Kromozomların Yapısı, Adlandırılması ve İnceleme PDF

KROMOZOM: Genomun paketlenmiş hali DNA; hücre içerisinde (nükleusta) izole halde değil proteinlere bağlı ve ilişki halindedir. Bir DNA molekülü ve ilişkide olduğu proteinlerin oluşturduğu yapıya kromozom denir. 4 Tam kromozom yapısı mitoz bölünmenin metafaz evresinde görülür interfaz metafaz Böl...

KROMOZOM: Genomun paketlenmiş hali DNA; hücre içerisinde (nükleusta) izole halde değil proteinlere bağlı ve ilişki halindedir. Bir DNA molekülü ve ilişkide olduğu proteinlerin oluşturduğu yapıya kromozom denir. 4 Tam kromozom yapısı mitoz bölünmenin metafaz evresinde görülür interfaz metafaz Bölünen hücre Bölünmeyen hüc. 5 Ökaryotik genom kromozomlar halinde nükleusta paketlenmiş olarak bulunur. (mitoz>>>metafaz) İnsan hücrelerinde 46 kromozom. 24 farklı kromozom 1>>>22:otozomal kromozomlar X, Y: gonozomal, sex kromozomları Her bir kromozom tek bir, uzun, lineer DNA molekülü içerir. 6 Replikasyon ile duplikasyon Lineer DNA Molekülü Bir sentromerli iki kollu kromozom yapısı İğ iplikleri İki ayrı yavru hücrede duplike olmuş kromozomlar Her bir kromozomdaki tek bir lineer DNA molekülü, •replikasyon orijinleri, •bir sentromer ve •iki telomerden oluşur. 7 İki kromozomlu bir hücrenin döngüsü Nükleusu çevreleyen nüklear zar Tam kromozom yapısını Metafaz evresinde görürüz 8 Organism Genome size (Mb)a Chromosome numbera Yeast (Saccharomyces cerevisiae) 12 16 Slime mold (Dictyostelium) 70 7 Arabidopsis thaliana 130 5 Corn 5,000 10 Onion 15,000 8 Lily 50,000 12 Nematode (Caenorhabditis elegans) 97 6 Fruit fly (Drosophila) 180 4 Toad (Xenopus laevis) 3,000 18 Lungfish 50,000 17 Chicken 1,200 39 Mouse 3,000 20 Cow 3,000 30 Dog 3,000 39 Human 3,000 23 a Both genome size and chromosome number are for haploid Mbolsa = Değişik türlerin, kromozom sayı ve büyüklükleri çokcells. farklı da millions of base pairs. temel kromozom yapısı tüm ökaryotlarda aynıdır. 9 Kromozomun Temel yapısı: DNA’nın kromozom yapısını oluşturacak şekilde sıkıştırılarak paketlenmesi Neden? Temel yapı: DNA’nın kromozom yapısını oluşturacak şekilde sıkıştırılarak paketlenmesi Neden? 10 11 3.2 X 109 nükleotidden oluşan genomun, rölatif uzunluğu 2 metredir. Nükleus 6 μm çapındadır. Bu , 40 km’lik bir ipi bir tenis topunun içine sokmak ile eşdeğer bir durumdur. Nükleus zarı Nükleolus 12 Bir nükleotid çiftinin 1 mm uzunluğunda olduğu varsayılırsa: İnsan genomunun 3200 km (Afrika kıtasının merkezi kadar) uzunluğunda olması beklenir. [Bu durumda ortalama protein kodlayan genom bölgesi 300 m dir.] 13 22 22.Kromozomda 48 milyon nükleotid vardır. Bu uzunlukta bir molekül paketlenmeden 22.kromozomu oluştursa 1.5 cm’lik bir kromozom olmalıdır.. OYSA… 2 μm 22.kromozom mitozda sadece 2 μm uzunluğundadır. Bu durumda 22.kromozomdaki DNA’nın nükleus içine sığmak için 10 000 kat katlanması gerekir. 