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BIOLOGÍA 10/09/2024 1r año Farmacia Bloque 1. Introducción a la Biología Celular animal y vegetal. Tema 2. La membrana plasmática y pared celular. Tema 3. Retículo endoplásmico rugoso y síntesis de proteínas. Tema 4...

BIOLOGÍA 10/09/2024 1r año Farmacia Bloque 1. Introducción a la Biología Celular animal y vegetal. Tema 2. La membrana plasmática y pared celular. Tema 3. Retículo endoplásmico rugoso y síntesis de proteínas. Tema 4. Retículo endoplásmico liso y tráfico vesicular. Tema 5. Orgánulos celulares. Lisosoma, peroxisoma, mitocondria y cloroplasto. Tema 6. El núcleo celular. Cromosomas, poro nuclear y transporte. Tema 7. Transducción de señales.  TEMA 1: Introducción a la Biología Celular animal y vegetal. 1. ENDOSIMBIOSIS Los organismos vivos han evolucionado a partir de un tipo celular que apareció hace unos 3500 millones de años denominado LUCA (Last Universal Common Ancestor). Esta célula debió ser semejante a los procariotas actuales. La complejidad celular de algunos linajes de procariotas aumentó, dando lugar a las células eucariotas. Todas las células eucariotas proceden de uno de estos linajes, un tipo celular a que se denomina LECA (en inglés, Last Eukaryotic Common Ancestor) Konstantín Mereschokovsky (1905, 1910) propuso que los cloroplastos de las células eucariotas fotosintéticas son los descendientes de una célula procariota incorporada dentro de una eucariota ancestral. A este proceso se le llamó simbiogénesis, que derivó en el término endosimbiosis. Posteriormente se incluyeron a las mitocondrias también como resultado de otro proceso de endosimbiosis, aunque temporalmente fue primero las de las mitocondrias que la de los cloroplastos. Algunos autores piensan que los peroxisomas, los cilios y los flagelos también se formaron por procesos de endosimbiosis. 2. Endosimbiosis seriada 1. La teoría de la endosimbiosis seriada postula una primera fusión entre una arquea (consumidora de azufre, fermentadora o termoacidófila) y una bacteria espiroqueta. La arquea formó el núcleo. Esto produjo a LECA. También tenemos la hipótesis de eucariogénesis viral para explicar el núcleo. Después tras un periodo de “colaboración” metabólica con una bacteria aeróbica, la bacteria se convirtió en la mitocondria con el paso del tiempo. Algo similar ocurre con los peroxisomas. Así, tendríamos una célula similar a las eucariotas actuales. 2. Posteriormente, hubo una segunda endosimbiosis en algunas de estas células eucariotas por parte de una procariota con clorofila, probablemente similar a las cianobacteras actuales, que con el tiempo se transformó en los cloroplastos actuales, resultando en las células eucariotas fotosintéticas como las algas y las plantas, que poseen tanto mitocondrias como cloroplastos. 2  TEMA 2: La membrana plasmática y la pared celular. 1. LA MEMBRANA PLASMÁTICA/ CELULAR/ CITOPLASMÁTICA: Las células eucariotas presentan un sistema de membranas intracelulares o endomembranas, que dividen el citosol en compartimentos y envuelven determinados orgánulos. Permite un intercambio selectivo de sustancias con su entorno. Están compuestas por lípidos, proteínas y una pequeña fracción de glúcidos, y que comparten una arquitectura básica común. Los lípidos forman una bicapa de 3-5 nm de espesor que constituye la matriz o armazón dinámico de la estructura móvil y plástica, sobre la que están embebidas en grado variable las distintas proteínas 3 1.1 Ácidos grasos. Los ácidos grasos son ácidos orgánicos con largas cadenas hidrocarbonadas. Tienen un número par de átomos de carbono que varía entre 12 y 20 (los más comunes entre 16 y 18). Presencia de dobles enlaces o insaturaciones. Todos los ácidos grasos insaturados de las membranas están en configuración cis, (poseen los grupos –H en el mismo lado de un doble enlace), produciendo a nivel de la insaturación, la una torsión de unos 120°. Es un factor decisivo en el estado de fluidez de la membrana. Los ácidos grasos saturados más habituales en los lípidos de membrana son el ácido palmítico y el esteárico (de 16 y 18 átomos de carbono, respectivamente). Los ácidos grasos insaturados más frecuentes son los ácidos oleico, linoleico y linolénico (los tres con 18 átomos de carbono y uno, dos y tres dobles enlaces, respectivamente) y el ácido araquidónico (de 20 átomos de carbono y cuatro dobles enlaces). Los glucolípidos participan en los procesos de señalización celular, en los que, junto a determinadas glucoproteínas, suponen puntos de reconocimiento para moléculas extracelulares o células adyacentes. La porción glucídica de determinados glucolípidos y glucoproteínas define los grupos sanguíneos humanos y desempeña también un papel esencial durante el desarrollo embrionario, pero además se asocia a determinadas situaciones patológicas. 4 1.2 Esteroles. Pertenecen al grupo de los esteroides, con entre 27 y 29 átomos de carbono organizados en torno al núcleo de esterano o ciclopentanoperhidrofenantreno. El más común es el colesterol. En este, al núcleo de esterano se unen una cadena lateral alifática en el C-17 y un grupo hidroxilo en el C-3, que actúa de grupo de cabeza polar (mínimo en comparación con el cuerpo apolar de la molécula, que resulta casi tan largo como un ácido graso de 16 carbonos). La membrana de una célula animal contiene cantidades de colesterol tales que pueden llegar a suponer el 50% del número total de lípidos. Las moléculas de colesterol se orientan en la bicapa lipídica con su grupo hidroxilo hacia la fase acuosa. En esta posición, el anillo esteroide, plano y rígido, inmoviliza los primeros grupos -CH 2 - de las cadenas hidrocarbonadas vecinas, provocando que la bicapa lipídica sea más rígida en esta región. La presencia de moléculas de colesterol en la membrana de una célula animal presenta un doble efecto. Por un lado, frena el aumento de fluidez asociado a temperaturas elevadas. Por otro lado, previene la cristalización derivada de la disminución de la temperatura. Dicho de otro modo, en términos de Tm: el colesterol ejerce el efecto dual de disminuir la fluidez de la membrana y dificultar su congelación por encima y por debajo de su punto de fusión, respectivamente. Cuatro tipos de movimiento distintos de los lípidos de membrana: 1) la flexión de las cadenas hidrocarbonadas. 2) la rotación de los fosfolípidos alrededor de su eje mayor. 3) la difusión lateral. 4) la difusión transbicapa, o flip-flop. En las difusiones lateral y transbicapa se produce el intercambio de posición entre dos moléculas de lípido. A 37 °C, una molécula de lípido individual puede llegar a intercambiar su ubicación con otras moléculas adyacentes 10.000.000 veces/segundo por difusión lateral. En cambio, el movimiento de flip-flop en las mismas condiciones experimentales es extremadamente lento, siendo su frecuencia menor de una vez a la semana. 5 1.3 Asimetría de la membrana Fosfatidilcolinay esfingomielina (colina) en el exterior. Fosfatidiletanolaminay fosfatidilserina (amino) en el interior. La fosfatidilserina(-) da carga al interior de la membrana La asimetría de la bicapa lipídica se remonta a la síntesis de sus componentes y es necesario mantenerla, ya que un cambio en la distribución de lípidos tiene notables consecuencias biológicas. 1.3.1 Balsas lipídicas Los lípidos de membrana ni siquiera se distribuyen de manera homogénea dentro de una misma hoja. Esta afirmación se traduce en la existencia de unas regiones transitorias, de 50-70 nm de diámetro, conocidas como microdominios o balsas lipídicas en las que la acumulación de determinados lípidos de membrana retiene proteínas implicadas en la señalización celular. Los microdominios se caracterizan por el predominio de esfingolípidos y colesterol. Una de las posibles funciones del glucocáliz es el reconocimiento celular y proteger a la célula de agresiones químicas y mecánicas, manteniendo los cuerpos extraños y la superficie de otras células a la suficiente distancia como para evitar interacciones no deseadas. 6  La membrana constituye una barrera semipermeable que permite el paso selectivo de sustancias necesarias para el metabolismo celular. Existe un gran trasiego de sustancias que pasan de un lado a otro de la membrana, como iones, agua y macromoléculas de diverso tamaño. Algunas sustancias pueden atravesar la membrana por difusión simple o a través de transportadores específicos, un tipo de transporte que no implica una deformación visible de la membrana; en este caso, hablamos de procesos de microtransporte. En cambio, existe otro tipo de transporte que implica una deformación de la membrana plasmática visible al microscopio; todos estos procesos pertenecerían al macrotransporte. Las sustancias liposolubles (1) pueden atravesar la membrana plasmática sin necesidad de que medie un transportador específico, mientras que las hidrófilas (2) precisan de transportadores, que forman canales por los cuales pueden pasar dichas sustancias, atravesando así la bicapa lipídica (1) (2) -Dos tipos de MICROTRANSPORTE: 1) Transporte activo: requiere de energía para intercambiar los solutos, ya que la dirección del transporte va en contra del gradiente. El transporte activo indirecto o secundario recibe esta denominación porque traslada el sustrato de un medio a otro aprovechando la energía liberada al equilibrarse un gradiente electroquímico. La mayoría de las proteínas asocian su transporte al gradiente de los iones Na + e H +. Este ha sido previamente generado gracias al transporte activo primario; de no existir este, tampoco lo haría el indirecto. Se pueden diferenciar dos tipos: el cotransporte y el contratransporte. 2) Transporte pasivo: no precisa de energía para el transporte y en el que la dirección de este siempre está a favor del gradiente de concentración. Las sustancias se mueven espontáneamente a través de la membrana, impulsadas por fuerzas de gradiente de concentración, o gradiente electroquímico. El transporte pasivo se denomina difusión simple cuando es un movimiento que no implica proteínas especializadas de membrana, sino solo una difusión a través de la doble 7  capa lipídica. En cambio, lo llamamos difusión facilitada cuando está facilitado por proteínas de membrana (canales o proteínas transportadoras). a) Difusión simple. Los gases (O 2 , N 2 , CO 2 ), las moléculas hidrófobas (benceno) y las sustancias hidrófilas polares, pero no cargadas (el agua y los alcoholes), presentan liposolubilidad, pasan directamente a través de la membrana. En cambio, las sustancias polares grandes no cargadas (como la glucosa) y los iones son incapaces de difundir entre las moléculas lipídicas. Por lo tanto, la difusión simple es un proceso relevante para el transporte de moléculas pequeñas y poco polares. La difusión simple tiende al equilibrio de concentraciones: una vez que se igualan las concentraciones la difusión se para. El gradiente de concentración es la fuerza impulsora del transporte. b) Difusión facilitada. La membrana plasmática contiene proteínas integrales que permiten el paso de sustancias que no pueden por difusión simple. Las proteínas que se encargan de la difusión facilitada pueden ser de dos tipos: -Poros o canales de membrana: son canales cuyo interior es hidrófilo, permitiendo el paso de solutos sin que haya un cambio de conformación en la proteína. -Transportador proteico: poseen un lugar donde los solutos se unen a la proteína transportadora, induciendo un cambio de conformación