Espressione Proteine nei Procarioti PDF

Espressione Proteine nei Procarioti Problema = devo ottenere grosse quantità di una particolare proteina in vitro. La difficoltà quando si ha un tessuto e si vuole purificare una proteina è che le metodologie sono solitamente complesse a livello biochimico, inoltre in un tessuto ci son...

Espressione Proteine nei Procarioti Problema = devo ottenere grosse quantità di una particolare proteina in vitro. La difficoltà quando si ha un tessuto e si vuole purificare una proteina è che le metodologie sono solitamente complesse a livello biochimico, inoltre in un tessuto ci sono solo poche quanità di proteina. Con le metodologie biotecnologiche si possono invece ottenere grandi quantità utilizzando i batteri come bioreattori. FATTORI CHE INFLUENZANO LA SINTESI PROTEICA Si possono ottenere più copie all’interno del batterio dato che il plasmide si duplica indipendentemente dalla sintesi del batterio stesso. Numero di copie del plasmide = Bisogna avere un numero limite però di copie, in caso negativo la cellula sarebbe troppo piena di plasmidi, soffrirebbe e andrebbe incontro alla morte. Non bisogna influire troppo dunque sulla fisiologia della cellula. Stabilità del plasmide Fisiologia della cellula ospite Forza del promotore = Le sequenze a -10 e -35 più sono vicine al consenso più è forte il promotore Terminazione della trascrizione = devo poter avere sia un promotore sia un sistema per terminare la traduzione Struttura dell’mRNA = bisogna favorire le strutture in cui il messaggero non è ripiegato in modo che possa essere letto. Sequenza al sito di inizio della traduzione = bisogna favorire la traduzione e quindi inserire sequenze per questo scopo Scelta dei codoni FORZA DEL PROMOTORE Se si utilizzano batteri come bioreattori bisogna utilizzare un promotore batterico perchè sia compatibile coi fattori per la traduzione nei procarioti—> Utilizzo di un promotore adeguato per la cellula ospite. Non si potrà usare la TATABox per esempio. Questa è una delle prime proteine prodotte in vitro ricombinanti da poter dare ai pazienti diabetici, inizialmente erano utilizzate proteine non umane provenienti dai maiali, ma in quanto tali non si sviluppavano i giusti anticorpi. Regolazione dell’espressione: l’espressione eccessiva può essere tossica per l’ospite (es. proteine strutturali di superficie, proteine che regolano il metabolismo cellulare di base, regolatori della conduttanza di membrana come CFTR, proteine dell’involucro del lentivirus). Nel momento in cui inizia a produrre la proteina eucariotica dunque ne risente, perchè produce qualcosa che la danneggia. TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE Termina quando la RNA polimerasi ha due sequenze complementari che si appaiano formando una forcina, seguita da una serie di U, che funzionano da etichetta in modo da richiamare gli enzimi per staccare l’RNApol. Se ho il cDNA si mette a monte il promotore a cui si lega la RNApol eucariotica, dopo il codone di stop verranno invece inserite le sequenze necessarie a terminare la trascrizione correttamente. STRUTTURA DELL’mRNA È opportuno che l’RNA abbia le strutture giuste per effettuare la traduzione. 1- Etchegaray e Inouye (1999) hanno identificato un elemento posto a valle del codone di inizio (downstream box) che facilita la formazione del complesso di inizio traduzione. 2- Se il 3’ UTR presenta delle zone di complementarietà con la regione codificante si possono formare strutture a forcina che intralciano il movimento dei ribosomi lungo il messaggero. Essendo il codice genetico degenerato se vi è una sequenza che tende ad appaiarsi, basta cambiare il terzo nucleotide di alcuni codoni per evitare l’appaiamento e permettere al ribosoma di continuare a scorrere. SEQUENZA DI INIZIO DELLA TRADUZIONE È la sequenza di Shine-Delgarno (RBS ribosome binding site) per i procarioti. È una breve sequenza che si appaia all’RNA ribosomiale 16S e permette di posizionarlo a una 10ina di basi dall’AUG. È seguita spesso da 4A o 4T. Senza di essa il ribosoma non è legato all’RNA. Questa viene così riconosciuta per essere agganciata dai ribosomi nei batteri. SCELTA DEI CODONI Il codice genetico è degenerato, ma alcuni organismi hanno più abbondanza di alcuni tipi di transfer, per questo utilizzano principalmente alcuni codoni piuttosto che altri. Geni altamente espressi presentano come secondo codone AAA (Lys) o GCU (Ala). Nella maggior parte dei geni l’utilizzo dei codoni non è casuale (è legato alla disponibilità dei tRNA) Esempio Si stava cercando di far esprimere una struttura eucariotica nei batteri, quando venne inserito un codone raro come AGA (arginina) in un gene di E.coli altamente espresso, si provocò un’alta percentuale di errori di incorporazione di lisina (AAA) al posto di