Cultivos Celulares - Tema 1 PDF

Cultivos celulares Tema 1. Principios y métodos básicos de cultivo celular Prof. Mirja Rotinen Departamento de Ciencias de la Salud Universidad Pública de Navarra  Técnicas de cultivo celular (cell culture) ´ Consisten...

Cultivos celulares Tema 1. Principios y métodos básicos de cultivo celular Prof. Mirja Rotinen Departamento de Ciencias de la Salud Universidad Pública de Navarra  Técnicas de cultivo celular (cell culture) ´ Consisten en el cultivo de células dispersas obtenidas de un tejido a partir de disgregación mecánica, enzimática o química, o de líneas celulares establecidas. ´ Denominación inicial: cultivo tisular (tissue culture). ´ Incluso utilizado para referirse a cultivos 3D de téjidos no disgregados (organ culture). todo parte de un explante de tejido humano y ponerlo sobre un vidrio/plastico y intentar mantenerlo en medio de cultivo problema: no se puede propagar una vez individualizadas, empizan a pero si una de las celulas que conforman el tejido dividirse y establecen conexiones con migra de manera expontanea, si esa celula otras celulas sobrevive en el medio adecuado va a ser capaz de dividirse, y va a dar lugar a x celula con cada cuando se llega a confluencia division celular (cuando el frasco se llena) se las celulas que se están dividiendo van a llenar el consume el medio de cultivo y se frasco subcultiva en otro frasco/medio cultivo primario in vitro: en celulas de cultivo in vivo: seres vivos al subcultivarse las celulas cambian respecto a sus celulas originales, no son clones identicos y eso con los en vez de esperar a que la celula migre se pueden usar pases se van acumulando disgregantes quimicos? que hacen que se favorezca la individualización de las celulas y permite que haya celulas por lo tanto, se congelan las células y individuales en el frasco y que comiencen a dividirese se descongelan para trabajar con ellas  Un poco de historia… con PBS: las celulas a la larga no sobreviven ´ 1885 Roux. Mantiene células embrionarias de pollo en solución salina durante varios días. ´ 1907 Harrison. Cultiva médula espinal embrionaria de anfibios. Observa el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y establece que el axón se formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusió́n de una cadena de células. ´ 1910 Burrows. Logra identificar un medio de cultivo adecuado (plasma) para nutrir R. G. Harrison los explantes de tejidos embrionarios de pollo. 1870-1959 ´ 1912 Burrows y Carrel. Comprueban que las células pueden proliferar en cultivo. disgregante químico ´ 1916 Rous y Jones. Emplean por primera vez tripsina para disociar células. ´ 1952 Gey. Establece una línea celular continua de carcinoma cervical humano conocida actualmente como “línea celular HeLa”. ´ 1954 Rita Levi-Montalcini. Establece que el factor de crecimiento nervioso (NGF) estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo (Premio Nobel 1986). ´ 1955 Eagle. Realiza el primer estudio sistemático de los requerimientos nutricionales R. Levi-Montalcini de las células en cultivo. 1909-2012 ´ 1961 Hayflick y Moorhead. Comprueban que los fibroblastos humanos en cultivo mueren tras un número limitado de divisiones. Establecimiento de la línea celular HeLa (1952) HeLa cells HENRIETTA LACKS DR. GEORGE OTTO GEY https://www.youtube.com/watch?v=EpfArSMnH1A  Ventajas de las técnicas de cultivo celular ´ Control de las condiciones fisicoquímicas y fisiológicas. Fisicoquímicas: pH, temperatura, presión osmótica, presión de oxígeno (O2) y de dióxido de carbono (CO2). que reciben las celulas de culitvo Fisiológicas: composición del medio de cultivo en nutrientes, metabolitos, hormonas, etc. ´ Muestra homogénea - - buena caracterización el trabajo con cultivo celular proporciona muestras homogenesas ´ Economía experimental (vs. in vivo). barato en comparación con experimentos con animales ´ Aspectos éticos (vs. in vivo). se evita matar ratones Desventajas de las técnicas de cultivo celular ´ Contaminaciones por