Técnicas de Separación de Linfocitos (PDF)

 Gradiente de Ficoll Es la técnica más habitual para obtener preparaciones de linfocitos en sangre periférica purificadas o enriquecidas necesarias para realizar técnicas in vitro. La sangre total desfibrinada se diluye en medio de cultivo y se...

 Gradiente de Ficoll Es la técnica más habitual para obtener preparaciones de linfocitos en sangre periférica purificadas o enriquecidas necesarias para realizar técnicas in vitro. La sangre total desfibrinada se diluye en medio de cultivo y se vierte en un tubo lleno hasta la mitad en un medio con Ficoll. Se centrifuga y se consigue la separación de los linfocitos. En realidad separamos leucocitos mononucleares: linfocitos y monocitos. En sangre periferica son más abundantes los infocitos.  Gradiente de Ficoll El medio de separación: Presenta un gradiente discontinuo. Tiene dos componentes: - Ficoll 400: Polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina de 400 kDa soluble en agua. Tiene mayor densidad que los linfocitos pero menos que eritrocitos y granulocitos. Provoca aglutinación de eritrocitos. - Diatrizoato de sodio: mezclado con Ficoll forma soluciones de baja viscocidad y alta densidad. Da la densidad óptima para la separación de células y la osmolaridad para que las células sean viables.  Gradiente de Ficoll Preparación del medio: - Preparar disolución al 14% p/v de Ficoll 400. Agitación toda la noche a temperatura ambiente. - Mezclar 12 partes de solución de Ficoll con 5 partes de Diatrizonato de sodio al 32,8%. - Ajustar densidad y osmolaridad. - Esterilizar por filtración - Conservar a 4ºC es oscuridad (Diatrizonato de sodio es fotosensible). Disponibles preparaciones comerciales.  Gradiente de Ficoll Fundamento proceso. - Con la centrifugación de la sangre desfibrinada y en el medio de separación se consigue: - Granulacitos: más densos que el medio, pasan por él y se depositan en el fondo -Eritrocitos: aglutinan al contacto del Ficoll, y aglutinados se depositan en el fondo. - Células mononucleares (L y M) permanecen en interfase entre el plasma y medio de separación, ya que tienen una menor densidad.  Gradiente de Ficoll Fundamento proceso. Se observan 3 fases: - Superior: Plasma - Intermedia (blanca): células mononucleadas - Inferior (rojiza): sedimento de eritrocitos y granulocitos.  Gradiente de Ficoll Procedimeinto. 1. Preparación del medio, o coger 3ml del medio comercial y añadir a un tubo de 15 ml. 2. Preparación de la sangre. Diluir 2 ml de sangre total (EDTA) con dos ml de medio de cultivo sin suero (Ej: RPMI). 3. Añadir sangre diluida sobre el medio de separación. Ojo, no mezclar, colocar sobre él. 4. Centrifugar 20 min. A 400 xg, Tª ambiente y en rotor oscilante. 5. Separación en las 3 fases. La superior recoger con P. Pasteur y desechar. Intermedia, recoger y traspasar a tubo limpio. Inferior descartar.  Gradiente de Ficoll Procedimeinto. 6. Añadir 10 ml de medio sin suero sobre la fase recuperada y resuspender. 7. Lavar las células por centrifugación a 100 xg 10 minutos. Eliminar el sobrenadante y repetir el proceso. 8. Añadir medio donde se conservarán las células para su uso posterior (Ej, RPMI con suero bovino). 9. Cuantificar la viabilidad de las células y efectuar el recuent. (ej azul de tripán: permite diferenciar células de muertas. Las vivas no se colorean, las membranas no dejan pasar el colorante.).  Técnicas de separación de Linfocitos. Separación de poblaciones Existen diferentes técnicas para separar las diferentes poblaciones de linfocitos. 1. Separación celular inmonomagnética: utiliza partículas magnéticas, que se cubren con Ac, que varían dependiendo del tipo de linfocitos a separar. Las partículas retiran las células con el ag correspondiente y las demás quedan libres. (Magnetic Activated cell Sorting). 2. Técnicas de inmunotoxicidad: se separa una población determinada al producir la lisis del resto de poblaciones añadiendo anticuerpos y proteínas del complemento..  Técnicas de separación de Linfocitos. Separación de poblaciones 3. Panning para linfocitos: utiliza placas a las que se unen selectivamente a la población de células deseadas. Ej. Subpoblación de linfocitos B. 4. Citometría de flujo: se separa una población determinada al producir la lisis del resto de poblaciones añadiendo anticuerpos y proteínas del complemento. 