 3) 1 su 224 oociti iniettati ha generato una scimmia transgenica Sono invece efficienti altre tecniche come: ICSI: Intracytoplasmatic Sperm injection L'iniezione delle teste spermatiche direttamente nel citoplasma delle cellule uovo. Usata anche per fecondazione artificiale. Trasferimento nucleare Briggs e King, 1952: metodologia del trasferimento nucleare negli anfibi. La potenzialità di riprogrammazione del nucleo è tanto maggiore quanto più precoce è lo stadio di sviluppo della cellula dalla quale esso viene isolato. Wiltmut, 1997: pecora Dolly, primo mammifero clonato utilizzando per il trapianto nuclei da tessuto adulto differenziato (efficienza 1:250) Hanno preso cellule di una pecora e le hanno messe in cultura. Le hanno fuse con un ovocita di cui si era rimosso un nucleo, dunque si era inserito il nucleo di una cellula differenziata. Cercavano di comprendere se era possibile ricombinarla, Hanno così ottenuto la pecora Dolly. Si è visto che è invecchiata Quindi è una cellula con proprio precocemente ed è morta molto patrimonio di fattori di trascrizione e giovane. attività di espressione genica specifica. Dunque sì, si è riprogrammato Quindi prendere una di queste cellule, il nucleo, però non è stato metterla dentro all’oocita e molto efficiente di base. riprogrammarla (‘farle dimenticare che Non viene molto applicata cosa era’) in modo da ripartire da zero è come tecnica perchè per ora stato un esperimento interessante. Ha non ci sono le consocenze per confermato che è possibile riuscire propriamente a riprogrammare, tuttavia qualche riprogrammare da zero. informazione nella cellula è rimasta BIOREATTORI Utilizo di organismi per la produzione di una proteina ricombinante utilizzata come farmaco. Si può quindi effettuare. Esempio ANIMALI TRANSGENICI PER LA PRODUZIONE DI FARMACI IN GRANDI QUANTITA' A1AD: una deficienza di questo enzima provoca Alpha-1 - antitrypsin deficiency Una mutazione nel gene AAT (alfa1-antitripsina) porta ad una proteina assente o anormale che causa una malattia ereditaria con deficienza in questo enzima: epatite e cirrosi. Questa è la più comune causa genetica di malattie al fegato nei bambini. Anche gli adulti ne possono essere colpiti e possono avere problemi al fegato ma anche problemi ai polmoni: enfisema. In realtà è possibile trattarla fornendo direttamente l’enzima a paziente. Per questo c’è molto interessa nella produzione di questi farmaci. ( È lo stesso concetto dell’insulina per i diabetici. ) Si utilizzano dei bioreattori come le pecore. Si microinietta il gene della antitripsina. Quando la pecora transgenica è matura il gene umano viene espresso dalla ghiandola mammaria e la proteina secreta nel latte. Dal latte si possono purificare grandi quantità di proteina per usi farmaceutici Ottengono grosse quntità semplicemente andando a mungere la pecora, ottenendo l’enzima nel latte. Con delle tecniche di purificazione si ottiene la proteina purificata e da qui si ottiene il farmaco. Le potenzialità del DNA ricombinante sono enormi. Chiaramente spesso da questa semplicità con cDNA, in realtà le ingegnerizzazioni hanno permesso anche di migliorare il farmaco. Le tecnologie del DNA ricombinante permettono di modificare proteine naturali migliorandole o generando nuove proprietà (migliore farmacocinetica). Es. Insulina resa più solubile, AAT resistente agli stress ossidativi. Dunque renderla più assorbibile, farla arrivare meglio nel sito interessato, ecc. Come si possono ottenere le modifiche che interessano? Analisi comparativa delle proteine correlate: le differenze aminoacidiche possono essere correlate alle differenze di funzione. Si vede ad esempio modificando aminoacidi correlati a diverse funzioni. Analisi della struttura tridimensionale e previsione delle modificazioni. Si modificano aminoacidi prevedendo al computer l’effetto che può avere la modificazione del residuo aminoacidico sulla proteina, se verrà migliorata o peggiorata. Evoluzione guidata: mutagenesi casuale (mutageni, PCR) così si possono analizzare un alto numero di mutanti se abbiamo a disposizione un test semplice. Si usano agenti mutageni poi si fa uno screening per vedere se la molecola funziona meglio o no.  