Récepteurs pour l’antigène des lymphocytes T et B PDF

Récepteurs pour l’antigène Récepteurs pour l’antigène des lymphocytes T et B des lymphocytes T et B Antigène : Structure reconnue par les agents effecteurs de l’immunité adaptative Cellules de l’immunité adaptative : - Lymphocytes B → Réponse humorale : agent effect...

Récepteurs pour l’antigène Récepteurs pour l’antigène des lymphocytes T et B des lymphocytes T et B Antigène : Structure reconnue par les agents effecteurs de l’immunité adaptative Cellules de l’immunité adaptative : - Lymphocytes B → Réponse humorale : agent effecteur soluble ↳ Contrôle du compartiment extra-cellulaire - Lymphocyte T → Réponse cellulaire ↳ Contrôle du compartiment intra-cellulaire Différenciation et maturation des lymphocytes T et B : - Les précurseurs communs à tous les lymphocytes se trouvent dans la moelle osseuse - La différenciation est le processus qui permet leur maturation en lymphocytes - Les LyB se différencient entièrement dans la moelle osseuse - Les précurseurs des LyT migrent dans le thymus avant de se différencier - Les lymphocytes ne deviennent immuno-compétents qu'au stade ultime de leur différenciation - Chaque lymphocyte acquiert, durant sa différenciation, un récepteur unique à l'antigène dont il est spécifique 1. Récepteur pour l’antigène des cellules B (BcR) Le BcR a été le 1er récepteur lymphocytaire découvert (par Edelman et Porter) car : - Soluble (= Anticorps) - Produit en grande quantité - Sa spécificité peut être définie aisément Pour cela, on les fait migrer en électrophorèse : - Sans agent réducteur (DDT) : 1 bande de 150kD - Avec agent réducteur : 2 bandes (50kDa et 25kDa) → 2 portions reliées par des ponts disulfures Structure d’une molécule d’immunoglobuline : PM total = 150 KDa - 2 chaînes lourdes H 50KDa chacune - 2 chaînes légères L 25 KDa chacune - Ponts disulfures H-H - Ponts disulfures H-L  a. Traitement enzymatique Papaïne On clive la molécule d’immunoglobuline : - Si on tente de purifier le fragment Fc, il cristallise ↳ Pas de fixation à l’Ag mais il peut se fixer sur le récepteur des macrophages (récepteur au fragment Fc) - Fab peut fixer 1 Ag mais pas de fonctions effectrices (contrairement au Fc qui ne fixe pas mais fonction effectrice) ↳ Si on traite Fab par du DTT : Plus de reconnaissance de l’Ag, le site de liaison est formé par H + L (site partagé) ↳ Fab fixe antigène (Fab 1 antigène, 2 sites de fixation par molécule) Pepsine Le fragment Fc est détruit mais les 2 parties Fab restent ensemble : Fragment fab’ - Fragment F(ab’)2 peut former un complexe avec l’antigène, le fragment F(ab’)2 est capable de lier 2 molécules d’antigène - Fragment Fc est détruit par la digestion enzymatique b. Structure de anticorps Molécule symétrique, reconnaissance du même antigène des 2 côtés de la molécule ↳ PM total 150 KDa - 2 chaînes lourdes H 50KDa chacune - 2 chaînes légères L 25 KDa chacune - Ponts disulfures H-H - Ponts disulfures H-L - Glycosilation (CHO) de la chaîne H Partie N-terminale : Fixation de l’Ag Partie C-terminale : Activité biologique Fragment Fc des Ig assure : - La fixation sur les macrophages - L'activation du complément - L'ancrage du BCR à la membrane du LyB - Le passage trans-placentaire des Ac - La sécrétion des anticorps au travers des muqueuses c. Séquençage des chaînes lourde et légère des molécules d’immunoglobuline Une séquence de 110 AA correspond à un domaine maintenu en boucle par un pont disulfure : Structure répétée tous les 110 aa Les chaînes lourdes et légères ont chacune des domaines variants et constants : - Chaîne Lourde H : 3 constant 1 variable ↳ 440 aa structure répétée tous les 110 AA (1 domaine) ↳ Séquençage de différentes chaînes H montre que les domaines CH1, CH2, CH3 sont conservés (= constants) ↳ Domaine VH est peu conservé : Domaine variable, interaction avec l’Ag - Chaîne Légère L : 1 variable 1 constant ↳ 220 AA structure répétée tous les 110 AA (1 domaine) ↳ Séquençage de différentes chaînes L montre que le domaine CL est constant ↳ Domaine VL est peu conservé → Domaine variable, interaction avec l’Ag Domaines variables VH et VL forment le site de fixation à l’Ag ↳ La variabilité de leur séquence primaire reflète la variabilité de leur spécificité v Séquençage du domaine variable de la chaîne H - Régions assez peu variables (Région charpente : « Framework region ») ↳ FR nécessaire à l’architecture du domaine : FR1, FR2, FR3, FR4 - Régions hypervariables (HVR) : Région assurant la reconnaissance des Ag HVR1, HVR2, HVR3 Cristallographie La cristallographie a permis de définir la structure tridimensionnelle des anticorps et a dévoilée l’organisation de chaque domaine. Repliement de la chaine légère/lourde : Région hypervariable CBR superposé ↳ Point de contact avec l’antigène : Site de fixation de l’antigène CRD3 ou HVR3 : Plus variable, fixation AG d. Mécanismes à l’origine de la génération de la diversité ? 10 milliards de structures antigéniques possibles auxquelles le S.I. devra faire face en créant autant (ou plus) de récepteurs capables de les reconnaitre Problème : le génome ne contient que 30 000 gènes → Invention par le système immunitaire d'un mécanisme capable de générer une diversité quasi-infinie de récepteurs différents à partir d'un nombre fini de segment de gène. ↳ « Big-Bang » de l'évolution : acquisition au cours du temps des recombinases (RAG-1 et RAG- 2) impliquées dans un mécanisme unique capable de remodeler une partie du génome pour fabriquer de la diversité La diversité génétique est en partie dû au réarrangement par des enzymes, les recombinases RAG1 et RAG2 : Elles sont capables de catalyser des réarrangements de l’ADN en configuration germinale dans les loci codant pour les chaînes H et les chaînes L. Ces enzymes sont exprimées uniquement durant la phase de différenciation du lymphocyte (dans la moelle osseuse pour les Ly B, thymus pour les Ly T)  L’activité de ces enzymes conduit à former un ADN réarrangé qui devient un gène actif et qui pourra être exprimé. Le réarrangement qui va être réalisé sera propre à chaque lymphocyte (mécanisme stochastique mis en place indépendamment par chaque lymphocyte) v Organisation du locus génétique codant pour la chaîne lourde (IgH) - L : Séquence leader qui permet l’adressage des protéines, en amont se trouvent des séquences promotrices - VH : segments géniques V codant pour une partie du domaine variable de la chaine H ↳ Segments VH tous différents : Homologie entre les séquences VH de 50 à 90% → Couple (L/VH) est répété une 100aine de fois - Segments D (Diversité) ~30 D différents - Segments J (jonction) ~6 J différents - Segment codant pour les différents domaines constants C Les enzymes RAG reconnaissent des séquences spécifiques situées aux extrémités D et J ↳ Séquences cibles : RSS « Recombination Sequence Signal) Choix aléatoire d’un segment D et d’un segment J physiquement ligués : Manipulation directe de l’ADN (pas confondre avec épissage ARN) Réarrangement implique les enzymes RAG-1 et RAG-2 ainsi que des séquences signal Il existe des séquences signal : - En aval de tous les V - En amont et en aval de tous les D - En amont de tous les J Règle stricte de combinaison RSS12/RSS23 (espaceurs de 12 ou 23nt) empêche le réarrangement direct V sur J. Le réarrangement conduit au rapprochement de l’ensemble V-D-J et du segment C où se trouve un enhancer en 5’ : Transactivation du promoteur le plus proche présent en position 5’ du segment L. Production d’un ARN primaire contenant l’ensemble VDJ recombiné (+intron) et contenant le segment codant