arginina. Il transfer con AGA è infatti raro in escherichia coli e dunque per poter procedere con la sintesi proteica veniva appaiato il transfer della lisina AAA. In questo modo si ottenne una proteina mutata. Dunque anche alcuni codoni possono essere modificati e ciò vale anche negli eucarioti. Se un gene è poco espresso in natura per generare il corrispondente terapeutico deve essere modificato, magari perchè in natura la proteina è prodotta poco, ecc. VETTORI DI ESPRESSIONE NEI BATTERI Il fatto di clonare il cDNA in un plasmide circolare corrisponde a un primo passaggio per inserirlo in un batterio in grande quantità. Deve essercene abbastanza per inserirlo in batteri diversi per la sintesi proteica. Clonaggio in vettore di espressione per batteri Utilizzo di un sistema inducibile, decido io quando il batterio inizia a produrre la proteina, per evitare accumulo della stessa che potrebbe risultare tossica per la crescita dei batteri Clonaggio a valle di una sequenza tag (etichetta) che facilita e permette la purificazione con colonne cromatografiche. PROMOTORI INDUCIBILI — OPERONE LAC Si basa su un operone visto nei batteri: l’operone lac, comprende i geni LacZ, LacY e LacA necessari per la metabolizzazione del lattosio. È uno dei primi operoni caratterizzati e di conseguenza uno dei più manipolati. Si può utilizzare in quanto può essere il promotore per il gene di interesse (blu). L’operatore lacO serve a regolare l’espressione del gene di interesse. La regolazione avviene attraverso un inibitore dell’operatore: lacI. Solo quando è presente una grande quantità di lattosio nell’ambiente e si è in carenza di glucosio iniziano ad essere prodotti i geni necessari. Questo sistema è inducibile con lattosio o IPTG (isopropyl-beta-D-tiogalattoside). Quest’ultimo è più semplice da utilizzare ed entra meglio nella cellula batterica, è un tiogalattosid. Agisce nello stesso modo sull’operatore come analogo del lattosio dunque. LacI normalmente produce l’inibitore, che si lega all’operatore impedendo fisicamente il legame della polimerasi al promotore e inibendo la trascrizione. IPTG o lattosio si legano all’inibitore, che non si attacca più all’operone, e permettono così la trascrizione o con l’attacco di sigma70. Posso dunque trasformare dei batteri con il mio sistema, in assenza non succede nulla ma nel momento in cui fornisco IPTG inizia la trascrizione. Questo sistema non è così stringente, questo inibitore non è in realtà così forte per regolare la trascrizione, proteine in quantità anche basse e che risultano tossiche vengono anche in minima parte prodotte. Inoltre anche l’operatore non è molto forte. Il sistema è dunque stato modificato ulterioremente. Questo sistema è presente anche nella sintesi di beta-galattosidasi, fornendo un substrato che diventa un indolo blu nelle cellule. Quindi si può fornire IPTG anche in questo caso. Anch’esso risulta essere dunque un promotore inducibile. Si utilizzano M15(pREP4), ovvero batteri con un plasmide che contiene i geni per Inibitore ↓ inibire la trascrizione. C’è così uno stretto controllo della trascrizione. Il promotore non è a -10 e -35 per legare l’RNApol eucariotica, e che potrebbe legarsi in condizioni non stringenti, ma il promotore (verde) è specifico per un’RNApol virale del fago T7. Questa polimerasi è molto più semplice della eucariotica ed è una sola proteina. Un batterio normalmente non produce quella polimerasi fagica. Quando è presente questa infatti non solo è coperto il sito per esprimere il gene ma manca pure la polimerasi per effettuare la trascrizione. In questo caso il genoma di E.Coli contiene sopratutto un promotore per legare lacI e avere l’operatore boccato. Interagisce con il gene e con l’espressione dell’RNApol fagica. Quando è prodotta IPTG si va a fermare l’espressione dell’RNApol di T7, si libera il promotore, che è un promotore forte, e può avvenire la trascrizione. Questo si fa perchè il promotore anche se non ci fosse lacI a fermarlo, manca della polimerasi corretta per fare il processo. Ho quindi un sistema complesso ma altamente stringente. Esempio: Si ha rappresentato il genoma con lacI e si inserisce il plasmide ricombinante con il gene di interesse rosso. Normalmente, appena inserico lacI si lega al promotore e interferisce con la produzione della proteina. Aggiungendo IPTG viene tolta l’inibizione e avviene la trascrizione. I ricercatori mettono prima i batteri in una cultura liquida e si fanno crescere, man mano aumenta il numero di cellule, non viene ancora prodotta la proteina. Viene aggiunto IGTP e vanno a rallentare la crescita in quanto molto impegnati a produrre la proteina.  