que permite el traslado de aquellos al otro lado de la membrana. Tipos de CANALES: -Canales de membrana: Los canales de membrana permiten el paso de moléculas de pequeño tamaño y carga apropiada. Su apertura suele estar regulada, es decir, no se trata simplemente de poros a través de los cuales atraviesan indiscriminadamente las moléculas a favor de gradiente. -Canales iónicos: Llevan a cabo un transporte rápido de iones. La estructura proteica del interior del poro está formada por aminoácidos de cadena lateral hidrófila que permiten el paso selectivo del soluto. Existe una gran variedad de canales especializados en el transporte de determinados iones, como K + , Na + , Cl – o Ca 2+. Estos canales son regulados por diferentes mecanismos que permiten o no su apertura. La regulación de la apertura de los canales iónicos puede provenir de la unión de moléculas extracelulares o de la activación de determinadas cascadas de señalización intracelulares. Existen muchos mecanismos de regulación intracelular, entre los que destacan la unión de metabolitos y ligandos intracelulares (p. ej., AMPc), la fosforilación de los canales o la endocitosis de los canales en vesículas (haciéndolos desaparecer así de la membrana). -Canales mecanosensibles: operan por fuerzas mecánicas y abundan en los mecanorreceptores de la piel y en los cilios de las células ciliadas del oído interno, entre otras localizaciones. El movimiento de los cilios induce un cambio en el citoesqueleto de la célula, lo cual provoca un efecto de tracción mecánica sobre las compuertas del canal, que regula la apertura o el cierre del mismo. -Canales quimiosensibles: se regulan mediante la unión de un ligando al canal (que actúa a la vez como un receptor) y son fundamentales en la transmisión sináptica. Cuando se une el ligando, los canales quimiosensibles cambian su conformación, haciendo que este se abra o se cierre, controlando así el flujo de un ión específico. Por ejemplo, cuando la acetilcolina se une al sitio específico en los canales de Na + de la membrana de la célula postsináptica, estos se abren y permiten la entrada de dicho ión, generando la despolarización de la membrana. 8  -Canales dependientes de voltaje: son esenciales en la transmisión y propagación de los potenciales de acción en los axones de neuronas y células musculares. Cuando se produce un cambio en el potencial de membrana, se altera la carga eléctrica de los aminoácidos de dichos canales, lo que se traduce en un cambio conformacional que provoca la apertura de los mismos. -Canales de las uniones de tipo gap: «uniones en hendidura» o «nexos», están formadas por numerosos canales y están implicados en la comunicación intercelular (permiten el paso de iones y macromoléculas de peso molecular < 2.000 Da) entre dos células vecinas. Constituye la unidad funcional de la sinapsis eléctrica, que es 1.000 veces más rápida que la química. Estas uniones abundan en el tejido neuronal y los cardiomiocitos del corazón, donde actúan para coordinar y sincronizar la contracción muscular y la actividad eléctrica cardíaca. Tipos de TRANSPORTE: - Transporte uniporte: transporte de un soluto. Ejemplo transporte de gucosa. GLUT (13 tipos). -Transporte acoplado (o cotransporte): se produce el transporte simultáneo de dos solutos. Este, a su vez, puede ser: ○ Simporte: dos solutos se transportan en el mismo sentido. Ejemplo transporte de Na + /glucosa. ○ Antiporte: dos solutos se transportan en sentidos opuestos. Ejemplo transporte de HCO 3 – /Cl –. Ejemplo: Otra ATPasa de tipo P es la Ca 2+ ATPasa. Esta bomba se encuentra en la membrana celular bombeando Ca 2+ hacia el líquido extracelular, y en las membranas del retículo endoplasmático liso (REL) y sarcoplásmico (un tipo de REL de las células musculares especializado en almacenar iones Ca 2+ ). Esta ATPasa tiene la importante misión de mantener bajos los niveles citoplasmáticos de Ca 2+. Los niveles intracelulares de este ión deben ser muy bajos (0,1-0,01 μmol/l) pues, de lo contrario, se uniría a los P i libres dando lugar a fosfato de calcio. Una de las funciones de la Ca 2+ ATPasa es permitir la adecuada relajación del miocardio a través 9 de la expulsión de Ca 2+ citosólico hacia el exterior celular. Existen hormonas potenciadoras de este transporte, como por ejemplo el calcitriol. Esta es una hormona lipófila de origen esteroideo que actúa sobre distintos órganos, como el intestino, el riñón, la placenta, las glándulas mamarias, los folículos pilosos y la piel, aumentando la expresión de la Ca 2+ ATPasa 10  TEMA 3: Retículo endoplasmático rugoso y síntesis de proteínas. 1. SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS CELULARES: Las células eucariotas, poseen una serie de membranas internas con una morfología y función determinadas. Entre estos compartimentos se encuentran los orgánulos que forman parte de las vías secretora o endocítica como el retículo endoplasmático (o endoplásmico), con sus componentes rugoso y liso, el aparato de Golgi, los lisosomas y los endosomas. Las funciones de estos orgánulos (a excepción del retículo endoplasmático liso [REL]) están relacionadas con la síntesis, procesamiento, tráfico, localización y degradación de una gran parte de las proteínas celulares. El REL, por su parte, juega un papel clave en la síntesis de lípidos, por lo que provee de elementos de membrana al resto de los compartimentos celulares. 11 2. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO. 2.1 Estructura y composición. El retículo endoplasmático rugoso (RER) es una red interconectada de sáculos (o cisternas) aplanados y túbulos membranosos con ribosomas adheridos a su superficie. Conecta con la envoltura nuclear y también con el REL. Claude, Porter y Fulham realizaron en 1945 las primeras descripciones del RER al microscopio electrónico, que fueron completadas posteriormente por Sjöstrand, Palade y Porter, quienes, además, relacionaron este orgánulo con la síntesis de proteínas. El RER está presente en todas las células nucleadas (exceptuando los espermatozoides) y está especialmente desarrollado en células con una elevada síntesis proteica. En una célula pancreática exocrina, el RER puede llegar a constituir hasta el 20% del volumen celular. El RER está involucrado en la síntesis y distribución de proteínas. Mediante el uso de aminoácidos radiactivos y técnicas de autorradiografía, se comprobó que los aminoácidos añadidos a las células se incorporaban a proteínas primeramente en el RER. Tiempos de incubación mayores revelaban que las proteínas se habían desplazado al aparato de Golgi, posteriormente a vesículas de secreción y, finalmente, eran secretadas al exterior celular. Por lo tanto, estos experimentos mostraron la presencia de una ruta sintética y secretora de proteínas que pasaban del RER al Golgi y luego a la membrana plasmática y al exterior celular. La membrana del RER presenta la típica estructura de las membranas celulares y su grosor es de unos 5-6 nm, es decir, algo menor que la que presenta la membrana plasmática. Posee algunas diferencias en composición con las otras membranas celulares, pues contiene un mayor porcentaje de lípidos y una serie de proteínas exclusivas de este orgánulo. Entre estas últimas cabe señalar las proteínas que permiten la unión de los ribosomas y la translocación de las proteínas hacia su luz del RE. Además, el interior del RER posee toda una serie de proteínas propias de este orgánulo, como enzimas relacionadas con la glucosilación de proteínas, peptidasas, isomerasa de puentes disulfuro y chaperonas (binding protein [BiP], calnexina y calreticulina). 2.2 Traducción de proteínas en el RER. Las proteínas celulares pueden traducirse completamente en ribosomas libres presentes en el citosol o comenzar su traducción en ribosomas citosólicos pero continuarla en el RER. Esta diferencia marca el destino de las proteínas, ya que aquellas cuya síntesis pasa por el RER irán destinadas a permanecer en este mismo orgánulo, en el aparato de Golgi, en los lisosomas o en la membrana plasmática, o bien serán secretadas al exterior celular. En cambio, las proteínas que sean traducidas completamente en el citosol podrán permanecer en el citosol o ser incorporadas posteriormente al núcleo, mitocondrias y peroxisomas. Como la incorporación de estas proteínas a sus orgánulos diana tiene lugar una vez que la proteína ha sido completamente traducida, se habla de una importación postraduccional. En cambio, los ribosomas que se adhieren a la membrana del RER sintetizan las proteínas a la vez que estas se van incorporando al RER, por lo que se habla de una importación cotraduccional. Las proteínas que van a ser traducidas en el RER presentan un péptido señal de 16 a 30 residuos en la región N- terminal. Paso 1: La traducción comienza en ribosomas libres. En el extremo N- terminal de la proteína en formación aparece el péptido señal indicando que la proteína se traduce en el RER. El péptido es reconocido por la Partícula Reconocedora de la Señal (PRS). 12 Paso 2: la unión de la PRS al ribosoma provoca una parada en la traducción y causa un cambio de conformación en PRS que le permite unirse a su receptor en la membrana del RER. El complejo ribosoma/PRS y su receptor interactúan con un translocador, un complejo proteico que permitirá el paso de la proteína en formación hacia la luz del RER. Paso 3: el translocador se abre y continúa la síntesis proteica, pero el péptido señal queda anclado en la región interna del translocador, por lo que no pasa al interior del RER. La proteína en síntesis va atravesando el translocador y penetrando hacia el interior del RER. Se produce la hidrólisis de GTP y, como consecuencia, cambios conformacionales que hacen que se libere la PRS. Paso 4: Una peptidasa señal, que está asociada a la cara interna de la membrana, corta el péptido señal de la proteína que se está incorporando al RER. Paso 5: se continúa la traducción de la proteína, que quedará en la luz del RER. Las secuencias internas de las proteínas pueden disponerse de tal modo que dirijan la translocación orientando el extremo N- terminal hacia el lado citoplasmático o hacia el lado luminal del RER. La presencia de varias secuencias señal de inicio de la translocación y varias secuencias de parada de transferencia permite la existencia de proteínas que atraviesan múltiples veces la membrana del RER. Las proteínas traducidas en el RER para adquirir su conformación final y función, REQUIEREN un correcto plegamiento y modificaciones postraduccionales en el interior del RER (glucosilación, fragmentación y formación de enlaces disulfuro). Casi todas las proteínas producidas en los ribosomas unidos a la membrana, ya sean componentes integrales de una membrana, enzimas solubles lisosomales o vacuolares, o partes de la matriz extracelular, se convierten en glucoproteínas. La glucosilación es un proceso que comienza en el RER y finaliza en el aparato de Golgi. Ambos orgánulos poseen enzimas capaces de transferir azúcares a las proteínas, o de eliminar algunos de ellos para dar lugar a cadenas de oligosacáridos específicos para cada proteína. La glucosilación es una modificación importante, ya que supone un Control de Calidad para el plegamiento correcto de las proteínas en el RER; además, la glucosilación impide la agregación de las proteínas 13 Las proteínas glucosiladas en el RER sufren una transferencia de un oligosacárido de 14 residuos: 2 de N- acetilglucosamina, 9 de manosa y 3 de glucosa, catalizada por una transferasa de oligosacáridos. El oligosacárido se inicia en el lado citosólico de la membrana del RER sobre un lípido llamado dolicol-difosfato. La síntesis del oligosacárido de 14 azúcares se inicia en la cara citoplasmática y después se produce una translocación de la cadena glucídica desde el lado citoplasmático hasta el lado luminal del RER. La transferencia del oligosacárido a la proteína tiene lugar sobre un aminoácido asparragina (Asn) que se encuentre en una secuencia Asn-X-Ser/Thr (donde X puede corresponder a cualquier aminoácido; Ser: serina; Thr: treonina). Tras la transferencia del oligosacárido se produce un procesamiento, que consiste en la eliminación de algunos azúcares: primero un residuo de glucosa, luego otros dos de glucosa y uno de manosa, catalizados por glucosidasas y manosidasas, respectivamente. Posteriormente este oligosacárido será modificado en el aparato de Golgi. 