TEMA 1 ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES PDF

CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES TEMA 1: ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES ESQUEMA: 1.INTRODUCCION 2. TIPOS DE LABORATORIOS DE CULTIVOS CELULARES 2.1 Según su patogenicidad a) Laboratorios de culti...

CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES TEMA 1: ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES ESQUEMA: 1.INTRODUCCION 2. TIPOS DE LABORATORIOS DE CULTIVOS CELULARES 2.1 Según su patogenicidad a) Laboratorios de cultivos de presión positiva b) Laboratorios de cultivos de presión negativa 2.2 Según el tipo de cultivo: a) Laboratorios de cultivos primarios b) Laboratorios de líneas celulares 3. ESTRUCTURA DE UN LABORATORIO DE CULTIVOS 1) Área estéril o área de cultivo 2) Zona o área de incubación 3) Zona de preparación de medios de cultivo 4) Zona de almacenaje 5) Zona de lavado de material y esterilización. 4. UBICACIÓN Y DISEÑO IDÓNEO DE LAS INSTALACIONES 1 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES 1. INTRODUCCIÓN Se define CULTIVO CELULAR como el conjunto de técnicas que permiten aislar, crecer y mantener in vitro células de origen animal o vegetal, bajo un entorno artificial favorable. Muchas veces se usa el término cultivo celular para referirnos al cultivo de células eucariotas animales mientras que cuando trabajamos con células vegetales habitualmente hablamos de “cultivo de tejidos vegetales”. El objetivo es cultivar las células fuera de su medio natural y en condiciones controladas para manejar sus respuestas en el laboratorio, preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas La clave del éxito en el cultivo celular es ser capaces de conservar la salud de nuestras células. Seguir una serie de protocolos es relativamente sencillo, lo importante es hacerlo conociendo nuestros cultivos y comprobando su salud constantemente. Las células son entes vivos y, por tanto, les afectan enormemente todas las condiciones del medio en el que se están desarrollando. Para trabajar con cultivos celulares es importante tener en cuenta que los cultivos son variables, crecen de forma poco homogénea y debemos adaptarnos a las necesidades que observemos en su manejo. En cuanto al laboratorio de cultivos el objetivo principal de contar con un espacio específico es el de mantener un buen nivel de asepsia. Solemos referirnos a dicho espacio como la sala, el cuarto o el laboratorio (si es un espacio grande) de cultivo celular, de cultivos celulares o de eucariotas (frecuente en centros que cuentan con sala de eucariotas y sala de procariotas específicas e independientes). La característica principal de una sala de cultivos será la de contar con todos los mecanismos disponibles y razonables para mantener el nivel de esterilidad necesario para el tipo de ensayos que se lleven a cabo en su interior. Por tanto, nos encontramos con diferentes niveles de seguridad, exigencia y normativa, en función del uso que se le dé a una sala de cultivos celulares. Desde una cabina de flujo laminar en un laboratorio biotecnológico general, hasta una sala blanca con los requerimientos y la normativa más estricta. En el cultivo de células la esterilidad y el mantenimiento de la asepsia son de especial relevancia debido a que la tasa de crecimiento de las células en cultivo es muy inferior a la de los contaminantes habituales (bacterias, virus, hongos, levaduras y micoplasmas) y, por eso, es fundamental mantenerlos lejos de nuestros cultivos. Por lo tanto, la situación ideal es disponer de una sala aislada del resto de actividades, lejos de vías de paso y dedicada exclusivamente al cultivo de células. 2 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Un ejemplo para hacerse a la idea: Si asumimos como generalidad que las bacterias se dividen cada 20 min (tiempo estimado para E. coli) y las células en cultivo se dividen cada 24 horas (tiempo medio para líneas celulares como HeLa o Hek) Si un cultivo con 1 millón de células se contamina con 1 bacteria...tras 24 horas tendremos 2 millones de células y 4.000 trillones de bacterias. 2. TIPOS DE LABORATORIOS Los laboratorios de cultivos se pueden clasificar teniendo en cuenta diferentes criterios: 2.1 Según el potencial de patogenicidad de los cultivos. Hay dos tipos de salas o laboratorios de cultivos según el potencial de patogenicidad de los cultivos con los que se trabaje en ellos: a) LABORATORIO DE PRESIÓN POSITIVA El laboratorio de presión positiva se usa para el cultivo de tejidos sin patógenos. Consiste básicamente es una sala aislada con suministro de aire climatizado y filtrado (HEPA). La entrada de aire produce un aumento de presión atmosférica en el interior del laboratorio (típicamente entre 15-20 Pa) que impide la entrada de contaminantes del exterior (sala limpia). 