Microbiological Monitoring of Ambient Environments

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Monitoraggio microbiologico ambientale  Maria Luisa Savo Sardaro Metodi di campionamentoe monitoraggio degli ambienti...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Monitoraggio microbiologico ambientale  Maria Luisa Savo Sardaro Metodi di campionamentoe monitoraggio degli ambienti Monitoraggio Microbiologico Ambientale (MAM) La contaminazione microbica è dovuta principalmente a due fattori: la contaminazione diretta da parte di presidi non sterili e la contaminazione indiretta da parte di agenti microbici aerodispersi. La sorgente di contaminazione è rappresentata soprattutto dall’uomo e dai sistemi di ventilazione. Per garantire condizioni di sicurezza è quindi necessario effettuare controlli sistematici su aria e superfici di un ambiente a rischio. Sulla base di tali considerazioni si è andato sviluppando nel tempo il concetto di MAM (Monitoraggio Microbiologico Ambientale), un sistema che si prefigge di quantificare la carica microbica in un ambiente confinato. Monitoraggio microbiologico ambientale 2 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Il Monitoraggio Microbiologico Ambientale –MAM – è una metodica che si compone di due momenti: il controllo dell’aria il controllo delle superfici L’aria è il veicolo tramite il quale gli agenti microbici (legati a particelle inerti di almeno 10 mµ di diametro) si muovono nell’ambiente, raggiungono le superfici e vi si depositano. Il monitoraggio delle superfici è essenziale per conoscere il fall out microbico, cioè quella parte di bioaerosol e di microrganismi in esso presenti che si deposita sulle superfici costituendo un potenziale veicolo di infezione. Monitoraggio microbiologico ambientale 3 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Fattori che influenzano la sopravvivenza dei microrganismi nell’aria a) resistenza propria del microrganismo b) umidità relativa dell’aria c) temperatura dell’aria e luce solare d) composizione dell’aerosol e) modalità di campionamento dell’aerosol Monitoraggio microbiologico ambientale 4 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro ARIA L’aria può essere veicolo di contaminazione di semilavorati e del prodotto finito. Per questo motivo molte aree nelle aziende sono dotate di sistemi di filtrazione dell’aria a vari livelli di efficienza che minimizzano la presenza di microrganismi. E’ dunque necessario un controllo costante di tali aree per valutare l’efficacia dei sistemi di filtrazione. Occorre validare il sistema di filtrazione dell’aria e garantirne il buon funzionamento con il monitoraggio Monitoraggio microbiologico ambientale 5 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro ARIA Validazione: Consiste nell’effettuare per 3 mesi consecutivi in zone critiche prefissate, campionamenti d’aria settimanale per ottenere un dato statisticamente significativo che rispetti i limiti previsti dalle Norme di Buona Fabbricazione. Il monitoraggio ambientale prevede controlli mensili Monitoraggio microbiologico ambientale 6 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro PARAMETRI MICROBIOLOGICI Carica Batterica Totale a 36°C (batterii mesofili) temperatura ottimale di sviluppo fra 25 e 40 °C batteri patogeni convenzionali o opportunusti e tutti i batteri che costituiscono la flora normale dell’uomo. Carica Batterica Totale a 20°C (batterii psicrofili) temperatura di 15 – 30 °C tutti i microrganismi saprofiti che sono in grado di compiere il proprio ciclo vitale a spese di sostanze organiche in decomposizione, per cui sono in grado di colonizzare il suolo e gli ambienti umidi. Carica muffe e lieviti totale La determinazione di questo parametro è necessaria poiché la loro presenza è spesso correlata alla presenza di polvere e può essere considerevole in presenza di elevata umidità Staphylococcus spp.: sono cocchi Gram positivi e sono numericamente i più rappresentati nella popolazione microbica normale della cute e dell’orofaringe dell’uomo. Monitoraggio microbiologico ambientale 7 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro I batteri più comuni degli ambienti confinati sono: Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus, Methylobac terium, Flavobacterium. Tali germi fanno