14  TEMA 4: Retículo endoplasmático liso y tráfico vesicular. 1. SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS CELULARES: El REL está constituido por un conjunto de estructuras membranosas, esencialmente tubulares, sin ribosomas adosados, y se diferencia del RER tanto en su morfología y composición, como en su función. Aunque existen diferencias morfológicas y funcionales entre ambos retículos, se encuentran interconectados entre sí, formando una estructura o compartimento en continuidad de membrana. Entre las características del REL que le diferencian del RER podemos citar: -No presenta ribosomas. -Los elementos membranosos son fundamentalmente túbulos (no sáculos). -Posee una composición distinta de la membrana (con diferencias en sus proteínas y con mayor porcentaje de lípidos). -Sus funciones están relacionadas principalmente con la síntesis de lípidos y derivados lipídicos. -Es abundante solo en células especializadas (hepatocitos, células secretoras de hormonas esteroideas, células musculares, etc.). 1.1 Funciones. 1.1.1 Síntesis de lípidos y derivados lipídicos. La síntesis lipídica se desarrolla en varias fases. En la primera, en el citoplasma, dos ácidos grasos unidos a coenzima A (CoA) se unen al glicerol 3-fosfato, formando el ácido fosfatídico, que se inserta en la membrana del REL. Posteriormente, una fosfatasa convierte el ácido fosfatídico en diacilglicerol (DAG). En una tercera fase se produce la unión de los diferentes grupos de cabeza polares al DAG, formándose así la fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. El fosfatidilinositol se genera a partir del ácido fosfatídico, en vez de hacerlo a partir del DAG. En el REL también se sintetizan el colesterol y la ceramida, que van a ser componentes de las membranas, junto con los glicerofosfolípidos. La ceramida dará lugar a glucolípidos y a la esfingomielina en el aparato de Golgi, donde se completará la formación de estos lípidos de membrana. Tanto el colesterol como la esfingomielina formarán parte de las balsas lipídicas o rafts 1.1.2 Formación de lipoproteínas, ácidos biliares y hormonas esteroideas. En el hígado se sintetizan lipoproteínas (LDL, VLDL, HDL y VHDL, que se vierten posteriormente al torrente sanguíneo) y ácidos biliares, que se forman a partir de colesterol (y se vierten a los canalículos biliares). La síntesis de hormonas esteroideas tiene lugar en células endocrinas 15 (glándulas endocrinas) y se desarrolla en pasos sucesivos que implican la acción de enzimas mitocondriales y del REL a partir de colesterol. Se forman así hormonas como la testosterona, el estradiol, el cortisol, la aldosterona, etc. 1.1.3 Detoxificación de sustancias liposolubles. El REL tiene un importante papel en la degradación de sustancias tóxicas liposolubles, como algunos fármacos, alcohol, pesticidas y carcinógenos, además de compuestos dañinos producidos por el propio metabolismo. Todas estas sustancias son convertidas en productos hidrosolubles, más fácilmente eliminables por el organismo. En los hepatocitos, cuando hay altas dosis de estas sustancias tóxicas, se observa un REL muy desarrollado con presencia de enzimas detoxificantes (como la familia de los citocromos P450, que están anclados en el lado citosólico de la membrana del REL). Las enzimas del citocromo P450 se agrupan en 27 familias de genes y se designan mediante las letras CYP, seguidas por un número del 1 al 10. La actividad de estas enzimas incluye oxidación, hidrólisis o reducción de las sustancias que tienen que ser modificadas químicamente para reducir su toxicidad. Otras enzimas citoplasmáticas actúan conjugando estas sustancias con determinados grupos químicos (glucurónico, sulfato, acetilo, etc.), que facilitan la excreción de las mismas. 1.1.4 Participación en el metabolismo del glucógeno. El REL aparece frecuentemente cercano a los depósitos de glucógeno de algunos tipos celulares, particularmente de los hepatocitos. Estas células poseen una importante función en el acúmulo de glucosa en forma de glucógeno. En el lado citosólico de la membrana del REL se encuentra la glucosa 6-fosfatasa, una enzima que hidroliza la glucosa-6-fosfato, produciendo glucosa libre, que puede así pasar al torrente sanguíneo y ser utilizada por los tejidos ante una situación de falta de glucosa. 1.1.5 Almacenamiento de Ca 2+. El REL posee bombas Ca 2+ ATPasas que introducen Ca 2+ en su interior en contra de gradiente, con el fin de que los niveles citoplasmáticos de este ión permanezcan bajos; por lo tanto, el REL actúa como reservorio intracelular de Ca 2+. El aumento de los niveles de Ca 2+ citoplasmático desencadena la activación de cascadas de señalización celular por lo que actúa como un segundo mensajero en la señalización intracelular. En los miocitos de las fibras musculares esqueléticas existe un REL especial, denominado «retículo sarcoplásmico», que forma una envuelta alrededor de las miofibrillas. Constituye un almacén de Ca 2+ que se libera con la llegada del impulso nervioso y desencadena la contracción muscular. 2. APARATO DE GOLGI: 2.1 Estructura y propiedades. Está constituido por un conjunto de estructuras membranosas, fundamentalmente sáculos aplanados y apilados en disposición paralela. También aparecen vesículas alrededor de los sáculos, especialmente junto a los extremos, además de elementos membranosos tubulares. Todos estos elementos se agrupan en unidades denominadas dictiosomas, cuyo número y distribución son variables según el tipo celular (p. ej., un hepatocito puede tener hasta 50 dictiosomas). 16 El aparato de Golgi está muy desarrollado en células productoras de glucoproteínas, como las células de los acinos pancreáticos, células caliciformes, hepatocitos, neuronas, etc. El aparato de Golgi presenta polaridad, lo que indica que existen dos zonas con morfología y composición bien distinta, denominadas cara Cis (o de formación) y cara Trans (o de maduración). En el aparato de Golgi tiene lugar la maduración de las proteínas, que ocurre mediante cambios sucesivos que se producen desde la cara Cis hasta la cara Trans. La maduración proteica, por lo tanto, está polarizada hacia la cara Trans del Golgi. Partes del Aparato de Golgi: Red del Cis Golgi (CGN). Cisternas Cis. Cisternas mediales. Cisternas Trans. Red del Trans Golgi (TGN). Cada compartimento (CGN y TGN) posee enzimas responsables de la maduración secuencial de las proteínas. Así, en la región CGN se transfieren grupos fosfato y en la zona Cis se eliminan residuos de manosa. En las cisternas mediales se añade N- acetilglucosamina; en las Trans, galactosa y ácido siálico, en la zona TGN se transfieren grupos sulfato a las proteínas. La glucosilación de proteínas y lípidos, da lugar a glucoproteínas y glucolípidos. Se dan también procesos de desglucosilación, en los que se eliminan, por ejemplo, grupos manosa. Las proteínas glucosiladas en el RER (donde tenía lugar la N- glucosilación), en el aparato de Golgi pierden algunos de sus radicales glucídicos y se añaden otros, dando lugar a glucoproteínas que contienen N- oligosacáridos que se pueden clasificar en tres grandes grupos: a) ricos en manosa. b) complejos. c) híbridos, que vienen a ser oligosacáridos intermedios entre los grupos anteriores. El aparato de Golgi también es responsable de la O- glucosilación (que tiene lugar de modo exclusivo en este orgánulo). En este caso, se unen azúcares a un grupo OH de los aminoácidos serina y treonina. *EJEMPLOS: Las mucinas son proteínas O-glucosiladas, abundantes en las células secretoras de mucosustancias; también el colágeno tiene azúcares O- ligados. Los proteoglucanos son estructuras de alto contenido proteico a las que se unen largas cadenas de azúcares que se llaman «glucosaminoglucanos» que también se añaden en el aparato de Golgi. La adición de ácido siálico tiene lugar en las cisternas Trans del aparato de Golgi. El ácido siálico proporciona una carga negativa a las proteínas, lo cual tiene importancia en interacciones célulacélula o en la infección de microorganismos. Por ejemplo, las células 17 metastásicas poseen una gran cantidad de glucoproteínas con ácido siálico, lo cual puede facilitar su salida de los tejidos hacia el torrente sanguíneo. El virus de la gripe se une al ácido siálico de la superficie de eritrocitos y células de las vías respiratorias, permitiendo así su entrada en las células. Algunas proteínas sufren sulfatación en sus tirosinas, reacción que es catalizada por una sulfotransferasa en la zona TGN del Golgi. Entre las proteínas que sufren sulfatación están determinadas moléculas de adhesión, proteínas de matriz extracelular o los receptores asociados a proteínas G. El proceso de glucosilación de proteínas y lípidos está alterado en algunas situaciones patológicas, como el cáncer. Se ha comprobado que las células tumorales producen glucoproteínas y glucolípidos con oligosacáridos distintos a los de las células normales, lo cual facilita su adhesión y migración a través de determinados tejidos y, por lo tanto, el proceso de metástasis. 2.2 Marcaje de enzimas lisosómicas. Las enzimas de tipo hidrolasa ácida que van a ser responsables de la digestión celular llevada a cabo por los lisosomas son clasificadas mediante una ruta especial, que las dirigirá hacia este orgánulo. Los lisosomas primarios se forman a partir de vesículas revestidas de clatrina que se originan en la zona TGN del Golgi. El proceso comienza en la zona CGN, que contiene enzimas que añaden grupos fosfato sobre el carbono 6 de manosas terminales en las proteínas de tipo hidrolasa que van a ir destinadas a lisosomas. La manosa-6-fosfato (M6P) constituye, por lo tanto, un marcaje de aquellas proteínas cuyo destino es el lisosoma. Las hidrolasas lisosómicas marcadas son reconocidas por receptores de M6P presentes en TGN. De esta manera, se formarán vesículas revestidas de clatrina que salen del TGN y se fusionan con el endosoma tardío. 