3 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Los filtros de aire HEPA (del inglés "High Efficiency Particle Arresting", o "recogedor de partículas de alta eficiencia") puede retirar la mayoría de partículas perjudiciales manteniendo el aire libre de polvo, polen, ácaros, virus, bacterias, y partículas finas cuya medida es inferior a 0,1 micrómetro. Aunque el diámetro de las fibras es de entre 0,5 y 2 micras, las mallas al estar dispuestas aleatoriamente retienen partículas más pequeñas de tres formas: las partículas se quedan adheridas a la malla al rozar la fibra cuando el aire que las trasporta pasa a través; las partículas más grandes directamente chocan con las fibras; y por último, la difusión, relacionada con el movimiento aleatorio de las partículas en un fluido (movimiento browniano) que facilita que se ejerza su adhesión. b) Laboratorio de presión negativa El laboratorio de presión negativa se utiliza para el cultivo con patógenos. Para evitar la salida accidental de los patógenos se filtra el aire que sale a través de un filtro HEPA y se genera un déficit de presión en el interior (mínimo -15 Pa). Si se determina que es necesario que el aire que entra sea también filtrado se deberán ajustar los caudales de aire para que el balance neto permita mantener una presión negativa en el interior. Hay que considerar también cualquier otro equipamiento que pueda afectar a este balance (p. ej. vitrinas y cabinas con conexión al exterior). 4 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Un ejemplo de laboratorio de presión negativa sería un laboratorio de producción de vacunas víricas utilizando cultivos celulares. 2.2 Según el tipo de cultivo En función del origen de las células podemos clasificar los laboratorios como laboratorio de Cultivos primarios o de Cultivos de líneas celulares. a) Laboratorios de primarios Los cultivos primarios son cultivos de células tomadas directamente de un tejido u órgano. A partir de una biopsia de un órgano o tejido, se lleva a cabo la disgregación celular y la dispersión e individualización celular para su cultivo. Los cultivos primarios son células con características morfológicas y funcionales bastante similares a las que se presentaban in vivo. Por lo tanto, en teoría, son el mejor modelo experimental in vitro. El que mejor podrá reflejar lo que está en realidad sucediendo en el individuo del que proceden. Sin embargo, su uso es limitado en investigación porque: - Mantienen la viabilidad un periodo de tiempo limitado. - Generalmente son una mezcla de tipos celulares. - Las diferentes muestras suelen proceder de individuos diferentes por lo que aumenta mucho la variabilidad interexperimentos. Obtendremos los mejores resultados cuando los cultivos primarios se establezcan a partir de tejidos u órganos con menor grado de diferenciación y mayor capacidad de división como son: - Tejidos embrionarios. - Tejidos u órganos tumorales. Un buen ejemplo de células con muy buen resultado en cultivo primario son las células madre mesenquimales procedentes de cordón umbilical, grasa o médula. b) Laboratorios de líneas celulares Las líneas celulares son una población definida de células mantenidas en cultivo, de un tipo único y que se han adaptado para crecer continuamente en el laboratorio. Se diferencian dos tipos principales de líneas celulares dependiendo de su vida útil: LÍNEAS CELULARES FINITAS Son líneas celulares que tienen un número definido de divisiones (inferior a 50). En consecuencia, experimentan senescencia después de un número predefinido de divisiones celulares. *La senescencia celular es el proceso iniciado como respuesta al estrés y daño ocurrido en una célula, y constituye una ruta alternativa de respuesta a la muerte celular programada (Apostosis) y es de vital importancia para suprimir la formación de células cancerosas. También está asociada a la reparación de tejidos e inflamación de los mismos, procesos asociados al crecimiento 5 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES de tumores. De esta manera, la senescencia celular está asociada a los procesos de supresión y promoción de tumores simultáneamente, al igual que en el envejecimiento y reparación de tejidos. En los sucesivos pases las células van acumulando anormalidades y perdiendo funciones especializadas, lo que da lugar a la muerte del cultivo. Ejemplos: HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) células endoteliales del cordón umbilical, HEKa (Human Epidermal Keratinocytes adult queratinocitos humanos de adulto. MEFs (Mouse Embryonic Fibroblast) Fibroblastos de embrión murino. LÍNEAS CELULARES CONTINUAS Son líneas celulares que tienen la capacidad de dividirse indefinidamente. Estas son células inmortales. Son células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de células derivadas de tumores o de un proceso de transformación (mecanismo de inmortalización). Los mecanismos de inmortalización pueden ser por métodos de transformación como la inducción de oncogenes, la infección con virus tumorales o el tratamiento con sustancias mutagénicas. La diferencia principal entre líneas celulares finitas y continuas es que las líneas celulares finitas experimentan un número definido de divisiones celulares mientras que las líneas celulares continuas experimentan un número indefinido de divisiones celulares. Además, las líneas celulares continuas mantienen intactas sus características tras sucesivas divisiones. 