parte della normale flora microbica degli ambienti confinati e la loro presenza in generale non deve creare allarmismo. Dei batteri riscontrati maggiormente, Staphylococcus spp. è un indicatore di buone pratiche di pulizia e potenziale patogeno. Monitoraggio microbiologico ambientale 8 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro I controlli ambientali: le superfici Le superfici degli impianti destinati alla produzione ed al confezionamento dei prodotti devono essere mantenute in perfette condizioni igieniche al fine di evitare lo sviluppo di microrganismi che potrebbero determinare una contaminazione dei semilavorati e dei prodotti finiti. Il campionamento si effettua con la: Tecnica Swab: effettuato il lavaggio delle attrezzature con l’impiego del detergente del sanitizzante idoneo, si sfrega un tampone su una superficie ben definita da campionare. Tecnica delle membrane di nitrocellulosa (per 30’’ e incubati alle T° idonee e su diversi terreni di coltura) INDICI DAVALUTARE: AM: accumulo microbico AMO: accumulo microbico orario Monitoraggio microbiologico ambientale 9 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Metodi di campionamento e monitoraggio dell’aria I metodi adottati per il c ontrollo mic robiologic o dell’aria ambientale si basano sui seguenti campionamenti: CAMPIONAMENTO PASSIVO CAMPIONAMENTO ATTIVO Monitoraggio microbiologico ambientale 10 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro CAMPIONAMENTO PASSIVO Impiego di piastre Petri di sedimentazione. Viene tolto il coperchio della capsula Petri contenente il terreno di coltura agarizzato sterile, in modo che la superficie dell’agar rimanga esposta all’aria per un tempo definito. Al termine si richiude la piastra e si procede all’incubazione a 37°C per 48 ore e a 25° C per altre 24 ore. Si conta il numero di colonie cresciute I risultati vengono espressi nell’ unità di misura: UFC (=Unità Formante Colonia)/m2/ora Monitoraggio microbiologico ambientale 11 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro CAMPIONAMENTO PASSIVO Standard da seguire: Piastra: 1 m da terra Durata esposizione: 1 ora Terreno di coltura: PCA Agar T° e durata incubazione: 37°C per 48 ore IMA: indice contaminazione dell’aria Indice IMA= n° di UFC Monitoraggio microbiologico ambientale 12 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Classi IMA GRUPPO A ESEMPIODI CLASSE INDICE IGIENE RISCHIO UTILIZZO IMA IMA ARIA 1 0- 5 OTTIMA MOLTO -ULTRACLEANROOM ALTO -IMPIANTIETRAPIANTI -OPERAZIONI ASETTICHE 2 6 - 25 BUONA ALTO -REPARTO INTENSIVO -PICCOLA CHIRURGIA 3 26 - 50 MEDIOCRE MEDIO - AMBIENTI CON PARTICOLARE RILEVANZA D’ IGIENEAMBIENTALE - AMBIENTI SENZA PARTICOLARE 4 51 - 75 CATTIVA BASSO RILEVANZA D’ IGIENEAMBIENTALE 5 ›Nu7o66votesto PESSIMA NULLO - ALTRIAMBIENTI Monitoraggio microbiologico ambientale 13 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro CAMPIONAMENTO ATTIVO attraverso l’uso di una apparecchiatura “SAS Surface Air System” portatile una quantità misurata di aria è aspirata in un coperchio sotto il quale è collocata una capsula petri contenente terreno agarizzato. Le piastre Petri vengono incubate a 37°C per 48 ore e a 25° C per altre 24 ore Le colonie cresciute sulla superficie dell’agar vengono contate e i risultati espressi in UFC/m3 in rapporto al volume d’aria aspirato ed analizzato. Monitoraggio microbiologico ambientale 14 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro CAMPIONAMENTO ATTIVO La conta totale delle colonie batteriche delle piastre di TSA (Triptic Soy Agar), di MSA (Mannitol Salt Agar) e di SAB (Sabouraud Agar) effettuata dopo incubazione è stata espressa in CFU/m3 ed è stata calcolata nel seguente modo: il numero totale (N) delle colonie cresciute è stato diviso per il volume d’aria campionato (V, espresso in litri), e il risultato moltiplicato per 1000 (1 m3 =1000 l). CFU/m3 = (N / V) x 1000 Le piastre di TSA sono incubate a 22°C e a 36°C per 48h. Le piastre di MSA sono state incubate a 36°C per 48h. I risultati delle letture sono stati espressi in CFU/m3 Monitoraggio microbiologico ambientale 15 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Monitoraggio microbiologico ambientale 16 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO ATTIVO PASSIVO S.A.S. I.M.A. Monitoraggio microbiologico