Tema 1: Concepto y Desarrollo Histórico de la Microbiología PDF

Tema 1: Concepto y Desarrollo Histórico de la Microbiología La microbiología es la ciencia que se encarga del estudio de los microrganismos. Micro (pequeño), bio (vida) y logos (ciencia). En definitiva, el estudio de la vida microscópica. Los macroorganismos son seres vivos, con un tamaño microscóp...

Tema 1: Concepto y Desarrollo Histórico de la Microbiología La microbiología es la ciencia que se encarga del estudio de los microrganismos. Micro (pequeño), bio (vida) y logos (ciencia). En definitiva, el estudio de la vida microscópica. Los macroorganismos son seres vivos, con un tamaño microscópico. Son microorganismos los organismos que viven como células aisladas o entidades que contienen ácidos nucleicos capaces de replicarse: algas microscópicas, hongos microscópicos, protozoos, bacterias y virus. Aunque sean seres vivos de tamaños y ciclos reproductivos diferentes, todos coinciden en que necesitamos un método para identificarlo, conocido como método microbiológico: método por el cual los humanos estudiamos a los microorganismos. Aunque los seres vivos son distintos, tienen en común que para verlo hace falta un microscopio, y para estudiarlos necesitamos trabajar con técnicas de cultivo puro en laboratorio. Método microbiológico. ¿Cómo afectan los microorganismos a nuestra vida? Diversos tipos de microorganismos son causantes de enfermedades y abundan casi en cualquier lugar, por lo que permanentemente estamos expuestos a un contagio. Pueden enfermar a animales, plantas y ganado. Encontramos microorganismos patógenos y beneficiosos. El número de patógenos es más pequeño. Las ventajas que tienen los microorganismos son el tamaño, la alta tasa metabólica, la posibilidad de cultivarse a gran escala y la estabilidad genética. También puede tener efectos positivos para el aspecto económico, manipulando los microorganismos para mejorar productos o participar en procesos industriales. Diferentes ramas de la microbiología: Microbiología general, industrial (depuradoras), médica sistemática alimentos y veterinaria. Fases en la historia de la microbiología 1. Periodo especulativo: cuando intuíamos la existencia de microorganismos. 2. Primeros microscopistas: avance y desarrollo del microscopio óptico. 3. Cultivo de microorganismo. 4. Hasta nuestros días: ciencias “emancipadas”. La microbiología empieza a considerarse como una rama del conocimiento. Fase especulativa No se veían microrganismos, pero había hechos que hacían pensar de la existencia de estos. Enfermedades infecciosas como las “miasmas”, Lucrecio (S. I a.C.) “semillas de enfermedad” y Frascatorius (1546) gérmenes vivos. Alimentos y bebidas fermentados. Primeros microscopistas Antonij Van Leeuwenhoek: holandés coleccionista de lentes, creo un microscopio simple de una sola lente y descubrió los microorganismos “animálculos”. Describió las bacterias y protozoos. Robert Hooke: elaboró un microscopio compuesto de dos lentes y describió los hongos filamentosos. El debate sobre la generación espontánea Generación: “se puede producir vida a partir de no vida”. La vida se genera espontáneamente: Aristóteles Redi: realizó experimentos que descartan la generación espontánea de animales, introdujo un pedazo de carne en frascos abiertos y cerrados y observó que solo aparecían gusanos en los frascos abiertos. No existe generación espontánea. Spallanzani y Needham (disputa): Needham; al calentar los frascos el aire pierde su fuerza vital. Spallanzani; calentó un caldo en un frasco abierto y observó la aparición de microorganismos y en los frascos cerrados no. Pasteur Zanja la polémica sobre la generación espontánea: Fundo la ciencia de la microbiología investigando los procesos de fermentación del vino y cerveza, descubriendo la existencia de sus bacterias. En 1681 introdujo los términos aeróbico y anaeróbico según las características de crecimiento de las levaduras. Demostró la teoría de los gérmenes como causantes de las misma e introdujo el termino virus y vacuna, desarrollando así vacunas que consiguieron salvar miles de vidas. Realizó experimentos con frascos abiertos, una vez llevados a ebullición no aparecieron microorganismos si el frasco presenta cuellos curvados, ni se mueve. Pero si aparecen cuando el líquido alcanza el cuello curvo. El debate sobre los fermentos: Dos teorías sobre el origen de las fermentaciones: química y biología. Se descubren bacterias que producen fermentación láctica, levaduras que producen fermentación alcohólica, la fermentación butírica y la vida en ausencia de aire (anaerobiosis). Avances técnicos: cultivo puro Para poder hacer cultivos puros se necesitan sistemas para aislar microorganismos. Dos teorías sobre la forma de microorganismos: pleomorfismo (movilidad que tuvieran las bacterias para cambiar de forma o de existir con formas morfológicas cambiantes), y monomorfismo (mismas formas). Su resolución dependió de cultivos puros.  Medios sólidos a base de rodaja de patatas.  Medios sólidos a base de gelatina.  Medios sólidos a base de agar-agar Richard Petri en el laboratorio de Koch inventó la placa de Petri. Beijerink, Winogradsky Medios de enriqueciminento y medios diferenciales. Avances técnicos: microscopios y técnicas de tinción Koch colabora con la industria alemana de vidrio. Lentes acromáticas mejoradas, iluminación inferior con condensador, objetivo de inmersión (1878). Koch colabora con la industria química BASF: tinción para observar bacterias (azul de metileno, fuchina, violeta de genciana, etc.), 1877 y siguientes. Robert Koch (1843-1910) Koch con su técnica de cultivo puro aísla y propaga una bacteria patógena, la responsable del carbunco o antráx. Confirma que esta bacteria presenta una fase de resistencia (endospora) donde el microorganismo es capaz de crear una especie de cápsula que le protege del oxígeno. La enfermedad se puede reproducir al reinocular bacilos a animales de laboratorio. En 1870 demostró que el carbunco solo se desarrollaba en los ratones cuando el material infectado en su torrente sanguíneo contenía esporas viables del Bacillus anthracis. En 1881 do a conocer sus estudios sobre tuberculosis y al año encontró al bacilo responsable de la enfermedad. Después se dedico al estudio de la colera, que en 1883 había alcanzado niveles de epidemia en la India, e identificó el bacilo causante y descubrió que era transmitirlo a través del agua. Postulados de Koch:  El agente debe estar presente en cada caso de enfermedad  El agente debe estar aislado del huésped y crecer in-vitro.  La enfermedad debe producirse cuando un producto de un cultivo puro es inoculado en un huésped sano.  El mismo agente debe ser recuperado del nuevo huésped infectado. Postulados moleculares de Koch (1980): 1. Identificar un gen o producto génico responsable de la virulencia. 2. El gen (o su producto) debe encontrarse en cepas bacterianas que causan las enfermedades. 3. No debe estar en cepas no virulentas. 4. La introducción del gen clonado en una cepa no virulenta debe convertirla en una cepa virulenta. 5. El gen asociado a virulencia debe expresarse por la bacteria en cualquier etapa del proceso infeccioso. 6. La inmunidad específica contra el producto génico protege de la enfermedad. La escuela de Koch aisló numerosos agentes patógenos: Colera (1883), Difteria (1884), Tétanos (1885), Neumonía (1886), Meningitis (1887), Peste (1894) y Sífilis (1905). Ferdinand Julius Cohn Fundador de la microbiología moderna y bacteriología. Propuso la clasificación de las bacterias: genero, especie y veriedades en 1872. Describió otros microorganismos patógenos transmitidos por agua contaminada, distintos al V. cholerae. Otros eventos importantes del siglo XIX  Joseph Lister, Bacterium lactis.  Albert Neisser, identificó agente de la gonorrea.  Alphonse Laverin encontró parásito de la malaria.  Paul Erlich utiliza azul de metileno. Edward Jenner Elaboró la vacuna de la viruela. Asepsia, quimioterapia. La introducción de anestesia, trajo infecciones quirúrgicas. Lister introduce el uso de fenol y de sales de mercurio (asepsia en quirófano) 1867. Paul Ehrlich, agentes terapéuticos ideales que actúan de forma específica en contra algún patógeno en particular sin ocasionar daños en las células del huésped. Colabora con industria química y descubre el salvarsán, contra la sífilis o “Quimioterapia” (1901). Domagk (1935): rojo de prontosilo contra neumococos. Primera droga efectiva contra las infecciones bacterianas. Época de las sulfamidas. Siglo XX En 1938 se observaron por primera vez los virus gracias a la invención del microscopio electrónico. Watson y Crick proponen la estructura de doble hélice de la molécula de ADN publicada en 1913. Diversas técnicas innovadoras: microscopio electrónico de barrido o las técnicas de secuenciación de ADN. Descubrimiento de priones por Stanley Prusiner y su equipo. Kary Mullis utiliza la enzima de Thermus aquaticus para estabilizar la PCR. Alexander Fleming (1929) Descubrió que algunas colonias crecidas de S. aureus eran destruidas por el crecimiento del hongo Penicillum. Realizó la extracción del compuesto activo, penicilina. Antibioterapia  Fleming: extracto crudo de penicilina (del hongo Penicillum notatum) 1929.  Chain y Florey: purificación penicilina (uso en la segunda Guerra Mundial) 1940.  Waksman: descubrimiento estreptomicina de Streptomyces griseus, 1944.  Tras la Guerra, se descubren numerosos antibióticos, producidos sobre todo po Actinomicetos. Auge de la microbiología general: litotrofía y autotrofía Sergei Winogradsky en 1888 descubrió que las bacterias del hierro crecen en medios minerales. En 1889 descubrió que las bacterias del azufre oxidan sulfuros o S y obtienen energía de ellos (litotrofía). En 1890 descubrió que las bacterias nitrificantes fijan CO 2 con la energía de la oxidación del amonio a nitrato (quimiolito-autotrofía). La mayoría de los quimiolitótrofos conocidos son capaces de fijar el CO 2 a través del Ciclo de Calvin. Auge de la microbiología general: fijadoras de nitrógeno Winogradsky hizo el primer aislamiento de bacteria fijadora de nitrógeno (Clostridium pasteurianum). Beijerink descubre Azototacteur en 1901. Explica el ciclo del N en la biosfera y demuestra que incorpora el N de atmósfera. Papel de Rhizobium en la simbiosis fijadora de las leguminosas (Hellniegel y Willfahrt, Beijerink). Incorporación de la microbiología agrícola a las universidades y estaciones experimentales. Karl Woese 1928-2012 Analizó las secuencias del rRNA, descubriendo las Archeas y sus resultados condujieron a una clasificación en tres dominios:  Archaea: procariotas. Hábitats muy extremos, altas temperaturas y altas salinidad.  Eubacteria: bacterias.  