pour l’ensemble des domaines constants de la chaîne lourde (CH1, CH2, CH3) - Segment C : Code pour l’ensemble des domaines constants CH1, CH2, CH3 - Segment V-D-J : Réarrangés, codent pour le domaine VH ↳ Partie 5’ du segment V code pour les régions FR1,2,3,4 et les régions HVR1 et HVR2 ↳ Partie 3’ de V et la transition V-D-J codent pour la région HVR3 (ou CDR3) HVR3 correspond à la zone la plus variable : Rôle majeure dans la fixation de l’Ag v Organisation du locus génétique codant pour la chaîne lourde (IgH) Diversité jonctionnelle Diversité jonctionnelle : Lors de l’excision/jonction des segments géniques durant le réarrangement, il existe une très grande imprécision lors de la « réparation » de l’ADN ↳ Décalage de la séquence initiale : Ajout de nucléotide au hasard par une enzyme TdT (Terminale déoxynucleotide Transférase) ce mécanisme est connu sous la dénomination N- diversité v Calcul du nombre de récepteurs possibles Mécanismes à l’origine de la génération de la diversité (mécanisme principal) : Recombinaison entre de nombreux segments choisis aléatoirement VDJ qui se combine de manière indépendante d’un lymphocyte à l’autre. ↳ En connaissant le nombre de segment VDJ : On calcule le nombre d’AC qu’on peut générer : 10 millions d’AC possible Diversité jonctionnelle : On rajoute de la diversité dans les zones de jonctions entre VDJ. Lors de l’excision et de la jonction : relégation de l’ADN. Pendant le réarrangement : très grande imprécision lors de la réparation de l’ADN dans lequel on a des décalages de la séquence initiale : Augmente donc le nombre de molécules ≠ que l’on peut générer N-diversité : Segment rajoutés entre les nt par une enzyme ↳ Desoxynucléotidyl transférase : Enzyme qui vient rajouter des nt au hasard et qui va permettre d’allonger au niveau de cette zone de jonction les deux brins d’ADN avant de réparer l’ADN Combinaisons entre chaine légère et chaine lourde Au final : 10 milliards d’Ac On appelle répertoire l’ensemble des spécificités lymphocytaires différentes présentes chez un individu.  e. Comment est assuré la clonalité du système immunitaire ? Chaque lymphocyte doit exprimer un seul et unique type de récepteur (sa spécificité est unique) Le réarrangement des locus codant pour les Ig ne se fait que durant la phase de différenciation. Les enzymes RAG ne sont exprimées que durant cette phase. ↳ Le lymphocyte mature qui sera activé par un antigène donnera naissance à un clone cellulaire qui gardera la spécificité originelle du récepteur Exclusion allélique : Seul 1 des 2 loci peut s’exprimer, ce qui conduit à la génération d’un lymphocyte B qui n’exprime qu'une chaîne lourde et qu’une seule chaîne légère ↳ 1 seul anticorps, 1 seule spécificité par lymphocyte la théorie clonale est respectée Un contrôle qualité du répertoire généré au hasard permettra de se débarrasser des lymphocytes exprimant un BCR auto-réactif Signalisation au travers du (BCR) : Le BCR ne possède pas de partie cytoplasmique suffisamment longue pour transduire le signal → Association aux molécules Ig-α/Ig-β qui jouent le rôle de module de transduction des signaux L’antigène provoque une agrégation de plusieurs BCR → Initiation de la signalisation 2. Lymphocytes T Le LT est lui aussi issu de la cellule souche hématopoïétique mais issu d'une étape supplémentaire. Il nécessite un passage dans le thymus pour sa différentiation : Les cellules colonisent le thymus pour acquérir leur TCR et devenir des LT matures. a. Récepteur pour l’antigène des cellules T (TCR) v Nature de l’antigène reconnu par les lymphocytes T Les LT ne reconnaissent pas les antigènes de façon directe. Les LT reconnaissent des antigènes uniquement à la surface d’une cellule : Il doit être digéré préalablement et présenté sur une cellule : c’est l’apprêtement antigénique réalise par une CPA. TCR reconnaît donc les antigènes sous forme dégradée et présenté par la cellule ↳ Double spécificité : TCR reconnaît le fragment de l’Ag et une protéine exprimée par le macrophage.  