Métodos y Técnicas en Biomedicina I (PDF)

MHETODS-AND-TECHNIS-IN-BIOMEDICI... andreadiaz_ Methods and Techniques in Biomedicine i 2º Grado en Biomedicina Facultad de Ciencias de la Salud y del Deporte Universidad Alfonso X El Sabio Reservados todos los derechos....

MHETODS-AND-TECHNIS-IN-BIOMEDICI... andreadiaz_ Methods and Techniques in Biomedicine i 2º Grado en Biomedicina Facultad de Ciencias de la Salud y del Deporte Universidad Alfonso X El Sabio Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  MODULE 1. INTRODUCTION TO RESEARCH TEMA 1. MÉTODO CIENTÍFICO. HIPÓTESIS El método científico se caracteriza porque: Trabaja con hechos de la realidad y considera que la realidad es algo externo al observador y puede ser medida. Sus postulados son susceptibles de ser evaluados o contrastados. En general, para ello, se propondrán distintos tipos de experimentos. En la medida de lo posible, evita incluir opiniones o preferencias del sujeto durante su desarrollo. Trata de mantener la coherencia durante su desarrollo y se decanta por las explicaciones sencillas y por aquellas que requieren el menor número posible de variables (no necesariamente significa que dichas explicaciones “sencillas” sean las “verdaderas”). Muchas veces las proposiciones pueden ser incorrectas, en consecuencia, el método científico está abierto a corregirse. El método científico usa distintas formas de razonamiento para llegar a sus conclusiones. Principalmente se basa en la deducción y en la inducción para crear una forma de razonamiento casi “propia” que es la forma llamada hipotética-deductiva que caracteriza al método INDUCCIÓN: La inducción es una forma de razonamiento que utiliza muchas ideas o hechos particulares a partir de los cuales se puede llegar a obtener una conclusión. DEDUCCIÓN: La deducción, en cambio, es una forma de razonamiento que parte de una idea general a partir de la cual se pueden derivar lógicamente los hechos individuales. El método científico utiliza un razonamiento hipotético-deductivo que es una “mezcla” de ambos. El método científico se estructura en distintos pasos, cuyos nombres pueden variar en las distintas fuentes, pero que conforman un “todo” sistemático: debemos atravesar todos los pasos para llegar al denominado “conocimiento científico”. o Podríamos imaginar una analogía con un puente que nos lleva desde la “incapacidad de explicar hechos de la realidad” hasta el “conocimiento y predicción basado en la ciencia”. Para aplicar el método científico, comenzamos con observaciones acerca de la realidad. Es necesario observar y proponer un problema surgido de esas observaciones. Además, dicho problema debe poder ser abordable. Utilizando la inducción recogemos esas observaciones y proponemos hipótesis para explicar la realidad observada. Posteriormente, aplicando la deducción obtenemos distintos hechos que naturalmente se desprenden de la hipótesis y a partir de los cuales podemos proponer experimentos que nos permitirán contrastar la hipótesis propuesta. El método científico está abierto a que los nuevos hechos desencadenen nuevas preguntas por lo que no se trata de un “bucle” cerrado, sino que al finalizar los experimentos (y de forma independiente a que la hipótesis se contraste o no) siempre surgirán nuevas preguntas que podrán (o no) ser investigadas aplicando nuevamente el método. VARIABLES, HIPÓTESIS Y EXPERIMENTOS Una hipótesis es una proposición formal (que puede ser afirmativa o negativa, evitando las preguntas en la medida de lo posible) que relaciona variables coherentes con el problema científico y que están sujetas a experimentación. Estas variables pueden ser modificadas frente a nuevos hechos de la realidad. De forma coloquial podríamos pensar en “posibles soluciones” , derivadas de las observaciones y los hechos previos frente al problema científico planteado. Cuando hablamos de una hipótesis sobre una investigación nos estamos refiriendo a una hipótesis amplia a partir de la cual no se puede obtener directamente un experimento. Además, podemos generar a partir de esas hipótesis (research) a hipótesis de trabajo (WH). a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Las hipótesis de investigación tienen que “operativizarse” es decir “volverse operativas” para poder trabajar con ellas y, en definitiva, poder plantear experimentos para contrastarlas. En caso contrario, estaríamos frente a una proposición amplia y general que no podría evaluarse. Un primer paso de “operativización” es la generación de “hipótesis de trabajo”. Generalmente en estas hipótesis ya figuran las variables a partir de las cuales podremos desarrollar los experimentos. La característica de las hipótesis de trabajo (operativa) es que siempre van a tener la variable sobre la que vamos a manipular o fijar (variable independiente) + la variable que vamos a medir (Variable dependiente) y al final vamos a proponer entre ellas algún tipo de relación. Trabajamos con hipótesis de investigación a partir de las cuales podemos desarrollar una hipótesis de trabajo y la característica de este hipótesis de trabajo es que vamos a tener variable independiente, dependiente y algún tipo de relación entre ella. Si la variable independiente hace algo, la variable dependiente a otra cosa (If… (VI) then…(VD). Una vez que ya tenemos esto definido entonces ya podemos proponer un experimento à operativizar una hipótesis. Si la hipótesis no es operativa no podemos hacer un experimento. Una hipótesis sería una sumatoria entre una variable independiente y una variable dependiente y su relación. Todas las hipótesis y en nuestro caso cuando tenemos hipótesis de trabajo, deberíamos identificar dentro del propio enunciado de la hipótesis cuál va a ser la variable independiente (la variable que el investigador puede manipular o puede fijar) y cuál va a ser la variable dependiente (la que el investigador va a medir). Una hipótesis de trabajo contiene una variable independiente, una variable dependiente y luego la posible relación. EJ: Posts de Instagram hechos por individuos diagnosticados con depresión pueden ser confiablemente distinguidos de los posts hechos por los controles sanos. ¿qué tipo de hipótesis es y que tipo? Is post made by individuals diagnostic with depression can be relative distinct from post made by healthy controls. El tono/claridad/color de un post es lo que nos permitiría distinguir entre pacientes con depresión y pacientes sanos. VARIABLE DEPENDIENTE: color (utilizando una escala, inteligencia artificial) varia y por tanto se puede medir VARIABLE INDEPENDIENTE: Presencia de enfermedad es fijo Dos poblaciones una población que tiene una enfermedad una población que tiene un control RELACIÓN: el color de un post, si es más oscuro puede estar relacionado con la depresión. Sirve como una hipótesis de investigación pero no sirve como