Esempio Vettore La resistenza all’ampicillina e Col E1 verranno rivisti in tutti i vettori che vedremo. Promotore T7 Due siti di legame lacO = che legano il sistema Lac. È un ibrido tra il promotore fagico ed procariotico. In natura ciò non esiste ma si sfrutta l’inibizione del sistema lac e la forza promotoriali di un sistema fagica. Sito di inizio trascrizione che non corrisponde con AUG ma ATG. RBS/SD ATG e il sito unico di clonaggio. Codone di stop, già presente dunque nel plasmide. TAG (il quadrato rosso) TAG Viene utilizzato come termine etichetta. È una sequenza di pochi aminoacidi per la quale è disponibile un sistema di legame per questi AA per poter purificare la proteina. Si può aggiungere la TAG o in aminoterminale o in carbossiterminale solitamente. HIS TAG È una sequenza di 6 istidine che vengono clonate in frame con la proteina da identificare. All’N-terminale = Met-HHHHHH-proteina di interesse- STOP All’C terminale = Met - proteina di interesse - HHHHHH - STOP A questo punto ho una proteina con 6 istidine che solitamente non da problemi quindi posso lasciarle lì. Se si vogliono rimuovere invece ci sono dei plasmidi già pronti per tradurre le proteasi ed eliminarla. Si usa una proteasi ricombinata e purificante direttamente nella provetta.  PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA Si ha il batterio in cui si è indotta la produzione di proteine, Quelle con la pallina rossa rappresentano le proteine ricombinanti. Vengono listati i batteri e si ha un miscuglio di proteine. Per separare le proteine con etichetta e senza devo separarle per affinità, ad esempio tramite cromatografia di affinità. Si usano palline di separosio a cui si aggiungono particolari molecole utili per la separazione. Viene inserito in una colonna, che raccoglie tutto il separosio. Se dall’alto si versa la soluzione, queste passano per capillarità ed escono dal beccuccio inferiore. Se qualcosa è trattenuto all’interno della colonna dalle molecole nel separosio, uscirà con una velocità differente. Nel nostro caso si fa in modo che vengano trattenute le proteine ricombinate. Bisogna poi fare in modo di recuperare le molecole legate. C’è così una fase mobile e una fase immobile. In questo caso sono gli ioni nichel a far sì di coordinare le istidine quando si trovano in sequenza. Interagisce con gli anelli aromatici delle istidine. È dunque un modo per trattenere le proteine con le sequenze modificate. Un’istidina isolata non viene coordinata dal nichel. Per staccare le proteine dal nichel si utilizza l’imidazolo, un analogo dell’istidina, che compete con gli ioni del nichel provocando il distacco della proteine e l’attacco dell’imidazolo al suo posto. CLONAGGIO VETTORI DI ESPRESSIONE Queste tecniche si fanno solo su DNA e non RNA. Dunque immaginiamo di voler aggiungere la sequenza all’aminoterminale della proteina. Si osserva il costrutto per DNA ricombinante, all’interno del quale sono inseriti frammenti diversi di DNA provenienti da cose diverse. C’è il promotore all’inizio, una sequenza rappresentata, l’ATG e i codoni per le sei istidine. C’è poi il sistema multiplo di clonaggio in cui si clona il cDNA. Poi codone di stop e la sequenza di terminazione. Un sistema molto semplice si basa sulla PCR. Per esempio si può disegnare un primer, definire una sequenza e generare il primer sintetico, in cui ci sia la sequenza complementare del filamento inferiore senza considerare la Met, dunque dal secondo codone. Posso poi aggiungere la sequenza di istidine e ATG. Bastano una ventina di nucleotidi di appaiamento che la PCR può avvenire. Si appaia poi al filamento superiore e si va a clonare. Si può aggiungere o al 5’ o al 3’. FRAME Dopo l’ultima istidina deve esserci il secondo codone della proteina, dopo Met. Nel momento in cui disegnano il primer bisogna stare attenti a che aminoacidi andrà a codificare per essere sicuri. Se c’è una mutazione nel cDNA causa variazioni in tutta la sequenza. LIMITI VETTORI BATTERI I batteri non possono fare varie modificazioni post-traduzionali: Corretti ponti disolfuro Glicosilazione Fosforilazione Acetilazione Aggiunta di acidi grassi Taglio proteolitico del precursore inattivo Sono molto utilizzati per la produzione ma ci sono proteine non adatte. LIEVITI È un altro sistema molto utilizzato che può propagare in modi molto simili ai batteri, ma che possono ridurre proteine che nei batteri non sarebbero adatte, e dunque molto adatto in quanto eucarioti, può essere fatto crescere su agar o coltura liquida. Crescono velocemente e bene come cellule singole Ben caratterizzati geneticamente = uno dei primi genomi completamente sequenziati Esistono forti promotori Sono organismi GRAS (generally recognized as safe) Usiamo soprattutto Saccharomyces Cervisae. - Unicellulari - Crescono velocemente in colture liquide - Genoma sequenziato - Si generano facilmente mutanti - Hanno una parete che può essere un problema, bisogna dunque lavorarci per far si che possa entrare ciò che vogliamo. Ci sono tre metodologie che possono essere utilizzate: 1. Rimozione della parete per ottenere uno sferoplasto con enzimi glusulasi (o zimoliasi) e poi l’assunzione di DNA viene facilitata dal PEG (può formare diploidi, triploidi) e bisogna poi rigenerare la parete. Togliere la parete facilita l’entrata del DNA sopratutto utilizzando poliacetileneglicole, che forma dei piccoli precipitati che vengono poi portati dentro al lievito. 