Cette protéine est codée par le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) : c’est la même partie du TCR qui reconnaît à la fois le CMH et la portion de l’antigène (schéma le plus à droite). v Structure du TCR TCR ressemble à un fragment d’anticorps (fragment Fab) : - 2 chaînes polipeptidiques α et β composées chacune d’un domaine variable V et d’un domaine constant C ↳ Ces deux chaînes contiennent chacune 2 domaines de type immunoglobulinique - Région transmembranaire et région cytosolique plus petite Entre les deux chaînes et la région membranaire, partie charnière : Pont disulfure reliant les deux chaînes α et β Même architecture en domaine que Ig : Superfamille des Ig, avec boucles de 110 AA qui forment des boucles maintenues par des ponts disulfures intra-chaînes. v Organisation des gènes qui codent pour TCR et réarrangement génique Il existe un locus pour la chaîne α et un locus pour la β Pour α : Exons correspondent pour les différents domaines : - Domaine variable Vα codé par un exon qui résulte d’un réarrangement ↳ Segment V avec segment J → VJ code pour domaine variable ↳ Parties hypervariables HVR1, HVR2 et HVR3 qui interagissent avec domaine CDR1, CDR2 et CDR3 de l’Ag (région à variabilité maximale qui déterminent l’interaction avec l’ag) - Exon qui code pour domaine constant Cα et un pour région charnière H, transmembranaire Tm et un pour cytoplasmique CT : Partie constante Cα Pour β : Segment D en plus pour le domaine variable (VDJ) - Région CDR 3 correspond à la jonction VDJ - → Variabilité maximale. Même mécanismes de réarrangement que pour Ig : Donc de façon aléatoire, un des segments V va se réarrange avec un segment J. La partie entre les deux est excisée et perdue. Il existe un locus α réarrangée et cela est caractéristique des cellules qui sont engagées dans la différenciation de la lignée pure. Cela permettra aux précurseurs des cellules matures d’exprimer une chaîne α, même chose au niveau du locus de la chaîne β. On a d’abord un réarrangement entre le segment D et le J puis il y a un autre réarrangement où DJ se réarrange avec V et donc on a un réarrangement VDJ et cela permet aux thymocytes d’exprimer une chaine β qui pourra s’associer à la chaîne α. v Clonalité assurée par le mécanisme d’exclusion allélique Exclusion allélique : Réarrangement fonctionnel de l’un des allèles inhibe tout réarrangement ultérieur du 2nd allèle Si réarrangement, il est nécessaire d’arrêter tout autre réarrangement. Ce mécanisme s’appelle l’exclusion allélique et permet d’obtenir un seul type de chaîne alpha et béta. Cette inhibition de tout réarrangement est possible par inactivation des deux protéines Rag-1 et Rag-2 responsables de la recombinaison VDJ. L’exclusion allélique est un mécanisme présent au niveau de l’expression du TCR et du BCR De ce fait, on a une seule chaine α sur un lymphocyte T donné. De même pour la chaine β. Chaque lymphocyte T a un récepteur unique qui est le fruit d‘un programme génétique unique de ces cellules et sa descendance c’est-à-dire le clone. C’est un répertoire très vaste avec des clones de toutes petites tailles fait d’une ou de deux cellules. Ces cellules devront se multiplier lorsqu’elles vont rencontrer leur antigène pour atteindre une taille suffisante pour exercer ses fonctions effectrices. Chaque LT possède une seule spécificité antigénique donc la théorie clonale est respectée. v Génération stochastique du répertoire lymphocytaire T Combinatoire des réarrangements des segments géniques conduit à la possibilité de produire jusqu’à 1010 