Eucariota: dentro están los animales, hongos, plantas, etc. Francisco Juan Martínez Mojica 1963-actualidad En 1993 descubrió las secuencias repetidas CRISPR en arqueas y su papel en los mecanismos de inmunidad de las células procariotas. Sus descubrimientos permitieron el desarrollo de la tecnología CRISPR-Cas. Siglo XXI Next-generation sequencing: Detectan la incorporación de nucleótidos al ADN por la liberación de pirofosfato cuando los nucleótidos son incorporados. ARN mensajero – Vacunación: Consiste en una secuencia de ácido nucleico que introduce en la célula el código para que la maquinaria celular fabrique la proteína extraña del agente infeccioso. Posteriormente, es presentada a la membrana celular y reconocida por el sistema generando inmunidad. Para evitar la rápida degradación de las moléculas de ARN antes de entrar a la célula, se emplea nanosferas de lípidos (liposomas) en cuyo interior se encuentra el ARN, que de esta forma entra en la célula con facilidad por un proceso de endocitosis. Hasta noviembre de 2020, ninguna vacuna de ARN había sido aprobada para uso en humanos. Actualmente hay más de 15 mil millones de dosis administrads. BNT162b2 de Pfizzer y BioNtech: Es una vacuna de ARN mensajero con nucleósidos modificados formulada en nanopartículas de lípidos, provoca la expresión del antígeno S del SARS-Cov2. Fue aprobada el 2 de diciembre de 2020 por la agencia reguladora del Reino Unido y el 21 de diciembre de 2020 por la Agencia Europea del Medicamento. mRNA-1273 de la empresa de biotecnología Moderna: Es una vacuna de ARN mensajero encapsulado en nanopartículas de lípidos que contiene el código de la proteína S del SARS-CoV-2. Fue aprobada el 18 de diciembre de 2020 en Estados Unidos y el 6 de enero de 2021 se autorizó por la Agencia Europea del Medicamento. Tema 2: Diversidad Microbiana Definición de célula La célula: Unidad fundamental de la vida. Es la unidad más pequeña del organismo que dispone de capacidad para actuar de manera autónoma. Historia de la ubicación de los microorganismos S XVII (1676) Antony Van Leeuwanhoech descubrió los animáculos, que los clasificó en el reino animal o el reino vegetal. En el Reino Animalia, en el Siglo XIX (1800) se diferenció según la pared celular:  Con pared celular es el reino vegetal – inmóviles: algas, rotíferos, hongos, protozoos, bacterias  Sin pared celular es el reino animal – móviles: infusorios En 1866 Haeckel clasificó un 3º Reino  Reino Animal  Reino Vegetal  Reino Protista: algas, hongos, bacterias y protozoos. En el Siglo XIX: Reino Plantae: Algas (inmóviles y fotosintéticas) Hongos (inmóviles y no fotosintéticos) Reino Animalia: Infusorios (microrganismos móviles) Divididos en metazoos, protozoos, algas y hongos. Cambios históricos en la ubicación microbiana en los siglos XIX y XX Haeckel (1866): introdujo el reino protista Seres vivos sencillos, fotosintéticos, y o móviles. Protozoos, algas, hongos y bacterias Copeland (1938): introdujo reino morena Separa a las bacterias. Margulis (1969): introdujo reino fungi y reino protoctista (Macroorganismo eucariotas y parientes macroscópicos; mohos mucosas, ameba – no hongos) Manual Bergey’s 8º edición (1974) Reino vegetal: plantas y metafitas Reino animal: animales y metazoos Reino protista: protozoos, algas y hongos Reino monera: bacterias y cianobaterias Woese (1977): Arqueobacterias y eubacterias en reino monera Las bacterias forman el conjunto de los procariotas: ADN libre en el citoplasma y no incluido en un núcleo. Reino Monera. Los restantes organismos unicelulares se clasifican como eucariotas: genoma en el núcleo:  Reino protista: protozoos y algas unicelulares  Reino Hongos: microscópicos y macromicetos. Los virus constituyen un mundo aparte, ya que no pueden reproducirse por sí mismos, sino que necesitan parasitar una célula viva para completar su ciclo vital. Diferencia entre la estructura celular de Bacteria, Archea y Euarya Propiedad Bacteria Eucarya Archea Membrana Nuclear No Si No Organelos No Si No Tamaño ribosoma 70s 80s 70s Peptidoglicano en la Si No No pared Esteroles en No (hopanoides) Si Si membrana Lípidos de Ester unidos a Ester unido a Eter, ramificados membrana glicerol glicerol Estructura y función de la célula procariota  Organización celular.  Material genético (cromosoma circular de ADN de doble hebra) inmerso en el citoplasma.  Replicación: fisión binaria  Carecen de orgánulos rodeados de membrana.   Ribosomas: coeficiente de sedimentación de 70s.  Citoplasma envuelto por una membrana celular.  Pared celular de peptidoglicano, excepto las arqueas. Tipos de Células Hay dos tipos de células en los seres vivos: Célula Procariota: El material genético ADN esté libre en el citoplasma. Posee unos orgánulos llamados ribosomas. Típico de bacterias. Célula Eucariota: El material genético ADN está encerrado en una membrana y forma el núcleo. Poseen un gran número de orgánulos. Típico de vegetales, animales, hongos, algas y protozoos. Diferencias entre células procariotas y eucariotas: Procariotas Eucariotas Organización del material ADN circular ADN lineal genético: Núcleo rodeado de No Si membrana nuclear Número de cromosomas 1 Varios Nucléolo No Si Mitosis No Si División: Binaria Mitosis Orgánulos y apéndices: Mitocondrias No Si Cloroplastos No Si Retículo endoplasmático No Si Aparato de Golgi NO Si Pared celular Si (archaeas no) Si (sin mureína) Membrana plasmática Si (sin esteroles) Si (con esteroles) Ribosomas 70s 80s Microtúbulos y No Si citoesqueleto Las bacterias son seres unicelulares su tamaño oscila entre 0,5-1micra. Morfología celular Cocos: Cocos sueltos, Diplococos, Estafilococo, Estreptococo, Sarcina, Tétrada Bacilos: Bacilos sueltos, Diplobacilos, Estreptobacilos Espirilos: Espiroqueta, Vibriones Multiplicación celular por fisión binaria En las células procariotas se produce la división simple por bipartición: 1. El ADN de la bacteria se duplica y forma dos copias idénticas. 2. Cada copia se va a un punto de la célula y más tarde la célula se divide en dos mitades. 3. Así se forman dos células hijas iguales, más pequeñas que la progenitora. Tema 3: Organización General de una Célula Procariota Principales elementos estructurales de la célula procariota  Pared celular o Gram negativos o Gram positivos  Membrana citoplasmática  Genoforo o nucleoide (ADN)  Inclusiones  Ribosomas  Flagelos  Fimbrias, Pilis  Otros Pared celular procariota Envoltura rígida compleja que rodea a la membrana plasmática de las células bacterianas salvo en los micoplasmas y algunas arqueas. Componente básico: Peptidoglicano o Mureina Los componentes de la pared se unen entre sí y forman la estructura que se repite a lo largo de la pared que se denomina Mureina. Funciones:  Dar forma y rigidez a la célula  Protección frente a lisis osmótica  Lisis-plasmólisis (agua hacia el exterior de la célula)  Barrera protectora frente a sustancias tóxicas  Lugar de acción de antibióticos  Influencia sobre la patogenicidad Formación de protoplastos: Mediante procedimientos de laboratorio se puede lograr eliminar total o parcialmente la pared celular bacteriana. Se denominan protoplastos las células bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de pared celular, mientras que esferoplastos son aquellas células bacterianas que poseen restos de pared. Los protoplastos se obtienen de bacterias Gram + y los esferoplastos de bacterias Gram -. Formas L.: Las formas L son el equivalente morfológico de los Protoplastos y Esferoplastos, carente de pared celular o con pared celular defectuosa. Aunque el termino de formas L se limita a los organismos capaces de multiplicarse. Gram + y Gram -. Tienen forma de huevo frito (parecido a micoplasma). Formas L naturales: Carentes totalmente (o casi) de pared celular que algunas bacterias generan espontáneamente en medios a base de suero (que son hipertónicos). Streptobacillus moniliformis. Colonias en forma de huevo frito. Formas L inducidas: Tratamiento con penicilina en medio hipertónico. L inestables: tratamiento breve, revienten la pared celular. Poseen ácido murámico en poca cantidad. El ácido murámico tiene estructura química anormal. L estables: tratamiento prolongado, no revierten pared celular. Los componentes del glucopéptido son ausentes. Tinción de Gram (1884) Gram positiva > pared celular tipo G+ Gram negativa > pared celular G- La técnica se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las 2min bacterias Gram + y Gram-. La pared celular de las bacterias Gram+ posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos (denominados según están insertados en la membrana plasmática o en la mureína). Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las bacterias Gram- es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas: Pared celular Gram +: Capa homogénea de peptidoglicano o mureína. (20-80 nm) que rodea a la membrana plasmática Alto número de ácidos teicoicos y lipoproteicos (útiles para el transporte de iones a través de la pared celular) denominados según estén insertados en la membrana plasmática o en la mureína. Peptidoglicano o mureína Es un polímero compuesto por subunidades idénticas de n-acetil-glucosamina y n- acetilmuramico alternativamente y cadenas polipeptídicas (tetrapeptido) unidas al n- acetilmuramico formando puentes peptídicos. Los aminoácidos son (L, D alanina, D-glutamico) y ácido diaminopimélico (DAP) que es un derivado de la lisina. Otros compuestos químicos característicos de la pared de Gram + Ácidos teicoicos (unido al peptidoglicano): Polímero de alcohol (ribitol o glicerol) unidos mediante enlaces fosfodiéster. Polisacáridos ácidos de paredes de Gram positivos unidos covalentemente al peptidoglicano (OH del C6 de NAM). Atraviesan la pared y alcanzan la superficie de la bacteria. Unión hidrofóbica a la membrana celular. Ácidos teicurónicos: polisacáridos ácidos conteniendo ácido urónico Ácidos lipoteicoicos: polímero de 16 a 40 unidades de glicerol unido a un glucolípido Ácidos micólicos: ácidos grasos que están presentes en las paredes celulares de las micobacterias. Pared celular de la las micobacterias  Acilo - lípido  Ácido micólico  Lipoarabinomanano LAM (lipopolisacarico)  Arabinogalactano (polisacárido) Pared celular de Archaea No contiene peptidoglicano Pueden ser de:  Pseudopeptidoglicano (pseudomureína) tiñe G+.  Pseudomureína cubierta de proteína, tiñe G+.  Monocapa superficial de proteína o glicoproteína, sin pseudomureína (halófilos, metanogénicos y termoacidófilos) tiñe G-. Existen Archaea sin pared. Pseudopeptidoglicano: se asemeja en morfología, función y estructura al peptidoglicano. Los componentes básicos son el N-acetilglucosamina y el ácido N- acetiltalosaminurónico (el verdadero peptidoglicano tiene ácido N-acetilmurámico), que están unidos por un enlace glucosídico -1,3. Síntesis del peptidoglicano Consta de 4 etapas: 1. Síntesis de precursores solubles en el citoplasma. 2. Estos precursores son transferidos a un transportador lipídico situado en la membrana citoplasmática (un poliisoprenol fosfatado llamado undecaprenil- fosfato o bactoprenol), donde se forman las unidades disacarídicas con el pentapéptido.  3. Las unidades disacarídicas se polimerizan en cadenas lineales fuera de la membrana, pero aún unidas al undecaprenil-fosfato de la membrana. 