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Les enzymes 1. Introduction : Les enzymes sont des catalyseurs biologiques spécifiques des réactions biochimiques. Toutes les enzymes sont des protéines. → Elles ont pour but de faciliter une réaction, tout en diminuant la quantité d’énergie nécessaire p...

Les enzymes 1. Introduction : Les enzymes sont des catalyseurs biologiques spécifiques des réactions biochimiques. Toutes les enzymes sont des protéines. → Elles ont pour but de faciliter une réaction, tout en diminuant la quantité d’énergie nécessaire pour qu’elle puisse se faire. Certaines réactions sont spontanées, c’est-à-dire qu’elles ne nécessitent pas d’apport énergétique extérieur, mais elles ne sont pas instantanées. Par exemple : Saccharose + H2O → Glucose + Fructose 2. Réaction enzymatique : L’enzyme change légèrement de forme à Produits Substrat mesure que le substrat se lie Site actif Substrat pénétrant Complexe Complexe Produits quittant dans le site actif de enzyme/substrat enzyme/produits le site actif de l’enzyme l’enzyme Le site actif d’une enzyme est généralement formé par des parties différentes de la séquence. Il y a une complémentarité avec un modèle de l’ajustement induit. 3. Propriétés des enzymes : Efficacité : La réaction est entre 103 et 1017 fois plus rapide que la réaction non catalysée. Non-consommation : Il y a une régénération de l’enzyme en fin de réaction. Rentabilité : La réaction se produit même si l’enzyme est en faible concentration. Spécificité : L’enzyme est capable de reconnaitre un seul réactif (= spécificité absolue) ou un type de réactif (= spécificité restreinte). Fragilité : Il y a une dénaturation de la structure protéique tertiaire (chaleur, pH, détergents, …). Régulable : Les enzymes modifient leur activité en fonction des signaux métaboliques. 1 4. Cinétique enzymatique : ❖ Activité spécifique : Activité enzymatique : Quantité de substrat (µmol) qui est transformé par unité de temps (minute). → Unité : µmol.min-1 = Unité Internationale (U.I.) → Autre unité : Le katal, qui est la quantité de substrat (mol) transformé par unité de temps (seconde). Activité spécifique : Activité enzymatique ramenée à 1 mg d’enzyme. → Unité : µmol.min-1.mg-1 → Si la masse molaire de l’enzyme est connue, l’activité spécifique s’exprimera en min-1 Constante catalytique : Nombre de molécules de substrat transformées par unité de temps. → Unité : min-1 → Appelé Kcat ou Turnover → Caractérise l’efficacité d’une enzyme dans une situation donnée. (Voir exercices sur feuille annexe) ❖ Vitesse initiale : Apparition du produit au cours du temps : La vitesse d’apparition du produit peut être mesurée par l’équation suivante : V0 = Pente de la droite à l’état stationnaire (M.s-1 ou µM.s-1) Influence de la concentration en substrat : Quand la concentration en substrat augmente, la vitesse d’apparition du produit augmente jusqu’à atteindre son maximum. 2  ❖ Équation de Michaelis-Menten : Expression de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat : 1) La vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration de substrat S 2) Quand S augmente, l’augmentation de V0 n’est plus proportionnelle 3) Quand S est très importante, V0 devient constante, indépendante de S → L’enzyme est saturée par le substrat. Km est la concentration de substrat S lorsque V0 est égal à Vmax/2 (quand l’enzyme est à demi- saturation) V0 = Vitesse initiale d’une réaction catalysée S = Concentration en substrat Vmax = Vitesse maximale de la réaction Km = Constante de Michaelis-Menten Signification des paramètres cinétiques : Vmax : C’est la vitesse de la réaction lorsque l’enzyme est « à saturation », quand toutes les molécules de l’enzyme sont complexées au substrat. Km : C’est la concentration du substrat lorsque l’enzyme est « à demi-saturation », quand la moitié des molécules de l’enzyme sont complexées au substrat. → Km est donc inversement proportionnel à l’affinité de l’enzyme pour le substrat. Kcat : Elle caractérise l’efficacité d’une catalyse enzymatique. Kcat/Km : C’est la constante de spécificité. → Plus ce rapport est grand, plus la transformation du substrat est rapide. 