Eterocromatina e Non coding RNA In base al tipo di cellula, nei diversi tessuti, ognuna ha il proprio trascrittoma, ovvero vengono trascritti determinati geni e non altri, in base alla necessità. Durante lo sviluppo vengono a delinearsi queste differenze. Possono esserci geni ubiquitari, che vengono trascritti in tutte le cellule, oppure specifici. Questo è determinato sia dai fattori di trascrizione sia dallo stato in cui si trova la cromatina, eucromatina o eterocromatina. In foto si può osservare una foto al microscopio elettronico e una in cui sono state colorate in rosso. Si capisce che i nuclei sono caratterizzati da una regione più elettrodensa, in cui il fascio di luce degli elettroni del microscopio non riesce ad entrare, questa è eterocromatina. Ci sono poi regioni più chiare e rilassate che sono quelle dell’eucromatina. Col colorante fluorescente si distinguono le cellule in divisione e in non divisione, dunque ce ne sono in mitosi in cui i cromosomi sono condensati e riconoscibili in base alla forma e ai bandeggi. In un cromosoma in fase di mitosi, l’eterocromatina si trova principalmente nella regione del telomero e del centromero. Le modificazioni che subiscono il DNA e gli istoni possono portare a formazione di eucromatina o eterocromatina, in base alle modificazioni sulle code istoniche, che possono portare così a modificazioni dell’espressione genica. Ci sono MECCANISMI EPIGENETICI che influenzano l’espressione. Substrati per metilzione e acetilazione derivano da stimoli ambientali fondamentali per la cellula. Va a modificare il suo metabolismo e producendo i substrati, i componenti, della reazione di modificazione della cromatina. Ad esempio la metionina è il donatore di metile che utilizzano le istoni metil transferasi o DNA metil transferasi. Al tempo stesso acetil-CoA, che è donatore acetile. => non devi sapere queste cose ma solo che le materie che studi sono interconnesse.  HP1 = Heterochromatin Protein 1 Viene legata da un cromo- dominio, ha istoni metilati e va a portare a trimetilazione degli istoni adiacenti. In particolare è correlata alla metilazione della Lys 9, nell’istone, H3K9, dunque a eterocromatina. Ricorda che metilazione ha vari enzimi perchè può avere significato diverso. COMPLESSO POLYCOMB Ci possono essere elementi detti Polycomb Response Elements a cui sono legati i complessi per reclutare Polycomb, come il repressore PHO-RC. Viene reclutato prima il complesso Polycomb 2. Il repressore va a metilare tre volte la Lys 27. Il complesso permette di reclutare il repressore e andare a chiudere la cromatina, grazie all’azione di proteine con cromo- domini come PRC1. Influenza così l’espressione genica. Ci sono altri meccanismi fondamentali per il reclutamento di Polycomb, che ora andremo a vedere. Sono uscite da poco queste pubblicazioni. Il complesso Polycomb 2 richiama la proteina EZH2 che va a metilare la Lys27, è l’enzima, l’istone metil transferasi. Quando è stata analizzata questa proteina si è notato che ha vari domini proteici, con diverse funzioni. In particolare modo hanno notato due regioni, un sito attivo dell’enzima HMT, che lega la lisina 27 dell’istone H3 e la va a metilare. Viene in realtà reclutato però dalla Lys 36, sempre nella coda istonica dell’istone di H3. Polycomb non ha particolari domini cromo, ma riesce comunque a selezionare le Lys 27 e non altre. La cellula non ha intelligenza, ma ha domini particolari. Quando abbiamo visto le modificazioni istoniche abbiamo vista che Lys 27 e Lys 9 se metilate sono correlate a chiusura della