Sintesi delle Proteine: La Traduzione PDF

Sintesi delle proteine: la traduzione  Dal RNA alle proteine: la traduzione TRADUZIONE = SINTESI DI PROTEINE Replicazione del DNA Riparazione del DNA Ricombinazione genetica Trascrizione: copiare un mess...

Sintesi delle proteine: la traduzione  Dal RNA alle proteine: la traduzione TRADUZIONE = SINTESI DI PROTEINE Replicazione del DNA Riparazione del DNA Ricombinazione genetica Trascrizione: copiare un messaggio usando lo steso linguaggio (o quasi). Traduzione: copiare un messaggio usando un linguaggio diverso: Il codice genetico Sintesi dell’RNA Trascrizione Sintesi delle proteine Traduzione  Dal RNA alle proteine: la traduzione Il codice genetico è fatto di parole di tre lettere (basi): codoni 4 nucleotidi in gruppi di 1: 4 parole 4 nucleotidi in gruppi di 2: 4 x 4 = 16 parole 4 nucleotidi in gruppi di 3: 4 x 4 x 4 = 64 parole 20 aminoacidi INIZIO FINE Questo codice è quasi universale, a eccezione di alcune differenze in mitocondri e alcuni protozoi e funghi.  codone di inizio: AUG 3 codoni non senso (di arresto): UAA, UAG, UGA ogni codone codifica per un solo aa: codice coerente 18 su 20 aa sono codificati da più di un codone: codice degenerato o ridondante Il codice è universale (con poche eccezioni) IL CODICE GENETICO E’ DEGENERATO MA NON AMBIGUO Come è stato decifrato il codice genetico? Primi anni sessanta (Nirenberg e Matthaei, 1961). - Hanno creato un sistema acellulare (cell free system) per studiare la sintesi delle proteine in assenza degli altri componenti cellulari, prendendo i componenti del citoplasma di E. coli e centrifugando ad alta velocità per trattenere solo la parte solubile: ribosomi e molecole; gli mRNA batterici vengono distrutti con una ribonucleasi. - Poi hanno creato un polinucleotide fatto di solo U (e poi solo A e solo C), e l’hanno aggiunto al sistema acellulare, insieme ad amminoacidi radioattivi purificati, una tipologia per esperimento. Così hanno capito il primo codone: UUU = fenilalanina, e dopo hanno scoperto AAA = lisina e CCC = prolina, e finalmente decodificato tutto il codice genetico. mRNA sintetico Polipeptide radioattivo risultante Sistema di traduzione in vitro contenente un aa radioattivo alla volta  Dal RNA alle proteine: la traduzione Un polinucleotide si può leggere in tre modi, iniziando dal primo, dal secondo o dal terzo nucleotide a fare i codoni, ma in ogni mRNA c’è soltanto un messaggio corretto che produce una proteina funzionale: c’è un solo modulo di lettura corretto (reading frame).  Dal RNA alle proteine: la traduzione Tipi di mutazioni nel DNA e loro effetto sulla lettura in triplette (codoni) HAI SEI API BLU PER TRE MIE ZIE PIE HAI SEI API BLU PER TRE MIE ZIE PIE mutazione neutra HAI FEI API BLU PER TRE MIE ZIE PIE sostituzione HAI GSE IAP IBL UPE RTR EMI EZI EPI E inserzione HAI EIA PIB LUP ERT REM IEZ IEP IE delezione HAI GSE IPI BLU PER TRE MIE ZIE PIE inserzione + delezione Gli RNA transfer (tRNA): adattatori per appaiare ogni codone al suo amminoacido, lungi ˜80 nucleotidi. Una delle anse lega il codone nel mRNA, appaiando tre nucleotidi del tRNA: l’anticodone. L’altra estremità (3’) lega l’amminoacido codificato dall’anticodone.  Dal RNA alle proteine: la traduzione Il secondo adattatore per decifrare il codice genetico: amminoacil-tRNA sintetasi. Sono gli enzimi che legano il giusto amminoacido al corrispondente tRNA (o tRNAs). Sono in grado di riconoscere sia delle sequenze nei tRNA che la struttura del amminoacido a legare, e usano energia (ATP) per catalizzare la formazione di un legame ad alta energia. Amminoacil-tRNA Legame ad alta energia tRNA sintetasi Dal RNA alle proteine: la traduzione riconoscimento dell’aa specifico attivazione dell’aa aa-AMP aminoaciladenilato riconoscimento del tRNA specifico legame dell’aa attivato con il tRNA specifico aa-tRNA aminoacil-tRNA Dal RNA alle proteine: la traduzione tRNA  Dal RNA alle proteine: la traduzione Ci sono più tRNA di 20: - Alcuni amminoacidi legano più di un tipo di tRNA: anticodoni diversi ma sinonimi. - Alcuni tRNA legano più di un codone, legando più specificamente i primi due nucleotidi e in modo meno esigente il terzo nucleotide: appaiamento oscillante. Esempio: arginina: AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU – 6 anticodoni sinonimi 64 20 ˜40 codoni ammino tRNA mRNA acidi  Dal RNA alle proteine: la traduzione Già ne abbiamo il messaggero e i tRNA pronti, ora ci manca la macchina molecolare per metterli insieme: i ribosomi.  