5. Filtración con columnas de lana de Nilon: sirve para obtener linfocitos T, libres de Linfocitos B y monocitos, ya que estos se adhieren a la lana de nilon y los linfocitos T no. Se utiliza una columna o jeringa con lana a través de la que pasamos la muestra diluida gota a gota. Los Linfocitos T la atraviesan y se pueden recoger y el resto se células se queda adheridas. Tieen un rendimiento bajo (15-12%)..  Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos. - Los Linfocitos T sensibilizados frente a un antígeno se transforman en linfoblastos que se dividen activamente, si se cultivan en presencia del antígeno o de un agente mitógeno. - La proliferación de linfoblastos implica síntesis de ADN, que podemos medir por la tasa de incorporación de Timidina tritiada a las células. - La tasa de incorporación se usa para estudiar la funcionalidad de los linfocitos T. Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos.  Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos. Procedimiento: 1- Separar los linfocitos por centrifucación con Ficoll y Diatrizoato. 2. Lavar varias veces los linfocitos separados con medio de cultivo celular. 3. Efectuar recuento y ajustar a una concentración 5·10 células. Añadiendo más o menos medio de cultivo. 4. Dispensar en placas de microtitulación de 96 pocillos. 5. Incorporar la solución de antígenos, excepto a los pocillos de control.  Estudio de proliferación en respuesta a mitógenos. Procedimiento: 6. Incubar 72 h a 37ºC y en atmósfera de CO. 7. Añadir Timidina titriada a los pocillos, incubar mínimo 16 horas. 8. Recoger las células sobre filtros de fibra de vidrio y colocarlas en viales con un líquido de centelleo. La radiactividad presente en el líquido se puede medir. 9. Establecer la tasa de proliferación comparando la radioactividad de las células estimuladas y las del control.  Estudio de proliferación mediante citometría de flujo Se utiliza un marcador en los Linfocitos y se mide la reducción de la intensidad de la señal de fuorescencia, es proporcional a la actividad mitógena.  Valoración de citoquinas Se estudian los sobrenadantes de cultivos estimulados con antígenos o mitógenos. El procedimiento es un ELISA en sándwich de dos anticuerpos: 1. Tapizar las placas con un anticuerpo monoclonal frente a la citoquina que se va a determinar (1 Ac). 2. Añadir la muestra problema. Incubar y lavar. 3. Añadir otro anticuerpo monoclonal anti citoquina, marcado con biotina.(2 Ac). Incubar y lavar.  Valoración de citoquinas 4. Añadir el conjugado. Incubar a Tª ambiente y lavar. 5. Añadir el sustrato e incubar a Tª ambiente hasta que aparezca el color. 6. Cuantificar el color con el lector de placas. Se hace una curva patrón. Para poder valorar los resultados. Se consideran positivos los que superan en 3 desviaciones el valor medio e las muestras de control negaticas  Prueba de hipersensibilidad cutánea retardada Consiste en la inoculación intracutánea de una cantidad de conocida de antígeno PPD (derivado proteico purificado) Tras 48-72 horas se observa la zona de la inyección. La prueba se considera positiva si aparece una pápula de más de 2 mm de diámetro. Un resultado puede hacer sospechar de algún tipo de inmunodeficiencia.  Prueba de hipersensibilidad cutánea retardada Consiste en la inoculación intracutánea de una cantidad de conocida de antígeno PPD (derivado proteico purificado) Tras 48-72 horas se observa la zona de la inyección. La prueba se considera positiva si aparece una pápula de más de 2 mm de diámetro. Un resultado puede hacer sospechar de algún tipo de inmunodeficiencia.  Técnica de formación de roseta-E La formación de rosetas-E con eritrocitos de carnero es una técnica barata y fácil de realizar. Los linfocitos T humanos tienen en su superficie la molécula CD2, que permite la unión espontánea a eritrocitos de carnero in vitro. Se forman agrupaciones llamadas rosetas-E. Sólo se forman con Linfocitos T viables. CD2 está presente en todos los Linfocitos T maduros y reacciona con el antígeno LFA-3 (Leukocyte funcion antigen)  Técnica de formación de roseta-E Procedimiento: 1- Obtener Linfocitos por centrifugación en gradiente de F. Ajustar el número de células a 5·10 /ml en medio sin suero. 