4. Unión del polímero lineal así formado al peptidoglicano preexistente en la pared celular, por entrecruzamiento de (al menos) parte de sus péptidos respectivos. A estas etapas hay que añadir una fase adicional de regeneración del transportador lipídico, una vez que ha cumplido su misión, para que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de síntesis. Fase 1: Los monosacáridos que luego van a constituir la unidad disacarídica repetitiva del esqueleto del peptidoglicano (N-acetilmurámico (NAM) y N-acetil-glucosamida (NAG)) se activan al unirse a uridín difosfato (UDP). Por lo tanto, en esta fase se sintetizan por separado NAG-UDP y NAM-UDP. Luego se va produciendo la adición secuencial y ordenada de los distintos aminoácidos al NAM 8 en reacciones que requieren energía e iones Mn ++): 1. L-ala 2. D-glu 3. m-DAP (ácido diaminopimélico u otro diaminoácido (L-lys en S.aureus) 4. D-ala-D-ala Observar que no se produce un tetrapéptido, sino un pentapéptido. El último paso de adición de aminoácidos es la unión del dipéptido D-alanil-D-alanina, que se ha sintetizado en dos fases: 1. Una racemasa convierte la L-ala a D-ala. 2. Creación de enlace peptídico entre dos D-ala. Fase 2: El UDP-NAM-pentapéptido se transfiere ahora a un transportador de membrana, llamado undecaprenil-fosfato o bactoprenol, en una reacción catalizada por una translocasa específica. El bactoprenol es un poliisoprenoide de 55 átomos de C (C 55, derivado de la repetición 11 veces de la unidad isoprenoide, con un fosfato terminal.) Permiten el transporte y ensamblaje de sustancias que, como las azúcares, son hidrofílicas, y no podrían pasar por sí mismas la barrera hidrofóbica de la membrana. Una vez que el NAM-pentapéptido está unido al bactoprenol (por medio de pirofosfato), una transferasa transfiere a éste la NAG desde el UDP-NAG. Por lo tanto, se obtiene: undecaprenil-P-P-NAM(pentapéptido)-NAG. Tanto la traslocasa inicial como la transferasa está localizadas en el lado citoplásmico de la membrana. Fase 3: Polimerización de varias unidades disacarídicas: Ahora el undecaprenil-fosfato o bactoprenol “se da la vuelta” en la membrana (una especie de flip-flop desde la capa interna hasta la externa), de modo que logra que el precursor resultante de la fase 2 quede expuesto hacia el medio acuoso exterior a la membrana. Entonces tiene lugar la polimerización de varias unidades desacarídicas: ello se logra en una reacción de transglucosidación. Consiste en la unión de cada unidad disacarídica NAG-NAM (con su pentapéptido) unida a su respectivo bactoprenol, con el extremo libre (reductor) de una cadena preexistente que a su vez está unida a otra molécula de bactoprenol. En el proceso se liberó uno de los undecaprenil (Bactoprenol), pero en forma pirofosforilada). Sobre este actúa una fosfatasa específica, que elimina el fosfato terminal, regenerándose el bactoprenol, que queda dispuesto para otro ciclo. Fase 4: Finalmente, el polímero naciente (con sus pentapéptidos) reacciona, por transpeptidación, el enlace entre D-ala (4) y D-ala (5) del peptidoglicano naciente se ve sustituido por otro enlace peptídico, entre dicha D-ala (4) y el diaminoácido (ácido diaminopimélico) del PG naciente.  La cicloserina impide la formación de peptidoglicano, la unión de D-ala y L-ala.  La bacitracina inhibe la regeneración del bactoprenol.  La vancomicina impide el paso del bactoprenol al exterior.  La penicilina impide la unión de las colas. Síntesis de la pared celular La pared celular se abre por autolisinas en el ecuador y se deposita nuevo péptidoglicano. Pared celular de Gram negativas Fina capa de mureína (2-7nm) de grosor. Membrana externa (7-8nm) de grosor. Capa adicional de lipopolisacáridos y proteínas por fuera de la mureína. La membrana externa tiene gran cantidad de lipoproteínas de braum que unen la membrana exterior al peptidoglicano fuertemente y otras proteínas denominadas Porinas, que actúan como canales de entrada y salida de sustancias hidrofílicas de bajo peso molecular. Presenta membrana externa y periplasma donde se sitúa el peptidoglicano. La membrana externa es una bicapa lipoproteica con proteínas integrales, altamente asimétrica:  La lámina externa contiene 60% de proteínas y 40% de lipopolisacáridos (LPS) que es una molécula exclusiva de Gram -.  La lámina interna presenta fosfolípidos, lipoproteínas de Braun responsable de la unión covalente entre la membrana externa y el PG y proteínas (porinas y otras). El espacio periplásmico o periplasma es un compartimento acuoso donde se encuentran: Proteínas hidrolíticas, de transporte y quimiorreceptores, y un regulador de la osmolaridad celular (ODM). Lipopolisacáridos LPS Molécula exclusiva de Gram -. Estimulante del sistema inmune, con un potente efecto tóxico. Cumple un papel principal en la adhesión de las bacterias a las células epiteliales. A menudo tóxico para animales – endotoxina (fracción de lipopolisacárido de la pared celular de algunas bacterias Gram - que al solubilizarse actúa como una toxina). Crea superficies densamente hidrofílicas. Estructura:  Lípido A (N-acetil Glucosamida + grupos acilos)  Núcleo del polisacárido o Contiene KDO (cetodesoxioctonato) otros carbohidratos (ramnosa, ácido galacturónico) o Usualmente específico de especies  O-antigen (Antígeno O) o Número de repeticiones variables o También contiene carbohidratos o Específico de cepa Funciones de la membrana externa  Barrera protectora y osmorreguladora.  Facilitar la entrada de moléculas pequeñas a través de las porinas y moléculas grandes por transportadores específicos.  Dificultar la entrada de sustancias tóxicas.  Dificultar la salida de enzimas periplásmicos. Espacio periplásmico Está entre la membrana externa y la membrana plasmática donde se encuentra el peptidoglicano y gran cantidad de enzimas periplásmicas. Contiene:  Gel periplásmico: periplasma  Capa de mureína  Enzimas (ARNasa fosfatasas)  Proteínas de transporte Proteínas periplasma de E. coli Proteínas de unión:  Para amino ácidos (histidina, arginina)  Para azúcares (glucosa, maltosa)  Para vitaminas (Tiamina o vitamina B1, vitamina B12)  Para iones (fosfato, sulfato) Enzimas de biosíntesis:  Ensamblado de mureína  Formación de fimbrias Enzimas de degradación de polímeros  Fosfatasas  Proteasas Enzimas detoxificantes:  Beta-lactamasas (penicilinasa)  Fosforilación de aminoglicósidos Diferencias entre la pared celular Gram positiva:  PC más ancha  El 90% está constituida por peptidoglicano  10% ácido teicoico Gram negativa:  Más fina  10% de la estructura es peptidoglicano  Capa externa adicional de lipopolisacáridos  Porinas  Zona periplasmática Membrana citoplasmática Es una bicapa proteo-lipídica que delimita al citoplasma tanto en células eucariotas como en procariotas. En arqueas es monocapa. Sirve de barrera selectiva y mantiene la integridad de la célula, y por tanto la supervivencia bacteriana. Composición:  Bicapa proteo-lipídica: (fosfolípidos  ácidos grasos / glicerol) Los fosfolípidos son anfifílicos (moléculas que poseen un extremo hidrofílico, es decir, que es soluble en agua, y otro que es hidrófobo   Proteínas: o Integrales o de transporte (fuerte conexión) o Periféricas de membrana (fácil extracción)  Calcio y magnesio formando parte de otras estructuras. Funciones: Permeabilidad, sistema de transporte, transporte de electrones (fosforilación oxidativa), biosíntesis, fuente de energía y liberación de exoenzimas.  Mantener al citoplasma en estado constante frente a cambios externos.  Barrera permeable selectiva (transporte activo y pasivo de nutrientes y residuos) o Los aminoácidos y sales inorgánicas (hidrofílicas) o No pueden atravesar la membrana (hidrófoba), por lo que tienen que ser transportados de forma específica.  Lugar de acción de procesos metabólicos (respiración, fotosíntesis, biosíntesis) o Punto de síntesis de ADN, polímeros de pared, etc. o Transporte de electrones.  Detector de señales ambientales (moléculas receptoras especiales que detectan sustancias químicas del medio externo). Permeabilidad de nutrientes: En procariotas no hay endo ni exocitosis. Hay tres tipos de transporte:  Transporte pasivo (no gasta energía y va a favor de gradiente)  Transporte facilitado (no gasta energía y va a favor de gradiente)  Transporte activo (gasta energía y va en contra de gradiente) Transporte pasivo y facilitado:  Difusión simple: o Sin gasto de energía o Siempre a favor de gradiente  Difusión facilitada o Mediada por transportador, pasiva, a favor de gradiente Transporte activo: Contra gradiente electroquímico, requiere de energía (ATP o gradiente de concentración)  Primario (directo): utiliza la energía liberada al hidrolizar el ATP. o Uniporte: una sustancia en una dirección  Secundario (indirecto): utiliza la energía potencial de un gradiente. Se acopla el movimiento de un soluto a favor de gradiente con el movimiento de otro en contra de gradiente. o Antiporte: transporte de dos sustancias en direcciones opuestas o Simporte: dos sustancias en la misma dirección. Translocación de grupo: proceso en el que se transporta una sustancia a la vez que se modifica químicamente, generalmente por fosforilación. Modificación de la estructura de la molécula de glucosa por una fosfotransferasa a glucosa-6-P. Mesosomas Son invaginaciones de la membrana citoplasmática originan vesículas, túbulos, lamelas tanto en bacterias g(+) como en g(-). Tienen una función desconocida. Las bacterias fotosintéticas y las nitrificantes presentan muchas invaginaciones intracitoplasmáticas, aunque no son mesosomas ya que de esa forma aumentan la superficie y se incrementan las actividades metabólicas. Cadena transportadora de electrones La función de la cadena transportadora de electrones es la de crear un gradiente electroquímico que se utiliza para la síntesis de ATP mediante el flujo de electrones. Se encuentra en la membrana plasmática de bacterias, en la membrana interna mitocondrial o en las membranas tilacoides. Tema 4: Contenido Citoplasmático y Apéndices Filamentosos Ribosomas Son partículas pequeñas y complejas cuya función es la síntesis de proteínas. Composición: son complejos de proteínas y ácido ribonucleico (ARN) presentes en todas las células excepto en los espermatozoides. Tipos de ribosomas:  De matriz citoplasmáticas: sintetizan proteínas intracelulares.  De membrana citoplasmática: sintetizan proteínas que son transportadas al exterior. Los ribosomas están formados por 2 subunidades (30s y 50s). (s coeficiente de sedimentación). Nucleoide Sin membrana nuclear. Región del citoplasma donde los procariotas ubican el cromosoma bacteriano (ADN). El cromosoma bacteriano es una molécula de ADN de doble cadena (esta molécula es muy grande en comparación con el tamaño de la bacteria), circular, superenrollado a proteínas no histosomas, y cerrada covalentemente que contiene la información genética esencial. Suele estar unida a los mesosomas. Composición:  ADN (60%)  ARN (30%)  Proteínas (10%) El proceso de replicación tiene lugar en un punto denominado Ori C. Plásmidos Son moléculas de ADN de cadena doble circular y cerrado covalentemente con capacidad de replicarse de manera independiente al cromosoma. Contienen material genético no esencial para la célula. Confieren características de fertilidad, de resistencia a antibióticos, capacidades metabólicas, virulencia… Cuerpos de inclusión Gránulos de material orgánico o inorgánico en el citoplasma. Poseen una composición variada algunas de naturaleza proteínica y otras pueden contener lípidos. Sirven de almacenaje de sustancias. Algunos son:  Polifosfatos - Almacén de P.  