TCR différents. Tout ce processus de différentiation cellulaire se fait dans le thymus, colonisé par précurseur de la lignée T issus de la moelle osseuse : les thymocytes. Différenciation cellulaire dans le thymus et acquisition du TCR suite aux réarrangements de locus TCR alpha et béta. Pour que le thymocyte puisse poursuivre sa différentiation il doit exprimer un TCR La majorité des thymocytes meurent par apoptoses car pas capables d’interagir avec les molécules de CMH de classe 1 ou 2 exprimée par les cellules épithéliales thymiques. - Sélection thymique ↳ Sélection positive : Ceux qui interagissent avec CMH sont préservés (mais n’interagissent pas trop fortement) ↳ Sélection négative : Ceux qui ont une trop forte affinité sinon maladie auto immune - 98% des thymocytes vont mourir durant la phase thymique par apoptose - Peu de LT matures (immunocompétents) sortent du thymus ↳ 2/3 de LTCD4+ ↳ 1/3 de LTCD8+ v Complexe TCR-CD3 : Récepteur complet de reconnaissance de l’antigène Extrémité N terminal à l’extérieur de la cellule : Interaction avec antigène et le CMH L’extrémité C correspond à la portion intra-cytoplasmique des deux chaines est très courte (quelques acides aminés), cela ne permet pas aux deux chaines de mettre en place des cascades de signalisation qui permettront d’activer les lymphocytes T. Donc les deux chaînes du TcR sont toujours associées avec d’autres chaînes polypeptidiques : γ, δ, ε et ζ. Ces chaines, on les regroupe sous le terme de CD3 qui est un complexe protéique fait des chaines γ, δ, ε et ζ (2 chaines ζ forment un pont disulfure) qui sont associées au TcR. Les chaînes α et β ne peuvent pas être exprimées seules à la surface de la membrane. Les chaines du CD3 non plus. Donc, sur la membrane, on retrouve la totalité des chaines. Les chaines CD3, pour certains d’entre-elles, possèdent également des domaines d’IG, elles appartiennent donc également à la superfamille des IG. Elles ont une région intra-cytoplasmique beaucoup plus grande que celle des chaines α et β. Ces régions intra-cytoplasmiques ont un motif particulier : le motif ITAM (= immuno tyrosine activation motif). Un sur les chaines α, β et γ et la chaîne ζ en a 3. Ces motifs ITAM sont importants pour la mise en place des cascades de transduction du signal du TcR. C’est l’ensemble qui joue le rôle de récepteur. On a une sous unité qui permet la reconnaissance du CMH et d’autres sous unités associé qui permet la conduction des signaux d’activation à l’intérieur de la cellule. - Affinité du TCR pour son ligand faible (complexe CMH/peptide) ↳ Pour que LT puissent s’activer, il faut quand même un temps de contact suffisant : Des co- récepteurs sont nécessaires pour stabiliser l’interaction TCR/CMH : molécule CD4 et CD8. CD4 interagit avec partie non polymorphe du CMH II : partie N-terminale qui va varier d’un individu à l’autre. Contrôle le compartiment phagolysosomial. - CD8 joue le même rôle avec partie non polymorphe des molécules de CMH I : contrôle compartiment intra cytoplasmique - CD4 et 8 ont un rôle important pour signalisation : Association avec une Tyr-Kinase LCK capable lorsqu'elle est recrutée à proximité du complexe CD3 de phosphoryler les motifs ITAM. C’est cette phosphorylation qui initie les cascades de signalisation v CD4 et CD8 définissent 2 populations de LT différentes - CMH I : o Présentation aux LTCD8+ de peptides issus du compartiment IC o LTCD8 sont des LT cytotoxiques qui lysent molécules infectées par virus - CMH II : o Présentation aux LTCD4+ qui coordonnent la réponse immunitaire o Rôle de chef d’orchestre de la réponse immunitaire : Production de cytokine activatrice/inhibitrices o Expression limitée aux cellules qui appartiennent au système immunitaire (LB, macrophage, cellules dendritiques, monocytes)