2.3 Fragmentación de zimógenos. Algunas proteínas son sintetizados en forma inactiva, y deben sufrir fragmentaciones para ser funcionales. La fragmentación tiene lugar en aminoácidos cargados positivamente (Lys-Lys, 18 Lys-Arg, Arg-Arg, Arg-Lys). En el aparato de Golgi y en las vesículas de secreción inmaduras, estas proteínas son procesadas mediante enzimas que eliminan parte de la proteína, dejando libre la forma activa. La síntesis y secreción de la insulina ilustra las modificaciones postraduccionales y la secreción regulada en las células β del páncreas. La traducción del ARNm de la insulina tiene lugar en el RER y genera una cadena polipeptídica precursora llamada «pre-proinsulina». Posteriormente, este precursor pierde el péptido señal por proteólisis, generando así la proinsulina, cuya estructura final de plegamiento se consigue mediante la formación de puentes disulfuro. La proinsulina pasa entonces al aparato de Golgi y desde ahí a gránulos de secreción inmaduros. Finalmente es procesada mediante una serie de proteasas (prohormona convertasa 1/3, carboxipeptidasa E) para dar lugar a la insulina madura y al péptido C. Los gránulos de secreción que contienen la insulina madura son exocitados cuando las células β activan una cascada de señalización intracelular en respuesta a la glucemia elevada y a otros estímulos 2.4 Tráfico vesicular y formación de vesículas de secreción. La regulación del tráfico intracelular de vesículas en las vías endocítica y exocítica requiere de la actuación de una serie de proteínas de revestimiento (coating proteins). El revestimiento tiene, al menos, dos funciones: a) proveer la fuerza mecánica para deformar la membrana. b) capturar en esas zonas los receptores específicos. Vesículas revestidas de clatrina: participan en la formación de vesículas en el aparato de Golgi que irán destinadas a lisosomas, en la endocitosis mediada por receptor y en la exocitosis regulada. Vesículas revestidas de coatómeros (COPI y COPII): su revestimiento está formado por un complejo proteico y el coatómero, compuesto por las subunidades proteicas COPI o COPII (del inglés coating protein ). Estas proteínas median el transporte del RER al aparato de Golgi (COPII), y de recuperación a RER (COPI), y el del TGN hacia la membrana plasmática (exocitosis constitutiva) (COPI). 19 2.4.1 Vías de comunicación mediante vesículas: 1. Transporte del RER al aparato de Golgi: las proteínas presentes en el RER que deben pasar al aparato de Golgi son empaquetadas en vesículas revestidas de COPII, que se forman en regiones especializadas del RER, sin ribosomas, denominadas exit sites (lugares de salida). Solo abandonan el RER las proteínas correctamente plegadas y ensambladas, ya que chaperonas retienen a las proteínas mal plegadas. Estas vesículas se desplazan hacia el Golgi, en un movimiento dependiente de microtúbulos. 2. Vía de retorno del aparato de Golgi al RER: las proteínas residentes del RER que hayan pasado al aparato de Golgi para ser modificadas, vuelven mediante vesículas recubiertas de COPI. En concreto, las proteínas solubles residentes del RER (como BiP o isomerasa de puentes disulfuro) presentan una pequeña señal carboxilo terminal que consiste en una secuencia de aminoácidos Lys-Asp-Glu-Leu (o KDEL). Las proteínas de membrana del RER poseen también secuencias específicas, que contienen dos residuos de lisina (KKXX), que las devuelven a través de la vía de reciclado. Estas proteínas son reconocidas por receptores presentes en la membrana de los agregados tubulo-vesiculares (ERGIC) y del aparato de Golgi, en zonas que forman vesículas revestidas de COPI y son devueltas al RER. 3. Transporte a través del Golgi: las proteínas procedentes del RER son incorporadas al aparato de Golgi por su cara Cis y van madurando en su recorrido hacia la cara Trans. El movimiento preciso que siguen las proteínas a través del Golgi es todavía objeto de debate. Existen dos posibles modelos teóricos, aunque en realidad, está prácticamente aceptado que lo que se da es una mezcla de ambos: a) transporte vesicular, en el que las cisternas son estáticas, con proteínas residentes características. b) maduración o progresión de las cisternas, en el que estas van madurando, por lo que debe haber un transporte vesicular retrógrado de las proteínas residentes de cada compartimento. 4. Transporte del Golgi a la membrana plasmática: este proceso repone la membrana perdida por endocitosis y sirve a la vez para verter al exterior celular moléculas de secreción y sustancias que formarán parte de la matriz extracelular. Existen dos grandes vías secretoras: a) la vía secretora constitutiva, que se da en todas las células y supone una constante exocitosis de vesículas que contienen proteínas y lípidos de la membrana plasmática, así como proteoglucanos y glucoproteínas de la matriz extracelular. 20 b) la vía secretora regulada, que tiene lugar solo en células especializadas en secreción. En ella las moléculas son secretadas en respuesta a un estímulo y pueden ser hormonas, enzimas o neurotransmisores. 2.5 Fusión vesicular. La fijación de las vesículas a las membranas aceptoras es un proceso aún poco conocido. Intervienen una familia de proteínas denominada Rab-GTP (más de 60 isoformasen humanos). Distintas isoformas de Rab se encuentran en distintos compartimientos de membrana (especificidad dirigida). En el acoplamiento de las vesículas, intervienen las proteínas SNARE, que constan de 35 isoformas también en compartimientos membranales específicos. Dos grandes grupos son las SNARE-v (sinaptobrevina en neuronas), que se incorporan a las vesículas durante su desprendimiento, y las SNARE-t (sintaxina y SNAP-25 en neuronas), que se encuentran en las membranas aceptora. 21  TEMA 5: Orgánulos celulares: Lisosoma, peroxisoma, mitocondria y cloroplasto. 1. LISOSOMA: Los lisosomas contienen hasta 40 tipos de enzimas hidrolíticos o hidrolasas ácidas (nucleasas, proteasas, glucosidasas, lipasas, etc.), que son capaces de digerir de manera controlada los distintos tipos de macromoléculas. El pH en su interior es ácido (en torno a 5), lo que es óptimo para la actuación de las hidrolasas. Presentes en todas las células y hay miles dentro de cada una. No todos los lisosomas contienen todas las enzimas capaces de digerir cualquier macromolécula de la célula, pero todos ellos contienen al menos la fosfatasa ácida, que se considera un marcador universal de lisosomas. La membrana de este orgánulo tiene características peculiares: por un lado presenta bombas de protones, cuya actividad genera el pH ácido al introducir iones H + en contra de gradiente. Además contiene gran número de proteínas transportadoras para translocar al citosol los productos de la digestión de las distintas macromoléculas (aminoácidos, azúcares y nucleótidos), y proteínas de membrana glicosiladas de manera inusual, lo que parece protegerlas de la acción de las propias hidrolasas. Si se digiriera la membrana o se rompiera por cualquier causa, quedarían libres en el citoplasma las hidrolasas, que podrían digerir los componentes celulares y causar la muerte celular. 2.1 Ejemplos de proteínas que tienen los Lisosomas, marcadas por manosa. Enzimas Sustrato Fosfatasa ácida/alcalina Fosfomonoéster FOSFATASAS Fosfodiesterasa Fosfodiéster NUCLEASAS Ácido ribonucleico ARN Ácido desoxiribonucleico ADN Catepsina Proteínas PROTASAS Colagenasa Colágeno Idursulfasa Dermatán Sulfato 22  beta-Galactosidasa Queratán Sulfato HIDROLIZADAS Heparán N-sulfato Heparán Sulfato alfa-Acetil Glucosaminidasa Heparán Sulfato alfa-Glucosidasa Glucógeno POLISACÁRIDOS Y Fucosidasa Fructooligosacáridos OLIGOSACÁRIDOS alfa-Manosidasa Manano Oligosacáridos Sialidasa Mucopolisacáridos (generalmente) Ceramidasa Ceramidas Glucocerebrosidase Glucosilceramida (lisosomal) ESFINGOLÍPIDOS HIDROLIZANTES beta-hexanamida Gm2 Gangliosida Arilsulfatasa A Galactosa Lipasa Triacilgliceroles LÍPIDOS HIDROLIZANTES Fosfolipasa Fosfolípidos 1.2 Tipos: Primarios: son orgánulos esféricos, de pequeño tamaño (alrededor de 0,5 μm), contenido homogéneo denso y pH no muy ácido. Se trata de vesículas provenientes del aparato de Golgi cargadas de enzimas hidrolíticas que todavía no han digerido, por lo que en la actualidad se les tiende a denominar «vesículas hidrolíticas del Golgi». Se forman por gemación en la zona TGN del Golgi. Las hidrolasas lisosómicas marcadas con las M6P añadidas a N- oligosacáridos son reconocidas por receptores de M6P presentes en TGN. De esta manera, se formarán vesículas revestidas de clatrina que salen del TGN y se fusionan con el endosoma tardío. El endosoma tardío proviene del endosoma temprano, donde se habían ido acumulando diversos sustratos procedentes de la endocitosis. El pH del endosoma tardío favorece la disociación de la hidrolasa ácida de su receptor de membrana, lo que, a su vez, posibilita que el receptor retorne a la zona TGN del Golgi mediante gemación de vesículas recubiertas de retrómeros, para comenzar de nuevo el proceso. En el endosoma tardío tiene lugar, por su parte, la disociación de los grupos fosfato que constituían el marcaje de las enzimas lisosómicas. Una vez que las enzimas están libres de su grupo fosfato, pueden actuar, digiriendo sus sustratos específicos. Secundarios: son aquellos que están digiriendo o ya han digerido los diferentes sustratos celulares. Estos lisosomas son el resultado de la fusión de los lisosomas primarios con los endosomas tardíos, con un pH ácido, donde se concentran los sustratos que han sido incorporados mediante endocitosis. La fusión de ambos orgánulos da lugar a un compartimento con un pH ácido, enzimas hidrolíticas y sustratos para la digestión. Los lisosomas secundarios son de mayor tamaño y más irregulares que los primarios y poseen contenido heterogéneo. 23 La digestión incompleta de las sustancias puede generar lisosomas (generalmente grandes y con forma irregular) con material de residuo en su interior, llamados cuerpos residuales o gránulos de lipofuscina (también se denominan «pigmento de envejecimiento», típico de las neuronas y del músculo cardíaco). 1.3 Vías de degradación de materiales en lisosomas: Existen tres vías por las que los materiales se degradan en los lisosomas, por ello existe una variedad morfológica en los lisosomas. 1) Vía de la endocitosis: Forma vesículas irregulares denominadas endosomas tempranos. La fusión de lisosomas primario y endosomas tempranas forman los endosomas tardíos o lisosomas secundarios que posteriormente se degradaría. ➔ Endocitosis por volumen (pinocitosis, captación de cualquier molécula grande). También es un sistema de recambio de los lípidos de membrana. ➔ Endocitosis mediada por receptores. Captación de ligandos como hormonas, factores de crecimiento, enzimas y proteínas sanguíneas que transportan nutrientes. Los receptores se acumulan en especializaciones denominadas fosos cubiertos. Están asociados a la clatrina y adaptinas. Una vez internalizadas las vesículas se transportan al sistema de red de túbulos denominados endosomas, que a su vez, son los centros de distribución de la vía endocítica. Dos tipos: endosomas tempranos, menos invaginados y más cerca de la membrana y endosomas tardíos, más invaginados y alejados de la membrana. Los receptores domésticos son enviados a los endosomas tempranos y vueltos a la membrana, mientras que las sustancias transportadas son llevadas al endosoma tardío en los cuales se fusionarán los lisosomas. 2) Vía de la fagocitosis (ingestión celular). Ocurre en macrófagos y neutrófilos. Mecanismo de defensa inmune. Se forma originariamente un fagosoma que posteriormente se fusiona con un endosoma tardío o un lisosoma. Captación de partículas grandes (>0.5 μm de diámetro). En mamíferos lo realizan células del sistema inmunitario como macrófagos y neutrófilos. Ingieren microorganismos, detritus, células dañadas y cuerpos apoptóticos. Se crea un fagosoma que empieza a destruir la partícula ingerida mediante radiales libres de oxígeno. Después se fusiona un lisosoma proveniente del aparato de Golgi formándose un fagolisosoma. Al final se crea un cuerpo residual que es eliminado por exocitosis o se quedan en el citoplasma (envejecimiento). 