cromatina. Nel caso della Lys 36 invece la sua metilazione è correlata all’apertura della cromatina. Ci sono domini SANS che sono in grado di legare dei residui non modificati. Può ad esempio legare in questo caso il residuo non modificato di Lys 36, interagisce e permette di accomodare la Lys a una distanza dal sito attivo in modo che Lys 27 cada precisamente nel sito catalitico perchè questa venga modifata. Se la Lys 36, che rappresenta una cromatina attiva, quando metilata non riesce a entrare e interagire con SANS, in questo modo Lys 27 non si accomoda nel sito catalico e si ha bassa attività catalitica. Gli enzimi di modificazione della cromatina vengono reclutati da altri enzimi ancora modificati o non. C’è ulteriore competizione con il complesso polycomb legata alla Lys. Se metilata la 36 metila anche la 27. Se non è metilata 36 rimane non metilata anche 27. Esiste quindi una competizione nell’istone H3 per il complesso polycomb per la lisina metilata. A competere sono PRC2 e SETD2: se K36 è metilata si lega SETD2 che apre la cromatina, invece se non è metilata si lega PRC2 che andrà a metilare K27. Lo stato di metilazione di queste due lisine è mutualmente esclusivo. EZH2 è una proteina grande e allungata. Facendo delle analisi su come si lega ai cromosomi, si nota che il sistema polycomb 2 si lega a ponte tra due cromosomi adiancenti. Per questo la modificazione di solito si amplifica a più nucleosomi, si propaga a quelli vicini.  Dunque EZH2, la parte enzimaticaa di polycomb. Contiene il cromodominio, quando si lega non porta ulteriore metilazione, è una propagazione della regione di regolazione della cromatina legata alla metilazione. Regioni di eterocromatina sono spesso caratterizzate da metilazione della Lys27 ma anche per ubiquitazione per la coda dell’istone H2A. Ci sono regioni in cui è spenta l’espressione genica. Polycomb 1 è composto da varie proteine tra cui RING1 che va ad ubiquitinare H2AK119. L’ubiquitazione di Lys 119 per l’istone H2A è inibitoria per la metilazione della Lys4 e la fosforilazione di H1. Tende a tenere chiuso il DNA. L’ubiquitinazione H2AK119 è essenziale per mantenere la repressione trascrizionale. Anche per l’ubiquitazione ci sono enzimi con il compito di rimuoverla, è comunque un punto chiave per l’espressione. L’enzima BAP1 ha il compito di rimuoverla quando la cromatina deve rilassarsi per attivare l’espressione. La perdita di questo enzima porta a cancro, è dunque fondamentale. CBP se porta ad acetilazione di Lys9 e Lys27 porta a richiamare altri fattori per altre metilazioni portando a spegnimento dell’espressione Ubiquitazione di H2B vanno a richiamare fattori correlati all’attivazione. Il complesso polycomb va a ubiquitarie Lys119 e metilare Lys 27 avere eterocromatina. Parliamo sopratutto della coda istonica H3 e dell’ubiquitinazione di H2A. Il silenziamento è correlato alla metilazione del DNA. Ad esempio HP1 che viene reclutato con la metilazione della Lys9, va a richiamare le DNA metiltransferasi portando a metilazione della citosina con completo spegnimento del locus. Quando abbiamo un gene ad esempio acceso, ci sono i fattori di trascrizione, la regione è acetilata, ad esempio in Lys9 e Lys27. Quando vengono rimossi questi acetili inizia il reclutamento per la metilazione del DNA. Viene dunque completamente spento e inattivato. Alcuni loci ad esempio nella cellula quando si divide deve tenerne di spenti per quelli che servono in altri tipi di tessuto, poi deve mantenere queste informazioni attraverso l’EPIGENETICA. Epigenetica: mantenimento nelle cellule figlie delle modificazioni della cromatina che regolano l’espressione genica. DNA metilasi di mantenimento: DNMT1 È lo studio di come si attivano e spengono determinati geni e come viene mantenuta l’informazione. Sono date principalmente da modificazioni del DNA, che sono più significative. Uno dei filamenti