Lezione 7 - Traduzione PDF

Lezione 7 - TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA...

Lezione 7 - TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica Il trasferimento dell’informazione dal DNA alle proteine  Schema dell’azione di un gene in una cellula eucariotica segnale cromosomi nucleari GENE 1 esterno GENE 2 segnale interno rimozione introni GENE 3 membrana nucleare RNAm1 RNAm2 RNAm3 ribosomi reticolo endoplasmatico RNAm4 apparato di Golgi GENE 4 cromosoma circolare mitocondrio proteine proteine interne membrana cellulare promotore regolatrici DNA codificante RNA codificante RNA polimerasi proteine mitocondriali DNA non codificante RNA non codificante proteine secrete  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  IL CODICE GENETICO I linguaggi possono essere di diverso tipo…….. Phe Glu Arg Pro Asn Leu STOP Le basi A,G,C,T si possono considerare come le quattro lettere di un alfabeto utilizzato per scrivere messaggi biologici nella struttura chimica del DNA TRASCRIZIONE: mezzo per trasferire l’informazione piuttosto semplice da capire: DNA ed RNA sono chimicamente e strutturalmente simili; il DNA fa direttamente da stampo per la sintesi dell’RNA tramite l’appaiamento delle basi complementari. Linguaggio e forma del messaggio non cambiano. TRADUZIONE: per convertire l’informazione dell’RNA in proteina bisogna tradurre l’informazione in un altro linguaggio espresso in simboli diversi.  IL CODICE GENETICO le regole per tradurre la sequenza nt del gene in seq aa di una pt mRNA: 4 tipi di nucleotidi proteine: 20 tipi di aminoacidi Quindi la traduzione non può avvenire facendo corrispondere direttamente 1 nt dell’RNA a 1 aa della pt Poiché 20 aa devono essere specificati da soli 4 nt, almeno 3 nt devono essere usati per codificare ciascun aa nt per codoni STOP STOP codone STOP 1 4 2 42=16 3 43=64 Met Il codice genetico è Degenerato: molti aa sono specificati da più di un codon. Universale: Quasi tutti gli organismi utilizzano lo stesso codice Dei 64 codon (triplette), 61 specificano un aa, mentre i rimanenti 3 sono codon di stop  IL CODICE GENETICO Seconda lettera STOP STOP STOP Prima lettera Terza lettera Met IL CODICE GENETICO E’ DEGENERATO  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  I RIBOSOMI I ribosomi sono i siti della sintesi proteica. Denominati secondo la loro velocità di sedimentazione: 70S batterici; 80S eucariotici RIBOSOMA 70S 80S RIBOSOMA PROCARIOTICO EUCARIOTICO PM 2 500 000 PM 4 500 000 50S 30S 60S 40S subunità PM 160 000 PM 900 000 PM 2 800 000 PM 1 400 000 rRNA 5S 23S 16S 5S 28S 5,8S 18S catalizzano legami strutture 120 160 120 peptidici secondarie 2900 1540 nucleotidi 1900 nucleotidi nucleotidi nucleotidi nucleotidi 4700 nucleotidi nucleotidi proteine 34 proteine 21 proteine ~ 49 proteine ~ 33 proteine Ripieg rRNA e posiz tRNA  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  La traduzione: il processo di sintesi proteica Le proteine sono sintetizzate da stampi di mRNA mediante il processo della traduzione Tutti gli mRNA sono letti in direzione 5’-3’ e le catene polipeptidiche sono sintetizzate dall’N-term al C-trem Ciascun aa è specificato da 3 basi (un codon) dell’mRNA, secondo un codice genetico quasi universale La traduzione si svolge sui ribosomi utilizzando i tRNA come adattatori tra lo stampo di mRNA e gli aa che vengono incorporati nella proteina La sintesi proteica comporta quindi interazioni fra 3 tipi di molecole di RNA (m, r, t) oltre a coinvolgere varie proteine necessarie per la traduzione RNAt aminoacido anticodone RNAm codone RNA transfert I tRNA sono lunghi circa 70-80 nt e hanno una caratteristica struttura a trifoglio prodotta dall’accoppiamento complementare di basi fra regioni diverse della molecola.  