Glóbulos de azufre - Alamcén de S  Glucógeno - Reserva de C  PHB (poli-hidroxibutirico) - Reserva de C  Cianoficina - Reserva de N  Carboxisomas - Acumulo de Ribulosa-P-Carboxilasa (enzima clave para asimilar CO2) Flagelo Estructura de naturaleza proteica y forma helicoidal responsable de la movilidad, conlleva gasto de energía en forma de ATP generado por el gradiente de protones. Cada flagelo se mueve por rotación, movimiento de sacacorchos en sentido opuesto a las agujas del reloj. Son apéndices largos y finos que se encuentran fijos a la célula por uno de sus extremos y libres en el otro extremo. El crecimiento del flagelo se da continuamente de la punta a la base. Partes:  Filamento: Tubo hueco helicoidal de unos 20nm de espesor (parte larga), de naturaleza proteica, proteína flagelina (forma y longitud)  Gancho: Segmento corto y curvo de naturaleza proteica entre le filamento y el cuerpo basal. Une el filamento a la parte motora del flagelo.  Cuerpo basal: Funciona de motor. El cuerpo basal son unas pequeñas varillas centrales que atraviesan un sistema de anillos embebidos en las células. Gram (-): 4 anillos.  1 anillo la capa externa de lipopolisacáridos “L”.  1 anillo en la capa de peptidoglicano “P”.  2 anillos en la membrana citoplasmática (S-M). Gram (+): 2 anillos  1 anillo en el peptidoglicano  1 anillo en la membrana plasmática. Proteínas MOT: Proteínas de la membrana plasmática responsables de la rotación del filamento: motor flagelar. Proteínas FLI: Intervienen en la rotación del flagelo. Estas proteínas se encuentran en los dos tipos de bacterias en la membrana plasmática. Localización Según la disposición y número de flagelos:  Monótrica  Anfítrica  Lofótrica  LofoAnfrítica  Peritricaa Movimiento flagelar: la bacteria decide a donde va a moverse Movimiento suave: el flagelo gira en dirección contraria a las manecillas del reloj; la emplea en situaciones agradables y no se desplaza mucho. Movimiento brusco. El flagelo gira de acuerdo a las manecillas del reloj. Lo emplea para alejarse de algo que no le gusta o para acercase a algo que le agrada. Las bacterias poseen receptores que reciben la señal de algo agradable o desagradable y envía la señal para el movimiento: Tactismos Pilis Naturaleza proteica: pilina (proteínas fibrosas que se encuentran en las estructuras del pilus en las bacterias). Solo existe uno o unos pocos sobre la superficie. Participan en el mecanismo de patogénesis Participan en el proceso de conjugación (intercambio de material genético). Fimbrias Son de naturaleza proteica. No participan en la movilidad. Son más cortos que los flagelos y más numerosos. Son estructuras que participan en la fijación de los microorganismos. Cápsula Material opcional polisacárido o peptídico que se extiende alrededor de la célula. También llamada cápside, glicocáliz y eps. Protege a la célula de la fagocitosis. Participa en el mecanismo de fijación del huésped.  Cápsula: polímeros adheridos a la pared celular que se ve por tinción negativa.  Glicocálix: red polisacárida externa a la pared celular.  Capa S: capa externa con estructura regular. Estructura parecida a baldosas formadas por proteínas o glicoproteínas. Capa S Capa sobre la superficie de la célula de naturaleza proteica o glicoproteica. Grosor entre 5 y 25nm y todos los poros tienen un diámetro idéntico comprendido entre 2 y 8nm. Gram (-): sobre la capa externa Gram (+): sobre el peptidoglicano Ventajas:  Protección al estrés osmótico y sustancias tóxicas.  Protección a cambios de pH.  Protección al ataque de otros organismos: fagocitosis, virus.  Mantener la forma de arqueobacterias sin pared celular.  Adhesión a superficies. Otras funciones:  Receptor de virus.  Adherencia a superficie.  Capacidad de invasión.  Resistencia a fagocitosis.  Especificidad antigénica. Dextranos Polisacáridos ramificados compuestos por unidades de -Glucosa, se forman a partir de la bacteria Leuconostoc mesenteroides. Utilizados como expansores del volumen plasmático. Interfieren en la agregación plaquetaria. Profilaxis enfermedad tromboembólica venosa. Vainas Son estructuras huecas que rodean a las células sin intimo contacto con ellas aunque si con un estrecho ajuste. Heteropolímero que puede acumular óxidos de Fe y Mn. Ventajas:  Protección a depredadores.  Adhesión a superficies sólidas.  Adquisición de nutrientes de aguas. Orgánulos típicos de procariotas: Vesículas de gas Vacuolas sistemas de flotación Brusco incremento de la presión hidrostática deshincha a las vacuolas. Vacuola de gas es la asociación de vesículas de gas (75x100-200nm). La presión y el tipo de gas en la vesícula esta función de los gases disueltos en el medio. Las células mantienen hinchadas las vesícuas mediante la síntesis “in novo” (los nucleótidos se sintetizan a partir de precursores de bajo peso molecular) de estas estructuras. Están formadas por una membrana de interior hidrófoba y exterior hidrófilo. El agua se excluye del interior a medida que la vesícula se va creando. Clorosomas Bacterias verdes ubican parte de su sistema fotosintético (pigmentos antena) en vesículas oblondas (que es más largo que ancho) llamada Clorosomas. La composición de los clorosomas consiste principalmente de bacterioclorofila con pequeñas cantidades de carotenoides y quinonas. Tamaño entre 50x100-150nm. Poseen una membrana en monocapa. Solo se observa al microscopio electrónico. Carboxisomas Diversos fotótrofos y quimiolitotrofos poseen cuerpos poliédricos o carboxisomas. Perfil poligonal de 50 a 500nm de ancho. Membrana en monocapa. Lugar de fijación de CO2. Contiene la ribulosa difosfato carboxilasa. Magnetosomas Lo poseen las denominadas bacterias magnéticas. Son cristales homogéneos de magnetita dispuestos en hileras rodeados de una membrana de fosfolípidos-proteínas-glicolípidos. Solo en bacterias microaerófilas y anaerobias estrictas en hábitat acuáticos. Tema 5: Células Diferenciadas Endospora Bacteriana Muchas bacterias Gram positivas formando endosporas. Visualización: contraste de fases, en fresco y tinciones. Se forman en respuesta a una limitación nutricional. Son formas de resistencia no de multiplicación. Clasificación: Centrales (Bacillus megateríum) Subterminal (B. antrhacis) Terminal (Clostridium tetani) Son células especializadas de bacterias del filo Firmicutes: Gram +:  Bacillus (B. subtilis)  Clostridium (C. tetani)  Sporosarcina (S. ureae) Gram -:  Sporomusa (S. ovata) Las bacterias que pueden sintetizar esporas son: aerobios, microaerófilos, anaerobios, facultativos y anaerobios estrictos. La temperatura de crecimiento de la mayoría oscila entre 25-35oC. Se forman en respuesta a una limitación nutricional. Observación de esporas Visualización:  En fresco (muy refringentes).  Contraste de fases. Tinciones:  Técnica de Dorner (10% Nigrosina).  Técnica de Dorner modificada.  Tinción de Schaeffer-Fulton Protocolo de la tinción de Schaeffer-Fulton 1. Colorante primario: verde de malaquita y calentamiento a emisión de vapores. 2. Con el calentamiento, el colorante penetra las esporas y tile todas las células de verde.  3. Decolorante: agua. 4. Colorante sales de las células y se quedan incoloras. Las esporas mantienen el color verde. 5. Colorante de contraste: safranina. 6. Las células se tiñen de rosa. Las esporas mantienen el color verde. Tipos de esporas  Endosporas no desformantes (quiere decir que no modifican la forma de la forma vegetativa): o Endospora central circular. o Endospora central oval (Bacillus megaterium). o Endospora oval subterminal (Bacillus anthracis).  Endosporas desformantes (FOTO): o Endospora terminar circular (Clostridium tetani). o Endospora central oval. o Endospora lateral oval. o Endospora terminal oval. Estructura y composición química de la endospora En cuanto a las partes que comprender la Endospora, encontramos: Protoplasto o núcleo: Rodeado de la membrana citoplasmática de la espora (membrana esporal interna). Rodeado por la membrana interna (bicapa lipídica carente de fluidez). Dentro de él encontramos los ribosomas y ADN. Contiene un cromosoma completo y los componentes indispensables para la germinación. Muy deshidratado. Componentes inmovilizados por matriz de quelatos de dipicolinato cálcico (DPC). Pared celular: Germen de la PC de la futura célula vegetativa. Análoga a PC vegetativa. Formada a base de un peptidoglicano similar al de la célula vegetativa Corteza o córtex: Rodeado externamente de la membrana esporal externa. Posee un peptidoglicano peculiar:  30% de NAM tiene tetrapéptidos normales, pero con bajo grado de entrecruzamiento (6%).  15% del NAM tiene solo la L-ala inicial, en lugar del tetrapéptido.  55% de una modificación del ácido murámico (lactama del ácido murámico). Estructura más laxa, floja y flexible que el peptidoglicano normal, pero con gran resistencia a la lisozima. Limitada por la membrana esporal externa que posee una polaridad opuesta a la de la membrana esporal interna. Cubierta: 60% en peso seco de la espora. Ricas en cisteína y en aminoacios hidrófobos, y que llegan a constituir el 60% en peso seco de la espora. Muy insoluble e impermeable, e impiden la entrada de numerosos agentes químicos, incluyendo sustancias toxicas La abundancia de puente S-S las hace muy compactas y muy estables químicamente. Exosporio (no universal): Las esporas de algunas especies carecen de él. Capa adicional laxa resistente a enzimas proteolíticas (¿barrera de defensa externa de la espora?) Formada por mezcla de proteínas, polisacáridos complejos y lípidos. Fases de formación de esporas Hasta la fase IV: Proceso reversible A partir de la fase V: Proceso irreversible Fase 0 (célula vegetativa): Al final del periodo de crecimiento exponencial, la célula vegetativa contiene dos cromosomas. Fase 1: 1. Formación del filamento axial ancho que ocupa el centro de la célula. 2. Formación de dos espículas de la pared celular cerca de los poros (rodeadas de la membrana citoplasmática). Fase 2: 1. Formación de un septo transversal acéntrico, cerca de un polo de la célula, por invaginación de la membrana citoplasmática. 2. Deposición de nuevo peptidoglicano entre las dos membranas adyacentes. 3. Cada nucleoide queda segregado en uno de los dos compartimentos formados. 4. Es una preespora. Fase 3: 1. Envolvimiento e independencia de la preespora respecto a la célula madre. 2. Degradación selectiva del peptidoglucano del septo. 3. La preespora queda rodeada por dos membranas de polaridad opuesta. Fase 4: 1. Se forma casi por completo la corteza de la espora, por deposición de peptidoglucano entre las dos membranas. 2. También se deposita el peptidoglucano de la pared celular. 3. Comienza la síntesis del dipicolinato cálcico en el núcleo. 