2. Litio Acetato: cationi di alcali rendono competenti i lieviti a ricevere DNA che viene associato con un polimero ad alto peso molecolare PEG. 3. Elettroporazione: il metodo più efficiente ma con basse quantità di DNA si satura facilmente. Si genera un campo elettrico transiente con micropori che permette l’entrata del DNA. PROBLEMI NELL’EPRESSIONE I plasmidi spesso sono instabili Sovraglicosilazione delle glicoproteine Le proteine secrete vengono intrappolate nello spazio periplasmatico BACULOVIRUS Le proteine vengono correttamente modificate ØPermette di ottenere grandi quantità di proteina grazie ad una sistema virale Le proteine rimangono per lo più solubili in cellule di insetto Il genoma virale è grande e può accomodare frammenti grandi di cDNA Il baculovirus non è infettivo per i vertebrati  Espressione delle Proteine negli Eucarioti Problema : Devo analizzare la localizzazione subcellulare di una particolare proteina e produrre grandi quantità di proteina correttamente modificata post- traduzionalmente. Ad esempio quando si ha una proteina che porta a una malattia, si vanno a studiare le mutazioni che questa ha subito e cosa questo comporta. È utile inserire così il DNA mutato in cellule eucariotiche. Queste in generale non sono usate come bioreattori come i procarioti. Si passa sempre per VETTORI DI CLONAGGIO, che possono a volte rimanere episomiali oppure includersi nel DNA della cellula eucariotica. La cellula si divide con centromero, fuso mitotico, ecc. man mano che si dividono le cellule se lo si lasciasse sotto forma di episoma col tempo verrebbe diluito e perso. Ogni cellula acquisisce un numero di plasmidi differente. Si parte dal cDNA, ma alcuni plasmidi hanno il primo esone non codificante seguito da un introne e seguito poi dal cDNA. Queste particelle che rimangono alla fine dello splicing, questi complessi di giunzione dello splicing, aiutano il trasporto dal nucleo al citoplasma: più è efficiente più proteina sarà prodotta. In figura si osserva un promotore viola e un MCS rosso, per inserire il cDNA giallo. Può essere inserito con taglio attraverso enzimi di restrizione e ligasi. Il plasmide dopo la ligazione per essere amplificato può essere inserito in procarioti per trasformazione e usare questi batteri come bioreattori. Dunque la cellula eucariotica si usa per inserire la sequenza gialla. Alla fine però si ottengono poche cellule in cui si sono legati, per questo sono utilizzati i batteri per amplificarle successivamente. CARATTERISTICHE DEI VETTORI Qualunque tipo di molecola ricombinante deve passare per l’amplificazione in E.coli, ci devono dunque essere vettori compatibili. E.coli è usato come bioreattore. Anche nelle cellule animali si può amplificare il plasmide in tante molecole in modo che quando la cellula replica possa essere distribuito anche se casualmente nelle cellule figlie; Origine di replicazione derivata da virus animali (SV40) Promotori per cellule eucatiotiche (lac per esempio non funzionerebbe perchè non ci sono i fattori di trascrizione necessari) Siti di clonaggio multipli (MCS) per clonare il cDNA, per la maggior parte i plasmidi utilizzati sono sviluppati in maniera biotech perchè ci siano tutte queste caratteristiche ottimali. Segnale di poliadenilazione eucariotico Gene di resistenza ad una sostanza tossica per cellule eucariotiche Eventualmente una TAG Il vettore è un plasmide circolare può essere diviso in due settori: PRIMO OriE/ColE1 = Si passa sempre attraverso la produzione tramite batteri: o clonaggio, o taglio con enzima di restrizione, o purificazione dei due frammenti, o ligazione; o la trasformazione dei batteri modificati geneticamente per essere molto adatti ad accettare il DNA ed amplificarlo (colture anche da ½ litro). Gene di resistenza all’ampicillina = Questo è fondamentale per non uccidere i batteri che si utilizzano durante l’amplificazione. Questo antibiotico agisce uccidendo i G- colpendone la parete. SECONDO = Ci sono poi le parti che servono per la parte negli ColE1 eucarioti: Promotore MSC Segnale poliadenilazione Resistenza a qualcosa di tossico negli eucarioti A volte: Origine di replicazione per SV40 ORIGINE DI REPLICAZIONE DI SV40 Entrano varie cellule che a volte vengono perse, perchè diluite nelle cellule figlie durante i processi di divisione. A volte