può essere dunque metilato, quello di nuova sintesi di base non sarebbe metilato, vengono però richiamate delle metilasi di mantenimento, anche negli eucarioti, per mantenere delle modificazioni in alcuni loci man mano che si dividono le cellule. Le modificazioni agli istoni possono essere ereditate dalle cellule figlie perché il nucleosoma viene costituito anche da istoni della cellula parentale. Questi istoni modificati reclutano altre HMT o altri enzimi. Dunque anche le modificazioni degli istoni vengono mantenuti. Le palline nere sono gli istoni del DNA parentale. Gli istoni vengono ereditati nel nuovo nucleosoma con una parte di vecchi e una parte di nuovi. Si osserva nell’immagine la distribuzione nel DNA nuovo di istoni vecchi e istoni nuovi. Se c’è una metilazione, questa recluta HP1 o il sistema Polycomb e la modificazione poi si espande agli istoni vicini, proprio perchè queste fanno da ponte tra i nucleosomi vicini. Per il reclutamento di nuove modificazioni vengono reclutate le istoni metil transferasi ed eventualmente le DNA metil transferasi. In questo modo, il nostro DNA parentale con le sue modificaizone viene trasmesso alla progenie, e questo è importantissimo per una cellula che si divide per manternere il suo trascrittoma costante. TRASCRITTOMA = tutti i geni che vengono trascritti nella cellula, che può essere diverso anche tra cellule dello stesso tessuto. Quindi per epigenetica si intende come queste modificazioni, writing, influiscano sull’espressione genica, come possono essere cancellate, erasing, e infine i reading, proteine con cromodominio, bromodomini, SANS, ecc. Si intendono dunque tutte queste modificaizoni e come queste vengono trasmesse alle generazioni successive. Questo vale sia per un tessuto, una cellula che si divide, ma anche per quanto riguarda le cellule germinali. Si parla di IMPRINTING. Ci sono dunque alleli che vengono espressi in modo diverso a differenza che il DNA sia di origine materna o paterna, questo è dato sopratutto dalla emimetilazione del DNA, perchè porta un allele completamente spento e non attivo. Per alcuni geni è importante che il contributo da parte degli alleli sia in mezzo dosaggio, dunque è importante che non tutti e due i geni siano attivi, poichè il doppio dosaggio, l’eccesso di espressione è legato a malattie. Un esempio è il IGF2 (un fattore di crescita simile all’insulina. Nello stesso Locus si trova il gene per H19, che trascrive per un RNA non codificante. Quello che è stato notato è che l’allele materno non lo esprime, mentre il paterno lo esprime. Quando viene ereditato questo locus nel cromosoma 11 viene acceso solo quello del paterno.  I 2 alleli in una cellula sul cromosoma 11p15.5 Mancato controllo imprinting con espressione biallelica di IGF2 e mancata espressione di H19 causa Sindrome di Beckwith- Wiedemann. Il cromosoma materno ha un sito di legame per la Zing Finger CTCF, che va a reclutare le coesine per andare a chiudere anse del DNA, andando a isolare la regione e far si che l’enancher finisca vicino al promotore di H19, per accenderlo, che ha del RNA regolatorio. Avendo questo isolatore comunque IGF2 non viene espresso nel gene materno. Nel paterno il sito di legame per CTCF è metilato, dunque ha delle citosine che possono essere metilate e influire sul legame con CTCF. Viene portato sul promotore di IGF2 e viene attivato. Se entrambi i gen sono accesi, e non c’è un controllo dell’imprinting, si sviluppa la Sindrome di Beckwith-Wiedemann, con sovraespressione di un fattore di crescita e propensione allo sviluppo di tumori, perché il locus non è controllato come nelle cellule normali. RNA NON CODIFICANTI Altri meccanismi si basano su RNA non codificanti, che vengono trascritti ma non trasdotti. Ad esempio RNA ribosomiale, RNA transfer vengono trascritti da pol I e III e servono per tradurre. Altri sono trascritti da pol II e