4. En esta fase comienza la síntesis del exosporio. Fase 5: 1. Los materiales de la cubierta comienzan a depositarse por fuera de la membrana esporal externa. 2. Continua la acumulación del dipicolinato cálcico en el núcleo. 3. Formación completa del exosporio. 4. Al funal de esta fase se adquiere la resistencia al ocatnol. Fase 6: 1. La preespora madura hasta espora. 2. Madura la corteza (formación del peptidoglicano cortical). 3. Maduran las cubiertas. 4. La espora se hace resistente al calor, aa las radiaciones ultravioletas (UV) y lisozimas. Fase 7: 1. Liberación de la espora madura por autolisis de la célula madre. Propiedades biológicas de la espora  Hipometabolia: Tasa metabólica más baja de los seres vivos (Criptobiosis).  Dormancia: Gran inercia a los sustratos exógenos.  Resistencia al calor: o Ciertas especies resisten el calor húmedo de 120ºC durante 10 minutos. o Las pequeñas proteínas ácido solubles (SASP) protegen al ADN del calor.  Deshidratación: Muy bajo contenido de agua.  o La formación de complejos macromoleculares de compuestos catiónicos (Ca2+) en el núcleo impide la neutralización de las cargas negativas del peptidoglicano cortical.  Resistencia a los reyos UV: o Absorción de luz UV por las cubiertas y por el DIIpicolinato cálcico. o Las proteínas SASP impiden la formación de dímeros de timina en el ADN. o Se producen fotoproductos de la espora (5-timinil-5,6-dihidrotimina).  Resistencia a agentes químicos: o Debido al grosor y composición a base de aminoácidos hidrófobos y con abundantes puentes disulfuro (cistinas) de la corteza. Genética molecular de la esporulación El esporulón es el conjunto de operones específicos de la esporulación, compuesto por más de 125 genes. Destacan los genes spo (esporulación) y los genes ger (germinación). Cuerpos parasporales Formación de cristales proteicos en el esporangio simultáneamente a la formación de la endospora. Producidos por cambios químicos asociados a la esporulación. Agregación regular de subunidades de una glucoproteína, en la fase IV de esporulación, en la célula madre (proteínas Cry). Ejemplo: Bacillus thuringiensis. Produce un cristal bipiramidal de proteínas adyacente a cada endospora. Insecticidas ecológicos frente a larvas de: coleópteros y díperos. 1. La oruga como materia vegetal que lleva bacterias esporuladas. 2. El cuerpo parasporal se libera junto con la espora, cuando la célula madre se autolisa. 3. Los cuerpos parasporales se disuleven en el tracto digestivo de la oruga trasnformándose en una toxina. 4. Esta toxina altera la permeabilidad del epitelio intestinal de la oruga provocando su muerte. La muerte de la oruga es una manera de asegurar la germinación de las endosporas. En agriculuta hay plantas BT (Bacilllus thuringiensis) manipuladas genéticamente, que producen en sus tejidos proteínas Cry. Germinación de la endospora La germinación es el proceso por el cual una espora se convierte al estado vegetativo. Se divide en cuatro etapas: 1. Preactivación Requiere que sus cubiertas se alteren. Natural: Por erosión y envejecimiento progresivo. Artificial:  Altas temperaturas, pero inferior a su inactivación (100ºC durante unos minutos).  Radiaciones ionizantes.  pH bajos.  Tratamiento con sustancias con grupos sulfhidrilo (-SH) libres (mercaptoetanol). 2. Activación Proceso reversible. Desencadenada por un agente químico externo (germinante) presente en el medio:  Iones inorgánicos (Mn2+, Mg2+).  La presencia de algunos aminoácidos (L-alanina = B. subtilis)  Glucosa u otros azúcares.  Adenina u otras bases nitrogenadas. 3. Iniciación (o germinación en sentido estricto) Proceso irreversible. Metabolismo endógeno (no depende todavía de sustancias externas). Los principales acontecimientos bioquímicos son:  Perdida de ácido dipicolínico y Ca 2+ favoreciendo la rehidratación del protoplasto y su hinchamiento.  Transformación del 3-fosfoglicerato (3-PG) en ATP.  Las pequeñas proteínas SASPs se hidrolizan.  La ARN polimerasa comienzan a sintetizar ARN (comienzan la transcripción de genes vegetativos). 4. Crecimiento ulterior (entrada en fase vegetativa) Aparece el metabolismo exógeno. Los principales eventos bioquímicos y estructurales son:  Se sintetiza ADN y el protoplasto crece.  La pared de la espora sirve de base para la producción de la pared de la célula vegetativa naciente.  La célula vegetativa sale por rotura de las cubiertas. Producción antimicrobianos Unidos a la esporulación se producen pequeños péptidos aproximadamente 1.400. Ejemplos de antimicrobianos:  Inhiben la síntesis de ADN o Edeinas (Bacillus brevis)  Inhiben la pared celular o Bacitracinas (Bacillus subtilis)  Actuan sobre la membrana citoplasmática o Gramicidina (Bacillus brevis) o Polimixina (Paenibacillus polymyxa) o Tirocidina (Bacillus brevi) o Colistina (Paenibacillus polymyxa) Otras células diferenciadas  Quistes de Azotobacter  Heteroquistes (Heterocistes)  Acinetos (Aquinetos) Estos dos últimos provienen de las cianobacterias filamentosas. Quistes de Azotobacter: So células que se producen por engrosamiento de la pared celular de la célula vegetativa. Se forman por la deposición e nuevos materiales externos a la membrana citoplasmática, y por la acumulación de materiales de reserva en el citoplasma. Poseen metabolismo endógeno, y resisten al calor; a la desecación y a agentes químicos más que la correspondiente célula vegetativa. Cuerpo central (con Poli-- hidroxibutirato) Exina (lipoproteínas y carbohidratsos) Intina (lípidos y carbohidratos) Exocistorio (lípidos y carbohidratos Heteroquistes  Se producen en condiciones limitantes de nitrógeno.  Especializadas en la fijación de nitrógeno molecular (N2).  La conexión entre células vegetativas y heteroquistes se establece a través de microplasmodesmos.  Por fuera de la pared celular (que es de tipo Gram -), existen tres cubiertas: (protección de la Nitrogenasa) o Una capa laminada interna a base de glucolípidos (barrera hidrofóbica para O2). o Una capa homogénea central a base de polisacáridos. o Una capa fibrosa externa, también polisacrídica, pero menos compacta. Acinetos  Lo producen las cianobacterias como respuesta a condiciones de vida desfavorables.  Se forman por acumulación de nuevas capas de materiales polisacáridos por fuera de la pared celular; y por la formación de acúmulos de reserva en el citoplasma.  Resisten más que las células vegetativas los períodos de desecación y de congelación, pero no al calor.  Germinan cuando las condiciones ambientales vuelven a ser las adecuadas. Tema 6: Nutrición de los Procariotas Proceso por el que los seres vivos toman del medio sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes. Clasificaciones de nutrientes  Según su necesidad: o Indispensables o No indispensables  Según su cantidad: o Macronutrientes o Micronutrientes  Según su utilidad en la célula: o Energéticos o Estructurales Clasificación nutricional de los seres vivos  Según su fuente de carbono: o Autótrofos o Heterótrofos  Según su fuente de energía: o Fotótrofos o Quimiótrofos  Según su fuente o donador de electrones: o Litótrofos (Utilizan compuestos inorgánicos, por lo general de origen animal) o Organotrofos (Obtiene hidrógeno o electrones de sustratos orgánicos)  Según su energía y fuente de carbono: o Fotoautrótofos (Tomar fotones de la luz como fuente de energía y fiajar carbono inorgánico en forma de carbono orgánico). o Fotoheterótrofos (Fuente de energúia la luz y como fuente de carbono, la materia organvia) o Quimioautótrofos (Qumiolitotrofos) (usan como fuente de energía la oxidación de compuestos inorgánicos reducidos y el CO2 como fuente principal de carbono). o Quimioheterótrofos (Compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía). o Mixotrofos (puedn utilizar la luz como uan fuente de enrgía, o tomarla de compuestos orgánicos o inorgánicos).  Según su fuente de nergía y donador de electrones: o Fotolitótrofo o Fotoorganotrofo o Quimiolitótrofo o Quimioorganotrofo Composición química de la célula  H2O  80-90% Peso total  C, N, P, S  95% Peso seco  K, Mg, Ca, Na (Fe)  5% Peso seco  Mn, Co, Cu, Mo, Zn, Ni, etc.  Micronutrientes Necesitan fuente de todos los elementos que componen los nutrientes y en distinta forma de tomarlos y en distinta cantidad.  C  CO2, Carbono orgánico  P  PO43-, Orgánico o inorgánico  N  Orgánico, HH4+, NO3-, N2  S  Orgánico, SO42- Nutrición mineral Existen fines inespecíficos para mantener la tonicidad y el equilibrio iónico en el medio interno. Fines específicos de los macronutrientes:  K: Cofactor enzimas, soluto compatible.  Mg: Cofactor enzimas y estabilizador de estructuras.  Ca: Cofactor enzimas, espora.  Fe: Citocromos, ferredoxinas. Fines específicos de los micronutrientes:  Mn: Activador de enzimas.  Mo: Enzimas (nitrogenasa, nitratroreductasa)  Cu, Zn, etc.: Enzimas Nutrición del Fe: El Fe es un factor limitante en muchos hábitats Hay mecanismos de captación de Fe (Hábitat aerobios Fe3+ insoluble). Las sustancias que solubilizan el F3+ y lo transportan al interior de la célula se denominan Sideroforos o Hierronoforos. Factores orgánicos de crecimiento Compuestos orgánicos que el microorganismo es incapaz de sintetizar a partir de los nutrientes y son fundamentales para la maquinaria metabólica de la célula. (Vitaminas, Aminoácidos, Bases púricas o pirimidínicas) Las bacterias pueden ser:  Bacterias Prototrofas: No requieren factores de crecimiento porque pueden sintetizarlos.  Bacterias Auxotrofas (solo crecen en medios de cultivo). Requieren factores de crecimiento. Calificación de las bacterias en función de sus requerimientos de oxígeno  Aerobios estrictos  Anaerobios estrictos  Anaerobios facultativos  Microaerófilos  Anaerobios Aerotolerantes Efecto del oxígeno Sustancia vital  Aceptor final de electrones en respiración aerobia. Efecto tóxico  Forma derivados tóxicos en reducción O2  H2O, que se eliminan por la vitamina E. Calificación de las bacterias en función de sus requerimientos de oxígeno y contenido enzimático para defenderse de sus derivados tóxicos Dispositivos Requerimiento de CO2 (Todas las bacterias requieren CO2)  Autótrofas  Fuente de la materia orgánica (fijación de CO2)  Heterótrofas  Carboxilaciones  Bajas concentraciones de CO2 generalmente CO2 endógeno es suficiente)  Algunas bacterias  Requieren elevadas concentraciones de CO2 Generadores de CO2 (Clásicamente Vela en Cámara Cerrada). Tema 7: Metabolismo de Quimioheterótrofos El metabolismo es un conjunto de reacciones químicas de la célula hasta la formación de una nueva célula. Hay dos tipos:  Catabolismo: Es la parte del proceso metabólico que consiste en la degradación de nutrientes orgánicos transformándolos en productos finales simples. Producción de energía.  Anabolismo: Conjunto de procesos del metabolismo que tienen como resultado la formación de moléculas grandes a partir de otras más pequeñas. En estos procesos se consume energía. Visión global: Reacciones de mantenimiento proporcionan:  Energía: ATP.  Poder reductor: NADH, NADPH (NADH está implicado en reacciones catabólicas, reacciones que descomponen las moléculas para liberar energía, mientras que la NADPH está implicado en reacciones anabólicas, reacciones que consumen energía para construir o sintetizar moléculas más grandes.  