microorganismos (trabajo en condiciones de asepsia). ´ Coste elevado del equipamiento y material. los cultivos están fuera de contexxto no están en la ´ Desventajas biológicas (vs. in vivo): estrcutura 3D en la que está el organismo vivo Inestabilidad de las poblaciones celulares (inestabilidad genética, desdiferenciación, selección…) en determinado momento un clon comienza a proliferar mas rapido Falta de control nervioso y endocrino porque crecen en una monocapa (dos diapos mas adelante) Ausencia de estructura 3D y de relaciones intercelulares específicas Cambios relacionados con el metabolismo energético Características de la célula cultivada ´ Cultivo primario: se obtiene a partir de células procedentes de un tejido, por disgregación (enzimática/mecánica/química) o migración. son células capaces de proliferar pese a haber perdido las interacciones célula- célula y célula-matriz extracelular. se produce un proceso de selección. cuando ocupan toda la superficie disponible de la botella se dice que han alcanzado la confluencia. en esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferación y el crecimiento se detiene. se detienen de dividir si hay muchas celulas en contacto para mantener el cultivo es necesario transplantar la células a un nuevo soporte (diluirlas en nuevo medio de cultivo y pasarlas a otros frascos) y realizar sucesivos subcultivos o pases. En este caso se habla ya de línea celular. Ø Crecimiento en monocapa Las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o vidrio). para que la celula se empiece a dividir la celula tienen que estar adherida al sustrato El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el modo normal de proliferación de la mayor parte de las células con excepción de las células hematopoyéticas. Ø Crecimiento en suspensión Son independientes de anclaje. Es propio de células hematopoyéticas, células madre, de algunas líneas transformadas y de algunas células tumorales. como son muy agresivan pierden la capacidad de anclaje y crecen en suspensión  that suppresses the androgen axis.” Nature medicine vol. 24,12 (2018): 1887-1898. Rotinen et al. “ONECUT2 is a targetable master regulator of lethal prostate cancer la morfologia nos indica con que clase de celula estamos trabajando y nos da info sobre su comportamiento un factor neuronal sobreexpresado y observo cambio de siempre adheridas conformacion que cambiaban al sustrato de morfologia desde una celula de cancer de prostata a parecer una nuerona adheridas al sustrato mas regulares pero con forma de sustrato Cell Culture Basics Handbook (ThermoFisher Scientific) celulas en suspension probablemente de origen sanguineo neuronas (muy especializadas) tienen morfologia propia  Características de la célula cultivada ´ Líneas celulares finitas: dejan de dividirse tras un número limitado de divisiones en cultivo (ej. fibroblastos, 25-40 divisiones). Superado ese límite, las células entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su capacidad de proliferar (supuestamente por el acortamiento de los telómeros) y mueren. ´ Líneas celulares continuas: sufren una transformación que les hace capaces de crecer pueden crecer de indefinidamente (ej. HeLa) manera ilimitada transformación espontánea mutacion muy buena herramienta de trabajo transformación inducida (radiaciones, virus, agentes químicos…) (finita) metabolicamente cultivo que activa pero no entra en se divide y senescencia eventualmente (si dejas las morirá celulas sin cambiarlas de medio y las dejar proliferar linea de prostata humana qeu ha hasta que sido tranformada y se tiene como llenen la placa linea celular de cancer necesario entrarán en para probar que los compuestos a senescencia) investigar no matan a celjulas normales nos interesa buscar un compuesto que mate las cancerigenas pero que no afecte a las normales esto sería un modelo normal (foto)  Características de las células transformadas in vitro Relativas al núcleo Alta relación núcleo-citoplasma. Alteraciones cromosómicas (en número y