3 Exercice : Quelle enzyme a la plus grande efficacité ? Catalase avec un Constante catalytique (Kcat) de 40 000 000. Quelle enzyme a le plus d’affinité pour son substrat ? Fumarase avec un Km de 0,005 (inversement proportionnel à l’affinité). Linéarisation de Linewaever et Burk : Équation d’une droite : Y=a.x+b 4 Détermination de Km et Vmax : Les données expérimentales suivantes ont été obtenues au cours d’une étude de l’activité catalytique d’une peptidase intestinale capable d’hydrolyser le dipeptide glycyglycine : Glycyglycine + H2O → glycines À partir de ces données, il est possible de déterminer par analyse graphique les valeurs de Km et Vmax pour cette préparation enzymatique. 5. Facteurs influençant la réaction enzymatique : ❖ Influence du pH sur la vitesse de réaction : L’état d’ionisation des acides aminés varie en fonction du pH, car il entraine une modification du site actif. Aux pH extrêmes, il y a une dénaturation de la protéine. Le pH optimal est souvent proche de la neutralité, mais pas toujours. Par exemple, le pH optimal de la pepsine gastrique est de 2, alors que le pH optimal de la trypsine duodénale est de 9. ❖ Influence de la température sur la vitesse de réaction : Température faible : Il y a une augmentation exponentielle de l’activité de l’enzyme, car la température fourni l’énergie nécessaire à la réaction. Température optimale : Elle est souvent proche de la température du milieu cellulaire. Température élevée : Cela entraine une dénaturation de la protéine, et donc une modification du site actif. 5  ❖ Inhibiteurs chimiques : Un inhibiteur est une molécule qui se fixe à une enzyme, entrainant :  Une diminution de l’activité enzymatique  Une diminution de la vitesse de réaction L’inhibition des enzymes joue un rôle important dans le contrôle des mécanismes biologiques, et notamment dans la régulation des voies métaboliques. Les inhibiteurs sont utilisés dans certains domaines d’utilisation : médicaments, insecticides, pesticides, … Complexe d’une protéase du VIH associée à l’inhibiteur (ritonavir) Inhibiteurs réversibles : Cela signifie que les liaisons avec l’enzyme sont faibles. Les compétitifs Les non-compétitifs « Mauvaise clé dans la serrure, elle rentre mais ne « Grain de sable qui empêche la bonne clé de tourne pas. » tourner dans la serrure. » → Quand Km augmente, l’affinité pour le substrat → Si Km n’est pas modifiée, cela signifie que diminue. l’affinité pour le substrat est inchangée. → Si Vmax n’est pas modifiée, cela signifie que → Quand Vmax diminue, cela signifie que l’inhibiteur est déplacé par excès de substrat. l’inhibiteur n’est pas déplacé par un excès de substrat. 6 Inhibiteurs irréversibles : Ces inhibiteurs forment des liaisons covalentes avec les enzymes. → Par exemple, l’aspirine qui inhibe la cyclooxygénase. Il y a une acétylation de Ser au niveau du site actif, ce qui empêche la synthèse des médiateurs chimiques responsables de l’inflammation, de la douleur et de la fièvre. ❖ Activateurs chimiques : Les ions métalliques favorisent :  Favorisent la bonne conformation en 3D  Favorisent la fixation du substrat  Participent à la catalyse La protéolyse limitée : - Irréversible - Transforme la proenzyme en enzyme - Permet le clivage de liaisons peptidiques - Pepsinogène - Fibrinogène La modification covalente :  Réversible  Transforme la forme active en forme inactive, et inversement 6. Enzymes allostériques : La structure quaternaire des enzymes peut avoir 2 configurations : - Tendu (T) → Faible affinité pour le substrat - Relâché (R) → forte affinité pour le substrat Tendu Relâché La fixation du substrat sur l’enzyme entraine une augmentation de l’affinité de l’enzyme pour son substrat. Une augmentation de la concentration en substrat entraine une augmentation de la proportion d’enzyme en conformation relâché (R). L’effet coopératif permet l’obtention d’une courbe sigmoïde, différente de la courbe obtenue avec une enzyme « Michaelien ». 