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Allgemeine Mikrobiologie Grundmodul WS24/25 (Bios) Seminar #6 Dr. Dimitri Meier Grundmodul -1-  Jetzt: Testat (8 Min.) Abstand von den Nebensitzer:innen....

Allgemeine Mikrobiologie Grundmodul WS24/25 (Bios) Seminar #6 Dr. Dimitri Meier Grundmodul -1-  Jetzt: Testat (8 Min.) Abstand von den Nebensitzer:innen. Skripte bitte umdrehen! Grundmodul -2-  Themen Übersicht Lysozym - Wiederholung: Grundstruktur der bakteriellen Zellwand - Eigenschaften und Wirkung von Lysozym - Exkurs: Bildung von Protoplasten - bakterielles Lysozym - virales Lysozym Versuch 8: Wachstumskurven - bakterielles Wachstum - Auswertung der erhaltenen OD-Werte, Erstellung der Wachstumskurven Grundmodul -3-  Aufbau der bakteriellen Zellwand Wieder- Besteht aus Murein holung (einem Peptidoglycan) = Heteropolymer, gebildet aus: N-Acetylglucosamin (G) und N-Acetylmuraminsäure (M) alternierend β-1,4 glykosidisch verknüpft (…und diese „Ketten“ sind durch Peptidbrücken querverbunden → Netzwerk) Grundmodul -4-  Was ist Lysozym? Primärstruktur (=Aminosäurensequenz) Lysozym Sammelbegriff für eine Sekundär- und Tertiärstruktur charakteristische (Proteinfaltung) Familie bakterizider (was bedeutet das?) Enzyme benannt durch Alexander Fleming (1922) Lysozym aus Eiklar gehört zu den am Besten untersuchten Enzymen Grundmodul Lysozym = Muramidase catalytic residues: Glutamate35 & Aspartate52 -5-  Eigenschaften Lysozym Molekulargewicht: ca. 14,4 kDa, 129 aa, 4 Disulfidbrücken R-S-S-R hydrolysiert die β-1,4-glykosidische Bindung zwischen N-Acetylmuramin- säure und N-Acetylglucosamin → Muramidase charakteristische tiefe „Furche“ quer durch das Molekül zur Bindung des Mureins → Ort der Hydrolyse minimale Länge des Substrates: 6 Zuckerreste wichtige Aminosäuren im aktiven Zentrum (essentiell für Hydrolyse): Glutamat35 und Aspartat52 Grundmodul -6-  Wirkungsweise Lysozym Hydrolyse der glykosidischen Bindungen zwischen C1 von (M) und C4 von (G) Abbau zu Disacchariden (G-M) Durch Lysozym gespaltene Bindung © Spektrum Bei hoher Lysozym-Konzentration kommt es zu einer Grundmodul reduzierten Hydrolyse (Warum?) -7-  Wirkung auf Gram-positive und Gram-negative Zellwände Lysozym Lysozym Lysozym + EDTA © 2006 Pearson Studium / Brock Einfluss von EDTA: komplexiert zweiwertige Metallionen Mikrobiologie, 11. Auflage bindet die Ca2+ Ionen der äußeren Membran → Destabilisierung Grundmodul Lysozym kann äußere Membran passieren → Abbau der Mureinschicht -8-  Bildung von Protoplasten Lysozym Wirkung von Lysozym: Zell-Lyse, “Auslaufen” der Zelle Anwendung im Labor: © 2006 Pearson Studium / Brock Mikrobiologie, 11. Herstellung von Auflage Protoplasten Grundmodul -9-  Was sind Protoplasten? Exkurs → Bezeichnung für den stoffwechselaktiven, „energetisierten“ Zellkörper (bei Pflanzen-, Pilz- und Bakterienzellen) also für den von der Zellwand umschlossenen Teil der Zelle. → Nach Auflösung der Zellwand (z.B. enzymatisch) verlieren die Zellen ihre durch die Wand bestimmte Form und können als Sphären in vitro kultiviert und manipuliert werden (bei Gram--Bakterien nur Protoplasten von Tabak-Mesenchymzellen schwer möglich) → Beispiel pflanzliche Protoplasten: werden häufig zum Einschleusen von Fremd-DNA genutzt (Transformation). projekti.gimvic.org, © F. Müller → Sind bei Bakterienzellen noch Zellwandreste Magnetospirillum gryphiswaldense-Sphäroplasten vorhanden, spricht man von Sphäroplasten. → Protoplasten sind osmotisch sehr empfindlich, Grundmodul so dass sie nur in isotonischen oder schwach