per far produrre all’eucariote la proteina con le giuste mutazioni, si può sfruttare il fatto che si ha alta conoscenza delle origini di replicazione nel genoma eucariotico, tra cui proprio SV40, bene caratterizzata. I vettori che si basano su sequenze virali si possono replicare come episomi in alcune cellule eucariotiche. Le origini di replicazione richiedono l’interazione con fattori virali. L’origine di replicazione di SV40 richiede il large T antigen, prodotto generalmente dal virus stesso. Prima il virus infetta, produce questo antigene che lega l’origine di replicazione e si replica. È una sequenza piccola. Generalmente una volta nelle cellula eucariotiche dato che non è presente il T antigen, non viene duplicata almeno che non si integri l’episoma nel DNA eucariotiche. Ci sono però cellule particolari stabilizzate. Le cellule COS-7 (cellule epiteliali di scimmia) ed HEK 293T (cellule embrionali renali umane) sono state modificate geneticamente ed esprimono il large T antigen di SV40. Anche se il genoma non si inserisce in quello delle cellule ospiti, dato che vi è il T antigen, durante la riproduzione verranno prodotti i plasmidi e divisi nelle cellule figlie. PROMOTORI PER CELLULE EUCARIOTICHE C’è bisogno di promotori specifici per le cellule eucariotiche, generalmente promotori molto forti. Si usano normalmente i promotori virali perché forti e permettono l’espressione in quasi tutti i tipi cellulari: Promotore del citomegalovirus (CMV) Promotore di SV40 Promotore ibrido con l’enhancer di CMV ed il promotore della b-actina di pollo (adatto per cellule staminali). L’actina è presente in tutte le cellule e pertanto è molto efficiente per reclutare tutti i fattori necessari per la trascrizione. Riesce a lavorare bene dalle cellule staminali in sù, dunque di base in tutte le cellule. Oppure promotori che conferiscano specificità di espressione in cellule derivate da diversi tessuti come ad esempio: Promotore di Insulina per espressione nel pancreas => se lo metto in cellule epiteliali non esprimerà nulla Promotore dell’albumina per il fegato SITI MULTIPLI DI CLONAGGIO Possono esserci vari siti di restrizione negli MSC ma vi è sempre un punto in cui ci sono alcuni siti per favorire il clonaggio, sono siti unici ovvero che tagliano una sola volta. SEQUENZA CONSENSO DI KOZAK A livello dell’MSC spesso questo è costruito in modo da produrre una metionina in modo che il ribosoma vada ad accomodare AUG esattamente nel sito P. Anche se negli eucarioti non c’è una sequenza SD, che rende ai ricercatori molto semplice generare un plasmide, AUG si trova in un complesso di sequenze altamente conservato, ovvero la sequenza consenso di Kozak. Con questa informazione i ricercatori hanno deciso di inserirlo direttamente nei vettori di clonaggio, questo per poter utilizzare il vettore in un contesto favorevole, la migliore ATG da poter usare. Utilizzare la sequenza di Kozak è molto semplice in quanto è una sequenza palindroma. Questa sequenza viene letta dall’enzima di restrizione Ncol. Tagliando qui dunque si va ad utilizzare un consenso che è uno dei migliori utilizzabili negli eucarioti. SEGNALE DI POLIADENILAZIONE È un punto che non si deve modificare o perdere per ottenere degli RNAm stabili e poter effettuare il clonaggio. La stabilità di un mRNA dipende dal segnale di poliadenilazione pertanto nei vettori per controllare l’espressione di una proteina é necessaria la presenza dopo la tripletta di STOP di un segnale per la poliadenilazione. Es: AAUAAA-(10-30nt)-CA- (10-20nt)-GUrich. => Dunque il segnale di poliadenilazione non sono le A, ma questa sequenza che va poi ad aggiungere le A. Interagendo con eF4G la coda aiuta la formazione dei poli ribosomi. Le prime trasformazioni che subisce RNA sono il CAP in 5’ e la poliadenilazione che ricopre il filamento, necessaria poi per favorire la traslazione coi ribosomi. PURIFICAZIONE PLASMIDE DA BATTERI Ho ottenuto i batteri con dentro i plasmidi dopo ligazione e trasformazion. Spesso come batterio si utilizza E.Coli DH5alfa. Crescita colonie singole per una notte in terreno liquido (3ml) contenente la selezione (ampicillina 50µg/ml ), in modo che qualunque contaminazione presente da parte nostra venga eliminata. Vene lasciato ad amplificare a 37°. I batteri si dividono e ottengono una o più copie con cDNA. Purificazione del plasmide dalla crescita di singole colonie di batteri in terreno liquido, dalle cellule si recupera il DNA puro. Viene effettuato su culture liquide. I batteri E.coli crescono in un terreno ricco di nutrienti: Triptone (estratto di carne) ed estratto di lievito in presenza di 1% NaCl (terreno LB=Luria- Bertani). Non è un terreno specifico. Sono state clonate due varianti di splicing alternativo: i primer si legno al primo esone e ll’ultimo esone del