una hipótesis de trabajo a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  TEMA 2. TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO. MEDIDAS. PRECISIÓN Y EXACTITUD MEDIDAS, PRECISIÓN Y EXACTITUD Métodos: procedimientos generales Técnica: procedimiento específico para alcanzar un fin Precisión: concepto relacionado con la dispersión de datos. Un aumento de dispersión de datos da un baja precisión Exactitud: medida cuyo valor es o se acerca al real Si un instrumento es preciso y exacto medirá todas las veces igual con una mínima dispersión o Ni agrupados ni cerca del punto central à ni preciso ni exacto o Agrupado pero lejos del punto central à muy preciso y poco exacto o No agrupado pero cerca del punto central à Muy exacto y poco preciso o Todos en el punto central y agrupados à muy exacto y preciso TEMA 3. SOLUCIONES Las soluciones son mezclas homogéneas que contienen uno o más solutos en un disolvente o Mass, weight, percentage à propiedades físicas o Molecular weight à propiedades químicas a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  MODULE 2. MODELS FOR BIOMEDICAL RESEARCH TEMA 4. MODELOS EN BIOMEDICINA. LISIS CELULAR MODELOS EN BIOMEDICINA o Modelos in-vitro: reproducen la realidad biomédica usando vías y procedimientos artificales (excepto en entes biológicos). Células madre y 1º lína o Modelos in-vivo: entes completos que representan no solamente la realidad celular, sino las interacciones entre estas y los tejidos que componen. Entidades biológicas independientes (ratas laboratorio, conejos, perros,…) o Modelos in-sillico: Variables que un investigador puede manipular (reacción de Real-Time PCR) Si decidimos usar como modelo una célula completa, debemos tener en cuenta su complejidad. En consecuencia, trabajamos bajo el paradigma de que podemos “separar” los componentes de la célula para poder comprender cómo estos entes moleculares son capaces de funcionar. Si aceptamos este paradigma, entonces, el primer paso siempre será obtener esas entidades moleculares independientes del interior de la célula. Esto se conseguirá mediante la lisis celular. Sin embargo, al romper un ente complejo es muy posible que la “suma de las partes no sea igual al todo”. Por lo tanto, debemos tener en cuenta ciertas variables para que estas modificaciones afecten en el menor grado a la complejidad celular. En este sentido, las variables que vigilaremos serán: o Naturaleza del procedimiento: mecánico, uso de búferes, etc. o Las propiedades químicas de los elementos que se ponen en contacto con un sistema (hasta ese momento cerrado) como lo es la célula. o La existencia de vías de señalización celular. o Los valores de pH o los cambios en la presión osmótica. o La estabilidad de las moléculas liberadas del interior celular una vez rota la célula. o El uso final que queremos dar a la molécula que liberamos. Aunque cuidemos todas estas variables, no existe un mecanismo “perfecto” que preserve todas las interacciones celulares por lo que debemos alcanzar una solución de compromiso entre la eficiencia y la efectividad del procedimiento Cuando la célula se lisa, también se desprenden muchos tipos de enzimas que se encargar de “apagar” algunas vías de señalización y de “encender” otras (como las de apoptosis). En consecuencia, es necesario detener esos procesos usando distintos inhibidores enzimáticos que estarán presentes en nuestras soluciones de lisis desde antes de que esta entre en contacto con la célula. WESTERN BLOT (WB) Es el análisis de proteínas (Se separan proteínas por el tamaño a continuación se pasa un medio sólido y se visualiza mediante marcación de proteínas con anticuerpo primario y secundario). Dado que se realiza con ayuda de anticuerpos, siempre que contemos con un anticuerpo apropiado podremos usar el WB. Así, este método nos permitirá evaluar la expresión proteica, las modificaciones de las proteínas (como fosforilaciones, ubiquitinaciones), etc. En este sentido, se pueden analizar proteínas humanas, animales, virales, etc. Siempre que exista la posibilidad de generar un anticuerpo, podremos aplicar el WB Las cargas en el western blot las da el SDS (carga negativa) El WB es un procedimiento largo, pero una vez puesto a punto es muy reproducible. Consta de los siguientes pasos: o Obtención de las proteínas de interés (lisado celular, etc.). o Separación de las proteínas mediante electroforesis. o Transferencia de las proteínas a un soporte inerte (generalmente una membrana de nitrocelulosa o PVDF). o Bloqueo de la membrana para evitar las interacciones inespecíficas de los anticuerpos. o Aplicación de un anticuerpo primario. o Lavados. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  o Aplicación de un anticuerpo secundario capaz de reconocer las cadenas pesadas del anticuerpo primario. Este anticuerpo se encuentra “conjugado” con alguna enzima que nos permitirá detectar la formación del complejo antígeno:anticuerpo (en este caso anticuerpo primario:anticuerpo secundario) mediante la formación de un color, precipitado, emisión de fluorescencia o emisión de luz. o Lavados. o Adición del sustrato enzimático y revelado de los resultados. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON ADICIÓN DE SDS (SDS-PAGE) USO DE POLIACRILAMIDA Se usa un polímero natural como la agarosa. Esta estructura forma distintos tamaños de poro (a través de los cuales se pueden mover las moléculas) cuyo diámetro estará en función de la concentración de soluto utilizada, sin poder controlar su tamaño/diámetro. Sin embargo, en el caso de SDS-PAGE interesa controlar de forma precisa el tamaño del poro y por ello el soporte gelificado será un polímero constituido por acrilamida y bis-acrilamida. Las proporciones entre ambos componentes nos permitirán determinar de forma específica el tamaño del poro y, en consecuencia, hacer la técnica mucho más reproducible. El problema de las disoluciones de acrilamida:bis es su reconocida neurotoxicidad (mientras se encuentren en estado líquido) por lo que será necesario manejarlas bajo condiciones de bioseguridad adecuadas. ELECTROFORESIS DISCONTINUA Cuando hacemos una electroforesis de una molécula cargada, esta migrará hacia el electrodo de carga opuesta. Así, la molécula de DNA tiene una carga neta negativa (dada por los residuos fosfatos) por lo que su migración es hacia el electrodo positivo. Sin embargo, las distintas proteínas tienen distintas cargas y estas pueden distribuirse de distinta forma sobre su estructura. En consecuencia, es necesario buscar una forma de dotar a las proteínas de un único tipo de carga. Para ello se utiliza el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) y se aplica calor al lisado celular El SDS destruye las células, si quiero una fracción nuclear tengo que tener un detergente y una centrifugación lenta low speed La suma de calor y