24 3) Vía de la autofagia. Usada para reciclar y degradar partes obsoletas de las células. La autofagia consiste básicamente en un proceso de autodigestión mediante el cual las células fagocitan sus propias estructuras. Esto beneficia en diversos aspectos a las células. En primer lugar es un mecanismo protector que implica un reciclaje dinámico de sus estructuras, gracias al cual tienen lugar la renovación y la homeostasis celular. Se eliminan así componentes celulares alterados, hipertrofiados o invadidos por agentes infecciosos. Además supone un mecanismo de supervivencia celular en situaciones de inanición o estrés. Existe la Autofagia mediada por chaperonas. Las membranas del retículo forman un autofagosoma el cual se fusiona posteriormente a un endosoma tardío o a un lisosoma. El papel del lisosoma en el recambio de orgánulos. Un orgánulo (mitocondria) se rodea por una cisterna del RE, posteriormente se fusiona un lisosoma, produciendo un autofagolisosoma. En hepatocitos este proceso se produce una vez cada 10 minutos. En ausencia de alimento, aumentan los eventos de autofagia. Como residuo a la autofagia quedan unos cuerpos llamados gránulos de lipofuscina. Se acumulan durante el envejecimiento (neuronas). La digestión intracelular de sustratos mediada por lisosomas puede ser de dos tipos: a)heterofagia, cuando los sustratos que se digieren provienen del exterior celular mediante endocitosis/fagocitosis. b)autofagia, cuando las células digieren sus propios componentes celulares. Macroautofagia: en este tipo de autofagia a gran escala, una membrana (probablemente derivada del RE) engloba una porción de citoplasma, que incluye material soluble y orgánulos. El elemento membranoso formado (autofagosoma) se fusiona con un lisosoma, formándose un autolisosoma en el que se llevará a cabo la digestión. Microautofagia: en este caso, pequeñas porciones de citoplasma son captadas por invaginaciones de la membrana del lisosoma, donde tiene lugar la digestión de las sustancias. 25 1.4 Patologías relacionadas con los lisosomas: Enfermedades causadas por acumulación o almacenamiento. Son enfermedades hereditarias, de baja incidencia, en las que faltan una o más enzimas lisosómicas para la degradación de macromoléculas, con la consiguiente acumulación progresiva del sustrato correspondiente. Las manifestaciones clínicas de estas enfermedades dependen de la enzima afectada; normalmente dan lugar a cuadros neurodegenerativos, organomegalia, y anomalías cutáneas, oculares y óseas. Existe un gran número de enfermedades de este tipo. 2. PEROXISOMAS (Mini cuerpos): Se parecen a los lisosomas pero no lo son ya que no están formados por el Complejo de Golgi. Son vesículas simples limitadas por membranas (0.1 a 1 μm). Presentan un centro denso y cristalino, con enzimas oxidativas, que se autoreplican al igual que las mitocondrias y contienen más de 50 enzimas. 2.1 Funciones: -Oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga (24 a 26 carbonos). -Síntesis de plasmalógenos (fosfolípidos en los que los ácidos grasos están unidos al glicerol por un enlace éter en lugar de éster). Los plasmalógenos son abundantes en la vaina de mielina). Disfunción neurológica. -Metabolismo oxidativo (alanina aminotransferasa) -Oxidación de urato, glucolato y aminoácidos=Síntesis y degradación de H2O2. 3. MITOCONDRIAS: Las mitocondrias son de forma generalmente oval que miden 2 μm de longitud y 0,5 μm de diámetro aprox. el tamaño de una bacteria). Juegan un papel esencial en el metabolismo oxidativo y la generación de energía (ATP), la señalización celular, la diferenciación y apoptosis, y el control del crecimiento de la célula. Está delimitada por una doble membrana: una membrana externa y una membrana interna muy amplia que presenta unas invaginaciones o plegamientos denominados crestas. La membrana externa contiene unas proteínas integrales denominadas porinas, las cuales forman canales que permiten la libre difusión de moléculas (de 10 kDa, casi cualquier), por lo que la composición del medio que ocupa el espacio entre las dos membranas (espacio intermembrana) es muy similar a la del citoplasma. Las proteínas de mayor tamaño pueden entrar también en las mitocondrias siempre que presenten una secuencia señal en su extremo N- terminal. Esta secuencia es reconocida por un complejo multiproteico denominado translocasa, que media el transporte activo de proteínas de gran tamaño al interior del orgánulo. 26 La membrana mitocondrial externa puede asociarse al retículo endoplasmático, permitiendo la transmisión de señales mediada por iones Ca 2+. La membrana interna presenta una alta relación proteína/fosfolípido (más de 3:1 en peso), y solo es permeable a O2 , CO2 y H2O. Esta membrana es rica en cardiolipina (también en las bacterias). Además de las proteínas de la cadena respiratoria, la membrana mitocondrial interna contiene transportadores y translocadores encargados de regular el paso de metabolitos (como el ATP, el ADP y el piruvato) e iones (como el Ca 2+ ). Las crestas incrementan la superficie de la membrana interna. El número de crestas varía con la actividad respiratoria de cada tipo particular de célula. Las mitocondrias de células que tienen mayor demanda de ATP, como las células del músculo cardíaco, contienen más crestas que las mitocondrias de los hepatocitos, células con una menor velocidad de respiración y más mitocondrias. El compartimento interno mitocondrial que queda delimitado por la membrana interna se denomina matriz. Contiene una sustancia tipo gel muy rica en proteína. 27 Entre éstas destacan las enzimas solubles del metabolismo oxidativo, como las del ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs o ciclo del TCA – Trycarboxylic acid-), salvo por la succinato deshidrogenasa, que esta unida a la membrana interna. También hay metabolitos (como el piruvato y el citrato), cofactores nucleotídicos: portadores de e- de alta energía, implicados en producción ATP mitocondrial: -NAD+ (Nicotinamida-Adenina Dinucleotico) → NADH -FAD+ (Flavina-Adenida Dinucleotido) → FADH2. La matriz mitocondrial contiene su propio material genético, así como la maquinaria para sintetizar sus propios ARN (ARNm, ARNt y ARNr) y proteínas. 3.1 Metabolismo Mitocondrial Aeróbico: Para la oxidación de la glucosa, los primeros pasos del proceso de oxidación se llevan a cabo por las enzimas de la glucólisis, que se encuentran en el citosol. Los productos de la glucólisis: 2 moléculas de piruvato, NADH y dos moléculas de ATP (por cada glucosa inicial) pueden metabolizarse en dos formas muy diferentes, dependiendo del tipo de célula en la que se forman y la presencia o ausencia de oxígeno. En presencia de O2, los organismos aeróbicos pueden extraer grandes cantidades de energía adicional del piruvato y el NADH producido durante la glucolisis en las mitocondrias (mas de 30 moléculas adicionales de ATP). Durante el ciclo del TCA, ocurren cuatro reacciones en las que un par de electrones se transfieren de un sustrato a una coenzima que acepta electrones. Tres de las reacciones reducen NAD+ a NADH y una reacción reduce FAD a FADH2 Los metabolitos del ciclo del TCA son los mismos compuestos generados por la mayoría de las vias catabólicas de la célula. El acetil-CoA, por ejemplo, es un producto final importante de una serie de vías catabólicas, incluyendo la β-oxidación de los ácidos grasos, que se degradan dentro de la matriz de la mitocondria hasta acetil CoA. El catabolismo de los aminoácidos también genera metabolitos del ciclo del TCA, que ingresan a la matriz por medio de sistemas de transporte especiales en la membrana mitocondrial interna. 28 Todas las macromoléculas que proporcionan energía a una célula (polisacáridos, grasas y proteínas) se descomponen en los metabolitos del ciclo de TCA. Por tanto, la mitocondria se convierte en el foco para los pasos de conservación de la energía final en el metabolismo independientemente de la naturaleza del material de partida. 3.2 Cadena Transportadora de electrones: Paso 1. Los electrones de alta energía se transfieren a partir de FADH2 o NADH a la primera de una serie de transportadores de electrones (complejos respiratorios) que se encuentran en el interior de la membrana mitocondrial. Los electrones pasan a lo largo de la cadena transportadora de electrones en reacciones que liberan energía. Los transportadores de electrones transportan los protones hacia el espacio intermembrana a través de la membrana mitocondrial interna. Como resultado, la energía liberada durante el transporte de electrones se almacena en la forma de un gradiente electroquímico de protones. Finalmente, los electrones de baja energía se transfieren al oxígeno molecular (O2), que se reduce a agua. Paso 2. El transporte controlado de protones a través de la membrana hacia la matriz mediante una enzima ATP sintasa, provee la energía requerida para fosforilar ADP a ATP (de aquí el término fosforilación oxidativa) *Cada par de electrones transferidos de NADH al oxígeno por medio de la cadena transportadora de electrones libera suficiente energía para impulsar la formación de alrededor de tres moléculas de ATP. *Cada par donado por el FADH2 libera energía suficiente para la formación de casi dos moléculas de ATP. 29 3.3 ADN Mitocondrial: El ADNmt humano es una molécula bicatenaria y circular cerrada (PLÁSMIDO). Una mitocondria posee de 2 a 10 copias de ADN, de tal forma que una célula puede contener entre 1.000 y 10.000 copias de ADNmt, dependiendo del tejido o de las condiciones fisiológicas (poliplasmia). A diferencia del ADN nuclear, el ADNmt no se encuentra asociado a histonas, lo que unido a su proximidad a los centros de producción de radicales libres de oxígeno explica su alta tasa de mutación, 10 veces superior a la del ADN nuclear. En una misma célula pueden coexistir mitocondrias con el ADN normal junto a mitocondrias con el ADN mutado (heteroplasmia). El ADNmt codifica 37 genes: 13 correspondientes a subunidades de los complejos respiratorios I, III, IV y V; 22 correspondientes a ARNt y 2 a ARNr (12S y 16S). No todas las proteínas necesarias para la función y la biosíntesis mitocondrial son codificadas por el ADNmt; por ejemplo, la mayoría de las subunidades de los complejos respiratorios son codificados por el genoma nuclear y posteriormente importados a la mitocondria. La organización genética del ADNmt es muy compacta. En humanos carece de intrones y ambas cadenas están casi completamente ocupadas por genes; contiene muy poco ADN repetitivo y no hay ninguna región 5’ y 3’ que no se traduzca (UTR), similar a la organización en bacterias. El código genético mitocondrial es más flexible que el nuclear. Los ARNt reconocen tripletes con cualquiera de los tres nucleótidos en la tercera posición del codón. Entonces, la síntesis de proteínas mitocondriales solo requiere 22 moléculas de ARNt. Además, el código mitocondrial presenta excepciones a la universalidad del código genético, y hay cuatro codones o tripletes que codifican para aminoácidos diferentes en el núcleo y en la mitocondria. Otra particularidad y similitud con los procariotas es que la síntesis proteica en los ribosomas mitocondriales se inicia con N- formil-metionina. Estos ribosomas, al igual que los bacterianos, son sensibles a antibióticos como el cloranfenicol y la estreptomicina, lo cual representa la principal causa de toxicidad de estos antibióticos. Las mitocondrias se replican por fisión binaria, de manera similar a como lo hacen las bacterias, pero a diferencia de estas, las mitocondrias también pueden experimentar procesos de fusión (formando una macromitocondría) con otras mitocondrias. 