Dal RNA alle proteine: la traduzione I ribosomi sono fatti da proteine (proteine ribosomiche) ed rRNA (RNA ribosomiali). Questi componenti si combinano per formare due subunità: - subunità maggiore - subunità minore Subunità maggiore Subunità minore Nelle cellule eucariotiche, gli RNA ribosomiali vengono trascritti in zone particolari del nucleo, i nucleoli, dove si assemblano le subunità dei ribosomi.  PROCARIOTI EUCARIOTI 3 tipi di rRNA + 55 proteine 4 tipi di rRNA + 82 proteine (S: unità di Svedberg's, per misurare la velocità di sedimentazione durante la centrifugazione) Struttura di un RNA ribosomiale RNA subunità maggiore Proteine subunità maggiore RNA subunità minore Proteine subunità minore Credit: Noller’s group  Dal RNA alle proteine: la traduzione Le due subunità si legano fra di loro attorno a un mRNA, e si separano alla fine della traduzione. Nel ribosoma ci sono un sito di legame per l’mRNA e tre siti per i tRNA. Sito A: amminoacil-tRNA Sito P: peptidil-tRNA Sito E: exit (uscita) Nei procarioti, i messaggeri non hanno un cappuccio 5’. In vece ci sono delle sequenze iniziatrici (5-10 bp) collocate 4-7 nucleotidi prima del codone di inizio AUG, che indicano l’inizio di ogni gene, e dove i ribosomi si legano. I messaggeri dei batteri sono policistronici: ci sono diverse proteine codificate in ogni messaggero, ognuna con la sua sequenza d’inizio. Così la traduzione di ogni gene al interno del messaggero può cominciare indipendentemente degli altri. Negli eucarioti, gli RNA sono monocistronici, codificano per una sola proteina e l’inizio si riconosce dal cappuccio di metilguanosina al 5’ LA SINTESI DELLE PROTEINE Con l’arrivo del secondo tRNA-aa comincia la Una volta legata traduzione. all’mRNA, la subunità minore si muove verso l’estremità 3’ in ricerca del primo AUG dove cominciare la traduzione. Quando lo trova, i fattori d’inizio si staccano e si unisce la subunità maggiore, completando il ribosoma.  Dal RNA alle proteine: la traduzione Tutte le proteine cominciano da un codone d’inizio: AUG, al quale corrisponde l’amminoacido metionina (Met). Il primo tRNA-Met è il tRNA iniziatore, diverso dagli altri tRNA-Met, l’unico in grado di legarsi alla subunità minore: - prima si legano i fattori d’inizio della traduzione, - dopo si lega il tRNA iniziatore, - e finalmente tutto il complesso si lega all’estremità 5’ (riconosciuta dal cappuccio) di un mRNA per iniziare la traduzione.  Dal RNA alle proteine: la traduzione I siti A, P ed E si occupano due alla volta. Arriva un tRNA-aa nuovo (4) che si appaia al codone nel sito A, subito dopo il codone precedente (3).  Dal RNA alle proteine: la traduzione Messi uno accanto all’altro, gli aa ai posti P ed A vengono legati in maniera covalente (legame peptidico), grazie all’azione enzimatica della subunità maggiore del ribosoma e all’energia liberata dal legame fra tRNA e amminoacido (3). In questa configurazione, l’estremità carbossilica del amminoacido in P si lega alla’estremità amminica del amminoacido in A: la proteina comincia dall’estremità amminica e finisce con quella carbossilica.  Dal RNA alle proteine: la traduzione Dopo la formazione del legame peptidico, la subunità maggiore si sposta verso l’estremità 3’ dell’mRNA. Il tRNA che porta l’ultimo amminoacido incorporato e legato al polipeptide in crescita si sposta dal sito A al sito P, e il tRNA vuoto dal sito P al sito E.  Dal RNA alle proteine: la traduzione La subunità minore si sposta a seguito di quella maggiore, rendendo accessibile il sito A al prossimo tRNA-aa in arrivo.  Dal RNA alle proteine: la traduzione Con l’arrivo di un nuovo tRNA che entra nel sito A, si ricomincia il ciclo da capo. I ribosomi degli eucarioti fanno questo ciclo due volte al secondo: allungano la catena polipeptidica di due amminoacidi al secondo. Quelli dei procarioti vanno anche più velocemente. Tutte queste reazioni sono aiutate da fattori proteici: fattori di allungamento. Dal RNA alle proteine: la traduzione Struttura di due dei rRNA e una proteina della subunità maggiore ribosomiale  Dal RNA alle proteine: la traduzione Il ribosoma è fatto per 1/3 di proteina e per 2/3 di RNA, ed è l’rRNA ad avere un ruolo centrale nella struttura e nella funzione del ribosoma: è un ribozima. Gli rRNA formano il cuore del ribosoma, le