SDS provoca una desnaturalización en las proteínas que abre la estructura de estas y las expone a los iones negativos del detergente. En consecuencia, todas las proteínas adquieren una carga neta negativa. Una vez resuelto el problema de la carga, nos encontramos con la situación de que las proteínas son de diferentes tamaños (masas moleculares) por lo que será necesario separarlas, pero, dado que en este punto todas tienen la misma carga, es necesario aplicar una separación electroforética discontinua. En este tipo de electroforesis se hace uso de la particular ionización de la glicina. o A un pH cercano al neutro, la glicina se encuentra en su forma de “carga neutra”. o A medida que el pH aumenta, el equilibrio de ionización se desplaza hacia la formación de la forma aniónica (“glicina con carga negativa” por ionización del grupo carboxilo). En la práctica se generan dos geles. Uno con un pH de 6.8 (cercano al pH neutro, denominado “concentrador”) y otro con un pH de 8.8, denominado “separador”. En el gel concentrador, la glicina se encuentra en su forma “neutra” debido al pH del gel. En consecuencia, la carga negativa es principalmente transportada por las proteínas. Dado el tamaño de estas, el movimiento es lento y en este movimiento se van concentrando. El movimiento lento sigue hasta el límite del gel concentrador con el gel separador. En ese punto, el pH del gel cambia a 8.8, con lo que el equilibrio de la glicina se desplaza hacia su “forma con carga negativa”. Al ser la glicina un aminoácido pequeño y ahora cargado negativamente, aumenta su velocidad de migración hacia el polo positivo. En esta migración “arrastra” a las proteínas las cuales ahora se separan según su masa molecular. Aquellas más grandes migrarán menos (y se quedarán en el extremo superior del gel separador) y las más pequeñas migrarán mucho más, llegando al extremo inferior del gel separador El último paso será preparar las muestras para que puedan migrar. Como indicamos previamente, utilizaremos calor para desnaturalizar las proteínas (95ºC durante 5 minutos), las cuales se diluirán en un “buffer de carga” (loading buffer) que contiene glicerol (para dar peso a la muestra de tal forma que se deposite en el fondo de los a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  pocillos del gel), SDS y un colorante que servirá como indicador visual (en general, azul de bromofenol, pero pueden ser otros). El colorante, además, migrará bastante por delante que las proteínas, formando un “frente de migración” que nos indicará de forma visual cuándo detener la electroforesis. o Para evitar una sobrecarga de muestras, se suelen preparar muestras que van de los 5 a los 50 microgramos de proteína por pocillo en el caso de un gel de 10x10 cm. No suele ser común trabajar con cantidades mayores porque se corre el riesgo de saturación de señal, difusión a otros pocillos, precipitación, etc TRANSFERENCIA Y BLOQUEO Una vez que tenemos las proteínas separadas en un soporte gelificado, vamos a transferirlas a un soporte sólido. En el caso del WB este soporte físico suele ser una membrana de nitrocelulosa o PVDF. Esta transferencia, nuevamente, se realiza aplicando un campo eléctrico tras poner en contacto el gel con la membrana. Como las proteínas tienen una carga neta negativa, se moverán hacia el electrodo positivo y, si en ese movimiento se encuentran con la membrana, se quedarán adheridas a esta. Entonces, tendremos una “foto” de las proteínas migradas, pero ahora retenidas sobre una membrana sólida que es muy útil para trabajar (no es blanda como el gel, el riesgo de ruptura es menor, etc.). Sin embargo, estas membranas suelen tener distintas imperfecciones en su superficie que pueden ser puntos de interacción inespecífica con los anticuerpos que usaremos posteriormente. Para evitar estas interacciones, la membrana se “bloquea”. Básicamente es ponerla en contacto con una disolución de una proteína inerte que no reaccione con los anticuerpos usados (suele ser leche o albúmina, aunque hay mezclas comerciales disponibles). o Para disminuir la probabilidad de interacciones inespecíficas, haremos uso de esta disolución “bloqueante” en todas las fases de preparación de nuestros anticuerpos. Una vez que la membrana esté “bloqueada” podremos aplicar los anticuerpos que reconocerán nuestra proteína de interés. ANTICUERPOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS. Aunque el WB es una técnica ampliamente utilizada y prácticamente homogénea y estandarizada, una de las claves de su éxito será contar con anticuerpos primarios de buena calidad para reconocer las proteínas de interés. La mayor parte de los resultados pobres en WB (descartadas causas técnicas y de procedimiento) se deben a la carencia de un anticuerpo de alta sensibilidad y especificidad. Muchas veces tendremos que poner a punto esta variable. En este caso procederemos a “titular” el anticuerpo. Básicamente se trata de hacer pruebas con distintas concentraciones del anticuerpo primario e ir viendo la respuesta ante nuestra proteína de interés. o La mayoría de las entidades que comercializan anticuerpos indican concentraciones aproximadas de uso, pero muchas veces estas son tan amplias que requieren pruebas en el laboratorio hasta obtener las bandas deseadas. El anticuerpo secundario no suele ser un problema, pero es el responsable de la presencia de background ya que suelen ser (en la práctica totalidad de las veces) anticuerpos policlonales. En consecuencia, siempre tenemos que lavar ampliamente la membrana, para evitar las interacciones inespecíficas que irremediablemente suelen suceder al usar estos anticuerpos. El anticuerpo secundario también será el responsable del tipo de señal final que obtendremos por lo que es necesario almacenarlos adecuadamente para evitar la degradación de las enzimas conjugadas. COMPLICACIONES Y PROBLEMAS EN WB El WB suele presentar distintos problemas, en particular durante nuestros primeros acercamientos al mismo. Un WB adecuado debe presentar bandas nítidas, definidas y diferenciadas entre sí. Además, debería poseer bajo background. También debería poseer un adecuado control biológico de carga proteica. Los “controles de carga” consisten en proteínas que, en general, presentan una expresión constante, de tal forma que si observamos variaciones en las bandas de interés sepamos que responden a nuestro experimento y no a un efecto general o a una pérdida de proteínas (fallos en la cuantificación, etc). a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  o Por ejemplo, la beta-tubulina es una proteína que se suele usar como “control de carga” ya que su expresión se suele mantener constante. Entonces, si realizamos una interferencia por RNA para disminuir la expresión de una proteína de interés, solamente deberíamos ver una disminución en dicha proteína de