30 La regulación de esta división no es igual en todas las células eucariotas. En eucariotas superiores la replicación de las mitocondrias está asociada principalmente a la demanda energética. Cuando la demanda energética disminuye, las mitocondrias pueden ser destruidas o permanecer inactivas. El ADNmt no se replica de manera ordenada y regulada como el ADN nuclear, sino que tiene la capacidad de replicarse durante todo el ciclo celular sin coordinarse con la replicación del material genético del núcleo. La replicación del ADNmt la realiza una ADN polimerasa específica denominada ADN polimerasa γ. Durante la división celular las mitocondrias sufren una segregación mitótica y se distribuyen al azar entre las células hijas. De esta forma, una célula con heteroplasmia puede dar lugar a células con fenotipos diferentes. Al estar contenidos en un orgánulo citoplasmático, los genes mitocondriales no se heredan de la misma manera que los genes nucleares, sino que lo hacen exclusivamente por vía materna. Tanto el espermatozoide como el óvulo poseen mitocondrias; sin embargo, el contenido de ADNmt del óvulo es muy superior al del espermatozoide. Además, tras la fertilización, las mitocondrias paternas que penetran en el óvulo son eliminadas. El ADNmt codifica para 13 proteínas, por lo que el resto son codificadas por el genoma nuclear, sintetizándose en los ribosomas citosólicos, y se importan a la mitocondria. Hay mecanismos específicos que coordinan el transporte y la acumulación de proteínas desde el citosol. Estos mecanismos deben ser capaces también de mediar el transporte de las proteínas a diferentes compartimentos dentro de la propia mitocondria: la membrana externa, el espacio intermembrana, la membrana interna y la matriz mitocondrial. Las proteínas que se transportan a las mitocondrias poseen unas secuencias señal reconocidas por receptores de la superficie y su transporte por la translocasa de la membrana externa (TOM) o por una de las dos translocasas de la membrana interna (TIM 23 o 22). La secuencia señal está en el extremo N- terminal. Por otra parte, aproximadamente el 30% de las proteínas dirigidas a la mitocondria no presentan estos motivos estructurales y la información que permite su localización mitocondrial está contenida en su secuencia interna. Las señales de localización mitocondrial de estas proteínas son de naturaleza más heterogénea y aún no se han caracterizado completamente. Todas las proteínas que son dirigidas a la mitocondria son capaces de interaccionar con el complejo TOM. Este complejo reconoce a las proteínas en el citoplasma, facilita su disociación de 31 factores citosólicos a los que puedan estar unidas, contribuye a su desplegamiento y transfiere los polipéptidos a través de poros en la membrana, mediando también la inserción en la misma de aquellas proteínas cuyo destino es la membrana mitocondrial externa. *El TOM, de carácter catalítico, en cuanto a la descomposición de las proteínas. El complejo TIM23: responsable del transporte de todas las proteínas de la matriz mitocondrial y de aquellas que residen en la membrana interna de la mitocondria. Este complejo requiere energía: el potencial de la membrana y el ATP. Los componentes del complejo TIM23 pueden dividirse en dos grupos que operan de manera secuencial y cooperativa. Por una parte, se identifican las subunidades que se encuentran embebidas en la membrana que actúan como receptores y componentes estructurales del canal. Estas subunidades, además de ser responsables de reconocer las señales de importación, intervienen en los pasos iniciales del transporte a través de la membrana interna, empleando para ello energía derivada del potencial de membrana. El segundo grupo de componentes del complejo lleva a cabo la translocación a la matriz mitocondrial en un proceso dependiente de ATP. Por otra parte, dado que las proteínas son transportadas a la mitocondria en una conformación desplegada, necesitan recuperar su estructura nativa para realizar su función. Esto se consigue mediante la acción de una serie de chaperonas mitocondriales de las familias Hsp70 y Hsp60/Hsp10. 32 La mitocondria libera proteínas hacia el citoplasma en el caso de la muerte celular programada (Apoptosis). La activación de la denominada vía intrínseca de la apoptosis resulta en la permeabilización de la membrana mitocondrial externa y la liberación de proteínas proapoptóticas, tales como el citocromo c (que participa en la formación del apoptosoma), Smac/Diablo, el factor inductor de apoptosis (AIF) o la endonucleasa G. Estas proteínas, en último término, activan las caspasas efectoras (p. ej., caspasa 3), las cuales provocan la fragmentación de numerosos sustratos e inducen una secuencia de cambios morfológicos en la célula que van desde la fragmentación del ADN y la condensación nuclear, hasta la exposición de la fosfatidilserina y de moléculas de adhesión en la superficie celular. Todo ello tiene como consecuencia la muerte celular por apoptosis. 3.4 Enfermedades: Son las producidas por la disfunción mitocondrial, la capacidad respiratoria y de síntesis de ATP. Causadas por mutaciones en el ADNmt, adquiridas o heredadas, o en genes nucleares que codifican componentes de la mitocondria. El ADNmt muta con más facilidad que el ADN genómico y el ADNmt es heredado de la madre. Las moléculas de ADNmt mutadas coexisten con ADNmt normal (heteroplasmia). Entonces, la manifestación clínica dependerá del porcentaje de ADNmt defectuoso presente en la célula. Las enfermedades mitocondriales se manifiestan cuando la alteración asociada a la presencia de ADNmt mutado no se compensa por las moléculas de ADNmt normal presentes en la célula. Las enfermedades mitocondriales son más severas cuando las mitocondrias defectuosas se acumulan en las células del sistema nervioso central, el músculo, el corazón, los islotes pancreáticos, el hígado o los riñones; es decir, aquellos tejidos que emplean más energía que otros. La gravedad de la afectación se ve condicionada por el tipo de mutación y el grado de heteroplasmia. 33 Las enfermedades mitocondriales se producen en su mayoría por mutaciones puntuales en el ADNmt que son heredadas por vía materna: -Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON), caracterizada por la pérdida de visión, siendo la primera enfermedad que fue asociada a una mutación en el ADNmt heredada por vía materna. -Epilepsia mioclónica con fibras rojas rotas (MERRF). La presencia ARNt Lys mutado produce defectos en la síntesis de proteínas mitocondriales produciendo un déficit de la actividad de los complejos respiratorios. La MERRF se caracteriza por convulsiones y degeneración del tejido muscular. Los pacientes pueden presentar demencia, sordera, neuropatía y miocardiopatía. -Encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica (MELAS) se asocia a mutaciones en genes que codifican ARNt y se caracteriza por la aparición de accidentes cerebrovasculares, demencia y convulsiones. También se han descrito enfermedades mitocondriales de herencia mendeliana, en mutaciones del ADN nuclear. Estas mutaciones son en genes nucleares que codifican las subunidades de los complejos respiratorios, afectando a su función o a su entrada en la mitocondria. En estos casos se produciría un déficit en la respiración mitocondrial sin alteración del ADNmt. 34 TEMA 6: Ciclo Celular Teoría celular (1858): Virchow propuso que las células surgen de otras preexistentes mediante un proceso de división por el que una célula progenitora da lugar a dos células hijas. “omnis cellula e cellula” 1. La fase G 1 Es un período posmitótico que precede a la replicación del ADN. En una célula en cultivo, su duración es de aproximadamente 11 h. A su vez, se puede distinguir en G 1 un subestadio inicial o de entrada en G 1 (G 1 a), uno medio o de progresión (G 1 b) y uno terminal o de transición (G 1 c). En G 1 la célula crece a un ritmo continuo. El aumento de tamaño responde al desarrollo de los distintos orgánulos y requiere un metabolismo anabólico activo, caracterizado por la síntesis de ARN (transcripción), proteínas (traducción), lípidos de membrana, etc. El nucléolo es visible y su presencia se relaciona con la síntesis y maduración de las subunidades de los ribosomas. La célula en fase G 1 posee una gran actividad y no muestra indicios de división, por lo que es capaz de contribuir a la homeostasis del tejido en el que se encuentra, desempeñando su papel fisiológico 2. La fase S En este período la célula duplica su ADN en un proceso denominado replicación. Se sintetizan las histonas, encargadas del empaquetamiento del ADN. Además, los centríolos del centrosoma se separan y dividen, generando cuatro centríolos (dos por centrosoma). Las parejas de centrosomas se encargarán de organizar el huso mitótico en la profase de la mitosis. El primer paso de la síntesis de ADN consiste en la desnaturalización de la doble hélice, de modo que la maquinaria replicativa pueda acceder a la secuencia de bases. Se desnaturaliza en múltiples puntos específicos denominados orígenes de replicación. Al final de la fase G 1 (G 1 c), los factores Orc1-6 y las proteínas Cdc6 y Cdt1 se unen a los orígenes de replicación y permiten el acoplamiento de las enzimas responsables de la desnaturalización del ADN. Estas proteínas de actividad ADN helicasa se denominan Mcm. A partir del origen de replicación, el complejo Mcm abre a su paso la doble hélice, separando las dos y da lugar a una formación en Y denominada horquilla de replicación. Cada molécula de ADN se duplica solo una vez por cada ciclo, pues al inicio de la fase S el complejo se desensambla hasta la fase G 1 c. 3. Fase G2 (gap 2). En una célula humana en cultivo, su duración es de aproximadamente 4 h. En este tiempo, la célula culmina su crecimiento y sintetiza los factores necesarios para iniciar la mitosis. Los cromosomas son visibles al microscopio óptico como largas hebras emparejadas que, de forma progresiva, se acortan y engrosan, aumentando su definición. Los denominados factores de condensación de la cromatina son las proteínas encargadas de transformar la hilera de nucleosomas en estas estructuras; entre ellos, cabe destacar las condensinas. El tamaño del nucléolo en esta fase es máximo y los centríolos, que comenzaron a replicarse en la fase S, se encuentran completamente duplicados. 35 4. División celular (fase M). La fase M es esa etapa dinámica del ciclo celular durante la cual la célula progenitora se divide para dar lugar a dos células hijas idénticas. En una célula humana en cultivo, se prolonga tan solo 1 h, cerca de un 5% de la duración total del ciclo. Profase: aparición de los cromosomas ( material cromosómico se condensa. Formados por dos cromátidas unidas por un centrómero) y desorganización de la envoltura nuclear. Paralelamente, los centrosomas (que se duplicaron en la fase S del ciclo celular) se separan y migran a polos celulares opuestos, y comienza el ensamblaje del huso mitótico. Prometafase: desmembramiento completo de la envoltura del núcleo y la entrada de las fibras del huso mitótico en el territorio nuclear, donde interaccionan con los cromosomas. Los microtúbulos se unen a los cinetocoros de los cromosomas. Metafase: los cromosomas se disponen en el plano ecuatorial de la célula, alineados a lo largo de la placa metafásica. El grado de empaquetamiento de la cromatina es máximo. Anafase: separación de las cromátidas hermanas (que pasan a ser consideradas cromosomas hijos) y su distribución equitativa entre los dos polos del huso mitótico. Telofase: como una profase invertida, los cromosomas hijos (CITOCINESIS) son recubiertos por una nueva envoltura nuclear y se desespiralizan para retornar a su estado interfásico. Formación de Golgi i ER. 36 6. Control del ciclo celular. 