3. ESTRUCTURA DE UN LABORATORIO DE CULTIVOS. El funcionamiento exitoso de un laboratorio de cultivo depende de varios factores: diseño y ubicación, equipamiento adecuado y personal especializado. La suma de estos factores apunta a lograr la máxima seguridad para las personas y condiciones apropiadas para los cultivos. En primer lugar, es primordial controlar a los elementos contaminantes, en ambos sentidos, es decir, proteger al trabajador de posibles agentes patógenos aportados por el cultivo celular y a éste de contaminaciones indeseables, ya sea del propio operador o del medio ambiente. Se considera muy conveniente que él o los ambientes destinados al laboratorio de cultivos celulares estén provistos de aire filtrado. Deben ser, además, de fácil limpieza, sin molduras ni otros elementos que puedan acumular polvo. Existen 5 zonas principales que deben ser consideradas para el buen funcionamiento de un laboratorio de cultivos celulares: 1. El área estéril o área de cultivo. Debe estar restringida sólo al cultivo celular y debe ubicarse en un lugar aislado, separado del laboratorio de microbiología u otros Si se cuenta con un único ambiente para cubrir la totalidad de las funciones descriptas, esta área debe estar ubicada en una zona donde no circulen usuarios ni haya corrientes de aire. Deben colocarse 6 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES en ella las cabinas de flujo laminar o en su defecto, pequeñas cabinas cerradas, de madera o metal, provistas de luz ultravioleta. Esta área estéril debe cumplir con los siguientes requisitos: - Estar libre de corrientes de aire. - Estar provista de filtros de aire. - Estar sujeta a desinfecciones periódicas. - Contar con lámparas de luz ultravioleta germicida, que serán encendidos durante el período de descanso. - Las áreas y los equipos deben ser usados sólo para los cultivos celulares. 2. Zona de incubación. La mayoría de las células de mamífero en cultivo requieren una incubadora sin agitación, con 5% de CO2, a 37° C y con ambiente húmedo (95%). Los incubadores deben ubicarse en una zona con poco tránsito, cercana al área de cultivo propiamente dicha. Si fueren necesarias más de dos incubadores, puede reemplazarse por un cuarto acondicionado y controlado termostáticamente, cuyo costo de construcción no es excesivo. Por otra parte, el costo para equipar un cuarto de incubación pequeño es similar al de equipar uno mayor, por lo que esto se debe tener en cuenta en el momento de decidir su instalación. 3. Zona de preparación de medios de cultivo. Puede evitarse en un laboratorio con poco personal, y en el que se procesa un número limitado de cultivos, donde quizás sea más ventajoso comprar los medios listos para usar. Sin embargo, para un laboratorio grande, es mucho más económico preparar sus propios medios. Esta área debe ser estéril y si fuera posible, contar con una cabina de flujo laminar para la filtración y envasado de las soluciones estériles. Se necesitan, además equipos como un medidor de pH y varios agitadores magnéticos. 4. Zona de almacenaje El área de almacenaje debe estar situada entre la zona de preparación y la zona de cultivo y debe ser de fácil acceso. 5. Zona de lavado del material y de esterilización. Deben llevarse a cabo en un área alejada de la zona de trabajo con los cultivos. Si necesariamente ambas zonas debieran estar en un mismo ámbito, estas dos funciones se realizan en la zona más alejada posible del área estéril, ya que el calor y la humedad que se producen son difíciles de disipar. Autoclaves y destiladores de agua deberían estar separados del resto. El lavado debe realizarse en fregaderos de profundidad adecuada. Debe contarse con hornos para el secado del material de vidrio y del material que sale húmedo del autoclave. Asimismo, deben existir una zona para la preparación de los elementos que van a ser esterilizados. 7 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES 4. UBICACIÓN Y DISEÑO IDÓNEO DE LAS INSTALACIONES Para un diseño adecuado de las instalaciones de un laboratorio de cultivos es necesario tener en cuenta: 1) Número de usuarios. Es necesario conocer cuántas personas trabajarán en la instalación, cuánto tiempo trabajarán cada semana y qué tipos de cultivos realizarán. Estas consideraciones determinar cuántas campanas de flujo laminar será necesario instalar (según si las personas pueden compartir la cabina o requerirá una cabina cada uno durante la mayor parte del día) y si se necesitará una gran superficie para manipular biorreactores, animales, disecciones de tejidos o un gran número de cultivos. Por ejemplo, 12 cabinas de flujo laminar en una instalación comunitaria pueden ser utilizadas por 50 trabajadores con necesidades intermitentes. 