14 1 3 4 2 15 Katlanmalar ve paketlenmeler nasıl gerçekleşmektedir? Hangi mekanizmalar işlev görmektedir? Paketlenme 16 Kromozom yapısındaki DNA, özel proteinlerle birlikte kompleks oluşturmuş olarak bulunur (paketlenir) Yapıda ayrıca bulunanlar: -Yardımcı diğer proteinler ve -RNA molekülleri -------- gen ekspresyonu -------- DNA replk. -------- DNA onarımı 17 DNA’nın kromozom yapısını oluşturacak şekilde paketlenmesi esas olarak bazik karakterli HİSTON proteinleri tarafından gerçekleştirilir. 1. aşama: nükleozom yapısının oluşumu 2. aşama: kromotozom yapısının oluşumu 3. aşama: kromatin (>> kromatin ağ) yapısının oluşumu 4. aşama: kromozom yapısının oluşumu 18 1. aşama: nükleozom (nükleozom çekirdek (=core) partikülü yapısının oluşumu Nükleozom çekirdek partikülü Bağlaç DNA Non-histon protein Histon H1 200 bp aralık Histon proteinleri 19 İnsan genomunda 30 milyon nükleozom bulunur. 20 Bir nükleozom yapısında: •Her bir histondan (H2A, H2B, H3, H4) 2 adet bulunan histon oktameri (H1 yok) Bir nükleozomun yapısı •Oktamer etrafına sarılı (yaklaşık 2 tur) 146 bp DNA bulunur. Nükleozom = Histon oktameri + 146 bp DNA 21 2. aşama: kromotozom yapısının oluşumu H2A, H2B, H3, H4 (histon oktamari) Linker DNA Nükleozom yapısı oluştuktan sonra son bağı H1 yapar. H1 ile birlikte 166 bp DNA’da (bağlaç=linker DNA) yapıda yer alır. Bu yapıya ise kromotozom denilir. H1 Kromotozom = Nükleozom + H1 Linker DNA (H1’in iki yanındaki bağlaç DNA dahil) Bir kromotozomun yapısı Linker DNA 22 Dış küçük oluk: G ve C zengin bölgeler İç küçük oluk: AA, TT ve AT dinükleotidlerince zengin bölgeler Histon oktameri Histonlar çok miktarda Arg ve Lys içerdiğinden baziktir. Asidik DNA’ya sıkıca bağlanır. DNA 23 3>KROMATİN: DNA ve 3. aşama: kromatin yapısının proteinlerden oluşan üst düzey oluşumu katlanmalar gösteren kompleks yapı. 1>Nükleozom 2>Kromotozom Kromatinin kendi üzerine sıkışması ile kromatin ağı oluşur. 24 4. aşama : Kromozom yapısının oluşumu Kromatin ağının üst düzey kendi üzerine katlanmaları ve yoğunlaşması ile kromozomlar oluşur 25 kromotozom Kromatin nükleozom 26 Kısa bir DNA bölgesi Kromatin yapısının oluşumu Kromatin ağı Kısa bir kromozom bölgesi Kondense olmuş bir kromozom bölgesi DNA molekülünün mitotik bir kromozom halinde paketlenmesi; kendi açılmış uzunluğundan 10 000 kat daha kısa bir forma girmesini sağlar Mitotik kromozom 27 Kromozomlar Kromatin ağı şeklinde iken bile nükleus içinde iyi korunmuş özel bölgelerde yerleşiktir Her bir kromozomun ayrı renkte floresans boya ile boyandığı hibridizasyon çalışması Figure 4-63 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 28 İKİ ÇEŞİT KROMATİN VARDIR Ökaryotlarda interfaz nükleusunda iki çeşit kromatin bulunur: 1.HETEROKROMATİN: Sıkıca paketlenmiş, transkripsiyonel olarak inaktif (örnek: sentromerik DNA) 2. ÖKROMATİN: Transkripsiyonel olarak aktif, gevşek paketlenmiş Total kromatinin ancak %10’u transkripsiyonel olarak aktiftir. 