RNA transfert (tRNA) l’aminoacido si attacca qui estremità 3’ I tRNA sono adattatori che estremità 5’ allineano ciascun aa ansa T con il codon corrispondente ansa D sullo stampo di mRNA nucleotidi ansa modificati dell’anticodone anticodon  RNA transfert (tRNA) l’aminoacido si attacca qui estremità 3’ Tutti i tRNA hanno la sequenza CCA al loro estremità 5’ termianle 3’ ansa T e gli aa sono attaccati covalentemente al ribosio ansa D dell’adenosina terminale nucleotidi ansa modificati dell’anticodone anticodon Lo stampo di mRNA viene riconosciuto dall’ansa dell’anticodon, posta all’altra estremità del tRNA ripiegato, che si lega al codon appropriato per appaiamento complementare delle basi  RNA transfert: adattatori che allineano ciascun aa con il codon corrispondente sullo stampo di mRNA La cellula contiene vari tRNA che l’aminoacido si servono da adattatori per questo attacca qui estremità 3’ processo: tRNA diversi hanno strutture generali estremità 5’ simili, ma hanno anche seq uniche che li ansa T identificano e permettono che l’aa corretto venga attaccato e allineato con il codon appropriato dell’mRNA ansa D nucleotidi l’aminoacido ansa modificati si attacca dell’anticodone qui anticodon LA STRUTTURA A TRIFIGLIO anticodon La funzione adattatrice dei tRNA coinvolge due regioni separate della molecola  RNA transfert L’incorporazione degli aa corretti nelle proteine dipende: 1. Dall’attacco di ciascun aa al tRNA appropriato 2. Dalla specificità dell’accoppiamento delle basi codon-anticodon  Attacco degli aa ai tRNA L’attacco degli aa a tRNA specifici è mediato da un gruppo di enzimi chiamati aminoacil-tRNA-sintasi. Ognuno di essi riconosce il singolo aa e il tRNA corretto (o più tRNA corretti) a cui deve essere attaccato l’aa. Esempio: Il triptofano è codificato dal codone UGG STOP STOP Met  Attacco degli aa ai tRNA La reazione procede in 2 fasi: 1. L’aa viene attivato dalla reazione con ATP a formare un intermedio aminoacil-AMP 2. L’aa attivato viene quindi unito al terminale 3’ del tRNA aminoacido (triptofano) RNAt specifico aminoacil-RNAt sintetasi specifica unione del Trp il tRNA si lega al tRNA al codon UGG  Attacco degli aa ai tRNA La struttura del legame aminoacil-tRNA: L’estremità COOH dell’aminoacido forma un legame estere con il 3’OH libero del ribosio dell’adenosina terminale che fa parte del (CCA). Poiché l’idrolisi di questo legame è associata a una variazione di energia libera molto alta, si dice che un aminoacido legato in questo modo è attivato. legame aminoacido estere (triptofano)  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  Ribosomi: sito della sintesi proteica Ribosoma: macchina utensile per la fabbricazione delle proteine Subunità La subunità maggiore catalizza la ribosomale formazione dei legami peptidici grande che uniscono gli aa tra di loro in Subunità una catena polipeptidica ribosomale piccola sito di legame La subunità minore accoppia i dell’RNAm tRNA ai codoni dell’mRNA SITO P SITO A Il ribosoma: percorre la catena dell’mRNA capta le molecole di tRNA complementari le posiziona in modo che gli aa trasportati possano essere uniti covalentemente in una catena proteica  Ribosomi: sito della sintesi proteica 1 Le 2 subunità si associano su una molecola di mRNA, all’estremità 5’ e cominciano a sintetizzare la proteina 2 Il ribosoma scorre sull’mRNA, traducendo la seq nucleotidica un codone alla volta, usando i tRNA come adattatori per aggiungere ogni aa nel posto che gli compete a un capo della catena polipeptidica in costruzione Modello di ribosoma funzionante RNAm molecola di RNAt proteina in arrivo nascente Le 2 subunità ribosomiche finiscono poi per separarsi 3 quando la sintesi della pt è terminata  Ribosoma: i tre siti di legame dei tRNA Subunità ribosomale maggiore Subunità ribosomale minore siti di legame dell’RNAm SITO P SITO A Ogni ribosoma contiene 3 siti di legame per le