Tema 2. Cultivos Celulares PDF

TEMA 2 CULTIVOS CELULARES  ÍNDICE 1. Introducción 2. Tipos de cultivos celulares 3. La curva de crecimiento. Comportamiento biológico de las células 4. Formas de crecimiento 5. Vida de las células tras consecutivos pases 6. Soportes físicos 7. Composición del medio de...

TEMA 2 CULTIVOS CELULARES  ÍNDICE 1. Introducción 2. Tipos de cultivos celulares 3. La curva de crecimiento. Comportamiento biológico de las células 4. Formas de crecimiento 5. Vida de las células tras consecutivos pases 6. Soportes físicos 7. Composición del medio de cultivo 8. Atmosfera gaseosa y condiciones de incubación 9. Procedimientos del cultivo celular 10. Contaminaciones 11. Aplicaciones de los cultivos celulares 1. Introdiccuión  El cultivo celular es una serie de procedimientos que tienen la finalidad de mantener vivas a las células in vitro, preservando al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas. En el laboratorio de cultivo celular, se mantienen a las células en medios de cultivo artificiales y condiciones controladas. 2. Tipos de cultivos celulares Se pueden hacer tres tipos de cultivos celulares: a) Cultivo de órganos b)Cultivo de explantes c) Cultivo de células a) Cultivo de órganos Consiste en el mantenimiento de órganos enteros o parte de ellos en un medio de cultivo artificial y en una atmósfera controlada. Su viavilidad es de tiempo limitado para que se mantengan las células del órgano, la estructura histológica y la forma del mismo. Se realizan estos cultivos para el estudio de las relaciones intercelulares y las respuestas ante estímulos y sustancias. b) Cultivos de explantes Un explante es una pequeña porción de tejido u órgano. Este se adhiere a una superficie (de un frasco de cultivo o una placa petri) y crecen las células de la periferia. Se nutre con medio de cultivo artificial y se mantiene con una atmósfera controlada donde proliferan las células ocupando toda la superficie del soporte. c) Cultivos celulares Se realiza a partir de una suspensión celular. Se introducen en un recipiente adecuado junto con medio de cultivo y se incuban en condiciones óptimas para que proliferen. Es el tipo de cultivo más utilizado. Se puede hacer un cultivo celular de cualquier tipo de tejido, depende de la procedencia de la suspensión celular de partida. Dentro de este tipo de cultivo, se pueden encontrar: – Cultivos celulares primarios – Cultivos celulares secundarios c) Cultivos celulares – Cultivos celulares primarios: Se obtiene a partir de un tejido disgregado y que contendrá una mezcla de diferentes tipos celulares. Para obtener la suspensión celular, se disgregan las células del tejido mediante técnicas físicas y enzimáticas. Después, en el cultivo, se pueden mantener los diferentes tipos celulares del tejido o selección un solo tipo concreto. – Cultivos celulares secundarios: Se obtienen a partir de un subcultivo de otro cultivo in vitro. Es decir, puede obtenerse a partir de un cultivo primario, o de otro cultivo secundario o bien, a partir de una línea celular mantenida en congelación. 3. La curva de crecimiento. Comportamiento biológico de las células La curva de crecimiento, es la representación gráfica de cómo crece y evoluciona u cultivo celular. Mide la concentración de células por tiempo de evolución del cultivo. La curva de crecimiento es de forma sigmoidea, en forma de S. En esta “S”, se diferencian 3 fases: 1. Fase de latencia o adaptación 2. Fase de crecimiento exponencial 3. Fase estacionaria 1. Fase de latencia o adaptación: Es un tramo normalmente recto. No suele tener pendiente o a veces, puede presentar cierta concavidad. Corresponde a las primeras 24 horas de evolución del cultivo. No hay crecimiento. El número de células se mantiene al inicial o puede disminuir un poco. 2. Fase de crecimiento exponencial: Es el tramo con pendiente ascendente elevada. Puede durar entre 6 y 7 días. Es la fase en la que el número de células crece muy rápidamente hasta alcanzar un máximo. 3. Fase estacionaria: Es un tramo recto, tras los 6-7 días de evolución del cultivo. El número de células permanece constante. 4. Formas de crecimiento Las células crecen de dos formas distintas: a) En monocapa b) En suspensión Las células crecen de dos formas distintas: a) En monocapa Son células que solo se dividen adheridas a una superficie sólida. Puede ser de plástico o de vidrio. Son células dependientes de anclaje, por lo que necesitan adherirse a una superficie para poder crecer. Sin esta, no proliferarían las células. Es el método normalmente utilizado. Las células crecen de dos formas distintas: a) En monocapa En este tipo de crecimiento, se pueden distinguir una serie de etapas: 1. Adhesión a la superficie: Es el periodo en el que las células se vn adhiriendo al soporte sólido. 