7 Effecteurs allostériques : Activateur allostérique :  Permet de faire passer tous les monomères en position relâchée.  L’affinité de l’enzyme pour le substrat est augmentée.  La courbe sigmoïde sera déplacée vers la gauche. Inhibiteur allostérique :  Permet de faire passer tous les monomères en position tendue.  L’affinité de l’enzyme pour le substrat est diminuée.  La courbe sigmoïde sera déplacée vers la droite. Allostérie : C’est un mode de régulation de l’activité d’une protéine, par lequel la fixation d’une molécule effectrice en un site modifie les conditions de fixation d’une autre molécule, en un autre site distant de la même protéine. L’allostérie confère à l’enzyme une grande sensibilité de son activité aux variations de concentration du substrat et des effecteurs. L’allostérie est souvent au premier rang des mécanismes régulateurs des activités enzymatiques. C’est souvent l’enzyme catalysant la première réaction limitante d’une voie métabolique. 7. Régulation des voies métaboliques : L’activité des voies métaboliques est constamment régulée pour adapter l’offre métabolique à la demande cellulaire. → Une enzyme peut être contrôlée par plusieurs effecteurs positifs ou négatifs appartenant à la même voie métabolique. - Le produit terminal sera un inhibiteur - Un précurseur sera l’activateur 8 Exemple : La glycogène phosphorylase musculaire Action de l’insuline :  Déphosphorylation de la glycogène synthase, permettant d’activer la glycogénogenèse  L’enzyme inactive la glycogène phosphorylase, et ainsi inhibe la glycogénolyse. Fonctionnement de la glycogène phosphorylase : - Active soit car la conformation passe de tendu à relâché, soit car il est lié à un produit (P) → La glycogène phosphorylase ne fonctionne pas quand elle est sous forme tendue, et fonctionne lorsqu’elle est sous forme relâchée. - ATP et glucose qui inactivent l’enzyme - A AMP active l’enzyme - Insuline inactive l’enzyme - Adrénaline active l’enzyme La glycogène phosphorylase est l’enzyme qui permet la réalisation de la glycogénolyse, c’est-à-dire la transformation du glycogène en glucose. L’insuline est hypoglycémiante, ce qui signifie qu’elle ne veut pas que le glycogène soit transformé en glucose, et elle inhibe donc la glycogénolyse. À l’inverse, l’adrénaline est hyperglycémiante, ce qui signifie qu’elle va activer la glycogénolyse pour que le corps obtienne du glucose. 8. Coenzymes : Apoprotéine : C’est la partie protéique de l’enzyme. Cofacteur : C’est une petite molécule requise pour donner son activité à l’enzyme et qui vient se fixer dans le site actif de l’apoprotéine. Groupe prosthétique : C’est un composé non protéique, maintenu dans une structure protéique au moyen de liaisons covalentes permanentes. Cosubstrat : C’est le second substrat de la réaction, qui est libre. 9  ❖ Coenzymes pyridiniques : Il s’agit de NAD+ et de NADP+, qui sont les dérivés de la vitamine PP et du tryptophane. → Le NAD+ (Nicotinamide adénine dinucléotide) est un cosubstrat d’oxydoréduction, mais il n’est pas toujours relié à l’enzyme. Elle est induite par l’enzyme mais a besoin d’un accepteur de proton (H+). ❖ Coenzymes flaviniques : Il s’agit de FAD et FMM, qui sont les dérivés de la vitamine B2. → Le FAD (Flavine adénine dinucléotide) est un groupement prosthétique d’oxydoréduction. Il est tout le temps relié physiquement à l’enzyme. ❖ Coenzyme A : Le CoA-SH (Coenzyme A) est un cosubstrat dans des réaction de transfert de groupe acyle dont l’acétyle. Il s’agit d’un dérivé de la vitamine B3, et c’est l’un des groupements qui permet la phosphorylation oxydative. ❖ Coenzymes quinoniques : Aussi appelée coenzyme Q (CoQ), c’est un cosubstrat d’oxydoréduction), et il n’est pas dérivé d’une vitamine. ❖ Coenzymes héminiques : Il s’agit du Cytochrome C, qui est un groupement prosthétique d’oxydoréduction. 10