Metabolitos precursores: Reacciones biosintéticas (especialmente los procariotas). Mecanismos bioquímicos de generación de ATP  Fosforilación a nivel de sustrato. Opera en fermentación y respiración.  Fosforilación asociada a transporte de electrones: o Fosforilación oxidativa  Respiración o Fotofosforilación  Fotosíntesis Fosforilación oxidativa: la energía necesaria para la fosforilación del ADP procede de la cascada de electrones en la cadena de transporte electrónico y es debido al gradiente de protones que se forma. Fosforilación a nivel de sustrato: la energía necesaria para la fosforilación procede de la propia reacción enzimática que sufre el sustrato orgánico. En la fermentación solo se usa la fosforilación a nivel de sustrato para producir ATP. Sin embargo, en la respiración se usan ambas. Poder reductor Es la capacidad de ciertas biomoléculas de actuar como donadoras de electrones en reacciones metabólicas. En la reducción hay ganancia de electrones. Los autótrofos requieren en altas concentraciones el poder reductor, los heterótrofos no. Esquema de reacciones óxido-reducción  Implica formas oxidadas y reducidas de las coenzimas de óxido-reducción: NAD o NADP.  Una reacción de óxido-reducción es una reacción de transferencia de electrones.  La especie que pierde los electrones se oxida y la que los gana se reduce.  Se llama reductor al que cede los electrones y oxidante a la que los capta. Metabolitos precursores 12 compuestos a partir de los cuales se forman todas las unidades estructurales.  Glucosa-6-fosfato  Fructosa-6-fosfato  Rubosa-5-fosfato  Eritrosa-4-fosfato  Triosa-fosfato  3-fosfoglicerato  Fosfoenolpiruvato  Piruvato  Acetil-CoA  -cetoglutarato  Succinil-CoA  Oxalacetato Rutas metabólicas de generación de ATP  Energía luminosa: Fotosíntesis  Energía química: Fermentación y Respiración (anaeróbica: aceptor final de electrones no es oxígeno, pero siguen respirando, aunque no tengan oxígeno; aeróbica: aceptor final de electrones es el oxígeno). o Reacciones de óxido reducción: como se obtiene la energía química.  Oxidación: perdida de electrones  libera energía.  Reducción: ganancia de electrones, a veces protones  consume energía. Fuentes de energía: sustancia reducida (capaz de oxidarse) Conceptos generales Catalizador: sustancia que acelera una reacción química. Enzimas: proteínas que catalizan o aceleran reacciones químicas específicas. Coenzimas: pequeñas moléculas no proteicas que participan en la reacción. Metabolismo de quimioheterótrofos Uso de energía química en reacciones de mantenimiento. Son dos procesos: Fermentación y Respiración 1. Fermentación Proceso generador de ATP donde los compuestos orgánicos son donadores y aceptores de electrones.  Solo oxidación parcial del sustrato: poco ATP.  Solo sustratos con nivel medio de oxidación (no requiere oxígeno) El ATP se obtiene solo por fosforilación a nivel de sustrato. 2. Respiración Proceso metabólico generador de ATP donde los compuestos orgánicos son donadores de electrones (en heterótrofos). Existen aceptores externos de electrones:  Respiración aerobia  O2  Respiración anaerobia  NO3-, SO42-, CO32-, Fumarato, etc. Oxidación total del sustrato  Mucho ATP El ATP se obtiene por:  Fosforilación a nivel de sustrato (producción de ATP, o GTP, a partir de ADP o GDP.  Fosforilación oxidativa: utiliza energía liberada por la oxidación de nutrientes (NADH o FADH) para producir ATP. Cadena transportadora de electrones. Metabolismo de heterótrofos, degradación de carbohidratos 1. Etapas comunes en fermentación y respiración: a. Transformación del azúcar en Piruvato. i. Rutas metabólicas: Embden-meyerhof o vía glucolítica (glucólisis) / Entner-doudorof / Pentosas fosfato. 2. Etapas diferentes en fermentación y respiración. a. Transformaciones posteriores del Piruvato. Glucólisis Ruta de Embden-meyerhof Balance final: 2 Pirúvicos / 2 ATP / 2 NADH Hay 6 metabolitos precursores:  Glucosa-6-fossfato  Fructosa-6-fosfato  Gliceraldehido-3-fosfato   Ácido 3-fosfoglicerato  Ácido fosfoenolpirúvico  Ácido pirúvico La poseen muchas Procariotas y Eucariotas. Ruta de Entner-doudoroff (Solo en bacterias) Balance final: 2 Pirúvicos / 1 ATP / 1 NADH / 1 NADPH Hay 6 metabolitos precursores:  Glucosa-6-fosfato  Fructosa-6-fosfato  Gliceraldehido-3-fosfato  Ácido 3-fosfoglicerato  Ácido fosfoenolpirúvico  Ácido pirúvici Lo poseen algunos procariotas (Pseudomonas spp, Rhizobium spp, Xanthomonas spp, etc. Ruta de las Pentosas-fosfato Vía de obtención del Piruvato en Fermentación heteroláctica. Tiene 2 fases: 1. Fase oxidativa: Se genera NADPH. ( 2 NADPH por cada Glucsa-6-p) y ribulosaa 5-P (intermediario del ciclo de Calvin). 2. Fase no oxidativa: Se inicia en caso de que la célula necesite más NADPH que ribulosa-5-P. Se sintetizan pentosas-fosfato y otros monosacáridos-fosfato. Se obtiene Ribosa 5-P (componente central de la síntesis de ncelótiods para la biosíntesis de RNA, DNA y cofactores de nucleótidos. Finalmente forma gliceraldehido-3-P y Fructosa-6-P, los cuales podrán seguir directamente con la glucólisis. Es una vía de oxidación de Pentosas. Aporta 2 nuevos metabolitos precursores:  Eritrosa 4-fosfato  Ribosa 5-fosfato La poseen muchos procariotas y eucariotas. Fermentación Transformación de Piruvato en productos finales. La finalidad es reoxidar el NADH en NAD. Produce NAD. Existen distintas rutas que dan distintos productos finales. Esto genera interés taxonómico e industrial (algunas). Tipos de fermentación de azucares: Ciclo del Glioxilato Genera Glucosa a partir de Ácidos grasos, esto es muy importante en las células vegetales. Etapas: 1. El Acetil-CoA reacciona con el Oxalacetato formando Citrato y posteriormente Isocitrato. 2. El Isocitrato, mediante una reacción catalizada por la enzima Isocitrato liasa, se fragmenta en Glioxilato y Succinato. 3. La Acetil-CoA transfiere un acetilo al Glioxilato produciendo Malato por la enzima Malato sintasa. 4. El Malato se deshidrogena formando NADH para formar nuevamente Oxalacetato mediante la enzima Malato deshidrogenasa. 5. El Oxalacetato es capaz de generar Glucosa (gracias a la Fosfoenol piruvato carboxilasa) mediante gluconeogénesis. Tema 8: Metabolismo de Quimioautótrofos Reacciones de mantenimiento de autótrofos Obtención de energía y poder reductor:  Quimioautrotofos  Oxidación de compuestos inorgánicos. o Obtención de ATP y NADH  en Quimiolitótrofos Metabolismo respiratorio  Respiración aerobia o anaerobia  ATP: Fosforilación oxidativa  NADH: Transporte inverso de electrones o directamente  Fotoautótrofos: Fotosíntesis Obtención de metabolitos precursores Respiración Proceso metaabólico generador de ATP donde los compuestos orgánicos son donadores de electrones (en heterótrofos) o inorgánicos (en autótrofos). Existen aceptores externos de electrones:  Respiración aerobia: O2  Respiración anaerobia: NO3-, SO42-, CO32-, Fumarato, etc. Oxidación total del sustrato  mucho ATP El ATP se obtiene por:  Fosforilación a nivel de sustrato: producción de ATP (GTP) a partir de ADP (GDP).  Fosforilación oxidativa: utiliza energía liberada por la oxidación de nutrientes (NADH o FADH) para producir ATP. Cadena transportadora de electrones. Energía y potencial reductor en litótrofos El transporte inverso de electrones genera poder reductor. Quimiolitótrofos: son aquellos capaces de utilizar compuestos inorgánicos reducidos como sustratos para obtener energía y utilizarla en el metabolismo respiratorio. La mayoría usan CO2 como fuente de carbono (litoautótrofos). Resumen de donadores y aceptores de electrones en:  Fermentación  Respiración: heterótrofos y autótrofos Aceptores de electrones de exógenos Los quimiolitótrofos “típicos”, son por lo general respiradores aerobios, por lo que el aceptor final de electrones es el oxígeno molecular. Son varios tipos según la clase de donante inorgánico de electrones que se oxidan: Bacteria Electrón donador Electrón aceptor Productos Alcaligenes H O2 H2O Nitrobacter NO2- O2 NO3- + H20 Nitrosomonas NH4+ O2 NO2 + H2O Thiobacillus S0, H2S NO3- denitrificans Recientemente se ha descubierto un nuevo tipo de quimiolitótrofos, que acoplan en anaerobiosis la oxidación del amonio con la reducción de nitritos, produciendo nitrógeno mlecular y agua (NH4 + NO2  N2 + H2O). Este proceso ha recibido el nombre de oxidación del amonio (ANAMMOX). El mecanismo de generación de ATP en quimiolitótrofos es similar al de quimiorganótrofos respiradores: los electrones extraídos del donador exógeno (en este caso inorgánico) pasan a una cadena transportadora de electrones hasta un aceptor final (que suele ser el oxígeno en los litótrofos típicos, y que es nitrato en los anammox), generando una fuerza protón-motriz que se transforma en ATP por ATP-sintasas. Pero a excepción del hidrógeno, los demás donadores inorgánicos de electrones tienen un potencial de reducción menor que el del NADH, por lo que la oxidación de estos donadores inorgánicos solo puede generar energía, pero no poder reductor de modo directo. Para obtener poder reductor emplean transporte inverso de electrones. Quimiolitótrofas del nitrógeno Muy especializadas. Existen 2 grupos en función de su fuente de energía: Nitrosas  Oxidan Amonio  Nitritos Nitrosas: NH4+ + ½ O2  NO2- + 2H+ + H2O Nitrificantes  Nitrificación Nítricas: NO2 + ½ O2  NO3- Nítricas  Oxidan (verdaderas nitrificantes) Nitritos  Nitratos Juntas en su hábitat  importancia ecológica y agrícola. Son autótrofas estrictas (en su mayoría). ANMMOX: Oxidación anaeróbica del amonio Proceso biológico del ciclo del nitrógeno, donde nitrito y amonio se convierten directamente en gas nitógeno sin necesidad de materia orgánica y bajo condiciones anaeróbicas. Se usa NO2 como aceptor final de electrones NH4+ + NO2-  N2 + 2H2O Bacterias anammox:  Orden Planctomycetes  Géneros: Brocadia, Anammoxoglobus (agua dulce) y Scalindua (marina)  Autótrofas  Crecimiento extremadamente lento (tiempo de división 2 semanas)  Poseen anamoxosomas (membrana compacta) o NH2=NH2 (hidrazina N4H2)  Tóxico o Landeranos (lípidos) Problemática del N NO3- y NH4+ son compuestos estables del nitrógeno. Eutrofización:  Exceso de nutrientes (N y P).  Proliferación de algas.  Disminución del oxigeno disuelto: Muerte de peces.  Descomposición de materia orgánica con incremento de DBO. Contaminación de aguas:  Calidad del agua.  Exceso de NH4.  Anoxia en medio acuático. Quimilitótrofas del azufre Bastante especializadas. Usan distintos compuestos reducidos de azufre como fuente de energía. Son quimiolitotrofos estrictos, facultativos y mixotrofos. Con frecuencia acumulas gránulos de azufre elemental S 0. Acidificación de ambientes:  Obtención de ATP  Fosforilación oxidativa  Obtención de NADH  Transporte inverso de electrones Los electrones producidos por el tiosulfato y azufre elemental recaen sobre el “Citocromo C”, mientras que los electrones producidos por el HS entran en la cadena, a nivel de la “flavoproteína” (FP). En las quinonas (Q) y el Citocromo AA3 se transfieren los H. Quimiolitotrofas del hierro Oxidan Fe2+  Fe3+, suministran poca energía  mucha oxidación de Fe3+ Thiobacillus ferroxidans oxida:  SH2 y otros compuestos reducidos de S.  