2. Proliferación y formación de colonias: Una vez adheridas, las células comienzan a proliferar, se expanden y forman colonias celulares. Esta etapa corresponde a la fase exponencial de la curva de crecimiento. Las células crecen de dos formas distintas: a) En monocapa En este tipo de crecimiento, se pueden distinguir una serie de etapas: 3. Inhibición por contacto: Con el paso del tiempo, las células ocupan toda la superficie disponible y comienzan a estar en contacto las células entre ellas. Aquí es cuando se produce la inhibición por contacto, donde las células detienen su proliferación aunque se mantienen vivas. En este momento es cuando comenzaría la fase estacionaria de la curva de crecimiento. Para que las células reanuden su crecimiento, se ha de hacer un subcultivo o pase celular: pasar parte de las células a un nuevo frasco de cultivo. Realmente, el momento ideal para realizar esto, es al final de la fase exponencial, unos 6-7 días de haber realizado el cultivo. Las células crecen de dos formas distintas: b) Crecimiento en suspensión: Las células no necesitan adherirse a ninguna superficie para crecer. Se mantienen dispersas y proliferando en la totalidad del cultivo. Este tipo de crecimiento suele ser propio de las células sanguíneas, circulantes, células hematopoyéticas, células madre y algunas líneas de células tumorales. Las células crecen de dos formas distintas: b) Crecimiento en suspensión: En este tipo de crecimiento, también se distinguen unas etapas: 1. Adaptación al medio de cultivo: Es un periodo corto donde las células se adaptan a las condiciones del cultivo. Correspondería a la fase de latencia de la curva de crecimiento. 2. Proliferación en suspensión: Las células ya se han adaptado al medio y comienzan a proliferar dispersas. Correspondería con la fase exponencial de la curva de crecimiento. 3. Inhibición por densidad: Se alcanza cuando el cultivo llega a un número crítico de células en relación con el volumen del medio de cultivo y los nutrientes disponibles. Aquí se produce la inhibición por densidad y las células dejan de proliferar y dividirse, aunque se mantengan vivas. Correspondería con la fase de estacionaria de la curva de crecimiento. Al igual que en los cultivos en monocapa, sería necesario realizar un pase celular al final de la fase exponencial. 5. Vida de las células tras consecutivos pases Las células que se han conseguido a partir de un órgano mediante cultivo primario se denominan líneas celulares primarias. Estos cultivos, se mantienen mediante pases seriados durante un tiempo limitado. La población celular aumenta en cada pase y normalmente, a partir del tercer pase se estabiliza. Cada tipo celular se estabiliza a partir de un determinado pase. La población de células se hace homogénea y uniforme, manteniendo las mismas características en las generaciones posteriores. Pasado ese tiempo, se entra entonces en la fase de senescencia o muerte. Aquí, las células van perdiendo la capacidad de dividirse y se van muriendo. Esto es debido a la teoría de los telómeros, los cuales, se van acortando en cada división y se van acumulando anomalías genéticas y perdiendo funciones. Es por ello por lo que es necesario anotar en el frasco de cultivo el número de pases que se han realizado en cada cultivo. Las líneas celulares continuas están formadas por células inmortales y se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante pases seriados. Son líneas estables y permanentes como consecuencia de la transformación celular, relacionado con la pérdida de los mecanismos de control celular. Las líneas celulares continuas tienen unas características especiales: Crecen indefinidamente en cultivo. Son inmortales Pierden la dependencia de anclarse para crecer. Pueden crecer en suspensión Pierden la inhibición por contacto Pueden invadir tejidos y producir tumores Acumulan anomalías genéticas. Normalmente son aneuploides, es decir, que tienen un número anormal de cromosomas. La aparición de estas líneas celulares continuas se puede producir por: Métodos físicos: Irradiación del cultivo Métodos químicos: Tratamiento con productos químicos carcinógenos Métodos biológicos: Infección vírica, transferencia de ADN… 