interés y no en el control de carga (b-tubulina en el ejemplo) o Si el control de carga se ve modificado, entonces las observaciones no podrán ser asignadas exclusivamente a nuestra intervención. Imaginemos que nuestra muestra ha difundido a otros pocillos y vemos, tras revelar el WB, que hay menos proteína de interés. Como ha habido una difusión, el resultado es en realidad un artefacto y lo detectaremos al ver que los niveles del control de carga también han variado. No suele existir una única causa cuando observamos fallos, pero es importante conocerlas para poder controlarlas y disminuirlas. El fallo más general suele estar representado por un background alto, siendo frecuentemente una de sus causas, el exceso de anticuerpos y/o la falta de lavados y/o bloqueo de la membrana. Básicamente cualquier punto donde haya posibilidad de interacción inespecífica de los anticuerpos. Muchas veces el exceso de carga proteica en cada pocillo puede provocar precipitaciones proteicas que se observan como “rayas” o “sombras” en las bandas. La forma de las bandas en sí depende mucho de la forma del pocillo y cualquier fallo en la superficie se observará al resolver el WB. En consecuencia, es importante tener cuidado al generar los geles y al formar los pocillos puesto que su forma es la que “veremos” en las bandas proteicas. Un problema muy común es la captura de burbujas durante la transferencia. Muchas veces se quedan atrapadas burbujas entre el gel y la membrana, generando marcas “circulares” donde no hay proteína a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  TEMA 5. FRACCIONAMIENTO CELULAR El fraccionamiento celular es una técnica que nos permite obtener por separado, al menos, las dos grandes porciones que constituyen una célula eucariota: el núcleo y el citoplasma. o Existen muchos protocolos desarrollados para obtener otras fracciones más específicas, como ribosomas, mitocondrias o membranas plasmáticas. Estos protocolos suelen ser aplicados por laboratorios especializados en el estudio de dichas organelas, suelen llevar una puesta a punto extensiva (a menudo durante años), por lo que no son procedimientos generales y no se estudiarán en Métodos. A pesar de esto, en todos ellos, deberemos tener en cuenta variables muy similares a las que estudiamos en el método del fraccionamiento celular general. Como siempre, para obtener las fracciones, partiremos de la lisis celular, pero en este caso será necesario controlar las variables de la lisis para evitar lisar la fracción nuclear. Dado que la membrana plasmática y la nuclear tienen una estructura diferente, podremos obtener las dos fracciones mediante distintos procedimientos que pueden ir desde los más agresivos a los más suaves, según el uso subsiguiente que necesitemos dar a nuestras fracciones. o Cuando decidimos el tipo de fraccionamiento debemos tener en cuenta que, a medida que el procedimiento es más agresivo, las probabilidades de afectar vías de señalización celular se incrementan. En otros casos, es posible que únicamente nos interese conocer la localización proteica o su estructura, por lo que podremos despreciar el efecto sobre la señalización. El método más agresivo consiste en una lisis mecánica usando morteros u homogeneizadores. Dado que suele generar cantidades importantes de restos celulares (debris), se suele combinar con una separación aplicando sustancias que generen gradientes de tal forma que, al final, las estructuras se separan por su densidad. Casi siempre los restos celulares son pequeños y pueden eliminarse fácilmente al generar bandas de densidad similar. o En algunos protocolos se aplica directamente la separación por gradientes de densidad tras la lisis celular. Actualmente en el mercado contamos con sustancias artificiales, de producción controlada que nos permiten generar gradientes con valores de densidad muy precisos y, sobre todo, muy reproducibles. El uso de búferes de lisis adecuados y la aplicación de gradientes de densidad suele ser una combinación común en los laboratorios de investigación, dado que combina la suavidad de los procedimientos con la capacidad de controlar todas las variables (puesto que el investigador puede controlar las concentraciones, sustancias, etc., que desee usar). Intentando desarrollar un acercamiento “intuitivo” al método, podemos ver que primero tendremos que lisar la membrana plasmática (conociendo y controlando las variables de la lisis) y posteriormente podremos aplicar gradientes para ir separando las fracciones y eliminando los restos celulares. En general las membranas nuclearas son mucho más resistentes por lo que su lisis es más agresiva y se alcanza al final del procedimiento. En todos los casos de fraccionamiento celular tendremos que controlar la pureza de las fracciones. Para ello, usando WB, analizaremos la presencia de proteínas exclusivamente citoplasmáticas (como ciertas enzimas, ciertas proteínas del citoesqueleto, etc.) y exclusivamente nucleares (como las histonas). o En el caso de que estudiemos organelas específicas, también tendremos que hacer uso de WB para comprobar la pureza de la fracción ensayando proteínas específicas de organela. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  TEMA 6. CULTIVOS CELULARES NECESIDADES COMUNES. Independientemente del tipo de cultivo celular (según lo definimos en Methods), las células humanas tienen necesidades básicas similares que debemos tener en cuenta: o Según el tejido de origen, las células pueden requerir de un soporte sobre el cual se desarrollarán: estaríamos hablando de “cultivos adherentes” o bien, no necesitarlo (cultivos en suspensión). § En particular, todos los cultivos que incluyan células de la circulación serán cultivos que se realizarán en suspensión. § Existen otros tipos de cultivos específicos que pueden requerir pasos intermedios de mantener las células en suspensión para activar vías de señalización específicas. Esto es común en los protocolos de diferenciación de células madre que analizaremos más adelante. § Cuando nos referimos a “soporte” para cultivos celulares nos estamos refiriendo a placas y frascos de plástico que han sido convenientemente tratados (y posteriormente esterilizados) para permitir que las células se adhieran y puedan crecer. En algunos casos particulares (como en el de las células madre) es necesario agregar una matriz extracelular que se adiciona directamente sobre la superficie plástica y entonces las células madre pueden crecer, pero ya encima de la matriz (y no sobre el plástico). o Interacción: las células deben interactuar con sus iguales y con la matriz extracelular para recibir información del medio que le permitan mantenerse vivas. También es posible que algunas células secreten factores y/o moléculas que permitan también el mantenimiento general del cultivo. § De hecho, en el