ambientale 17 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO I.M.A. – Indice Microbico Aria Esposizione all’aria di Piastre Petri PASSIVO contenenti agar, tempo di 1 ora a 1 m di altezza I.M.A. a 1 m da ogni ostacolo Particelle > 10 µm Monitoraggio microbiologico ambientale 18 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO PASSIVO I.M.A. Monitoraggio microbiologico ambientale 19 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA Monitoraggio microbiologico ambientale 20 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO Surface Air System: ATTIVO Campionatore ad impatto convoglia l’aria aspirata direttamente su agar. S.A.S. Flusso 180 L/min 1,5 m di altezza Monitoraggio microbiologico ambientale 21 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO ATTIVO S.A.S. Monitoraggio microbiologico ambientale 22 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA Monitoraggio microbiologico ambientale 23 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA parametri di valutazione I.M.A. S.A.S. (Pitzurra, 1997) (Orpianesi et al., 1983) GIUDIZIO I.M.A. (ufc/ dm2 /h) ufc/m 3 ottimo 0÷ 9 buono 10 ÷ 39 0 ÷ 125 mediocre 40 ÷ 84 126 ÷ 250 cattivo 85 ÷ 124 251 ÷ 375 pessimo > 124 > 375 Monitoraggio microbiologico ambientale 24 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro H2O Monitoraggio microbiologico ambientale 25 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro L’acqua potabilizzata può contenere una flora microbica “autoctona” e ”alloctona”, capace di resistere ai trattamenti di potabilizzazione. Alcuni di questi microrganismi possono trovare condizioni favorevoli al loro mantenimento in rete. Monitoraggio microbiologico ambientale 26 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro BIOFILM Comunità batterica, altamente stratificata, adesa ad una superficie,, circondata da una matrice extracellulare di natura organica e inorganica dove i microrganismi sono organizzati in una comunità funzionale. Monitoraggio microbiologico ambientale 27 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Formazione di un biofilm costituito da più specie microbiche Batteri: (cariche positive) cariche -- (cariche +) Monitoraggio microbiologico ambientale 28 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Protocollo disconnessione della rete idrica e applicazione di un sistema di alimentazione indipendente. modifiche tecniche al circuito per renderlo compatibile con i trattamenti. trattamento dei circuiti. ricollegamento alla rete idrica. Monitoraggio microbiologico ambientale 29 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro 1. Dalla difficoltà di utilizzare di routine tecniche finalizzate alla ricerca di tutti i possibili microrganismi patogeni, é sorta la necessità di ricercare, per la definizione della qualità di un'acqua, microrganismi indicatori di contaminazione, la cui presenza può essere indice della presenza di patogeni. 2. Un efficace indicatore microbiologico di contaminazione deve: a)poter sopravvivere sufficientemente a lungo nell'ambiente per consentire la sua evidenziazione b)deve poter essere identificato con metodologie poco complesse e sufficientemente rapide. Monitoraggio microbiologico ambientale 30 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Sistema delle membrane filtranti: quantitativo e qualitativo Volume prestabilito di acqua da saggiare Risultato UFC/ml di H2Ofiltrata Monitoraggio microbiologico ambientale 31 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Microbiologia: metodo delle membrane filtranti Metodo delle membrane filtranti N Colonie/100 ml = (N colonie contate/ volume campione filtrato) *100 Monitoraggio microbiologico ambientale 32 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro - Conta dei coliformi totali (UFC/ml) Microbiologia: analisi delleacque - Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml) - Conta delgi Streptococchi fecali TERRENODI T° INC. TEMPO INC. COLTURA CONTA PCA 22°C 72h BATTERICA (Plate Agar 36°C 48h TOTALE Count) COLIFORMI Membrane endo agar 36°C 24h TOTALI less COLIFORMI Membrane 44°C 24h FECALI faecal coliform STREPTOCOCCHI KF streptococcus 36°C 48h FECALI Monitoraggio microbiologico ambientale 33 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Monitoraggio microbiologico ambientale 34 di 34