estructura). Relativas a la superficie celular Cambios en la membrana plasmática (transporte, movilidad de proteínas, aumento de blebbing).invaginaciones membrana de la nucleo muy grande y Cambios antigénicos, de glucoproteínas de membrana. poco citoplasma Alteraciones de la adherencia Independencia de anclaje: disminución de la necesidad de adherencia a superficies. Disminución de la capa externa de fibronectina. Desorganización de las fibras de estrés (haces de filamentos de actina). Aumento de la producción de proteasas y, por tanto, incremento de la proteólisis extracelular. favorece metastasis? Relativas al crecimiento y división llegan a formar mini tumores No inhibición del crecimiento por densidad celular.cuanto menos dependiente sea del medio de cultivo Bajos requerimientos de factores de crecimiento. mas agresivo va a ser por lo que van a seguir Inmortalidad. dividiendose aunque tengan Capacidad de inducir tumores. por ejemplo menos suero donde se encuentran los factores de crecimiento Datos tomados de Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. ElSevier Masson (2014) p.267. Cultivos 3D ´ Las células en cultivo pierden muchas características tras la disgregación del tejido. Por ello se están volviendo a la utilización de explantes de tejidos y órganos. ´ En ellos se retienen la estructura histológica y fisiológica original de las células, así como sus relaciones intercelulares. ´ Presentan limitaciones: Necrosis por difusión pobre del O2 a las zonas más profundas del tejido No se pueden propagar Variabilidad grande Reproducibilidad baja  Cultivos histotípicos y organotípicos (cultivos 3D) ´ Cultivo histotípico: amplificación de un solo tipo celular en ambiente tridimensional que mimetice la estructura original del tejido. Esferoides: clusters de células formadas por reasociación de células en cultivo. Pueden crecer en suspensión o en la parte superior de una matriz 3D. Se pueden obtener por varios métodos: para evitar que las celulas se puedan adherir al método de la superficie no adherenteplastico favoreciendo la formación de esferoides cultivo en suspensión: agitación/viscosidad del medio método de la gota colgante *Esferoides multicelulares (MCTS: Multicellular tumor spheroids) para observar interacciones entre células ´ Cultivos organotípicos: se caracterizan porque constan de varios tipos celulares que interaccionan entre sí de una forma que intenta ser lo más similar posible a la original. Los cultivos organotípicos constituyen la base de la ingeniería de tejidos. Este tipo de cultivos persigue la creación “in vitro” de tejidos u órganos completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en transplantes. Requieren el diseño de soportes especiales que crean una interfaz de aire/medio. Ojo! terminología francesa vs. anglosajona.  Meseguer, et al. Departamento de Biología Celular e Histología (Biología Celular), Universidad de Murcia. Esferoides y esferas líquidas. Cultivos celulares en 3D para mimetizar el ambiente de las células en el organismo. J en una placa de petri se ponen gotas que contienen celulas de ese tipo celular se juega con la viscosidad del medio de cultivo se genera un ambiente con humedad muy alta y se quedan las celulas arriba y las celulas se reasocián en la gota formando esferoides  explante de tejido organotipico mantener el tejido lo maximo en cultivo reasociación de dos tipos celulares Nath S, Devi GR. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacol Ther. 2016;163:94-108. doi:10.1016/j.pharmthera.2016.03.013  Cultivos organotípicos (cultivos 3D): organs-on-a-chip Huh D, Matthews BD, Mammoto A, Montoya-Zavala M, Hsin HY, Ingber DE. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 2010;328(5986):1662-1668. doi:10.1126/science.1188302  Recap: ´ Cultivo de órganos ´ Explantes primarios ´ Cultivo celular primario ´ Líneas celulares ´ Cultivos histotípicos ´ Cultivos organotípicos EL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR Tissue culture room Tipos de laboratorio de cultivo celular: ´ Niveles de bioseguridad (BSL: biosafety level) Atendiendo a los agentes biológicos con los que se va a trabajar, los laboratorios se clasifican como: Laboratorio básico – nivel de bioseguridad 1 (BSL-1) Laboratorio básico – nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) Laboratorio de contención – nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) Laboratorio de contención máxima – nivel de bioseguridad 4 (BSL-4) Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes biológicos de los distintos grupos de riesgo. Agentes biológicos: microorganismos, con inclusión de los genéticamente modificados, cultivos celulares y endoparásitos humanos, susceptibles de originar cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad. ´ Agente biológico del grupo 1: nula o escasa probabilidad de causar una enfermedad al ser humano. Ejemplos: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, ciertas cepas de Escherichia coli. ´ Agente biológico del grupo 2: puede causar enfermedades (supone un riesgo para los trabajadores) pero existe muy baja probabilidad de que se propague a la comunidad y se dispone de profilaxis o un tratamiento eficaz. Ejemplos: Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii ´ Agente biológico del grupo 3: puede causar enfermedades graves (peligro serio para los trabajadores) y la infección puede propagarse con cierta facilidad a la comunidad, si bien existen posibles medidas preventivas o terapéuticas. Ejemplos: VIH, Coxiella burnetii, Mycobacterium tuberculosis. ´ Agente biológico del grupo 4: puede causar enfermedades graves (peligro serio para los trabajadores) y la infección puede propagarse con cierta facilidad a la comunidad. No existe profilaxis o un tratamiento eficaz disponible. Ejemplos: Virus del ébola, de Marburg y de Lassa. Los básicos de un laboratorio de cultivo celular: ´ Cabina de flujo laminar ´ Incubador de CO2 ´ Microscopio invertido ´ Centrífuga para tubos ´ Contador de células ´ Material estéril ´ Contenedor para desechar material biológico ´ Baño termostático ´ Congeladores y depósito de N2 líquido  La importancia de mantener una técnica aséptica para evitar contaminaciones Click here: https://www.youtube.com/watch?v=nr1tV_LuqJk ´ Asepsia: ausencia absoluta de gérmenes. Sin infección o contaminación. Conjunto de procedimientos o métodos para evitar la contaminación. Exclusión continua de microorganismos contaminantes. no toda forma de vida como pasa con la esterilización ´ Esterilización: eliminación de toda forma de vida de un material o medio. Conjunto de procedimientos que destruyen los gérmenes, impiden su desarrollo y evitan contaminación. ´ Desinfección: conjunto de procedimientos para destruir o eliminar agentes contaminantes de todo lo que no pueda esterilizarse (por ejemplo: mobiliario). materiales que no se pueden esterilizar contaminación hace que el medio de culto cambie de color el medio contiene porque acidifica mucho el rojo fenol (indicador medio de ph) Click here: https://youtu.be/zXPiZ2XBUzE levaduras 293 cells contaminated with yeast Contaminantes de cultivo celulares: ´ Químicos: impurezas en el medio, suero o agua, incluyendo endotoxinas, plásticos y detergentes. ´ Biológicos: bacterias, levaduras, hongos, micoplasma, virus y otras líneas celulares. bacterias sin pared celular que no provocan en el cultivo cambios que no se ven (no cambia el color del medio) (Hoechst: colorante fluorescente que tiñe núcleos y el micoplasma) hongos  Cabinas de flujo laminar: ´ La función principal de un flujo unidireccional/laminar es proporcionar un área de trabajo libre de partículas y contaminación. ´ Esto se consigue gracias a la ausencia de partículas al ser filtrado el aire por un filtro de alta eficiencia HEPA (high efficiency particulate air). El filtro HEPA retiene partículas desde un tamaño de 0.3 µm con una eficiencia del 99,97%. hace que el aire que incide sobre mi muestra esté esteril y no contamine ´ Filtros ULPA (Ultra Low Penetration Air): 99,9995% de eficiencia