29 Transkripsiyon İçin Açık Kromatin Gerekir Kapalı kromatin Kromatin açılması Açık kromatin Transkribe olan gen 30 Histon proteinlerinin dışa doğru çıkıntı yapan N-Terminal kuyruk (tail) yapıları vardır H H H Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 31 Histon proteinlerinin kuyruk yapıları histon modifikasyonlarının gerçekleştiği yapılardır Histon modifikasyonları 32 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 33 Histon kuyruk yapılarındaki LİZİN’lerin metilasyon asetilasyon metilasyonu ve asetilasyonu Histon kuyruk yapılarındaki SERİN’lerin fosforilasyonu Figure 4-38 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 34 Gen ekspresyonu için histonların asetillenmesi gerekir: Histon asetilasyonu ile transkripsiyonun başlaması uyarılır. Histon deasetilaz tarafından asetil grupları kaldırılarak transkripsiyon represe edilir (baskılanır) Gen ekspresyonu için histonların demetile olması gerekir: Histon metil transferaz; Histonu belli bazı bölgelerden metilleyerek kromatin yapısı içinde o gen bölgesinin sessiz formda kalmasını sağlar. 35 Modifikasyon durumu Modifikasyonun sonucu M+: Heterokromatin oluşumu Gen susturulması M+A+: Gen ekspresyonu (Transkripsiyon var) P+A+: Gen ekspresyonu (Transkripsiyon var) Figure 4-44b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 36 Kromozom Eldesi •Sitogenetik teknikler •Sitogenetik inceleme 37 Kromozom Eldesi Geleneksel sitogenetik yöntemlerle kromozom eldesi; aktif olarak bölünebilen hücrelerden mümkün olabilmektedir. Kromozomlar ışık mikroskopu altında sadece mitoz bölünmenin metafaz evresinde iken görünebilir. Metafaz kromozomu eldesi için spontan olarak bölünebilen kemik iliği lenf node solid tümörler koryonik villus hücrelerinden direkt preprasyon yapılabilir 38 Doğal olarak bölünmeyen hücrelerden kromozom analizi ise kültür sırasında bölünmeyi uyaran bir ajan eklenmesi ile gerçekleştirilir (Örn: Periferik kan lenfositleri için Fitohemaglutinin=PHA) • Doku biyopsileri • Amnion sıvısı gibi örneklerdeki hücreler ise doğal olarak bölünen hücrelere sahip olduğundan kültüre mitotik uyarıcı eklenmez. Hangi örnekten kromozom elde edileceği klinik bulgulara ve tanının prenatal mi, postnatal mi olduğuna bağlıdır. 39 Örnek toplanması ve işlenmesi Periferik kan örneği: Steril şırınga yada vakum tüpü sodyum-heparin (antikoagulan) 24 saat içinde kültür kurulmalı Oda ısısında yada +4˚C de saklama Kemik iliği (hematolojik hastalıkların tanısı için): Steril şırınga yada vakum tüpü sodyum-heparin (antikoagulan) Çekilen örneğin ilk birkaç ml’si aktif olarak bölünen hücreler içerir. Ardından gelen kısım kan ile dilue olduğu için uygun değil. 