Fe2+  Fe3+ (insoluble) Acidófila estricta: Fe2+ estable a pH ácido  A pH neutro condiciones óxicas no estable  Fe2+  Fe3+ (espontáneamente)  A pH neutro en condiciones anóxicas  Fe2+ es estable (no oxidación) Los electrones producidos por el Fe2+ recaen sobre el Citocromo C, gracias a la rutiscianina (cuproproteína de tipo 1) a pH ácido. Obtención de ATP  Fosforilación oxidativa Obtención de NADH  Transporte inverso de electrones Precipitados Fe(OH)3:  Depósitos similares en la tierra.  Vainas vacías de Spharotilus.  Drenaje ácido de las minas.  Coloración.  Óxidos de hierro. Quimiolitótrofas del hidrógeno Quimiolitótrofas facultativas (en su mayoría), con una amplia distribución taxonómica. Son aerobias, anaerobias y anaerobias facultativas. Obtención de NADH  Transporte inverso de electrones  Muchas bacterias (1 hidrogenasa ligada a MC)  Pocas bacterias poseen dos hidrogenasas: o 1 soluble en el citoplasma. o 1 ligada a la membrana citoplasmática Directamente: H2 + NAD  NADH + H+ Obtención de ATP  Fosforilación oxidativa Ejemplo de producción de metano y acético Usando:  H2 como donador de electrones.  CO2 como aceptor de electrones. Carboxidobacterias Usan CO como fuente de energía. CO + H2O  CO2 + 2H+ + 2e- Tiene una gran importancia ecológica. Todas las carboxidobacterias son quimiolitótrofos del hidrógeno, pero todas las quimiolitótrofas del hidrógeno no son carboxidobacterias. Tema 9: Metabolismo de Fotótrofos Aparato fotosintético Consta de:  Pigmentos antena: Captadores de luz. Absorben la luz y la transmiten al centro de reacción. Son específicos de cada grupo. o Distintas clorofilas o Bacterioclorofilas o Carotenoides o Ficobiliproteinas  Centro de reacción fotoquímica: Son clorofilas. Se activan y donan electrones a las cadenas de transporte. Se distinguen de los pigmentos antena por: o Asociadas a proteínas que disminuyen su energía de activación. o Próximas a cadenas de transporte de elctrones.  Cadena de transporte de electrones: (similares a las cadenas respiratorias). Fosforilación acíclica Los electrones cedidos por la bacterioclorofila excitada no solo sirven para generar fuerza protón-motriz (FPM) y, por lo tanto, ATP, sino que también se emplean en producir los equivalentes de reducción NAD(P)H + H+ que hace falta para la fijación de CO 2. Resultado: Los electrones se transfieren al NADP (produce NADPH) y se forma ATP. Fosforilación cíclica Un electrón del fotosistema se eleva a un mayor nivel de energía y durante la caída al nivel najo de energía en la misma clorofila se forman dos moléculas de ATP (no NADPH) Resultado: Formación de ATP. Aparato fotosintético de las bacterias rojas Cromatóforos: alojan todo el aparato fotosintético. Aparato fotosintético de las bacterias verdes Consta de clorosomas o vesículas de Chlorobium. Alojan parte del aparato fotosintético. Los pigmentos antena absorben longitudes de onda y refleja otras que dan color. La membrana citoplasmática aloja parte del aparato fotosintético, centros de reacción y cadenas de transporte de electrones. Principales moléculas implicadas en el aparato fotosintético bacteriano  Clorofilas y bacterioclorofilas: o Estos tetrapirroles cíclicos quelados con Mg2+ y dotados de largas cadenas de alcohol como el fitol pueden formar parte tanto de los pigmentos antena como de los centros de reacción. o Las clorofilas del centro de reacción son mucho menos abundantes que las del complejo antena.  Carotenoides: o Forman parte del complejo antena. o Protección contra los efectos potencialmente perjudiciales derivados de la interacción entre la luz y el oxígeno. o Como pigmentos antena, captadores de luz (aunque menos eficientes que otros).  Ficobiliproteínas: o Organizadas en complejos supramoleculares denominados ficobilisomas. o Están dispuestos en la superficie de los tilacoides y constituyen el complejo antena en las cianobacterias. o Las principales ficobiliproteínas son: ficocianina, ficoeritrina, aloficocianina.  Feofitinas y bacteriofeofitinas: o Actúan como aceptores intermediarios del electrón que pierde cada bacteriofila del centro de reacción. Otros compuestos: quinonas. Tilacoides Son sacos (su conjunto forma grana) independientes de la membrana interna del cloroplasto, cuya función es absorber los fotones de la luz solar. A diferencia de los tilacoides vegetales, en las cianobacterias no se organizan en granas, sino que se disponen en laminas paralelas cerca de la membrana citoplasmática. Aloja el aparato fotosintético de las cianobacterias. En su superficie externa está el ficobilisoma – antenas recolectoras. Tipos de fotosíntesis Fotosíntesis anoxigénica: bacterias purpura o rojas y verdes. En la fosforilación acíclica anoxigénica el donador exógeno de electrones para generar poder reductor es siempre una molécula diferente al agua. Fotosíntesis oxigénica: cianobacterias. En la fosforilación acíclica oxigénica usa H2O como donador exógeno de electrones, que sirven tanto para la obtención de energía como para la del poder reductor. Requiere un elevado potencial de reducción para poder extraerle lo electrones, y un único fotosistema no es un oxidante suficientemente fuerte como para captar electrones directamente del agua. Aparato fotosintético de las bacterias rojas La fotofosforilación acíclica anoxigénica: estas bacterias tienen un fotosistema formado por una molécula de bacterioclorofila o bacteriofeofitina (BPh), y presenta un pico de absorción a 870nm, en la zona del rojo, por lo que se denomina P870. Los electrones abandonan el fotosistema, de dos en dos, transportados por una molécula de quinona que los cede a una bomba redox, que cataliza la transferencia de los electrones a dos moléculas de Citocromo C2. El gradiente de hidrogénesis así creado puede ser empleado por la bacteria para sintetizar ATP a través de la ATPasa de su membrana. Obtienen poder reductor mediante transporte inverso. Las bacterias rojas producen fotosíntesis anoxigénica por fosforilación acíclica. Los donadores de electrones son compuestos como SH2, S2O3, S0, Fe2+, etc. Fosforilación acíclica de las bacterias verdes del azufre Estas bacterias tienen un fotosistema con un pico de absorción a 840nm. Puede tener bacteriofilas de los tipos c, d, e. Los electrones abandonan el fotosistema unido a una ferrosulfoproteina (ferrodoxina), que se desplaza y son transferidos a la Coenzima Q por la enzima ferredoxina-coenzima Q oxidorreductasa, y a continuación, pasan al Citocromo C555, que devuelven el electrón al fotosistema. Obtención del poder reductor directamente y producen fotosíntesis acíclica anoxigénica. Esquema del aparato fotosintético de las cianobacterias Fosforilación cíclica: tienen en serie un fotosistema de tipo II y un fotosistema de tipo I. El electrón del fotosistema II cae a un nivel menor de energía y es recibido por la clorofila (P700) del fotosistema I. Siguiendo una serie de transportadores: Fotosistema II  PQ (plastoquinona)  Citocromo b-f  PC (plastocianina)  Fotosistema I En esto proceso se forma un ATP (medida de energía). Esa clorofila, a su vez, por acción de la luz en el fotosistema I eleva de nuevo un electrón a un nivel superior de energía por medio de la ferrodoxin-NADP reductasa. De allí va la molécula transportadora de energía NADP, la cual puede unir los iones de hidrógeno. Resultado: el agua como donador de electrones. Los electrones se transfieren al NADP, directamente y pueden formar ATP. Autótrofos – Síntesis de metabolitos precursores Ciclo de Calvin Benson o Ciclo de C3: Sirve para la fijación de carbono CO 2. La usan:  Fotosintéticas: o Cianobacterias o Bacterias rojas   Quimiolitotrofas: o Bacterisa nitrificantes o Algunas bacterias del azufre 6CO2 + 12NADPH +18ATP  C6H12O6 (PO3H2) + 12 NADP+ + 18ADP + 17Pi Enzimas exclusivas del ciclo: Ribulosa difosfato carboxilasa y Fosforibulaso kinasa. Ciclo de Krebs inverso: Consumo de ATP + NAD(P)H o ferredoxina H Bacterias fotosintéticas verdes. Es una ruta metabólica por algunas bacterias para sintetizar compuestos orgánicos de carbono a partir de CO2 y agua. Tema 10: Crecimiento Celular Y Poblacional Crecimiento  Incremento ordenado de todos los componentes del sistema biológico.  Aumento de la masacelular.  Multiplicación celular: o En microorganismo que se dividen por fisión o por gemación (aumento del número de individuos). o En microorganismos cenocíticos (aumento del tamaño de la colonia cenocítica). Crecimiento microbiano: Cambio en el número de células por una unidad de tiempo determinada. Tiempo de generación (G) (duplicación): Tiempo requerido para que una célula se divida en dos (mins, horas, días). Ciclo celular Secuencia de acontecimientos identificables que ocurren desde que surge una nueva célula hasta que esta se divide en dos hijas. En el ciclo procariótico existen periodos o estadios.  Fase C (equivalente a la S eucariota): replicación del ADN cromosómico.  Fase D (equivalente a G2 + M): formación del septo y división celular.  Fase innominada (equivalente a la G1 Geucariótica): durante este tiempo la célula duplica su tamaño y masa debido a la continua síntesis de todos sus componentes.  Las fases C y D son relativamente constantes. Cuando disminuye G lo hace a expensas de la fase innominada. Control del ciclo celular de E. Coli Dos secuencias paralelas de acontecimiento controlan el ciclo: 1. La unión de muchas unidades de la proteína DNA A (unida a ATP) al origen de replicación (ori C) desencadena la replicación cromosómica. 2. El reparto de los cromosomas y la formación del tabique depende de: a. El cromosoma ha debido terminar su replicación y las copias hijas deben de estar separadas en extremos opuestos. b. La célula debe haber alcanzado una longitud umbral (en fase C – 40 min y en la fase D – 20 min). Crecimiento balanceado o equilibrado Se caracteriza por ser el crecimiento en el que todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo. Expresión matemática del crecimiento Supongamos que partimos de una célula. Tras una división (generación celular), tendremos 2, tra dis divisiones tendremos 4, luego 8, etc. tenemos una serie geométrica 1, 2, 22, etc. 2n: n es el número de generaciones transcurridas Si en vez de partir de una célula partimos de N 0 células iniciales, tenemos N = N0 x 2n. Número de generaciones: n = t - t0 / g, donde g = tiempo de generación N (incremento del número de células) es una función exponencial del tiempo, por eso el crecimiento balanceado no restringido, se conoce como crecimiento exponencial. Crecimiento en sistemas cerrados líquidos Es el más habitual en el laboratorio. Cultivo en frascos, tubos, etc. No hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar los productos de desecho del cultivo. Se desarrolla a través de una curva característica de crecimiento 7 (7 fases). En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos. 1. Fase de retardo (fase lag): Es el periodo de tiempo durante el que el inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un periodo de ajuste metabólico. Su duración depende de: a. Tamaño del inóculo. b. Estado metabólico previo del inóculo: i. Si el inóculo procede de células en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros constituyentes de las céulas son bajos, y las células deben reponerlos en el medio físico. ii. Si las células están dañadas por algún agente, el lag también es largo. iii. Si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase logarítmica, el lag es más corto. c. Medio del que procede el inóculo: i. Si el medio es similar al medio fresco, el lag es más corto. ii. Si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más pobre, la fase de retardo se hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el medio rico. 2. Fase de transición, de crecimiento acelerado: Cada célula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compañeras. Ello demuestra que las células del inóculo no están todas en las mismas condiciones fisiológicas.  