6. Soportes físicos Cuando se va a realizar un cultivo celular, se requiere: 1. Extraer las células de su entorno tisular fisiológico 2. Introducirlas en el interior de un recipiente adecuado, aisladas del exterior y con un medio de cultivo 3. Incubarlas en estufas especiales con condiciones ambientales adecuadas. Para que el cultivo celular tenga éxito, se requieren una serie de condiciones: el soporte físico, la composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo, la atmósfera gaseosa y las condiciones de incubación. En el caso del soporte físico, el material de estos recipientes debe de cumplir unos requisitos: Permitir la adhesión de las células Ser fácilmente esterilizable Tener una mínima calidad óptica para poder visualizar el cultivo con un microscopio invertido. Los materiales más habituales son: 1. Vidrio: Es reutilizable, fácil de limpiar y esterilizar. La capacidad óptica es buena. 2. Plástico desechable: Es el más utilizado y el más económico. Permite su esterilización por irradiación y tiene buena capacidad óptica. Al no ser reutilizado, disminuye mucho el riesgo por contaminación. Los materiales más habituales son: 3. Matrices tridimensionales: Estructuras tridimensionales porosas de colágeno o de celulosa. Se usan para cultivar algunos tipos celulares que se introducen dentro de esta red tridimensional y crecen de manera similar a como lo hacen en su tejido de procedencia. 4. Microesferas de sphadex o poliacrilamida: Las células crecen adheridas a estar microesferas que se mantienen en suspensión en el medio de cultivo. De este modo las células dependientes de anclaje proliferan en suspensión. Los tipos de soportes o recipientes para cultivos normalmente son: 1. Placas multipocillo: Son placas con un número variable de pocillos. Pueden ser de 6 a 96 pocillos. EL fondo es plano y suelen tener unas tapas no herméticas. El diámetro de los pocillos puede variar entre 8 a 35 mm. Y la superficie del diámetro entre 0,5 y 10 cm por pocillo. 2 Se suelen utilizar para experimentos puntuales simultáneos, con diferentes líneas celulares o diferentes condiciones de cultivo. No se aconsejan para el mantenimiento de las líneas celulares y tienen alto riesgo de contaminación Los tipos de soportes o recipientes para cultivos normalmente son: 2. Placas Petri: Son placas redondas con tapa no hermética. Su tamaño puede variar entre 3,5 y 10 cm de diámetro, unos 10 a 78. Tienen la misma utilidad y limitaciones que las placas multipocillos Los tipos de soportes o recipientes para cultivos normalmente son: 3. Frascos o botellas Roux: Son frascos planos con tapón de rosca, disponibles de muchos tamaño. Su superficie varía entre 25 y 75 cm2 pudiendo llegar a 225 cm2. Sirven tanto para cultivos de suspensión como los de monocapa. El tapón de estos frascos tienen una membrana que posibilita el intercambio de gases. Si el tapón no tiene esta membrana, no hay que enroscar el tapón del todo. Los tipos de soportes o recipientes para cultivos normalmente son: 4. Botellas para incubadores de tipo roller: Son botellas cilíndricas que se incuban sobre rodillos. EL cultivo crece sobre las paredes interiores de estas botellas logrando una gran superficie de cultivo. Para mejorar la adhesión de las células dependientes de soporte, a los recipientes se suelen tratar con proteínas de matriz extracelular como colágeno, laminina, fibronectina u otras proteínas sintéticas o naturales. 7. Composición del medio de cultivo Un medio de cultivo es una solución o un gel, que contiene los nutrientes necesarios para permitir en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de las células. Los medios de cultivo sustituyen el medio natural en el que se encuentra la célula fisiológicamente. Debe de aportar todo lo necesario para que la célula viva y prolifere. Se deben de generar también las condiciones adecuadas de pH y osmolaridad adecuadas y permitir la acumulación temporal de productos de desechos sin que esto les altere significativamente. Los medios de cultivo pueden ser: 1. Medios naturales: Consisten básicamente en fluidos naturales, caracterizados por la gran adecuación para las células. Por el contrario, son difícilmente reproducibles por carecer de la información exacta de su composición. 