gene. Sia una lisi incompleta sia una lisi eccessiva possono abbassare la resa di plasmide recuperato nella purificazione, nel primo caso non si recupera tutto nel secondo si recupera anche il genomico. Bisogna effettuare dunque una lisi controllata che permette di liberare dalle cellule solo DNA plasmidico senza troppa contaminazione di DNA cromosomi. LISI ALCALINA Metodo di Birnboim e Doly 1979. Ad un pH compreso tra 12 e 12.5 si ha denaturazione del DNA Riportando la soluzione un pH neutro per pochi minuti si ha rinaturazione del DNA plasmidico ma più difficilmente del DNA genomico molto più grande. Posso così separare e ottenere una soluzione ricca nel plasmide. Si può usare un enzima che rompe la parte batterica del Gram- chiamato il lisozima. successivamente si sospendono i batteri e poi si aggiunge una soluzione di NaOH, SDS, sodio acetato. È un denaturante e va a rompere la membrana del batterio andando ad estrarre i lipidi. Le due cose permettono la rottura completa della cellula batterica. Viene aggiunto sodio acetato, rinatura velocemente il plasmide in pochi minuti. Si centrifuga, DNA genomico e proteine precipitano sul fondo. Rimane la soluzione con il plasmide, RNA ribosomiale. Ci sono ora vari metodi per poter completare la purificazione.  1. ELIMINARE LE PROTEINE Si aggiunge una soluzione di fenolo e cloroformio a pH 8. Il fenolo è un forte denaturante di proteine. Il plasmide viene risospeso in soluzione di 10mM Tris. HCl e 1mM EDTA (TE) e trattato con RNAsi per eliminare le molecole di RNA Fenolo: è un forte denaturante delle proteine che le lega mediante legami H, elimina i residui proteici e lipidici (si procede spesso con una o più estrazioni fenoliche) in quanto il fenolo legandosi al core delle proteine ne causa la loro denaturazione, alterandone la struttura. Le proteine denaturate, con i gruppi idrofobici esposti, diventano solubili nella fase fenolica o precipitano all’interfase fenolo- acqua; inoltre è un solvente dei lipidi. Il fenolo è fortemente igroscopico e deve essere sempre equilibrato con una soluzione tampone perché altrimenti assorbirebbe la soluzione acquosa contenente gli acidi nucleici. Tende ad ossidarsi facilmente assumendo un colore rossastro per la presenza di chinoni. Cloroformio: denatura e stabilizza l'interfaccia; completa la denaturazione delle proteine, rimuove i lipidi e, grazie alla sua elevata densità, facilita la separazione della fase acquosa (contenente il DNA deproteinizzato) da quella organica (fenolica) stabilizzando l’interfaccia tra le due fasi. La fase acquosa è al di sotto della fase organica e contiene le proteine; la fase organica è al di sopra della fase acquosa e contiene DNA. 2. CONCENTRAZIONE DEL DNA Si usa etanolo e sali di acetato. Il pellet si lava con 70% etanolo per togliere i sali (poichè NaCl è poco solubile in 70% etanolo si usano sali di acetato). Etanolo dunque serve principalmente a farlo precipitare non a lavare. Il plasmide viene risospeso in soluzione tampone di 10mM Tris.HCl e 1mM EDTA (TE) e trattato con RNAsi per eliminare le molecole di RNA. EDTA serve a chelare ioni bivalenti, molto presenti come cofattori. Mettendolo qui le DNAsi non riescono ad agire, non riescono a spostare le cariche. Il DNA si conserva poi nella soluzione di EDTA. 3. RESA Dipende da vari fattori: Numero di molecole di plasmide per cellula Terreno di coltura Fase di crescita in cui le cellule sono state raccolte Attenzione alla preparazione del lisato di cellule, questa è una fase molto delicata => bisogna essere molto precisi con i tempi Le soluzioni devono essere prive di nucleasi (autoclavate) => sopratutto non contengono DNAasi, queste sono eliminate mettendo in autoclave con un ciclo di mezz’ora circa a 120°. Non si denaturano in questo modo le RNAasi. ULTERIORE PURIFICAZIONE Necessario purificare e concentrare una soluzione di DNA prima di ulteriori manipolazioni o di studi analitici. Fenolo denatura le proteine ed il cloroformio è anch’esso denaturante ma inoltre stabilizza la fase organica separandola dalla fase acquosa riducendo la quantità di soluzione acquosa trattenuta nella fase fenolica. In presenza di alte concentrazioni di cationi monovalenti (0.1-0.5M Na+) l’etanolo induce una transizione strutturale nelle molecole di acido nucleico con conseguente aggregazione e precipitazione dalla soluzione a bassa temperatura. Rimuove inoltre fenolo. Bisogna così rimuovere tutte le soluzioni aggiunte durante la purificazione Ci sono due procedure. 