6.1 Los tejidos lábiles: Poseen células que se dividen de manera constante y rápida, como es el caso de la médula ósea, las mucosas y la piel. Estos tejidos están dotados de una enorme capacidad de regeneración, pero son muy sensibles al efecto de la radiación ionizante y son altamente susceptibles de desarrollar neoplasias. 6.2 Las células de los tejidos estables: Se encuentran en un estado de reposo o quiescente y solo se dividen cuando reciben un estímulo apropiado de crecimiento, por ejemplo, ante una lesión tisular. Son células que se encuentran en una especie de estado G 1 permanente pero reversible conocido como G 0. Este es el caso de las células hepáticas, que proliferan tras la resección de parte del hígado para mantener una función hepática correcta. Esto se traduce clínicamente en la posibilidad de realizar hepatectomías parciales y trasplantes hepáticos de donante vivo. 6.3 Los tejidos permanentes: Están compuestos por tipos celulares altamente especializados, que no se dividen nunca. Los dos ejemplos más claros son las células del músculo estriado y las neuronas, que se encuentran en un estado G 0 irreversible. Estos tejidos presentan una capacidad de regeneración escasa o nula y la muerte de sus células conlleva su sustitución por una cicatriz fibrosa y una pérdida irreversible de la función. No obstante tiene la capacidad de división y regeneración tisular in vitro. El motivo por el que estas células madre no son capaces de activar la replicación en situaciones patológicas es actualmente objeto de una intensa investigación. 37 7.Puntos de control. -Punto de control G 1: Se corresponde con la transición de la fase final del período G 1 (G 1 c) a la fase S. La duplicación del material genético de la célula exige que se evalúen: a) el estado del ADN (para detectar posibles lesiones). b) el tamaño celular. c) las condiciones del medio ambiente. Las células que rebasan el punto G 1 quedan «comprometidas» a completar el ciclo. De esto deriva que el punto G 1 sea considerado el inicio del ciclo. En cambio, si las células no sobrepasan este punto de control, se detendrán en la fase G 1 de forma transitoria o permanente (G 0 ). -Punto de control G 2 o G 2/M: Se localiza en la transición entre la fase G 2 y la fase M. El empaquetamiento de la cromatina y el inicio de la mitosis implica que en esta fase se evalúan: a) si la replicación del ADN es completa y las dos copias fidedignas. b) el tamaño celular. c) las condiciones del medio extracelular. -Punto de control M: Se corresponde con la transición de la metafase a la anafase. Comprobación que los cromosomas se encuentran correctamente unidos al huso mitótico. Por ese motivo, el punto M es conocido también como el punto de control del ensamblaje del huso. 8. Sistema de quinasas de activación cíclica CDK El control de la proliferación celular depende de una familia de proteínas conocidas como quinasas dependientes de ciclinas Cdk. Se expresan de forma constitutiva a unas concentraciones relativamente estables. Presentan dos dominios entre los cuales se encuentra su centro catalítico: -El primer dominio: con el que interaccionan y fosforilan a sus sustratos que son proteínas intracelulares que intervienen, de forma directa o indirecta, en las rutas responsables del crecimiento celular, la replicación del ADN y la división celular. -El segundo dominio es el de unión a la ciclina, que permite la activación de la Cdk y la dirige contra proteínas dianas específicas. La propiedad característica de estas enzimas es que, se activan e inactivan de forma cíclica. Esto ocurre porque las ciclinas, principal factor que regula su actividad, experimenta cambios cíclicos en su concentración intracelular durante el ciclo celular, experimentando ascensos y descensos en picos y valles. *Las ciclinas activan los Cdk cuando suben y la desactivan cuando bajan. La unión de las ciclinas a las Cdk da lugar a un cambio conformacional que conduce a la exposición del centro activo de las quinasas e incrementa su actividad catalítica en varios órdenes de magnitud. En ausencia de ciclinas, las Cdk son prácticamente inactivas. 38 Los complejos Cdk-ciclina pueden ser englobados en cuatro grupos: Complejos Cdk-ciclina G 1 /S. El principal representante de este grupo es la asociación Cdk2-ciclina E, que promueve la progresión de la fase G 1 a la fase S. Al final de G 1, la ciclina E alcanza sus máximos niveles intracelulares y estos se mantienen estables (en meseta) hasta el comienzo de la fase S, momento en el que regresan a sus niveles basales. Complejos Cdk-ciclina G 1. Los principales complejos de este grupo son Cdk4/6-ciclina D (D1, D2 o D3). Estos heterodímeros están presentes en la mayoría de las células eucariotas y asisten a los complejos Cdk-ciclina G 1 /S en la transición de la fase G 1 a la fase S. Complejos Cdk-ciclina S. Pertenecen a este grupo los complejos Cdk1/2-ciclina A. Al igual que los anteriores, estos heterodímeros se reconstituyen en la transición entre las fases G1 y S del ciclo celular. Estimulan la replicación del ADN, pero también parecen intervenir en etapas posteriores, asistiendo a los complejos Cdk-ciclina M en el inicio de la mitosis. Complejos Cdk-ciclina M. El principal representante de este grupo es el complejo Cdk1-ciclina B, que promueve el inicio de la mitosis. 39 8.1 Mecanismos de regulación de CDKs: 1-CICLINAS El principal factor son ciclinas y pertenecen a una familia muy heterogénea (de 36 a 87 kDa), pero poseen una serie de características comunes. La estructura primaria de las ciclinas contiene el dominio denominado «caja de la ciclina», una región relativamente conservada de unos 150 aminoácidos responsable de la unión y activación de las Cdk. En primer lugar, actúan como moduladores alostéricos de las Cdk: inducen un cambio conformacional que resulta en la exposición del centro catalítico de la quinasa. Parece ser que las ciclinas, no solo activan, sino que también dirigen a las Cdks hacia sus proteínas dianas específicas. Esto implica que cada complejo Cdk-Ciclina fosforila a un grupo distinto de proteínas sustrato. La concentración intracelular de las ciclinas varía de forma cíclica debido a la alternancia de síntesis y degradación durante el ciclo celular. La síntesis se desencadena por señales extra- e intracelulares. El aumento en los niveles de las ciclinas permiten la activación de los complejos Cdk-ciclina específicos que dirigen la progresión del ciclo celular a través de los puntos de control de inicio (G 1) y G 2/M. Sin embargo, la progresión a través del último punto de control (M) desde la metafase a la anafase se desencadena por la degradación proteica de las ciclinas, llevando a las etapas finales de la división celular. 2-La degradación de las ciclinas corre a cargo del proteasoma. Las proteínas que van a ser degradas por el proteasoma son ubiquitinadas. Para ello, las ciclinas presentan en su extremo Nterminal otra región conservada denominada «caja de destrucción». Esta secuencia de nueve aminoácidos es reconocida por la proteína reconocedora de la caja de destrucción (DBRP), que va a permitir la ubiquitinación de la ciclina. Entre las ubiquitinas ligasas implicadas en el control del ciclo celular cabe destacar el complejo promotor de la anafase o ciclosoma (APC/C). Su actividad depende se su asociación con las subunidades activadores Cdc20 o Cdh1, que se expresan en la fase M y permiten el reconocimiento de las ciclinas diana. APC promueve la separación de las cromátidas hermanas en anafase, pero también ubiquitina a las ciclinas S y M (esencial para que finalice la mitosis) para su degradación. Las enzimas ubiquitina ligasas marcan para su degradación a las ciclinas. Sin embargo, esta interacción depende de que la proteína acopladora DBRP sea activada por fosforilación (los responsables de este proceso son los propios complejos Cdk-ciclina). Se trata, por lo tanto, de un sistema de retroalimentación negativa, en el que los propios dímeros Cdk-ciclina limitan su actividad y sus efectos porque el aumento de la concentración intracelular de los complejos Cdk-ciclina resulta en la activación de la DBRP y la subsiguiente poliubiquitinación y degradación de las ciclinas en el proteasoma. Al cesar su fosforilación, la DBRP es desfosforilada (e inactivada) por fosfatasas celulares. 40 3. Fosforilación de las Cdk. La regulación de las Cdk por fosforilación puede ser activadora e inhibidora. Si bien la unión de la ciclina a las Cdk incrementa su actividad varios órdenes de magnitud, su activación no es completa hasta que la quinasa activadora de la Cdk o CAK (Cdk-activating kinase) fosforila un residuo de treonina próximo a la entrada del centro activo de la Cdk. Esta fosforilación activadora ocurre en el residuo treonina 161 después de la unión a la ciclina y genera un cambio conformacional adicional que expone aún más su sitio activo y aumenta su eficacia catalítica. La enzima CAK es uno de los ejemplos más claros de la diversidad funcional de los complejos Cdk-ciclina, ya que la CAK está constituida en si misma por la combinación Cdk7-ciclina H y, además de fosforilar y activar al resto de las Cdk, también participa en la transcripción y reparación del ADN. Por el contrario, la fosforilación de residuos de treonina-14 y tirosina-15 localizados en el bolsillo de unión al ATP inhibe a las Cdk. Las cargas negativas de los grupos fosfato impiden la unión del ATP. Esto implica que aunque el complejo Cdkciclina haya sido activado por la CAK, esta fosforilación inactivadora prevalece e inactiva el complejo. Las quinasas de la familia Wee1 (Wee1, Mik1, Myt1) fosforilan los residuos treonina 14 y tirosina 15 de Cdk1, inhibiendo así su función. En cambio, la fosfatasa Cdc25 (cell division cycle 25) posee un papel opuesto a Wee1, al desfosforilar estos residuos y reactivar Cdk1. La duración de la fase G 2 depende en gran medida de la actividad de Wee1. Las células mutantes en Wee1 no pueden mantener la Cdk en un estado inactivo, y se dividen de forma prematura produciendo células más pequeñas, de ahí el nombre “wee” (pequeñitas). En las células normales, Wee1 mantiene inactiva a Cdk-Ciclina M hasta el final de G 2. Al final del G 2, el fosfato inhibidor en Tyr 15 es eliminado por Cdc25. La eliminación de este fosfato, lleva a la activación de los complejos Cdk-ciclina (pTyr 161), lo que le permite fosforilar los sustratos clave y conducir la célula a la mitosis (punto de control G 2/M). Estas vías pueden impedir que la célula ingrese a la mitosis en condiciones que puedan conducir a una división celular anormal. 