40 Amnion sıvısı (prenatal tanı için): En erken 10.haftada (en uygun 15-16.hafta) 15-30 ml alınmalı Steril koşullarda steril şırıngaya alınır. Oda sıcaklığında taşınmalıdır. Kısa sürede taşınmalıdır. Solid doku biyopsileri: Deri, koryonik villus, küretaj yada düşük materyalleri, cerrahi çıkarım örnekleri, Kültür ortamı içinde taşınmalı Transportu buz içinde 41 KÜLTÜR ORTAMININ HAZIRLANMASI Kültür ortamı *Tüm örnekler için sıvı kültür ortamları kullanılır *Bazı kültür ortamları ise belli hücre tipleri içindir (amniomax ve Chang---amnion sıvısı için) *Çoğu kültür ortamı birçok hücre için uygundur (RPMI 1640, MEM) Tüm ortamlar: •Amino asitler •Çeşitli tuzlar •Glukoz •Uygun ph için tamponlar içeren DENGELİ TUZ SOLUSYONLARIDIR. 42 RPMI 1640’ın içeriği 43 Kromozom eldesine genel bir bakış: 1.Hücre Kültürü kurulması 2.Kültüre edilen hücre tipine göre inkübasyon 3.Kültürde çoğaltılan hücrelerin mitoz bölünmelerinin metafaz evresinde durdurulması (Kolçisin) 4.Metafaz hücrelerinin kromozomlarının lam üzerinde prepare edilmesi 5.Mikroskopta görülebilir hale getirilmesi (boyamabantlama) 44 Hücre kültürü ve kromozom eldesine genel bakış Kültür kurulması Canlı hücre Sterilite Uygun kültür ortamı Kültürün Devamı Sterilite Kromozom eldesi Uygun ısı ve süre bölünmenin durdurulması (KOLÇİSİN ile) Uygun pH Harvest işlemi ile lamda kromozom eldesi Boyama-bandlama 45 Düz boyalı Bandlanmış 46 Işık mikroskopunda 100 lük objektifte inceleme Toplam büyütme oranı: 10x100=1000 47 48 KROMOZOM BOYAMA ve BANDLAMA 1970 den önce orcein vb. boyalarla uygulanan solid boyama ile: Bazı sayısal değişimleri (Örn: anoploidi) ayırabiliriz. Kromozomların yapısal değişimlerini göstermek zor. Her bir kromozom spesifik olarak tanımlanamaz. 49 Sık kullanılan kromozom bandlama teknikleri G Bandlama Rutin bandlama tekniği 50 G Bandlama: Rutin bandlama metodudur. Koyu boyanan bandlar A ve T zengin geç replike olan heterokromatin bölgelerdir. Açık boyanan bandlar G ve C zengin erken replike olan ökromatin bölgelerdir. Kromozomların aktif bölgeleridir. Koyu bandların birkaçı aktif gen taşımaktadır. 51 Değişik tür canlılarda; •Kromozom sayı ve uzunlukları farklı olsada •G bantlama özelliği benzer. 52 G bandlanmış metafaz kromozomları 53 Metafaz kromozomunun karyotipi 800 bant düzeyi 54 550 bant düzeyi 55 400-450 bant düzeyi 56 -400 bant düzeyi Kromozom Morfolojisi 57 58 telomer p kolu (kısa kol) sentromer q kolu (uzun kol) telomer 59 METASENTRİK SUB-METASENTRİK KISA KOL AKROSENTRİK p q (p) Stalk Satellit p p 21 q UZUN KOL q (q) 21 17 3 Kromozom Adlandırması 60 En büyük, Metasentrik En küçük akrosentrik Cinsiyet kromozomları XX Normal dişi birey 61 İnsan kromozomlarının G bantlama yöntemine göre hazırlanmış ideogramı 62 Grup Kromozom Tip ve Şekil A 1–3 Büyük metasentrikler B 4 ve 5 Büyük submetasentrikler C 6 – 12 ve X D 13 – 15 Büyük akrosentrikler E 16 – 18 Kısa submetasentrikler F 19 – 20 Kısa metasentrikler G 21, 22 ve Y Kısa akrosentrikler Submetasentrikler 63 2 sentromer 7p15.2 bandı 1 7 nolu kromozomun 1 p (Kısa) kolunun 1 nolu bölgesinin 5.bandının 2.alt (sub) bandı 2 3 64 2 1 1 7p15.2 Hangi kromozom: Hangi subband: 7 7p15.2 2 Hangi Kromozom kolu: 3 7p Kromozom kolunun hangi bölgesi: Hangi band: 7p15 7p1 7q35 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78