2. Medios artificiales y sintéticos: Son los más utilizados. Se preparan agregando nutrientes orgánicos, inorgánicos, vitaminas, sales, proteínas, hidratos de carbono, etc. De estos se pueden encontrar 4 grandes grupos: Los medios de cultivo pueden ser: 2. Medios artificiales y sintéticos: a) Medios complementados con suero: El suero fetal bobino (FBS: Fetal Bovine Serum) es uno de los complementos más utilizados por su bajo coste. Aporta hormonas y factores de crecimiento. b) Medios libres de suero: La presencia de FBS puede causar malinterpretaciones en estudios inmunológicos, por ello se hacen medios libres de suero con factores de crecimiento y proteínas. Los medios de cultivo pueden ser: 2. Medios artificiales y sintéticos: c) Medios químicamente definidos: En la línea de los medios libres de suero, se manufacturan medios con ingredientes orgánicos e inorgánicos ultrapuros libres de contaminación. Su composición está totalmente definida. d) Medios libres de proteínas: No contienen ningún componente proteico y comparado con los sueros complementados con FBS promueven un crecimiento celular y expresión proteica superior. La composición de los medios de cultivo dependen de los requerimientos de las diferentes líneas celulares. En general, la composición de los medios de cultivo van a contener: a) Sales minerales: Es la base del medio de cultivo. Es una solución salina equilibrada en la que van disueltos el resto de componentes. Normalmente están compuestos de cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, cloruro de magnesio, fosfato sódico y bicarbonato sódico. Este último es muy importante para regular el pH del medio junto con el CO2 ambiental del incubador. En general, la composición de los medios de cultivo van a contener: b) Tampón: El medio de cultivo tiene que estar tamponado, pues las células son muy sensibles a los cambios de pH. El más utilizado es el tampón bicarbonato, compuesto por ácido carbónico y bicarbonato. Actualmente se prefiere el uso de tampón HEPES (10-20 mM), por el gran poder tamponador en el rango de pH óptimo para el crecimiento de células (pH 7,2 a 7,6). c) Glucosa: Se añade como fuente de energía, de forma única o junto con otros hidratos de carbono. En general, la composición de los medios de cultivo van a contener: d) Aminoácidos: Deben estar presentes, como mínimo, todos los aminoácidos esenciales. EL resto, se pueden suplementar en base a las necesidades de las células. e) Vitaminas: Las vitaminas influyen en la tasa de crecimiento y en la supervivencia de las células. La composición de las vitaminas varía mucho, depende de la concentración que se use. f) Suplementos orgánicos de bajo peso molecular: Se incluyen ácidos grasos esenciales y otros lípidos, nucleósidos, piruvatos etc. En general, la composición de los medios de cultivo van a contener: g) Indicador de pH: El pH es un parámetro fundamental para la supervivencia del cultivo. El indicador se añade para poder registrar los cambios mínimos en el rango de pH óptimo. El indicador más utilizado es el rojo fenol. h) Hormonas y factores de crecimiento: Se incluyen muchos componentes esenciales para el crecimiento de las células. La mayor parte de los medios de cultivo básicos se suplementan con un 10% de suero anmal (FBS) para añadir estos componentes esenciales. En general, la composición de los medios de cultivo van a contener: h) Hormonas y factores de crecimiento: El suero debe de estar descomplementado, para inactivar las proteínas del sistema de complemento, un complejo sistema de reacciones enzimáticas que facilita la fagocitosis, lisis celular y apoptosis. Forma parte de la respuesta inmunitaria del organismo. El FBS habitualmente se conserva congelado hasta su uso. Para descomplementarlo se descongela a 37ºC y se mantiene a 56º durante 45 minutos. Pasado ese tiempo, se alicuotan volúmenes pequeños (de 10-15 ml) que se mantienen a -20ºC. En general, la composición de los medios de cultivo van a contener: i) Antibióticos y antifúngicos: Es importante añadirlos al medio para evitar la contaminación por bacterias, levaduras y hongos. Los más utilizados son: Gentamicina y penicilina/Estreptomicina como antibióticos y AnfotericinaB como antifúngico. Las principales características fisicoquímicas son: 1. pH: Generalmente para todas las células, el pH óptimo es de 7,4 (de 7,2 a 7,6). Se deben controlar los cambios de pH observando el viraje del indicador incorporado en el medio de cultivo. 2. Osmoralidad: Los medios de cultivo deben de ser isotónicos o ligeramente hipertónicos (260-320 mOsm/kg). 3. Viscosidad: No es un parámetro limitante para el crecimiento celular. Dependerá principalmente de la concentración de suero que se une al medio. 