caso de los cultivos primarios, cuando dos células crecen y se expanden hasta tocarse, dejan de crecer. Este fenómeno se denomina “inhibición por contacto” y no se observa en las líneas celulares. § Algunas líneas celulares específicas tienen una pequeña población de células con potencialidad, que se mantienen en suspensión, y que son las que se dividen y dan origen a todo el resto de las células adherentes. § Para la mayoría de las líneas celulares de origen tumoral, el soporte plástico y la liberación de factores propios suele ser suficiente para garantizar el desarrollo del cultivo. § Los cultivos celulares CRECEN EN MONOCAPA, es decir, están constituidos por una única capa celular que ocupa todo el soporte. Para mantener este cultivo en monocapa es fundamental que a la hora de subcultivar separemos adecuadamente las células (lo veremos más adelante). o Nutrientes: aunque cada tipo celular requerirá nutrientes específicos, todas las células (independientemente de su tipo) demandarán proteínas/aminoácidos, vitaminas, glúcidos, lípidos y, en algunos casos, factores de crecimiento y señalización, hormonas, etc. En cualquier caso, la clave es que el cultivo debe proveer estas variables, adaptadas al tipo celular. § Comúnmente, existen formulaciones comerciales que cubren estas necesidades nutritivas de las células y se venden listas para usar, por lo que, salvo cultivos específicos, no suele ser una variable que cause problemas en el desarrollo del trabajo del laboratorio. Estas formulaciones comerciales contienen cantidades perfectamente conocidas y reproducibles de glúcidos, iones, etc. § Para el aporte de proteínas, péptidos, hormonas y factores de crecimiento se suele recurrir al suero fetal bovino (FBS). Este suero es una mezcla compleja por lo que es complicado obtener concentraciones similares de aquellos factores en distintos lotes de suero. Para evitar los cambios, los laboratorios suelen adquirir todo el lote o bien, comprobar el crecimiento de la línea en cuestión bajo la acción de un determinado lote de suero antes de adquirirlo. Dado el carácter empírico de esta situación, no se pueden dar precisiones al respecto. Por regla general suele constituir el 5-10% del medio de cultivo. En la jerga de cultivos celulares a veces se habla de “medio completo” para referirse al medio al que se ha agregado el FBS. Este FBS se considera al “100%” por lo que un “medio completo al 10%” estaría formado por 50ml de FBS y 450ml del resto del medio comercial. § Sin embargo, el FBS puede contener hormonas o factores de crecimiento que pueden interferir con el desarrollo de ciertos tipos de células. Así, el FBS promueve la diferenciación de las células madre, por lo que no se debe utilizar con estas. Existen en el mercado medios de cultivo específico que incluyen formulaciones mejor conocidas y controlables para células madre. § En general, cuando obtenemos nuestro cultivo, la casa comercial nos sugiere el medio de cultivo óptimo para nuestras células. Si no fueran células adquiridas comercialmente, deberíamos recurrir a la literatura científica para tener datos acerca de cómo se han cultivado las células previamente. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  § Un punto que debemos tener en cuenta son las concentraciones salinas, ya que estas pueden afectar la presión osmótica.Además, ciertos iones inorgánicos son requeridos para acciones enzimáticas o actividades celulares (cobre, zinc, magnesio, etc.). o Control del pH: esta variable es fundamental para que la maquinaria celular pueda mantenerse y permitir el sostenimiento en el tiempo del cultivo. La ventana óptima de pH está muy limitada y por eso es fundamental mantenerlo constante. § El principal regulador del pH es la presión de CO2, aunque hay otros sistemas de control de pH que pueden incluir bicarbonato u otros reguladores. Para que tengamos un control visual, los medios de cultivo suelen incluir rojo fenol como indicador: cuando el medio se acidifica se vuelve de color amarillo, en tanto que cuando se basifica se vuelve de un color rojo/rosado intenso. o Temperatura: es una variable íntimamente relacionada con la anterior, ya que aquella depende de esta y, además, las maquinarias enzimáticas también tienen una regulación bastante estricta en cuanto a las temperaturas a las que pueden funcionar sin desnaturalizarse. § Para asegurar la temperatura, así como el nivel de CO2, los incubadores de cultivos celulares tienen una temperatura regular de 37ºC e inyectan de forma constante presión de CO2 para mantener una atmósfera interior controlada conteniendo un 5% de CO2. A su vez, los frascos de cultivos tienen filtros que permiten la difusión del gas hacia el cultivo, permitiendo así la regulación adecuada del pH. o Técnica aséptica /ambiente estéril: los cultivos se contaminarán con todos los agentes externos si no mantenemos una técnica aséptica y si no los manipulamos en condiciones de esterilidad. § Para asegurar la esterilidad, se han desarrollado cabinas de cultivos celulares dotadas de filtros de aire y de generación de flujo laminar para mantener la esterilidad. § Existen distintos tipos de cabinas de flujo laminar según el nivel de bioseguridad en el que estemos trabajando. Un nivel medio de bioseguridad (que es el que comúnmente hallaremos en la mayoría de los laboratorios de investigación) requiere de cabinas de flujo laminar de tipo 2, con circulación/extracción de aire y generación de cortina de flujo. § Las especificaciones técnicas de estas cabinas, además, vienen recogidas en diversas normas de estandarización y en legislaciones específicas por lo que su compra debe ser realizada a comerciales que cumplan estos estándares de calidad. PROBLEMAS COMUNES, SOLUCIONES COMUNES Independientemente del tipo de cultivo celular, existen problemas que podremos observar en todos ellos y, por esto mismo, las soluciones suelen ser similares. Veamos algunos casos: o Variación del pH: en general se debe a contaminaciones o a fallos del sistema de inyección/incubación de CO2 y se puede detectar por el cambio del color del indicador del medio de cultivo. § Este cambio afectará profundamente el metabolismo celular y, además, puede estar asociado a contaminaciones, cambios en la temperatura o en los niveles de CO2. § La solución más apropiada es mantener un sistema de control de calidad que incluya una revisión diaria de los cultivos, así como una evaluación mensual/anual de las conexiones, aparatos y equipos. o Contaminación microbiana: es una causa muy común de muerte del cultivo celular. Aunque la contaminación más común es la causada por bacterias, los medios de cultivo eucariotas son muy ricos en nutrientes por lo que se pueden contaminar con prácticamente cualquier microorganismo. Cuando los cultivos se contaminan con bacterias, se suele observar acidificación del medio. o Otro contaminante común son los hongos y, en este caso, suelen basificar el medio. Finalmente, una contaminación muy problemática es con micoplasmas. Estas bacterias son intracelulares y su eliminación es muy complicada, pudiendo contaminar otros cultivos que se encuentren compartiendo el mismo incubador. o La buena práctica es desechar el cultivo contaminado, pero si fuera irremplazable, se puede intentar tratarlos con antibióticos. o Para el caso de micoplasmas, la gentamicina es el antibiótico de elección, pero su toxicidad sobre las células es elevada. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Modificaciones en el aspecto o forma celular: cada célula tiene una forma genérica definida (redondeada, ahusada, alargada, con relaciones núcleo:citoplasma alta/baja, etc.). Estas características morfológicas se suelen mantener en el tiempo, por lo que cualquier cambio en ellas debe hacernos sospechar de sufrimiento del cultivo. o Muchas veces los cambios morfológicos se deben a contaminaciones, pero también las mutaciones pueden promover estos cambios. o En general, estos cambios se detectan con cierta facilidad ya que a medida que ganamos experiencia en la observación microscópica vamos aprendiendo a reconocer las formas y estructuras celulares visibles y a mantener un seguimiento de estas características. Así, cuando el cultivo empieza a perder su morfología típica, podemos tomar decisiones. Un problema común, en el caso de los cultivos primarios, es la senescencia. En este caso, simplemente el cultivo muere luego de un número determinado de pases. No suele haber posibilidad de recuperarlo y se caracteriza por cambios bruscos en la forma celular, células que se despegan de su soporte y mucho debris celular flotante. Finalmente, en algunos tipos celulares nos interesará mantener las características biológicas de potencialidad, como el caso de las células madre. Estas células tienden a la diferenciación por lo que tenemos que usar los medios de cultivo adaptados al mantenimiento de la potencialidad. Si al final el cultivo de células madre se diferencia (sin dirección por parte del investigador, es decir, sin que haya una intervención dirigida hacia la diferenciación) entonces ya no será útil para seguir trabajando con él y, obligatoriamente, tendremos que eliminarlo. PROCEDIMIENTOS COMUNES Hay muchos procedimientos que llevaremos a cabo de forma similar, con independencia del tipo de cultivo celular. Uno de ellos es el sub-cultivo o “pase”. o Cuando las células cubren el soporte sobre el que se desarrollan (o se inhiben por contacto en el caso de las células primarias), deben ser “pasadas” a una nueva placa de cultivo § En los casos de líneas celulares, constituidas por células cuyo origen es tumoral, estas seguirán creciendo sin detenerse. o Para realizar este pasaje, en el caso de las células que crecen de forma adherente, el cultivo debe ser tratado con proteasas que “cortan” las interacciones entre la célula y el soporte y así se ponen en suspensión. § Un protocolo común es tratar al cultivo celular con tripsina, una proteasa que romperá las interacciones de las células entre sí y con el soporte (suele ser un tratamiento de 5 minutos a 37ºC). También se suele utilizar EDTA para quelar los iones calcio, implicados en las interacciones celulares (y en general se usa una combinación tripsina: EDTA). Posteriormente, las células en suspensión son contadas y diluidas para que puedan crecer en una nueva placa con nuevo medio de cultivo. § En este procedimiento buscamos que las células estén completamente separadas para que posteriormente puedan crecer en forma de monocapa. Si se quedan acúmulos de células pueden ser focos de complicaciones en el cultivo de la línea. Cuando tratemos el tema de células madre, veremos que este punto es diferente. o En el caso de los cultivos en suspensión, se cuentan las células y directamente se realiza una dilución del cultivo a otro frasco nuevo. § Algunos cultivos celulares en suspensión pueden ser muy sensibles a las cantidades celulares iniciales. El procedimiento de pase representa un “envejecimiento” del cultivo (ya que cada vez que pasamos las células permitimos que sigan dividiéndose en una nueva placa) por lo que se puede sumar a otros procesos como mutaciones o inestabilidad cromosómica. Por ello, se habla de trabajar “a pases bajos” (es decir, células divididas pocas veces). o En general, los cultivos primarios tienen un “número de pase” por encima del cual alcanzan la senescencia, en tanto que las células madre (al ser de cariotipo normal y potentes) se pueden dividir durante decenas y hasta centenas de “pases”. o Las líneas celulares, constituidas por células con características/orígenes tumorales son las más susceptibles a los “pases” puesto que cada pase puede afectar la inestabilidad cromosómica, etc. Otro procedimiento común es la criopreservación, que consiste en el almacenamiento de las células a largo plazo y a bajas temperaturas. Para ello, se deben usar medios que evitan la formación de cristales de agua en el interior celular, permitiendo que estas puedan ser recuperadas posteriormente. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  o Existen en el mercado distintos medios de criopreservación, pero clásicamente en el laboratorio se opta por el dimetilsulfóxido (DMSO) a distintas concentraciones (entre el 1% y 10%) como agente de criopreservación. El DMSO a veces se disuelve con medio de cultivo específico, o bien, en con suero fetal bovino. o El proceso de congelado debe ser lento y se usan dispositivos específicos, cuya tasa de bajada de temperatura es conocida y constante. Si no se cuenta con dichos dispositivos, se puede hacer una congelación en fases: 3 horas a -20ºC, luego se pasan a -80ºC (durante toda una noche: “over-night” / ON) y finalmente se trasladan a nitrógeno líquido donde las células se mantendrán a 196ºC bajo cero para su almacenaje a largo plazo. Finalmente, el tercer procedimiento común es el descongelado. A diferencia de la criopreservación, el proceso de descongelado debe ser rápido y se realiza transfiriendo el vial, que contiene las células en nitrógeno líquido, directamente a un baño a 37ºC. Una vez que las células comienzan a despegarse de las paredes del vial, rápidamente se pasan a un tubo conteniendo medio de cultivo fresco y se centrifugan para recogerlas, a la vez que se elimina el DMSO (ya que aporta una relativa toxicidad que se sumará al estrés celular del descongelado y puede poner en peligro la integridad del cultivo). Estas células así descongeladas, son directamente cultivadas. CONTROLES DE CALIDAD COMUNES Además de los controles a los equipos, existen varios controles de calidad comunes que debemos llevar adelante con cierta periodicidad (semanal, mensual, etc.) en nuestros cultivos. Controles