para la filtración de partículas MMPS (0,1 – 0,25 micras). ´ El aire impulsado debe tener una uniformidad de velocidad controlada acorde a la normativa a cumplir. ´ Configuración de las cabinas: Elsevier Masson 2ª Edición. Montuenga L. Técnicas en histología y biología celular. Ed. Vertical supone una gran difrencia Horizontal la vertical hace que aire incida verticalmente sobre nuestra muestra protegiendolas ´ Protección: el horizontal incide ademas de la muestra sobre ti y eso no garantiza tu seguridad De la muestra Del operador Medioambiental entra aire del exterior ´ Recomendaciones: Encender lámpara ultravioleta 30 minutos antes (germicida). No generar corrientes de aire. Cambiar periódicamente los filtros.  ´ Clase I no son adecuadas para trabajar con cultivos celulares Tipos de cabinas: ´ Clase II: A1, A2, B1 y B2 (distintas velocidades y % de aire reciclado) dentro de las verticales ´ Clase III Clase II Clase III Clase I Clase I: protección al operador y al ambiente. Clase III: protección al operador, a la muestra y al No protege el producto con el que se trabaja. ambiente Cabina totalmente sellada. Clase II: protección al operador, a la muestra y al Adecuada para trabajar con agentes del grupo 4 ambiente. Adecuada para trabajar con agentes del grupo 1, 2 y 3  ´ temperatura Incubador de CO2: control de ´ humedad ´ presión parcial de CO2 La T óptima depende de la temperatura corporal del animal del que proceden las células. También varía según el tejido (ej. testículo). El hombre y la mayoría de animales de sangre caliente: 36,5-37ºC Excepciones: aves (39-40ºC), cerdos (38,5ºC) La humedad es elevada para evitar la evaporación del medio de cultivo. El nivel de CO2 suele ser de en torno al 5%. El CO2 en la fase gaseosa se disuelve en el medio, estableciéndose un equilibrio con los iones de bicarbonato y estabilizando el pH. La mayoría de las líneas celulares crecen bien a pH de 7.4, pero el pH óptimo para una determinada línea celular puede variar: fibroblastos (7,4-7,7), células transformadas (7-7,4). El nivel de O2 es variable. La presión atmosférica (21%) es suficiente para células en cultivo. El requerimiento es mayor en el cultivo de órganos (hasta un 95%). La profundidad del medio de cultivo puede influir en la tasa de *En los más modernos: + filtro HEPA difusión del O2 a las células (aconsejable 2-5 mm altura; 0,2 a 0,5 + inyección agua filtrada mL/cm2). Microscopio invertido: fuente de luz y ´ El revólver portaobjetivos se encuentra debajo de la condensador platina. La platina se encuentra en posición fija y para enfocar la muestra lo que se mueven son los objetivos. ´ La fuente de luz y el condensador se localizan en la parte superior. revólver ´ La amplia distancia de trabajo que así se genera permite observar especímenes o muestras gruesas, como células creciendo en medios de cultivo de varios milímetros de espesor. ´ Permiten observar las muestras situadas en el fondo de un recipiente. Esto es muy útil para mantener las muestras hidratadas y permite hacer observaciones de muestras vivas durante largos periodos de tiempo. ´ El contraste de fases, la interferencia diferencia o la fluorescencia… son algunos de las técnicas de microscopio observación usadas con los microscopios invertidos para invertido con monitor en vez de oculares el estudio de las células vivas. ´ Se utilizan para las técnicas de fecundación in vitro. Recuento celular: hemocitómetro https://www.youtube.com/watch?v=pP0xERLUhyc &list=TLPQMTAwODIwMjBVl6Mh5_il6w&index=2  Recuento celular automatizado: contador electrónico y análisis de imagen ´ Contadores coulter ´ Análisis de imagen ´ Citometría de flujo Esquema contador Coulter Recipientes de cultivo y sustratos: ´ Las células hematopoyéticas y algunas células transformadas pueden proliferar sin adherirse al sustrato. Crecen en suspension. ´ La mayoría de células son dependientes de anclaje: necesitan adherirse al sustrato (matriz o base sólida) para dividirse. ´ Originalmente se utilizó el vidrio (barato, fácil