1. GRADIENTE CESIO Introdotto da Vinograd (Radloff et al. 1967) Molecole circolari chiuse (plasmidi) che mancano di estremità libere non si possono svolgere efficientemente e ciò limita la quantità di etidio bromuro che si può intercalare. Vengono separati i diversi DNA in base alla loro diversità di densità. La densità dei complessi DNA-etidio bromuro è inversamente proporzionale alla quantità dell’intercalante e pertanto le molecole plasmidiche avranno densità superirore di quelle del DNA lineare cromosomico: Ultracentrifugazione le spinge più in basso. Le molecole si depositano dunque diversamente all’interno della provetta. le molecole con densità più alta e quindi con una quantità minore di etidio bromuro sono in basso; le molecole con densità più bassa si quella del DNA genomico, e quindi maggiore quantità di etidio bromuro, sono più in alto; Si inserisce poi una piccola siringa e si estrae la banda corrispondente a DNA plasmidico. Richiede l’utilizzo di sostanze pericolose e dunque vanno smaltite correttamente.  2. CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO È semplice e veloce, non si utilizzano sostanze pericolose e dannose. Si può utilizzare per ottenere DNA plasmidico purificato, anche da endotossine, per il suo utilizzo in vivo, in animali da laboratorio (es. Drosophila, Cenorabditis Elegans). Le varie sfere di separosio sono funzionalizzate, in questo caso sono aggiunte molecole a carica positiva. Si inserisce dall’alto, per capillarità la soluzione scende, si velocizza tutto attraverso la centrifuga. Si aggiunge tutto il miscuglio, prima del fenolo. Vengono trattenute tutte le molecole con carica negativa, dunque non solo DNA. Viene aggiunto un buffer non ionico a pH neutro,NaOH e sodio acetato, che aiuta a fare uscire RNA e proteine in eccesso. Viene poi fatta l’eluizione ad alto sale, in questo modo si va ad interagire con l’interazione elettrostatica tra DNA e sferuline, riuscendo così ad andare a recuperare il plasmide. Il plasmide dunque si stacca. Da qui poi si può fare la PCR e amplificare il DNA QUANTIZZAZIONE DEI FRAMMENTI La concentrazione (microgrammi) degli acidi nucleici può essere calcolata mediante lettura allo spettrofotometro: dsDNA: coefficiente di estinzione 6.4x103 A260 alla concentrazione 1M dsDNA: lettura a l 260 di 1OD corrisponde a 50µg/ml ssDNA: lettura a l 260 di 1OD corrisponde a 20µg/ml RNA: lettura a l 260 di 1OD corrisponde a 40µg/ml Dato che il DNA ha anelli aromatici, il raggio UV dello spettrofotometro colpisce il DNA e si ottiene un coefficiente di estinzione che corrisponde al raggio di cui viene deviato. Si misura una densità ottica. Si può sempre anche andare a valutare la qualità della preparazione, ad esempio andare a vedere se ci sono contaminanti di proteine. PUREZZA DEL DNA Nelle proteine si utilizza una lunghezza d’onda differente. Ci sono aminoacidi con anelli aromatici quali Tirosina, Triptofano. È stato calcolato il coefficiente per gli aminoacidi di questa proteina, che hanno quindi coefficiente sempre diverso in base al numero di AA di questo tipi sono presenti. L’assorbanza di un campione viene misurata a diverse lunghezze d’onda per la valutazione della concentrazione e della purezza degli acidi nucleici Gli acidi nucleici hanno un picco di assorbanza a 260nm mentre le proteine a 280nm e questo ridurrà il rapporto A260/A280. Un rapporto A260/A280 tra 1.8 e 1.9 indica un preparazione altamente pura di DNA. Un rapporto A260/A280 tra 1.9 e 2.0 indica un preparazione altamente pura di RNA. Facciamo così due misure e dal rapporto posso capire quanto può essere contaminato il DNA. TRASFEZIONE IN CELLULE EUCARIOTICHE Dopo aver ottenuto grandi quantità di DNA modificato posso andare a modificare la cellula eucariotica. Bisogna fare in modo che entri nella cellula e vada nel nucleo, dove ci sono i fattori per la trascrizione, poi che l’RNA trascritto esca dal nucleo e vada nel ribosoma ad effettuare la traduzione. Ciò può essere fatto solo se si hanno grandi quantità di DNA, ad esempio 1µg, con questo si possono manipolare le cellule nelle sequenze COS. Ci sono vari modi per modificare il DNA: Dato che ha cariche negative posso mischiarlo con lipidi cationici, dato che sono carichi positivi si legano al DNA, si ottengono dei miscugli di molecole avvolte da lipidi, tipo vescicole, che avvicinandosi alla membrana plasmatica negativa fanno si di venire endocitati per andare fino al nucleo. GENI RESISTENZA AD UNA SOSTANZA TOSSICA Si vogliono eliminare tutte le cellule che non hanno acquisito il DNA modificato, di fatto solo poche cellula acquisiscono il DNA esogeno, tipo il 50%. Per questo si usa una sostanza tossica per selezionare le cellule, nel DNA modificato si aggiunge la resistenza a questa sostanza. Sostanza tossica per cellule eucariotiche: per esempio interferisce con la sintesi proteica. Selezionare cellule in G418 (0.1-1.0 mg/ml), un aminoglicoside che agisce sulla sintesi proteica ed è un analogo della neomicina. È una molecola che entra nel ribosoma e blocca la sintesi proteica. L’amminoglicoside si intercala tra i due transfer e