non codificano proteine, ad esempio gli RNA funzionali che fanno parte di : RNA dello spliceosoma RNA delle telomerasi lncRNA che regolano l’espressione genica TERRA Inattivazione del cromosoma X, XIST Questi RNA non codificanti sono da sempre oggetto di studio dei ricercatori. Quando è stato sequenziato il genoma umano si è visto che c’è un numero limitato di geni codificanti per proteine, che subiscono splicing alternativo, avendo un numero maggiore di possibilità rispetto al numero di geni. Si è osservato comunque che molto del genoma viene trascritto, e genera molti RNA che non vengono tradotti in proteina ma che hanno importanti funzioni ad esempio regolatorie. Immaginiamo che il non coding RNA forma una struttura grazie alle regioni di appaiamento per complementarietà di basi. Queste strutture si legano a proteine e le portano in certi punti del genoma in cui RNA interagisce con DNA. Per portare qualcosa in una regione genomica particolare è efficiente utilizzare di fatto un altro acido nucleico. Lnc Air Se il locus subisce imprinting, anche il recettore lo subisce e viene espresso in modo differenziale tra materno e paterno. Non si basa però solo sul legame con CTCF. Questo long non coding RNA è detto Air. Viene trascritto in direzione dx- sx, quando questa regione non è metilata, possono legarsi fattori di trascrizione e produrre lncRNA Air nel parentale che si lega e va a modificare il promotore del gene per il recettore di IGF2, e altri geni nella regione. In un qualche modo dunque interferisce con l’espressione genica. Nel gene materno il locus per lncRNA è metilato, non si esprime, mentre possono e sprimersi tutti gli altri geni,, come il recettore per il gene simile all’insulina. Dunque in questo caso si bassa sull’espressione di un lncRNA. Il lncRNA Air agisce in cis sull’allele paterno stesso. Viene espresso dall’allele paterno e lega proteine che reprimono l’espressione del recettore Igf2r (insuline-like growth factor 2 receptor) HOTAIR Viene reclutato il complesso polycomb che va a tri metilare le Lys27, ubiquitine la Lys 119 di H2A. Agisce in questo caso in trans. HOTAIR è trascritto dal cluster genico HoxC e va a regolare il cluster di HoxD. I geni Hox sono espressi in modo molto regolato durante lo sviluppo embrionale, un tipo di regolazione è dato proprio da questo HOTAIR. Se sovraespresso porta a forme di cancro. Per questo nelle analisi sulle cellule tumorali non si cercano solo geni codificanti proteine espressi, dato che si sa che ci sono dei lncRNA. TELOMERO RAP1 lega il DNA telomerico e recluta le SIR SIR2, SIR3 e SIR4 (Silent Information Regulation) SIR2 ha attività HDAC. Il telomero ha delle ripetizioni caratteristiche che permette di reclutare la telomerasi e permettere l’allungamento ad ogni ciclo cellulare. Sono anche sito di aggancio per proteina RAP, che recluta SIR. Queste servono a reclutare degli istoni acetilasi. Il telomero non contiene e geni per l’attività cellulare, ma trascrivere RNA regolatori, come TERRA. Trascrive quindi anche le regioni blu, ripetute del telomero, che si possono legare e reclutare HP1 che porta alla metilazione della Lys9 e eterocromatina. È legato alle SIR che vanno a deacetilare, poi la metilazione viene favorita da TERRA che reclutare le istoni metil transferasi portando alla formazione di eterocromatina. TERRA è altamente regolato. Disfunzioni di TERRA portano però al collasso della forca replicativa, perchè ha sequenze complementari al telomero. Inoltre può interagire con la telomerasi. Si appaia con RNA della telomerasi Tel. XIST È il sistema di inattivazione del cromosoma X. Un esempio è quello del gatto calico, la cui colorazione è dovuta alla casuale inattivazione del cromosoma X. Nelle prime divisioni cellulari si continuano ad esprimere materno e paterno in modo simile. Allo stadio di blastociste, con cellule ancora totipotenti, avviene l’intattivazione random o di X materno o di X paterno. Le cellule che derivano da queste però avranno sempre lo stesso inattivato. Per questo noi femmine siamo delle chimere, perchè i geni X possono esprimere in modo leggermente diverso a causa del dosaggio di X.  