diarios: o Observación microscópica para ver los posibles cambios morfológicos, contaminaciones, etc. o Cambio del medio de cultivo (si es necesario). Las células deben ser mantenidas y para ello se elimina el medio de cultivo en el que se encuentran (y que contiene todo el debris celular y todos los productos de desecho de su metabolismo) y se lo sustituye por una alícuota fresca. El cambio de medio es dependiente del tipo celular y puede ir desde un cambio de medio diario (como en el caso de las células madre) a un cambio cada 3 días (como en las líneas celulares tumorales). o Realización de un “pase” (si es necesario). Controles semanales/mensuales: o Análisis de integridad de la esterilidad: cultivos de sobrenadantes de medio para analizar el crecimiento bacteriano y, en particular, del desarrollo de micoplasmas. o Detección de micoplasmas, usando kits comerciales o por amplificación mediante PCR de genes específicos. ADEMÁS, ESTA DETERMINACIÓN DEBE HACERSE OBLIGATORIAMENTE ANTES DE CRIOPRESERVAR NUESTROS CULTIVOS YA QUE NO QUEREMOS MANTENER CULTIVOS INFECTADOS QUE PODRÍAN INFECTAR OTROS CULTIVOS. o Determinación y observación del cariotipo. Este tipo de control es muy importante si estamos trabajando con cultivos primarios o células madre, cuyo cariotipo debe mantenerse estable. § En el caso de trabajar con líneas celulares, existe la posibilidad de determinar la identidad de la línea mediante la amplificación de STRs/microsatélites específicos de línea. De esa forma podemos asegurarnos de que trabajamos con una línea en concreto y que, aunque tenga cierta inestabilidad cromosómica por su propia naturaleza, los experimentos seguirán siendo reproducibles. § La determinación mediante STRs también está disponible para cultivos primarios, pero, en general, sabemos el tejido de origen y cualquier inestabilidad cromosómica suele conducir a la muerte del cultivo, por lo que no suele ser un control de rutina. § Sin embargo, esta determinación puede ser interesante para células madre y sus células diferenciadas. En este caso, los STRs nos permitirían asegurar que cualquier línea/tejido diferenciado proviene, sin ninguna duda, de una línea específica de célula madre. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  TEMA 7: CLASIFICACIÓN DE LOS CULTIVOS CELULARES o Cultivos primarios o Líneas celulares y o Células madre o No hay un criterio biológico en la clasificación, sino uno meramente técnico. Cada uno de esos tipos de cultivos celulares son lo suficientemente diferentes como para plantear necesidades o técnicas específicas. Cultivos primarios. Los cultivos primarios se obtienen explotando la capacidad de división celular de una célula sana. A partir de una porción de tejido original, podemos obtener sus células constituyentes y permitir el crecimiento y desarrollo fuera del tejido, partiendo de las células de las capas más indiferenciadas de cada tejido de origen. o Desde luego, estas células solo darán origen a un tipo celular que madurará según el tejido inicial. En el apartado anterior hemos visto las necesidades fisiológicas de las células: si las satisfacemos, las células se desarrollarán en el soporte adecuado, pero ahora, fuera del tejido. o No todos los tejidos pueden cultivarse de forma primaria y, en general, el cultivo primario sufre un mayor riesgo de contaminación y muerte. Para obtener un cultivo primario procederemos a realizar una resección del tejido en cuestión, usando una técnica estéril. Posteriormente el tejido se trocea y se digiere con proteasas para liberar a las células de las distintas interacciones (tanto entre sí como con la matriz extracelular). Finalmente, las células separadas se ponen en el soporte de cultivo (placas, frascos, etc.) y se le adiciona el medio de cultivo. o Hay disponible en el mercado distintos tipos de medios de cultivo adaptados a la obtención de cultivos primarios de distintos orígenes. Si no hubiera ninguno disponible para nuestro tejido de interés, siempre es una buena práctica recurrir a la literatura científica para evaluar opciones (es muy probable que algún investigador haya realizado previamente un cultivo similar). Las células crecerán y ocuparán todo el espacio, sufriendo una “inhibición por contacto”: cuando se encuentren muy cerca de otra célula, detendrán su crecimiento. En este momento, realizaremos un “pase” (según lo que indicábamos en los procesos de cultivo comunes). Los cultivos primarios tienen muchas aplicaciones en el laboratorio de biomedicina, pero su principal característica es que representan un modelo con las características genéticas conservadas de su donante. o Esta característica es tan crucial que en algunos textos científicos se indica que son “modelos in-vivo” y suelen utilizarse en trabajos específicos donde requerimos un modelo celular que represente fielmente a su donante. Pero por esta misma condición, sufren un envejecimiento más marcado y rápido que las líneas provenientes de tumores. Este envejecimiento se observa en su máxima expresión en el proceso de senescencia, que implica distintos procesos celulares que finalizan con la muerte celular y, en consecuencia, con la muerte del cultivo. Estos procesos, además, son inevitables: los cultivos primarios, al ser “normales”, alcanzarán un número específico de divisiones celulares a partir de la cual las células comenzarán a sufrir senescencia y a morir. o Este número de divisiones es específico para cada tejido y, aunque se puede alargar bajo condiciones de cultivo mejoradas, no se puede detener. o Mientras el cultivo se mantenga lozano podemos realizar toda la experimentación y, desde luego, criopreservarlo si planeamos trabajar con él durante más tiempo. La clave: un cultivo primario representa “la normalidad” biológica del donante. LÍNEAS CELULARES Las líneas celulares provienen de tumores o de cultivos primarios infectados con vectores virales o mediante otros métodos que permiten que la célula se “transforme” y se siga dividiendo, sin sufrir senescencia, mientras tenga disponibles los nutrientes y señales adecuados. La principal característica de las líneas celulares es su capacidad ilimitada de división: las células seguirán creciendo y desarrollándose siempre que tengan nutrientes y espacio. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  o Incluso, si no tienen espacio podrán seguir creciendo en capas, por encima de otras, llegando a destruir a otras para ocupar su lugar. Esto no suele suceder en el laboratorio, ya que se realiza un “pase” cuando el cultivo alcanza una confluencia alta. Como modelo, las líneas celulares son muy versátiles y existe un amplio abanico de opciones comerciales por lo que suelen ser un modelo de trabajo muy extendido. o Existen distintas casas comerciales que venden los viales criopreservados, indican los medios de cultivo específicos/recomendados y cuentan con servicios de atención al cliente para resolver cualquier duda, por lo que poner en marcha un cultivo de líneas celulares no suele representar un problema para el laboratorio de biomedicina. o Como científicos, debemos generar hipótesis y usar el modelo adecuado para contrastarlas. Las líneas celulares son un modelo tan ubicuo y de tan baja complejidad técnica, que suele ser el primer modelo al que se enfrenta el científico en formación. Se acepta que el origen tumoral de la línea en cuestión sigue representando la patología de base. Por eso, cuando estudiamos los tumores, escogemos las líneas cuyo origen tumoral es el correspondiente. o Todo lo dicho anteriormente es directamente aplicado a las líneas celulares (necesidades fisiológicas, técnicas de “pase”, criopreservación, descongelado, control de calidad, etc.). a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  TEMA 8: CÉLULAS MADRE ADVERTENCIAS INICIALES Las células madre son tanto un modelo como la base de un área de investigación completa: la medicina regenerativa. Dada esta situación, existe legislación específica, entrenamientos específicos, etc. A los fines de esta asignatura nos centraremos en analizar su utilidad como modelo, pero no debemos olvidar la complejidad legal y técnica a la que nos enfrentaremos si decidimos su uso. o En España, el Instituto de Salud Carlos III es el responsable de la vigilancia de proyectos que impliquen el uso de células madre, así como el ente encargado de la ejecución de la legislación y la supervisión de los bancos celulares. LA “POTENCIALIDAD” CELULAR Durante la mayor parte del desarrollo científico biológico/biomédico se había dado por sentado que las células siguen un desarrollo, partiendo del embrión y, tras seguir una cascada específica de reacciones y señalizaciones, llegaban a su estado adulto, siempre siguiendo unas “leyes” más o menos fijas. o Así, cada capa embrionaria da lugar a un tipo celular específico e, incluso, se ha “monitorizado” la migración de las células inmaduras y se puede conocer su ubicación específica conociendo su sitio origen embrionario. o Este paradigma se vio modificado con las investigaciones de diversos grupos que derivaron en la obtención del Premio Nobel por parte del investigador japonés Shinya Yamanaka y del británico John B Gurdon. o Estos investigadores pudieron demostrar que, con la introducción de ciertos factores de transcripción, se podían “reprogramar” células para que volvieran a un estado inmaduro/embrionario. Lo veremos en breve. En general, la capacidad de división y diferenciación celular, nos permitía clasificar las células de acuerdo con su potencialidad para generar distintos tejidos. Totipotente sería el cigoto puesto que genera capas extraembrionarias, así como las capas celulares embrionarias (endo, ecto y mesodermo). Pluripotentes son las células de aquellas capas embrionarias, ya que cada una de ellas es capaz de generar muchos tipos celulares de distintos linajes tisulares. o Las células madre obtenidas de embriones o las células madre adultas inducidas (iPSC), son consideradas pluripotentes. Multipotentes son las células que pueden dar origen a diferentes tipos celulares, pero de un único linaje tisular. A medida que la célula se va “especializando” su nivel de “potencia” va disminuyendo, hasta llegar a la célula adulta que sería incapaz de generar más que células similares a sí mismas mediante la replicación celular, e incluso, llegaría a un estado de maduración donde sería incapaz de generar nuevas células. Considerando esta “potencia”, los primeros trabajos se centraron en el uso de células madre provenientes de embriones. Más allá de las consideraciones éticas y legales, el problema principal de este modelo es el desarrollo de teratomas, ya que es muy complicado el control adecuado de la potencialidad de las células embrionarias. Por ello, se comenzaron a utilizar otros modelos menos agresivos y bajo un mayor control experimental, desarrollándose las células madre pluripotentes inducidas adultas (iPSC del inglés induced Pluripotent Stem Cells). Como su nombre lo indica, estas células adquieren pluripotencia tras recibir ciertos factores de transcripción: los “factores de Yamanaka” (FY). Estos factores de transcripción permiten la expresión de ciertos genes silenciados que promueven una reprogramación celular hacia un estado similar al embrionario. ¿CÓMO SE OBTIENEN LAS IPSC? Se parte de células adultas, obtenidas mediante biopsia/donación. Un tipo celular muy sencillo de obtener son los fibroblastos de la piel. Estos fibroblastos son cultivados (cultivo primario) y posteriormente son “nucleofectados”: se les inyectan los plásmidos de expresión de FY y se dividen en múltiples pocillos, cada uno de los cuales contiene (idealmente) una única célula. Se permite así una expansión clonal (iniciada en dicha célula única que contiene los FY) y se permite la reprogramación hasta obtener colonias de células indiferenciadas. o Las células madre, a diferencia de los cultivos vistos hasta ahora, crecen en colonias, agrupadas, sin llegar a ocupar todo el espacio del soporte. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-6496879 Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.  Existen distintas técnicas y métodos para inyectar estos factores, según veremos en apartados siguiente, pero uno muy común es abrir poros en las células mediante un pulso eléctrico. Esto se realiza con aparatología específica y si bien es muy efectivo inyectando los ácidos nucleicos, tiene una alta tasa de muerte celular y un bajo rendimiento. En cualquier caso, no es necesario obtener muchas células, ya que realizará la selección clonal previamente indicada (es decir, las colonias obtenidas provendrán de una única célula). Por otra parte, a medida que avanzó el conocimiento en el área se han descrito otros factores de transcripción que también pueden promover la reprogramación (que se suman a los “factores de Yamanaka” originales) y, a su vez, estos factores se pueden ir combinando para obtener mejores rendimientos, etc. En general siempre serán utilizados los factores OCT3-4, SOX2, KLF4 y c-Myc (aunque a veces c-Myc puede tener actividad oncogénica). Finalmente, todos estos procesos fueron galardonados con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2012, por lo que rápidamente surgieron opciones comerciales para el desarrollo de esta área. CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULAS IPSC La obtención de una línea de iPSC es un proceso bastante largo, no tanto por la obtención de las colonias pluripotentes, sino por la necesidad de realizar una caracterización extensiva para demostrar que, efectivamente, las células obtenidas presentan pluripotencialidad. Se deben realizar experimentos in-vitro (en cultivo) e in-vivo (usando ratones).