2) Diseño del espacio. Es importante una gestión adecuada del espacio. La zona más grande debe ser el área de cultivo. En esta zona se tienen que colocar las campanas de flujo laminar, contadores de células, centrífugas, incubadoras, microscopios y el uso de reservas de reactivos, medios, materiales fungibles y si es posible un área de cuarentena. La segunda zona más grande es para lavado, preparación y esterilización. El tercero es para almacenamiento, y el cuarto es para incubación. Un razonable estimación es 4:2:1:1, en el orden que se acaba de presentar. 8 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Además, para el diseño un laboratorio de cultivos debe cumplir las siguientes consideraciones: 1) SISTEMA DE DOBLE PUERTA. Debe ser una habitación sin corrientes de aire por lo que se recomienda que cuente con un sistema de doble puerta y con mecanismos de interbloqueo que impida la apertura de las dos puertas al mismo tiempo. La ausencia de corrientes de aire impide que partículas potencialmente contaminantes lleguen a los cultivos. Este espacio entre las dos puertas suele utilizarse para que los trabajadores se coloquen los EPIS necesarios y específicos. Habitualmente recibe el nombre de antesala de cultivos. 2) LUZ ULTRAVIOLETA. La luz ultravioleta es un potente esterilizador de superficies. Habitualmente en ciclos de 15 minutos son suficientes para conseguir superficies limpias estériles. En las salas de cultivos es muy aconsejable contar con lámparas de luz ultravioleta en el techo y establecer protocolos de esterilización diariamente. 3) ENTRADA DE AIRE FILTRADO. Las salas de cultivos celulares suelen ser laboratorios de presión positiva (dependiendo del uso que le vayamos a dar). Estas salas de presión positiva deben contar con un sistema de infusión y filtrado de aire por filtros HEPA que asegure el mantenimiento de la presión positiva en el interior. De esta forma cuando la puerta de la sala se abra, el aire tenderá a salir y se dificultará la entrada de aire del exterior con potenciales contaminantes. 4) SUPERFICIES RESISTENTES. Para optimizar la eficiencia de los procedimientos de limpieza, las salas de cultivo deben ser construidas con materiales especiales impermeable de fácil limpieza como por ejemplo: panel tecnipure chapa Todos los ensamblados entre suelo, mampara y techo deben de tener perfiles formando molduras. Los vértices cóncavos deben terminar en punto redondeado mediante casquetes esféricos para evitar acumulación de polvo y facilitar limpieza. Las esquinas convexas deben realizarse con perfil curvo y en techo utilizar pieza en forma de pie de copa. 9 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Generalmente del mismo material que las paredes e incorporando resina sintética termoestable, sin grietas de unión ni tornillería vista. El techo debe ser continuo, panel tipo sándwich absolutamente sellado: uniones entre placas, distintos elementos, luminarias, filtros.. 5) NIVELES DE HUMEDAD Y ELECTRICIDAD ESTÁTICA Ha de mantenerse constante entre el 40%-60% para que no se produzca electricidad estática. A su vez, en ningún momento debe existir condensación. Además, la instalación de disponer de una red de tierra independiente de la del resto del edificio con una resistencia muy baja donde se conectarán todos los dispositivos eléctricos, mobiliario, etc. 6) TEMPERATURA La temperatura de la sala viene determinada por el tipo de actividad que se realiza en ella. La tolerancia en la temperatura es muy limitada, en determinadas industrias puede ser de apenas ±0.5°. La exigencia en cuanto a control y estabilidad de la temperatura, exigen que los sistemas de frío/calor, control y regulación, además del propio aislamiento de la sala, sean de las máximas prestaciones. 7) ILUMINACIÓN Al igual que en cualquier otro espacio, la iluminación debe proporcionar la cantidad de luz necesaria para las actividades que se van a desarrollar. Dado que los procesos que se realizan en ellas suelen requerir un alto grado de precisión un sistema lumínico de calidad se hace imprescindible. A diferencia de otro tipo de instalaciones, la iluminación supone una parte ínfima de los costes de un laboratorio, tanto en la parte de instalación y puesta en marcha como en la de mantenimiento o consumo de energía. La dificultad al diseñar el sistema de luces la impone el, muchas veces escaso, espacio que queda para las luminarias. Ya que, dependiendo de la clase de la sala, la superficie que ocupa el sistema de ventilación suele ocupar más del 90% de la disponible. Finalmente disponer de luminarias con un índice de reproducción cromática alto es muy recomendable, ya que no distorsiona los colores. Paneles LED no magnéticos Una excelente opción para iluminar donde los procesos a desarrollar limitan la presencia de campos electromagnéticos son los paneles LED no magnéticos. 10 Profesora: Helena Amigo González CURSO DE ESPECIALIZACIÓN CULTIVOS CELULARES MÓDULO: LABORATORIO CULTIVOS CELULARES Estos se caracterizan por estar construidos con materiales que no interfieren electromagnéticamente Por otro lado presentan un altísimo rendimiento LED y factor de deslumbramiento (UGR) reducido. 11 Profesora: Helena Amigo González