proteine si legano sulla superficie, stabilizzando gli rRNA e aiutando nei cambiamenti conformazionali necessari per la sua attività catalitica. I siti A, P ed E e il sito catalitico sono fatti da rRNA. Nel sito catalitico, le interazioni tra rRNA e tRNA avvicinano e orientano i due amminoacidi che si devono unire per legame peptidico, per procedere alla catalisi di questo legame. Credit: Noller’s group  Dal RNA alle proteine: la traduzione Sia nei procarioti che negli eucarioti, l’arrivo a un codone di terminazione (UAA, UAG, UGA) segnala la fine del messaggio. Non ci sono tRNA per legare questi codoni. In vece si legano i fattori di terminazione, che modificano la procedura in modo da legare una molecola d’acqua all’estremità C-terminale della proteina, che è finita. La proteina si stacca dal ribosoma, il ribosoma si separa dall’mRNA e le subunità si staccano. Dal RNA alle proteine: la traduzione Translation_II Dal RNA alle proteine: la traduzione Translation_atomic_view Dal RNA alle proteine: la traduzione Translation_I  Dal RNA alle proteine: la traduzione A un solo mRNA si attaccano diversi ribosomi, partendo dal codone d’inizio, e man mano che il ribosoma precedente avanza lungo l’mRNA. Così si formano i poliribosomi, che sintetizzano tante coppie della proteina simultaneamente. Dal RNA alle proteine: la traduzione polyribosome  Dal RNA alle proteine: la traduzione I ribosomi batterici e quelli eucariotici hanno piccole differenze. Queste sono state sfruttate dai funghi per creare delle tossine in grado d’inibire la sintesi di proteine batteriche: molti degli antibiotici. Ostacola il legame dell’amminoacil-tRNA al sito A del Tetraciclina ribosoma batterico Streptomicina Impedisce il passaggio del ribosoma dalla modalità d’inizio a quella d’allungamento; induce anche errori di codifica Cloramfenicolo Blocca la reazione della peptidil-trasferasi sui ribosomi Cicloesimide Blocca la reazione di traslocazione sui ribosomi Blocca l’inizio della sintesi di RNA legando la RNA polimerasi Rifamicina Quante copie di una proteina ci sono nella cellula dipende: - della quantità che si sintetizza - di quanta proteina si distrugge Meccanismi di regolazione della traduzione. 1. Repressione della traduzione mediata da proteine regolatrici che legano l’mRNA nella regione 5’ non tradotta (5’ UTR). 2. Repressione della traduzione mediata da proteine che legano l’mRNA nella regione 3’ non tradotta (3’ UTR). In alcuni casi lo fanno interagendo con i fattori d’iniziazione. Le proteine che legano il 3’ UTR possono anche localizzare gli mRNA in posti specifici all’interno della cellula, e questo può essere molto importante (ad esempio durante lo sviluppo embrionale). Diversi mRNA (blu) localizzati in regioni specifiche in embrioni di Drosophila (rosso: nuclei cellulari)  Dal RNA alle proteine: la traduzione 3. Micro RNA (miRNA): piccoli RNA a doppio filamento che regolano sia la trascrizione che la traduzione, interagendo con complessi proteici diversi in ogni caso. A livello dell’mRNA, i miRNA possono indurre la degradazione o soltanto inibire la traduzione, a seconda dell’mRNA bersaglio. Questo meccanismo è molto diffuso e importante come meccanismo veloce per regolare l’espressione genica.  Dal RNA alle proteine: la traduzione 4. Controllo globale della traduzione proteica: - Le cellule sotto stress possono ridurre la traduzione bloccando i fattori d’iniziazione della traduzione. - Le cellule stimolate dai fattori di crescita possono aumentare i livelli di traduzione. Stress nutrizionale Stress del RER Stress ossidativo Fattori di crescita (Struttura e funzione delle proteine) Una volta sintetizzate, le proteine chaperon aiutano il ripiegamento della nuova catena per raggiungere la conformazione corretta, rendendo più efficiente il ripiegamento. Possono agire in due modi diversi:  Dal RNA alle proteine: la traduzione Il tempo che dura una proteina, tra la sua sintesi e la degradazione, è la vita media della proteina. La degradazione è a carico di proteasi, che tagliano i legami peptidici fino a ridurre le proteine ad amminoacidi. Queste si trovano: - Nei lisosomi. - Nel citoplasma, come componenti dei proteosomi, macchine per la degradazione di proteine con un centro cilindrico dove le proteasi si trovano all’interno. Le proteine che devono essere degradate dai proteosomi vengono marcate con una piccola proteina chiamata ubiquitina.