2. Lavar los eritrocitos de carnero 4 veces con solución salina al 0,85% y resuspendenderlos medio sin suero al 0,5%v/v (0,1 ml de E en 20 ml de medio sin suero). 3. Añadir 0,1 ml de E suspendidos y 0,1 ml de Linfocitos. Añadir 20 µl de suero fetal bovino inactivado.  Técnica de formación de roseta-E Procedimiento: 4. Centrifugar a 50x 5 min e incubar a 4ºC 90 min. 5. Añadir azul tripán para teñir la muestra. 6. Resuspender la muestra suavemente. 7. Tomar una gota por capilaridad y ponerla en cámara de recuento. 8. Contar 100 linfocitos vivos (sin teñir por azul), anotando como rosetas los que tengan 3 o más E adheridos. 9. Los resultados se expresan en %.  Técnica de formación de roseta-E Procedimiento: 4. Centrifugar a 50x 5 min e incubar a 4ºC 90 min. 5. Añadir azul tripán para teñir la muestra. 6. Resuspender la muestra suavemente. 7. Tomar una gota por capilaridad y ponerla en cámara de recuento. 8. Contar 100 linfocitos vivos (sin teñir por azul), anotando como rosetas los que tengan 3 o más E adheridos. 9. Los resultados se expresan en %.  antígeno. Se basa en su capacidad de lisar células diana que expresan el antígeno. Las células dianas se marcan con isótopo radiactivo Cr. El complejo péptido antigénico/ molécula de histocompatibilidad de clase I es reconocido por el TCR Linfocito CD8+, se induce la lisis de la célula diana. Produce la liberación del Cr al medio. Se mide la radiación con un contador gamma. Inconvenientes. Riesgos  a una suspensión de partículas inertes (microesferas de látex) o de microorganismos (bacterias; Staphylococcus o levaduras: Candida) para permitir la fagocitosis y posteriormente cuantificarla. Se estudian las células teñidas. Inconvenientes: la técnica no es capaz de distinguir entre las partículas fagocitadas y las moléculas adheridas a la superficie. También se pueden evaluar por citometría de flujo marcando las bacterias con un colorante fluorescente.  Es un método que permite evaluar el estallido respiratorio de los fagocitos, que tiene lugar justo después de su activación. El estallido respiratorio es inducido por proteínas de membrana y citoplasmáticas (sistema NADPH oxidasa), durante el proceso se genera anión superóxido que gracias a la enzima superóxido dismutasa se transforma en peróxido de hidrógeno.  Evaluación de activación de los fagocitos El NBT es un compuesto soluble amarillo, que al ser endocitado por los fagocitos que generen ión superóxido, es reducido u precipita en forma de cristales de formazán , que son de color púrpura oscuro. En algunas inmunodeficiencias hay defectos en el sistema NADPH oxidasa. Se detecta en el laboratorio porque los fagocitos son incapaces de reducir el NBT tras estimularlos (lipopolisacáridos bacterianos o con otros agentes)  Evaluación de la actividad microbicida Para evaluar la actividad microbicida de los fagocitos se incuban con una cantidad conocida de microorganismos (bacterias o levaduras). Después de la incubación se hace un recuento de la viabilidad residual del agente microbiano. Cuando el número de unidades formadoras de colonia disminuye nos indican que han sido eliminadas por acción de los fagocitos. Evalúa la capacidad de ingestión de los fagocitos, pero también la capacidad de destrucción.  Ensayos de quimiotaxis Evalúan la capacidad de locomoción direccional de los neutrófilos al ser atraídos por diferentes estímulos. Se utilizan dos cámaras aisladas separadas por un filtro. En una de las cámaras (interior) se colocan las células y en la otra (exterior) un agente quimiotáctico. El dispositivo más utilizado es la cámara de Boyden.  Ensayos de quimiotaxis Las células (neutrófilos) atraidas por el agente quimiotáctico, intentan desplazarse hacia él, pero quedan retenidas en la membrana que separa los dos compartimentos. Tras dejar pasar un periodo de incubación , la membrana se tiñe y se observa al microscopio.  