41 4. Proteínas inhibidoras de las Cdk: El último mecanismo regulador de las Cdk es la interacción con proteínas inhibidoras de Cdk (CKI, del inglés Cdk-inhibitor proteins). Estas proteínas de bajo peso molecular se agrupan en dos grandes familias: la familia Ink4 y la familia Cip/Kip. Familia Ink4 (inhibitor of cyclin-dependent kinase 4) impiden la constitución de complejos Cdk-ciclina G 1 : se unen de forma específica a la Cdk4 y la Cdk6 y bloquean su interacción con las ciclinas D (D1, D2, D3). Algunos miembros de esta familia son los productos p15 Ink4b (o Cdkn2b), p16 Ink4a (o Cdkn2a), p18 Ink4c (o Cdkn2c) y p19 Ink4d (o Cdkn2d). Familia Cip/Kip (Cdk inhibitor/kinase inhibitor proteins). Inhiben los complejos Cdk-ciclina G 1 /S, S y M: se unen de forma específica a los dímeros Cdk-ciclina y los inactivan. Además, interfieren con la actividad de CAK, de forma que las Cdk no pueden ser completamente activadas. Algunos miembros de esta familia son las proteínas p21 Cip1 (o Cdkn1a), p27 Kip1 (o Cdkn1b) y p57 Kip2 (o Cdkn1c). 5. La degradación de las CKI corre a cargo del proteasoma. Existen varios tipos de ubiquitina ligasas implicadas en el control del ciclo celular. A parte del complejo APC, también cabe destacar la ubiquitina ligasa de subunidades S, C y F (SCF), en referencia a las 3 subunidades que lo forman (subunidades S, C y F). La actividad del SCF depende de las subunidades denominadas “proteínas con caja F”, que participan en el reconocimiento de sus proteínas diana. A diferencia del complejo APC, la actividad del SCF es constante durante el ciclo celular y la ubiquitinación mediada por SCF es dependiente del estado de fosforilación de las proteínas CKI dianas, que es reconocido por estas subunidades con caja F. Este encima SCF ubiquitiniza ciertas proteínas CKI al final de G 1 (punto de control G1) y facilita en gran medida la activación de los complejos Cdk-ciclina S y la replicación del DNA durante la fase S. 42 43 TEMA 7: Síntesis de proteínas, Chaperonas y Sistema UBI-Proteosoma 1. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: Considerado uno de los procesos biosintéticos más complejos en el que intervienen más de 300 moléculas distintas: enzimas ACTIVADORES y AUXILIARES, FACTORES PROTEICOS, distintos tipos de ÁCIDOS NUCLEICOS…. Crick hipótesis de secuencia y adaptadores: -La secuencia de bases en una cadena de DNA codifica la secuencia de aminoácidos en una proteína. -Una molécula adaptadora nucleotídica puede alinearse con un molde mediante apareamiento de bases Las proteínas son un conjunto secuencial de aminoácidos que forman una cadena polipeptídica y se organizan tridimensionalmente en el espacio. Todas las proteínas están construidas a partir del mismo conjunto de 20 aminoácidos. Las células pueden producir proteínas con propiedades y actividades diferentes uniendo los mismos 20 aminoácidos y dando lugar así a todos los tipos de proteínas de la célula (enzimas, hormonas, anticuerpos, proteínas estructurales del citoesqueleto, etc.) 44 La expresión génica es el proceso celular que transforma la información codificada por los ácidos nucleicos en las proteínas. Maduración del ARNm: Adición caperuza 5’ (nucleótido de guanina modificado), Cola Poli-A en extremo 3’ y eliminación de intrones con ensamblaje de exones. Exceptuando a los genes constitutivos, (genes que se expresan en todas las células del organismo y codifican proteínas que son esenciales para su funcionamiento general) todos los demás genes se expresan o no dependiendo de la función de la célula en un tejido particular. Por ejemplo, genes que codifican proteínas responsables del transporte axonal se expresan en neuronas pero no en linfocitos, donde se expresan genes responsables de la respuesta inmune. También existe especificidad temporal, esto quiere decir que los diferentes genes en una célula se encienden o se apagan en diferentes momentos de la vida de un organismo. Para “construir” la cadena de aminoácidos se necesitan principalmente tres elementos: el ARN mensajero (ARNm), los ribosomas y distintos ARN de transferencia (ARNt) que transportan cada uno de los aminoácidos. Los ribosomas se unen a un ARNm para «leer» su información genética e incorporar secuencialmente ARNt cargados con un aminoácido específico. Normalmente, varios ribosomas «leen» de modo secuencial cada ARNm, lo cual resulta en un proceso eficaz de traducción. Un conjunto de ribosomas en proceso de traducción de un mismo ARNm, se conoce como polirribosomas o polisomas. Para la traducción de las proteínas los ribosomas recorren el ARNm en sentido 5’→ 3’. Por cada tres nucleótidos que recorre el ribosoma (denominados codones) se incorpora un aminoácido al polipéptido en formación. Una vez que ha terminado el proceso de síntesis, los ribosomas se separan del ARNm y la proteína recién sintetizada queda libre. 1.1 ARN de Transferencia: En general, todos los ARNt maduros proceden de precursores más largos por acción de diversas nucleasas. En el procesamiento del ARNt participan algunas ribozimas, como la ARNasa P que elimina secuencias de ARN del extremo 5’. También se pueden dar eliminaciones de intrones por acción de determinadas endonucleasas. Además, se añade el trinucleótido CCA en el extremo 3’. Esta estructura es esencial (común en todos los ARNt) para la traducción, ya que es el lugar de unión del aminoácido entrante. La adición de este trinucleótido es llevada a cabo por la ARNt nucleotidiltransferasa. 45 ARNt alanina: -76 ribonucleótidos -Extremo 5’ fosforilado -Extremo 3’ tiene un grupo hidroxilo libre (unión aa) -Anticodón en el centro de la molécula. Además de las cuatro bases, A, U, G y C, contiene ψ, pseudouridina; T, ribotimidina; mI, metil inosina; I, inosina; D, dihidrouridina; y meG, metilguanosina. (Característicos del ARN de transferencia). Secuencia de ribonucleótidos con función de proteína. Probablemente el ARN, ancestro común más antiguo, que además de contener ADN, hacía funciones catalíticas. 1.2 Código genético: Relaciona ácidos nucleicos con aminoácidos que formarán las proteínas. Y es utilizado por todos los seres vivos. UNIVERSAL. (Aunque siempre hay algunas excepciones, p.e bacterias) 46 1.3 RIBOSOMAS: Los ribosomas son ribonucleoproteínas formadas por varios ARN ribosómicos (ARNr) y proteínas. Los ribosomas de células eucariotas poseen una velocidad de sedimentación de 80 S, y están formados por dos subunidades: a) La subunidad pequeña posee una velocidad de sedimentación de 40 S y contiene un único ARNr de 18 S y unas 30 proteínas b) La subunidad grande posee una velocidad de sedimentación de 60 S y contiene 3 ARNr (de 28 S, 5,8 S y 5 S) y alrededor de 45 proteínas. Los ribosomas mitocondriales son parecidos a los de los organismos procariotas no solo en cuanto a su estructura, sino también en lo referente a su sensibilidad a antibióticos y fármacos inhibidores de la traducción 1.4 Antibióticos que interfieren en la sintesi proteica en bacterias: 1.5 Traducción: El sitio A hace referencia al sitio de unión del aminoacil-ARNt que entra inicialmente en el ribosoma. El sitio P es el lugar que ocupa el aminoacil-ARNt una vez que éste se ha unido a la cadena polipeptídica en crecimiento (peptidil-ARNt). El sitio E corresponde al lugar de salida (exit) del ARNt que ya ha transferido el aa la cadena polipeptídica en formación y se dispone a abandonar el ribosoma. 47 Iniciación: La subunidad menor del ribosoma se une al ARNm. La traducción comienza por el codón AUG, que codifica para la metionina (Met). El ARNt iniciador (que lleva unido el aminoácido Met) se une a la subunidad menor del ribosoma en el sitio P, ayudado por el factor de iniciación eIF2 (eukayotic iniciation factor 2) unido a un GTP. Por su parte, la subunidad menor se asocia a los factores eIF1, eIF1A, eIF3 y eIF5. El ARNm también necesita unirse a varios factores: eIF4E, eIF4G (ambos asociados a la región 5’), eIF4A, eIF4B y PABP (poly A binding protein; proteína de unión a la cola poli-A). La unión de esta última proteína permite que la región 3’ del ARNm (que contiene la cola poli-A) se repliegue y quede junto a la región 5’. Tras la unión, el complejo de preiniciación formado por la subunidad menor del ribosoma y los factores de iniciación (eIFs), se desplaza por el ARNm hasta que el codón de iniciación AUG es localizado sobre el sitio P del ribosoma. Cuando el codón de iniciación es reconocido por el anticodón, el factor eIF5 provoca la hidrólisis del GTP presente en el factor eIF2. Entonces, los factores de iniciación se liberan y un nuevo factor denominado eIF5B-GTP (no mostrado en el dibujo), mediante la hidrólisis del GTP, permite el anclaje de la subunidad mayor, formando el ribosoma 80S. De esta manera, la maquinaria para la síntesis proteica queda preparada para la siguiente fase. Elongación: El segundo ARNt que entra en el ribosoma precisa de la ayuda de dos factores de elongación (eukaryotic elongation factors) (eEF1A unido a GTP y eEF1B) para colocarse en el sitio A del ribosoma. La correcta colocación de este aminoacil-ARNt en el sitio A produce un cambio de conformación que induce la hidrólisis del GTP del eEF1A, lo cual provoca la liberación de este factor (que ahora está unido a GDP). La energía liberada en la hidrólisis del GTP orienta el aminoácido unido al ARNt hacia el sitio P, donde se sitúa el primer aminoácido que se incorporó a la cadena (Met). La orientación de ambos aminoácidos en el ribosoma permite la formación del enlace peptídico mediante la actividad peptidil - transferasa que posee la subunidad mayor del ribosoma. La cadena dipeptídica formada por sus dos primeros aminoácidos queda anclada al ARNt colocado en el sitio A (fase 6). 48 Tras la formación del primer enlace peptídico, el ribosoma se desplaza en sentido 5’→ 3’ del ARNm, por lo que el ARNt que lleva los aminoácidos (Met y Phe) queda ahora situado en el sitio P y el ARNt que llevaba inicialmente Met se sitúa en el sitio de salida (E). De este modo, el siguiente codón disponible del ARNm queda localizado en el sitio A. Estos desplazamientos reciben el nombre de «translocación» y requieren energía, que es suministrada por la hidrólisis de un GTP unido al factor eEF2. Este factor se une al ribosoma una vez que ha tenido lugar la catálisis del enlace peptídico y, además de proporcionar la energía necesaria para la translocación, también contribuye a la misma por medio de cambios conformacionales inducidos en el ribosoma. Cuando ha finalizado la translocación, el factor eEF2 y el ARNt del sitio E se desprenden del ribosoma, dejando al ribosoma preparado para una nueva ronda de elongación. Terminación: Conforme avanza la elongación, quedan disponibles en el sitio A nuevos codones del ARNm y se añaden nuevos aminoácidos a la cadena polipeptídica en formación hasta que un codón de parada (UAA, UAG, UGA) alcanza el sitio A. Las secuencias de parada en eucariotas son reconocidas por un dominio específico del factor de terminación eRF3 (eukaryotic release factor 3), que forma un complejo con otro factor de terminación, eRF1. Una vez que este complejo proteico se une al ribosoma, se produce un cambio de conformación en dicho complejo que permite al factor eRF1 liberar la proteína recién sintetizada de su unión con el ARNt (fases 10 y 11). Posteriormente, la proteína recién formada y el factor de terminación se desprenden del ribosoma, terminando así la traducción. 49 *Muchos mRNA eucarióticos están sometidos a represión traduccional (permiten obtener grandes cantidades de proteínas de manera rápida, en genes muy largos): Los transcritos (pre-mRNA) en el núcleo eucariótico tienen que ser modificados y transportados hacia el citoplasma antes de su traducción a proteínas, lo que implica un