3. Fase de crecimiento exponencial (fase logarítmica): Etapa en la que las células están dividiéndose, por lo que crecen de manera exponencial. La velocidad varía de una especia a otra y depende de parámetros ambientales como la temperatura. Durante la fase logarítmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones. El tiempo de generación (g) es característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto. El valor del tiempo de generación (g) depende de: a. Composición del medio b. Temperatura c. pH d. Osmolaridad (tonicidad), etc. 4. Fase de aceleración negativa: Fase de crecimiento desequilibrado. 5. Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo (m = 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. En este periodo se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. En la fase estacionaria aún existen reacciones metabólicas, pero el metabolismo general es diferente al de la fase logarítmica: a. Las células son más pequeñas, debido a que existe división celular después de que se haya detenido el incremento de masa. b. Suelen ser más resistentes a agentes físicos y químicos. c. Existe reciclado de ciertos materiales intracelulares. d. Baja el contenido en ARN. 6. Fase de transición. 7. Fase de muerte exponencial: Las células ya no crecen ni realizan actividades metabólicas. Hay lisis celular. Se debe al agotamiento de reservas de energía. Cultivo continuo o Quimiostato (sistema abierto) Cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo compuesto por:  Una cámara de cultivo de volumen constante.  A la que llega un suministro de nutrientes desde una cámara reservorio.  Desde la cámara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias tóxicas por un dispositivo de rebosadero. Los parámetros a tener en cuenta son:  Flujo (f), medido en ml/h.  Volumen de la cámara de cultivo (v, en ml).  Densidad celular en la cámara (x).  Factor de dilución o tiempo de retención hidráulico D = f/v (en h-1).  Coeficiente de crecimiento (m). Existe un apérdida de células por el rebosader: -dx/dt = x D El crecimiento bruto es: dx/dt = x m Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = x (m-D) Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m) se haga igual al factor de dilución (D) entonces dx/dt = 0 y por lo tanto, la concentración de células es constante (x=x). La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilución (D). En cambio, el valor de tiempo de generación (g) varía ampliamente donde puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que afecte la concentración bacteriana. Sin embrago, a valores extremos de dilución, se puede ver el equilibrio se rompe:  A altas tasas de dilución (Dc: dilución crítica) el cultivo se “lava” porque su velocidad de crecimiento es inferior a la tasa de dilución.  A muy bajas diluciones (DM: dilución mínima) el nutriente limitante es la fuente de energía. La fuente de energía solo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento. Tema 11: Medida del Crecimiento Bacteriano Fases de la determinación de medidas  Recogida de muestras: tomas de muestras, traslados, conversación.  Procesado: concentración, dilución, homogenización.  Evaluación del crecimiento: o Directos: directamente por conteo se determina el número de microorganismos presentes en la muestra. o Indirectos: mide actividades, contenidos, etc. que son proporcionales al número de microorganismos. Medida del número de individuos  Métodos directos: Recuentos totales o Observación directa al microscopio o Cámara de Petroff-Hauser (para bacterias) o Contadores electrónicos de partículas (contador Coulter)  Métodos indirectos: Recuentos viables o Recuento de viables por siembra de diluciones en placas de Petri. o Recuento de viables por filtración (sistema Millipore), y se incuban los filtros sobre medio sólido. o Técnica Número más Probable (NMP). Determinación del número de microorganismos  Los recuentos directos al microscopio.  Limitaciones: Difícil distinción de microorganismos vivos o muertos. Pueden difundirse los microorganismos usando tinciones fluorescentes como naranja de acridina que tiñe todas las células. O usando anticuerpos fluorescentes o sondas de DNA para la identificación de especies. Método directo de recuento: Cámara de Petroff-Hauser Porta rayado con 25 cuadrados y volumen conocido µL. Se rellena por capilaridad de un cultivo líquido. Se cuentan las células en x cuadrados de la cámara. Nº de m.o. en 4 cuadrados  Ej. 160 bacterias X= 160x25/4 = 100 25 cuadrados  x Contador Coulter El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se produce cuando una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio. Controlando la cantidad de la suspensión que circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas. Las células deben estar en forma individual y la suspensión diluida. Método indirecto  Recuento en placa  Células viables  Tiempo y condiciones de incubación  Límite de detección es de 1-10 ufc/ml Reglas para conteo en placa:  Una colonia equivale a un microorganismo inicial.  Contar todas las colonias de la placa. Ideal 30 a 80 UFC.  Multiplicar el número de colonias por el inverso de la dilución y expresarlo UFC/ml.  Hacer la medida de las réplicas. Los métodos de enumeración que involucran el cultivo de organismos presentan el problema de que no todas las bacterias viables crecerán sobre un medio de cultivo específico. Un segundo problema asociado a todos los métodos de enumeración es que ellos no indican cuando los microorganismos están activos en el medio ambiente. Recuento de viables – Filtración por membrana  Etapa 1: Se filtra a través de un filtro de membrana un volumen conocido de muestra. Se aplica vacío para que el líquido baje, pero las bacterias quedan arriba.  Etapa 2: Se coloca el filtro de membrana en una placa con un medio con agar y se incuba.  Etapa 3: Se cuenta el número de colonias de la placa. Número más probable: Tres o más diluciones decimales de la muestra se inoculan en un medio de cultivo líquido (en tubos) y se incuban a temperatura definida durante un tiempo definido. El número más probable de microorganismos de los tres grupos se calcula. Ventajas:  Sencillo.  Es fácil que los resultados coincidan entre laboratorios a diferencia de recuento en placa.  Con medios selectivos y diferenciales se puede determinar el número de microorganismos y a que grupos pertenecen. Desventajas:  Gran cantidad de material.  No se observa la morfología.  No es exacto. Medidas del crecimiento por masa celular La masa celular es proporcional al crecimiento poblacional.  Determinación del peso húmedo, peso seco y N total.  Determinación de algún componente. Ej: Componentes de paredes celulares (quitina, ácido murámico, ADN, etc.).  Consumo de nutrientes, de C, N, O2, CO2.  Producción de ciertos metabolitos: Producción de ácidos orgánicos.  Métodos turbidímetricos (ópticos): Espectrofotómetro (mide luz transmitida). Peso seco celular: Consiste en sacar volúmenes conocidos de cultivo celular y expresarlo en (g, mg/l). En ocasiones para concentrar las células se usa el centrifugado o filtrado según la dificultad. Un incremento en el peso indica un aumento del número de células. Peso húmedo: Consiste en una centrifugación o filtración seguida del pesado. Se mide tanto el agua intracelular como el extracelular ocasionando errores considerables. Espectrofotometría: El espectrofotómetro permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Es necesario usar “blancos” para ajustar la lectura a cero absorbancia con todos los componentes de la reacción, menos la sustancia que va a ser medida. La concentración es proporcional a la absorbancia, donde a mayor cantidad moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus electrones. Medidas de actividades celulares Fotosíntesis-respiración. Actividades enzimáticas: Fosfatasa, celulasa, quitinasa, nitrogenasa, etc. Biopelículas Estructura compleja formada por agregados de células embebidas en una matriz polimérica de naturaleza orgánica y origen microbiano, adherida a un material o interfase que puede ser de naturaleza abiótica (rocas, metales, etc.) o biótica (mucosa intestinal, plantas, etc.). En ella, las células exhiben un estado metabólico alterado comparadas con el crecimiento planctónico correspondiente, especialmente con respecto a la transcripción y las alteraciones. La forma planctónica y betónica, ambos estadios son compartidos y podemos encontrar a un determinado microorganismo de una forma u otra en función de las características ambientales y el momento de su ciclo de vida que estemos considerando. Algunos autores consideran que el estado planctónico es solo en la naturaleza un estado transitorio entre dos situaciones bentónicas. Fases de formación 1. Los microorganismos en fase planctónica interactúan con una superficie (biótica o abiótica) produciéndose en primer lugar un reconocimiento y adhesión por fuerzas electroquímicas de carácter débil y reversible, aunque otras fuerzas más específicas (adhesivas) pueden ocurrir también. Las características de la superficie es un factor muy importante en este proceso de adhesión, en principio reversibles, pueda prosperar a irreversible. Este acondicionamiento puede estar regulado por las características físicas y químicas de la superficie. 2. Si la adhesión y la interacción superficial entre superficies (microbiana y soporte) es adecuada el proceso de formación de la biopelícula progresa. Produciéndose la adhesión irreversible con producción de materiales exopoliméricos (fundamentalmente ESP = exopolisacáridos) y producción de microcolonias. En este momento se producen cambios morfológicos y genéticos como puede ser la desaparición del flagelo. 3. Las biopelículas avanzan en su desarrollo, originando biopelículas maduras con número elevado de microcolonias (que suelen estratificarse), producción abundante de EPS hasta que la biopelícula envejece y comienza el procesa de liberación. La formación de biopelículas no es algo aleatorio. Se originan según las condiciones de oxígeno, nutrientes, etc. Modelos principales  Biopelículas con modelo de