de lavar, esterilizable, opticamente claro). Hoy en día se utiliza plástico (poliestireno) con una superficie totalmente plana y propiedades ópticas superiores. ´ El poliestireno es hidrofóbico, no adecuado para la adhesión celular, por eso debe recibir un tratamiento químico o con radiación γ, para producir una superficie con carga y capaz de humedecerse. ´ En algunos casos se usan recubrimientos de proteína de la matriz extracelular para mejorar la adherencia (colágeno, fibronectina, laminina). Los medios de cultivo: componentes tipicos de los medios de cultivo Composición de un medio típico adecuado para el cultivo de células de mamífero Aminoácidos Vitaminas Sales inorgánicas Varios Proteínas Arginina Biotina NaCl Glucosa Insulina Cisteína Colina KCl Penicilina Transferrina Glutamina Folato NaH2PO4 Estreptomicina Factores de Histidina Nicotinamida NaHCO3 Anfotericina B crecimiento Isoleucina Pantotenato CaCl2 Rojo fenol específicos indicador de ph Leucina Piridoxal MgC2 Suero Lisina Tiamina Metionina Riboflavina Fenilalanina para evitar contaminaciones bacterianas (antibioticos) Treonina Triptófano Tirosina Valina Datos tomados de Montuenga et al. Técnicas en histología y biología celular. ElSevier Masson 2ºEdición (2014) p. 274 Los medios de cultivo: ´ Las formulaciones más comunes: MEM o EMEM: medio esencial mínimo de Eagle, Eagle´s minimum essential medium DMEM: medio de Eagle modificado por Dulbecco, Dulbecco´s modified Eagle medium RPMI: formulación de Roswell Park Memorial Institute en el que se puede crecer prácticamente de todo Otros: F12 (Ham´s nutrient mixture), Opti-MEM, Media 199 ´ Soluciones salinas: ej. PBS (Phosphate-Buffered Saline) Contienen sales inorgánicas y en algunos casos, glucosa y bicarbonato en general se utiliza para diluir medios y lavados Para diluir medios, hacer lavados e incubaciones cortas (no más de 4h siempre y cuando lleven glucosa) Son soluciones isotónicas pero no necesariamente nutrientes ´ Suero (5-20%) Los más comunes: FBS (suero fetal bovino), el de ternera recién nacida, de caballo y humano. que les rodea y son capaces de crecer sin factores de adhesion que es lo que aporta el suero excepcionalmente se pueden no utilizar suero porque hay ciertas celulas transformadas que van a adquirir esa independecnia dle medio Contiene factores de crecimiento y factores de adhesión. Fuente de minerales, lípidos (vitaminas liposolubles) y hormonas. se obtiene mediante Obtención: coagulación-filtrado-control-inactivación para cutivo evitar que haya linfocitos citotoxicos que puedan alterar el Importancia de la adquisición de lotes completos para evitar varibilidad en los resultados para ver que no está contaminado si es del mismo lote te aseguras de que no hay pequeñas variaciones en los resultados Los medios de cultivo: Componentes del suero Proteínas Factores de Hormonas Lípidos Minerales crecimiento Fibronectina PDGF Insulina Ácido oleico Zinc Albúmina GH Hidrocortisona Ácido linolénico Hierro Transferrina EGF Etanolamina Selenio α2-macroglobulina FGF Fosfatidiletanolamina Cobre VEGF Colesterol IGF-1 Prostaglandinas Congelación: toleran muy bien las disminuciones de temperatura, no como el aumento, qeu aumentando 2 grados pro encima de su crecimiento optimo se mueren ´ Las células en cultivo de mamífero no toleran aumentos de más de 2ºC por encima de su temperatura óptima (las humanas mueren rápidamente a 40ºC). ´ En cambio, pueden tolerar disminuciones de temperatura: pueden sobrevivir varios días a 4ºC o ser congeladas (-80ºC; -196ºC en nitrógeno líquido). ´ Para su congelación necesitan de agentes crioprotectores (DMSO o glicerina) para evitar la formación de cristales de hielo. que rompan las paredes de las membrana para que luego en el proceso de descongelación puedan ser viables Aplicaciones del cultivo celular: Cell Culture Basics Handbook (ThermoFisher Scientific) VIDEOS https://www.youtube.com/watch?v=CA5fVLK5zAE https://www.youtube.com/watch?v=ON2e1VsBhJk https://www.youtube.com/watch?v=CMRKKl9XSDU