4. Tensión superficial: En cultivos en suspensión, se añade CO 2 forzado al medio, produciendo burbujas. Para evitar las burbujas, se añaden agentes antiespumantes. En monocapa no tiene apenas importancia. 8. Atmósfera gaseosa y condiciones de incubación La atmósfera gaseosa es la mezcla de gases en que se mantienen los cultivos. Los dos componentes son el O 2 y el CO2. Todas las células eucariotas requieren oxigeno para vivir. Normalmente la concentración de oxígeno atmosférico (21% es suficiente para cubrir las necesidades. Solo algunos cultivos de órganos requerirán hasta un 95% de oxígeno en la atmósfera, debido a lo mal que difunde este gas hacia las zonas internas del órgano. El dióxido de carbono tiene un papel muy importante. Los incubadores de células llevan acopladas botellas de CO2 y un dispositivo para determinar la concentración, normalmente a un 5% (entre el 2 y el 8%). La fracción que se disuelve en el medio de cultivo estará en equilibrio con el ión bicarbonato del tampón, por lo que los niveles de CO2, pueden influir en el pH del medio. En cuanto a las condiciones de incubación, el incubador debe de mantener constantes las condiciones ambientales óptimas para el crecimiento, controlando la temperatura y la humedad. La temperatura influye en la tasa de crecimiento. La temperatura óptima de crecimiento suele ser la misma que la fisiológica para ese tipo celular y el organismo del que proceden. En mamíferos, es de 37ºC. La humedad, es un parámetro importante para evitar la evaporación del medio de cultivo debido a la temperatura. Se esta evaporación se produjese, produciría variaciones en la concentración de los componentes del medio, la osmolaridad y el pH. La humedad relativa óptima es del 95%. 9. Procedimientos del cultivo celular Para realizar el cultivo, se suelen hacer una serie de pasos consecutivos: 1. Disgregación celular: Es el primer paso para obtener una suspensión celular. Hay que desunir a las células entre sí y de la matriz celular. Para ello, se pueden conseguir de varios procedimientos: 1. Métodos mecánicos: Se basan en cortar, picar y triturar con suavidad los fragmentos de órganos y tejidos. Un ejemplo de los más utilizados son el cribado de células o tamizado, donde los trozos de los órganos se colocan sobre una malla de nailon o metálica y se aplasta suavemente. Esta malla se acopla a un recipiente, un tubo falcon o placa Petri y se realizan lavados seriados sobre la malla. Así las células caen al recipiente y los restos orgánicos no disgregados, permanecen en la malla. Para realizar el cultivo, se suelen hacer una serie de pasos consecutivos: 1. Disgregación celular: Para ello, se pueden conseguir de varios procedimientos: 2. Métodos enzimáticos: Se basan en la aplicación de enzimas proteolíticas sobre la matriz para que las células se liberen. Las proteasas más utilizadas son: tripsina, papaína, elastasa y proteinasa K Para realizar el cultivo, se suelen hacer una serie de pasos consecutivos: 2. Selección de células: Una vez disgregadas, se obtiene una mezcla compleja de células en suspensión con la que se puede hacer un cultivo primario. Pero, si es importante seleccionar un tipo celular concreto, se seleccionan células de dos modos: a) Por sus propiedades específicas: Se pueden separar los tipos celulares en base a su diferente adhesión a los sustratos. Se hace pasar las células por columnas o filtros con los diferentes sustratos y las células quedan retenidas. Para liberarlas, se lavan las columnas con un tampón que disminuya la adhesión y eluya las células. Para realizar el cultivo, se suelen hacer una serie de pasos consecutivos: 2. Selección de células: es importante seleccionar un tipo celular concreto, se seleccionan células de dos modos: b) Por métodos inmunológicos: Son métodos basados en la técnica ELISA, mediane el empleo de anticuerpos específicos para antígenos celulares concretos. Para realizar el cultivo, se suelen hacer una serie de pasos consecutivos: 3. Recuento y viabilidad celular: Para saber la densidad celular (al iniciar un cultivo o un subcultivo) debemos de conocer la concentración de células y cuántas son viables. Los colorantes vitales nos permiten diferenciar las células vivas de las muertas. EL más utilizado es el azul tripano, un coloide que penetra en el interior de las células cuya membrana está rota, pero no lo atraviesa de las células que están vivas. Para realizar el cultivo, se suelen hacer una serie de pasos consecutivos: 3. Recuento y viabilidad celular: Al observar al