interferisce sia con l’appaiamento che con la rotazione necessaria per la sintesi proteica. Il promotore può essere eucariotico o un ibrido virale-eucariotico Espressione nei trasfettati del gene per conferire la resistenza alla Neomicina (aminoglicoside fosfotransferasi) è un gene dal trasposone batterico Tn5. TAG Le TAG sono delle bandierine che ci permettono di identificare la proteina in mezzo a molte altre. Devono essere clonate in frame. Alcune TAG sono autofluorescenti e pertanto possono essere viste facilmente al microscopio a fluorescenza. Altre TAG vengono rilevate mediante immunofluorescenza, piccole sequenze in cui ho anticorpi che legano in modo specifico la sequenza peptidica e ci permettono di localizzare la proteina. Sono facilmente reperibili sia anticorpi monoclonali che policlonali per analizzare l’espressione e localizzazione di una proteina per la quale non abbiamo anticorpi. Cromatografia di affinità con l’anticorpo specifico immobilizzato su separosio o colonna di nichel permette la purificazione di queste proteine oppure la purificazione si basa su caratteristiche chimiche della TAG (si aggiunge anticorpo antiTAG), anche dagli eucarioti. TIPI EGFP/YFP/RD autofluorescenti 238 aa, dunque abbastanza grande His sequenza di 6 istidine, contro la quale abbiamo degli anticorpi e si può fare immunofluorescenza HA epitopo (9 aa) derivato dall’emoagglutinina del virus dell’influenza Myc epitopo (10 aa) derivato dalla proteina Myc Flag epitopo completamente sintetico formato da 8aa EGFP La Green Fluorescent Protein (GFP) e una proteina presente in natura nelle meduse Aequorea victoria usata come indicatore fluorescente per analizzare una proteina. Proteina di 27 kDa che emette luce verde (509 nm) quando viene eccitata da luce UV. Adatta per seguire in vivo una proteina senza dovere fissare la cellula. Non necessita di anticorpi per rilevarla. EGFP è un mutante della GFP con 2 aminoacidi sostituiti: leucina (64) al posto della fenilalanina e treonina (65) al posto della serina. Il mutante si presenta più brillante della GFP naturale Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Y. Tsien ottennero il Nobel per la chimica nel 2008 Ci sono varie fluorescenze per varie lunghezze d’onda Quello in natura non è agisce sui vertebrati, infatti non si utilizza la GFP ma la EGFP per questo, è quella modificata in laboratorio per far sì che funzioni. Vennero trovate poi anche delle varianti che rispondevo ad altre lunghezza d’onda. Con EGFP si lavora con lunghezza d’onda di 488 nm per eccitarla ed emette a 520nm. Può essere espressa anche in lieviti e batteri. ALTRE TAG In generale sono brevi sequenze o sintetiche o derivanti da proteine che producono epiteti che sono riconosciuti da anticorpi. Se l’epitopo non viene normalmente espresso negli eucarioti ciò permetterà di ridurre al minimo la cross-reazione ed eventuali segnali aspecifici. Per rilevarle è necessario fissare le cellule e fare una immunofluorescenza con l’anticorpo specifico. Dopo aver modificato le cellule produco la proteina e uso degli anticorpi fluorescenti che riconoscono la TAG e si legano ad essa. Questa è quella detta immunofluorescenza. Si osserva la proteina marcata con la EFGP e la TAG delle istidine. Si eccita con UV. Si possono usare anche cellule vive nel primo caso, nel secondo invece bisogna fissarle. Le palline blu sono i nuclei delle cellule perché si usa un intercalante della cromatina, la proteina di interesse, in questo caso era presente soprattutto nel nucleolo. Non tutte le cellule sono transfettate. Per la cellula in vivo devo utilizzare le proteine autoflorescenti. UTILIZZO PROTEINE RICOMBINANTI La proteina può essere utilizzata in saggi funzionali in vivo in appropriati tipi cellulari La proteina può essere studiata nella sua localizzazione subcellulare La proteina può essere utilizzata per studi di interazione con altre proteine La proteina può essere studiata in condizioni normali o sperimentali (stress, trattamento con farmaci,...) RIASSUMENDO Modifico il DNA Lo faccio entrare nella cellula eucariotica Deve arrivare nel nucleo e generare RNAm E’ fatto uscire dal nucleo per fare avvenire la traduzione Sono prodotte proteine nel ribosoma Per vedere dove si trova la proteina modificata inserisco un anticorpo che si lega alla TAG e uno già fluorescente di per sè. Anticorpo primario rosso: generato per legarsi all’antigene di interesse. Possono essere: Monoclonali: riconoscono un unico epitopo nell’antigene. Generalmente generati in topo Policlonali: riconoscono più epitopi nell’antigene. Generalmente generati in coniglio Anticorpo secondario blu: generato per legarsi all’anticorpo primario pertanto riconosce gli anticorpi della specie in cui viene generato l’anticorpo primario. E’ marcato con fluorocromi o enzimi.