molecole di tRNA, noti come: 1. Sito A: sito dell’aminoacil-tRNA 2. Sito P: sito del peptidil t-RNA 3. sito E: uscita  La molecola di mRNA viene tradotta in un processo ciclico a tre stadi. Stadio 1: Una molecola di amminoacil-tRNA si lega al sito A libero. Riconoscimento codone- anticodone Un tRNA, caricato con l’aa successivo della catena, si associa al sito A vacante, abbinando le basi del suo anticodone al codone dell’mRNA esposto allo stesso sito A Stadio 2: Formazione di un nuovo legame peptidico, grazie all’attività catalitica dell’enzima peptidil transferasi Il C-term della catena polipeptidica si distacca dal tRNA sul sito P, per rottura del legame tra il tRNA e il suo aa e si unisce con un legame peptidico al gruppo amminico libero dell’aa legato al tRNA sul sito A L’enzima che catalizza questa reazione è la peptidil-transferasi, parte integrante del ribosoma La reazione della peptidil transferasi è accompagnata da uno slittamento della subunità maggiore rispetto a quella minore, che di fatto rimane aderente all’RNA messaggero Lo slittamento sposta i 2 tRNA nei siti E e P della subunità maggiore Stadio 3: mRNA slitta di un tratto lungo 3 nucleotidi all’interno della subunità minore espellendo la molecola di tRNA utilizzata e riposizionando il ribosoma per consentire il legame della molecola successiva di tRNA La subunità minore scorre esattamente di 3 nt lungo la molecola di mRNA, riportandola nella posizione in cui si trovava inizialmente rispetto alla subunità maggiore e il tRNA rimasto al sito E si dissocia L’intero ciclo si ripete fino a un codone di stop  Formazione del legame peptidico Residuo C-ter Gruppo formilico Del residuo N-ter Attività Peptidil-transferasica  L’mRNA viene tradotto in direzione 5’-3’ L’estremità N-term della pt è quella sintetizzata Catena polipeptidica in crescita per prima Aminoacil-tRNA in arrivo Ogni ciclo aggiunge un amminoacido all’estremità C-term della catena polipeptidica RNAm La catena polpeptidica rimane sempre legata al tRNA collocato al sito P della subunità ribosomica maggiore  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  L’organizzazione degli mRNA La traduzione non inizia semplicemente all’estremità 5’ dell’mRNA, ma in siti di inizio specifici. Le porzioni terminali 5’ degli mRNA procariotici ed eucariotici sono pertanto sequenze non codificanti, chiamate 5’UTR. Tutti gli mRNA terminano con seq 3’UTR mRNA procariotico Siti multipli di inizio della traduzione UTR proteina 1 proteina 2 proteina 3 UTR mRNA eucariotico Singolo sito di inizio della traduzione UTR proteina 1 UTR mRNA procariotici: codificano polipeptidi multipli e si chiamano policistronici mRNA eucariotici sono monocistronici  Il processo della traduzione La traduzione viene divisa in genere in tre fasi: inizio, allungamento e termine. Inizio Allungamento Termine Direzione del movimento del ribosoma Il ribosoma si lega Quando si incontra La catena polipeptidica si all’RNAm nel codone un codone di stop, il allunga per di inizio polipeptide viene aggiunta successiva di rilasciato e il aminoacidi ribosoma si dissocia  Inizio della traduzione Fase di inizio nei procarioti: ricerca del codone di inizio da parte del complesso di pre-inizio e la subunità piccola del ribosoma Riveste un ruolo chiave la sequenza, Shine-Dalgarno a monte dell’AUG mRNA policistronici Fase di inizio negli eucarioti: ricerca della sequenza consenso contenete AUG, chiamata sequenza di Kozak mRNA monocistronici Allungamento della traduzione IL LEGAME PEPTIDICO Terminazione della traduzione L’allungamento della catena polipeptidica continua fino a che un codone di stop viene traslocato nel sito A del ribosoma. Fattore di rilascio Nessun tRNA riconosce questi codoni Tali codoni sono riconosciuti da fattori di rilascio che mettono fine alla sintesi proteica H2O