microscopio, las células azules son muertas y las células blancas (refringentes) son las vivas. Para el contaje celular se realizan o bien de manera manual con la cámara de recuento o de manera automática con el autohemocitómetro. También, hay otras formas para comenzar a tener un cultivo celular como es mediante la descongelación de células, iniciar cultivos secundarios por la descongelación de células que se encuentran a -80ºC. El procedimiento sería: Incubar el vial congelado a 37ºC en un baño Limpiar la superficie externa del vial con etanol de 70º Transferir el contenido del vial a un tubo y añadir medio de cultivo nuevo atemperado a 37ºC Centrifugar el tubo a 800rpm durante 5 minutos Desechar el sobrenadante para eliminar el DMSO (críoprotector) que es tóxico y resuspender el pellet celular en medio de cultivo atemperado a 37ºC. Cultivo en siembra: A partir de una suspensión celular obtenida de un tejido o de las descongelación celular, se puede iniciar un cultivo de la siguiente forma: 1. Elegir el recipiente a emplear y su volumen: frasco, placa… 2. En base al recipiente, ajustar la densidad celular a sembrar una vez hecho el recuento de células viables 3. Añadir medio de cultivo en el volumen adecuado, atemperado a 37 4. Incubar a 37ºC de temperatura, humedad95% y 5% de dióxido de carbono. Para el mantenimiento del cultivo: 1. Control periódico al microscopio: Se controlan de forma periódica por el microscopio, entre 1 a 3 días. 2. Cambios de medio: Es la operación más frecuente. Se renuevan los nutrientes consumidos y se eliminan los productos de desecho. EL cambio se hace cada 2 o 3 días, siempre observando el cambio de color (viraje del indicador de pH). EL cambio de medio de cultivo nunca es total. Se cambia 2/3 del total. Así mantenemos sustancias beneficiosas secretadas por las mismas células. Para el mantenimiento del cultivo: 2. Cambios de medio: En los cultivos monocapa el medio de cultivo está por encima del cultivo y tan solo es necesario retirar 2/3 del medio antiguo En los cultivos en suspensión, se centrifugan suavemente a 800 rpm durante 5 minutos para depositar las células al fondo. Después se retiran 2/3 partes y se renueva con medio nuevo. Pase o subcultivo: Cada 6 o 7 días, los cultivos en monocapa llegan a su confluencia máxima y los cultivos en suspensión a su densidad crítica. Entonces hay que hacer un pase celular. En el caso de las células en monocapa hay que despegarlas de la superficie, o bien con rascadores o scrappers o bien de forma enzimática con tripsina. Una vez resuspendidas, se realiza el recuento de las viables y se realiza un subcultivo con la cantidad adecuada para iniciar un nuevo crecimiento. En los cultivos en suspensión, se hace el pase a partir de las células viable. Conservación de células Las líneas celulares continuas o inmortales, se pueden conservar mediane su congelación. Se obtiene una suspensión celular en monocapa mediante su rascado o por enzimas. En los cultivos de suspensión no hace falta este proceso. A continuación centrifugamos a 800 rpm durante 5 minutos y se resuspende junto con FBS y DMSO (críoprotector). La concentración final de céluas debe de ser de 10 elevado a 6 células por ml. Se alícuota en críotubos de 1 ml y se procede a su congelación progresiva. La primera es 24horas a -20 y después otras 24h a -80. A continuación, se pueden conservar en nitrógeno líquido a -196º de forma indefinida. 10. Contaminaciones Se producen por bacterias, levaduras y hongos: Las bacterias y las levaduras son los contaminantes más habituales a corto plazo. Los hongos filamentosos son los más habituales a largo plazo. En los medios de cultivo crecen mucho más rápido. Por ello el uso de antibióticos y antifúngicos son necesarios. Por ello es importante: Trabajar en condiciones de asepsia Tener cuidado al manipular los cultivo Limpiar las superficies externas y todos los utensiolios a utilizar Micoplasmas: Son microorganismos procariotas sin pared celular. Suelen infectar los cultivos continuos o inmortales y son difíciles de detectar. Para detectarlos, muchas veces se tiene que hacer mediante pcr amplificando el 16s RNA ribosómico que lo tienen muy conservados los micoplasmas en su genoma. Siempre que haya un cultivo contamindo, se elimina. Virus: Son poco frecuentes pero son graves. La fuente de contaminación suelen ser los sueros animales. La presencia del virus se detecta por la observación del efecto citopático característico de cada virus. Ante la sospecha, se elimina.