L’inattivazione è legata a XIST e al centro di inattivazione di X, in cui c’è una regione che può essere trascritta sia da dx a sx , che da sx a dx. Può produrre due tipi di RNA codificanti XIST e TSIX. Se RNA pol si lega sotto ha come stampo l’inversione e trascrive il complementare, dunque uguale al superiore, e viceversa, come al solito. Dunque i due RNA sono complementari. Se si trascrivono entrambi si formano dei dimeri di RNA. L’X che si deve inattivare deve esprimere solo XIST e non TSIX, perchè questo nel momento in cui si genera agisce in cis, copre il cromosoma da inattiva e richiama polycomb, agisce come AIR. Si inattiva così il cromosoma X. XIST è lncRNA che inattiva X. Si hanno i due cromosomi X, in cui su quello a dx si esprime molto XIST e si inattiva per metilazione, reclutando polycomb ed espansione all’intero cromosoma e non solo un locus. L’altro cromosoma esprime ad alto livello TSIX che si lega a XIST, non riesce a reclutare polycomb e rimane attivo. Una cosa simile a ColE1 nei batteri. Nel cromosoma inattivo si ha la trascrizione di XIST. Nel cromosoma attivo c’è anche TSIX. XIST ha una sequenza che lega polycomb 2 ed EZH2, componente enzimatica che agisce metilando Cys27, che può legare il cromodominio di polycomb 1. Vengono richiamati dei ring che portano a compattazione della cromatina. Ci sono ponti tra le diverse parti in modo che venga a propagarsi velocemente. Si è visto che non solo XIST lega polycomb, ma si aggancia anche a proteine che legano la cromatina, proteine dello Shuffle nucleare. Il cromosoma X infatti risulta condensato in un certo punto nel così detto corpo di bar. Questa è una regione molto densa.  Recentemente si è visto che recluta e va ad interferire con l’attività delle proteine che servono per lo slittamento degli istoni, Swift. Si è visto che XIST va ad interferire con loro tenendoli lontani dal cromosoma X in modo che si formi eterocromatina senza allontanamento degli istoni. Questi lncRNA permettono dunque di condensare la cromatina ad esempio in questo modo. Se si reprime TSIX: istone H4 ipoacetilato istone H3 ipometilato su H3K4 istone H3 ipermetilato su H3K27 Dunque è importante per mantenere attivo il cromosoma attivo, in assenza si ha troppa espressione di XIST. Il corpo di bar è facilmente visibile anche solo andando a vedere con una sonda dove si trova XIST. Si può fare una marcatura con anticorpi. Anche nel cromosoma in metafase durante la mitosi è possibile riconoscere l’X ipoacetilato con particolari colorazione per gli istoni ipoacetilati. RIASSUMENDO Si ha inizialmente una fase precoce dello sviluppo embrionale con entrambi gli X attivi. TSIX è espresso da entrambi figli alleli inizialmente. In blastocisti avanzata si stabilisce il centro di inattivazione dell’X in cui si ha in un cromosoma l’espressione, ma nell’altro si spegne. In questo modo viene stabilito che uno esprime XIST e l’altro TSIX. Dove si esprime TSIX porta a metilazione di XIST in modo che non possa esprimersi, perchè deve rimanere almeno un X attivo. CENTROMERI Nei nucleosomi del centromero l’istone H3 è sostituito da CENP-A. Ha dunque un istone modificato per agganciarlo al fuso mitotico ecc. è fondamentale dunque che ci sia questa componente del nucleosoma e non un classico istone. Questo è regolato da un lncRNA. Porta CENP in questa regione. RNA viene regolato da una proteina specifica CENP-C che recluta CENP-A. Porta un’organizzazione di eterocromatina in questa zona. Le coesine vanno a chiudere la regione. È sempre regolato da RNA non codificanti che vanno dunque in partiocolare modo a regolare l’eterocromatina.