Questi fattori si legano al codone di stop al COOH sito A e stimolano l’idrolisi del legame tra il tRNA e la catena polipeptidica al sito P, portando al rilascio del polipeptide completato dal ribosoma Il tRNA viene quindi rilasciato e le subunità ribosomali si dissociano dall’mRNA stampo  POLIRIBOSOMA Rilascio del Su ogni molecola di mRNA si polipeptide verificano molteplici eventi di Dissociazione inizio: un nuovo ribosoma si dei ribosomi posiziona al 5’ terminale di un messaggero non appena il ribosoma precedente ha tradotto un tratto abbastanza lungo della Codone di stop seq nt da fargli posto. Perciò spesso le molecole di mRNA in via di traduzione assumono l’aspetto di poliribosomi, grossi aggregati Codone di inizio citolplasmatici costituiti da ribosomi disposti su una sola molecola di mRNA, distanti uno dall’altro un minimo di 80 nt. In questo modo la pt viene prodotta Polipeptide RNAm in quantità maggiore e in meno in crescita tempo La macchina della traduzione  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  Mutazioni Sequenza di DNA 3’ Sequenza di RNAm 5’ (STOP) H 2N C=O Sequenza aminoacidica O- MUTAZIONI PER SOSTITUZIONE DI UNA BASE Mutazione missenso Mutazione non senso  Mutazioni Sequenza di DNA 3’ Sequenza di RNAm 5’ (STOP) H 2N C=O Sequenza aminoacidica O- MUTAZIONI FRAMESHIFT La delezione produce mutazioni non senso La delezione produce una sequenza aminoacidica alterata Esistono anche mutazioni silenti: Es. AGA AGG : Arg  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  Produzione di una proteina matura funzionale Per essere utile alla cellula, la catena polipeptidica completata deve: ripiegarsi correttamente nella sua conformazione tridimensionale: la pt inizia a ripiegarsi mentre viene ancora sintetizzata legare i cofattori richiesti assemblarsi con i sui partner proteici (se ce ne sono) Questi cambiamenti sono guidati dalla formazione di legami non covalenti Molte proteine hanno anche modificazioni covalenti prodotte in amminoacidi selezionati L’informazione necessaria per tutti questi stadi di maturazione è contenuta nella sequenza di amminoacidica della proteina stessa appena sintetizzata  Produzione di una proteina matura funzionale Una volta che il dominio proteico di una proteina multidominio emerge dal ribosoma, forma nel giro di pochi secondi una struttura compatta che contiene la maggior parte della struttura secondaria finale ( eliche e  foglietti) allineata più o meno nel modo giusto. Questa struttura insolitamente aperta e flessibile è chiamata globulo fuso Il completamento del ripiegamento della proteina è molto più lento e porta ad aggiustamenti di catene laterali che alla fine formano la struttura terziaria corretta ed avviene quando il ribosoma rilascia l’estremità C-terminale della proteina.  Chaperone molecolari Aiutano a guidare il ripiegamento di molte proteine. Agiscono sulle proteine dopo che sono state completamente sintetizzate e ne impediscono l’aggregazione fornendo loro un ambiente favorevole in cui tentare di ripiegarsi.  TRADUZIONE 1. Flusso dell’informazione 5. Ribosomi: sito della sintesi genetica 6. Sintesi proteica 2. Codice genetico 7. Mutazioni 3. Ribosomi 8. Folding 4. tRNA 9. Controllo dell’espressione genica  IL CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE DEI GENI NEGLI EUCARIOTI RNAm inattivo NUCLEO CITOSOL controllo della degradazione trascritto dell’RNAm primario DNA di RNA mRNA mRNA controllo controllo controllo dell’elaborazione controllo controllo trascrizionale del trasporto dell’RNA dell’attività dell’RNA traduzionale della proteina proteina proteina inattiva L’espressione genica può essere regolata in più punti del percorso che conduce dal DNA all’RNA e quindi alle proteine, tuttavia quello più utilizzato è il controllo della trascrizione Come si legge un gene