Ensayos de quimiotaxis Comercialmente hay dispositivos de cámaras de Boyden. Son celdas de cultivo cilíndricas insertadas en un pocillo de una placa de cultivo. Estos insertos tienen la membrana con un tamaño de poro determinado. Las células se siembran en la parte superior, en medio sin suero, en la parte inferior se añade medio con suero y una sustancia quimioatrayente. Las células se desplazan a hacia la memebrana y luego se tiñen y observan. El tamaño del poro debe ser menos que las células https://www.instagram.com/ cebio.ecuador/reel/ DAuKg9wvajW/  Estudio del complemento El sistema del complemento se puede activar por varias vías: - Vía clásica: la inician los anticuerpos (IgM e IgG). - Vía alternativa: la inician moléculas presentes en la superficie de los patógenos. - Vía de las lectinas: la inician residuos de manosa de la superficie bacteriana. Los defectos en el sistema del complemento producen situaciones patológicas, como inmunodeficiencias o enfermedades autoinmunes.  Estudio del complemento Las alteraciones del complemento se pueden evaluar mediante pruebas funcionales y pruebas inmunoquímicas. - Cuantificación de las fracciones C3 y C4. - Análisis de la vía clásica: Técnica CH50 y Técnica de hemólisis en gel de agarosa  Cuantificación de las fracciones C3 y C4 La cuantificación de los componentes C3 y C4 (proteínas que activan los fagocitos) se realiza mediante diferentes técnicas: - Inmunodifusión radial - - Inmunonefelometría. Inconvenientes de estas técnicas: miden tanto los componentes funcionales como los inactivados y algunos fragmentos de degradación de ellos,  Análisis de la vía clásica. Técnica CH50 Se mezcla suero fresco con una suspensión de eritrocitos sensibilizados con anticuerpos, el complementos se activa por la vía clásica y se producirá la lisis de los eritrocitos. Se realiza una curva patrón con cantidades crecientes de suero problema que contendrá cantidades crecientes de complemento. Y se calcula el volumen de suero que lisa el 50% de los eritrocitos.  Análisis de la vía clásica. Técnica CH50 Esta medida es la que se define. como unidad hemolítica 50 o unidad CH50. Luego se calcula el número de unidades de CH50 por mililitro de suero. Ej: 10 µl de suero problema producen la lisis del 50% de los eritrocitos, esto significa que en 10 µl hay 1 unidad de CH50. Por tanto en 1 ml habra 100 unidades de CH50.  Análisis de la vía clásica. Técnica CH50 Procedimiento: 1. Preparación eritrocitos de carnero.. - Lavar los eritrocitos con PBS y resuspenderlos con tampón para CH50. - Homogeneizar la suspensión de E y transferir a un tubo con agua para lisar los eritrocitos. - Leer la absorvancia a 540 nm en una cubeta de 1 cm y ajustar.  Análisis de la vía clásica. Técnica CH50 Procedimiento: 2. Sensibilizar los eritrocitos con anticuerpos (EA) Se utiliza un antisuero obtenido. en conejo que contiene anticuerpos frente a los antígenos de los eritrocitos de carnero. HEMOLISINA. Fases: - Mezclar en un tampón los E y a hemolisina a concentraciones adecuadas. - Homoeneizar suavemente para no romper eritrocitos. - Incubar para obtener la suspensión de los EA.  Análisis de la vía clásica. Técnica CH50 Procedimiento: 3. Preparación de las diluciones de suero problema. - Diluir la muestra de suero fresco. a 1/20 y diluir suero control. - Preparar una serie de 7 tubos. La cantidad de agua destilada del último tubo produce la lisis del 100% de los E. - Añadir a todos los tubos la misma cantidad de suspensión de EA. - Incubar a 37 ºC y agitar periódicamente. - Meter los tubos en hielo, añadir tampón frío y centrifugar. - Leer absorbancias de los sobrenadantes a 540 nm. 4. Realizar los cálculos. lítico eritrocitos incorporados en un gel de agarosa. Se prepara un gel de agarosa. en el que se incorporan eritrocitos sensibilizados con anticuerpos y se excavan pocillos en él. Se añade suero con complemento activo a los pocillos, este difunde radialmente y genera un halo circular de lisis de los eritrocitos contenidos en el gel. Podemos medir el halo. El diámetro del halo es proporcional a la concentración y funcionalidad del complemento que hay en la muestra.  Análisis de la vía clásica. Técnica de homólisis en el de agarosa Procedimiento: - Preparar los eritrocitos sensibilizados. - Preparar agarosa fundida con. tampón. - Añadir los EA a la agarosa en la concentración adecuada, homogeneizar y verter en una placa plástica hasta que solidifique. - Excavar los pocillos. - Añadir en los pocillos las muestras problemas, controles e incubar. - Medir diámetros. - Hacer los cálculos límite en que la muestra pasa de ser capaz de producir un 100% a un. 0% de lisis.