hypertonischen Medien stabil sind. -10- E. coli-Sphäroplasten mit fluoreszenzmarkierten Cytoskelett-Proteinen  Natürliche Vorkommen Lysozym Hühnereiweiß Milch Pflanzensäfte diverse Pilze Eukaryontische Lysozyme Nasensekret Teil der unspezifischen Immunabwehr Speichel Mehrere Typen (c-, g-, i-Typ, je nach Schweiß Sequenz und Substratspezifität) Blutplasma Einige (v.a. pflanzliche) Lysozyme können Tränenflüssigkeit aufgrund der Substratähnlichkeit auch Grundmodul Chitin abbauen. -11-  Natürliche Vorkommen Lysozym Bakterielle Lysozyme „Peptidoglykan-Hydrolasen“, „N-Acetylglucosaminidasen“, „Lytische Transglycosylasen“, „Autolysine“ u.a. Lytische Transglycosylasen: - ubiquitär in Eubakterien (Ausnahme: Mykoplasmen) - vier Familien mit unterschiedlichen Funktionen - exo-Aktivität (spalten Disaccharid-Anhydromuropeptide vom Peptidoglykan ab) Funktion: - lokaler Abbau des Mureins – Wozu? - beteiligt am Zellwachstum und an der Zellteilung - ermöglichen auch den Einbau von Proteinkomplexen wie Flagellen und Pili, die in die Zellwand integriert werden müssen Beispiele: Streptomyces-Lysozym lytische Transglykosylase "Slt35" von E. coli N-Acetylglucosaminidasen von Enterococcus hirae und Grundmodul Listeria monocytogenes -12-  Natürliche Vorkommen Lysozym Virales Lysozym: v-Typ: - verbreitet, sowohl bei Phagen, die Gram-negative, als auch bei Phagen, die Gram-positive Bakterien infizieren g-Typ: - Sequenz ähnlich der tierischer g-Typ Lysozyme T4 (z.B. bei diversen Vogelarten → Eiklar) λ-Typ: de.wikipedia.org/wiki/ Bakteriophage_Lamb - benannt nach dem λ-Pagen - lytische Transglykolase da Grundmodul λ-Phage -13-  Natürliche Vorkommen Lysozym Virales Lysozym: Wozu? Funktion der Lysozyme bei Bakteriophagen: lokal begrenzter Abbau des Peptidoglycans ermöglicht Infektion (→ „Lyse von außen“, das Lysozym muss „mitgebracht“ werden!) Globaler Abbau der Zellwand zur Freisetzung von Phagenpartikeln am Ende des (lytischen) Infektionszyklus: - Vor allem größere Phagen (T4-, T7- oder λ-Phagen) codieren eigene Lysozyme. Diese werden nach der Synthese im Zellinneren aus dem Cytoplasma des Wirts z.T. aktiv (Sec-System) in das Periplasma transportiert und dort wirksam. Grundmodul -14- Lysozym Fragen? Grundmodul -15-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Letzte Woche: - Kolben auf OD600 = 0,04 eingestellt (➔ waren 0,04 bis 0,08) - OD600 (t0) bestimmt (Referenzwert LB-Medium) - Schüttler synchron eingeschaltet und Zeitmessung gestartet - alle 20 min eine weitere Messung vorgenommen - Messwerte in die Tabelle an der Tafel und in die Excel-Tabelle am Rechner eingetragen, Messwerte der anderen Gruppen übernommen - Graphische Bestimmung der Verdopplungszeiten td (halblogarithmisches Papier im Skript) Hausaufgabe: - Berechnung der spezif. Wachstumsraten: µ = ln(2) / td Grundmodul -16-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Tafel: Messwerte sofort eintragen! Wachstum Ablauf Temp [°C] 28 32 37 44 Zeitpunkt - Jede Bankreihe hat einen eigenen Erlenmeyerkolben, t0 der bei einer bestimmten Temperatur inkubiert t1 - Berechnung des Volumens, t2 Animpfen und t0-Messung erfolgen gemeinsam t3 (bankreihenweise) - Start des Experimentes t4 durch gleichzeitiges Einschalten aller Schüttler t5 - Anschließend erfolgt gruppenweise exakt alle 20 7 Grundmodul min eine Probenahme lt. Tabelle → 8 -17-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles → Indirekte Bestimmung der Zunahme der Zellzahl Wachstum → Quantitative Messung der optischen Dichte (Streuung des einfallenden monochromatischen Lichts) → Im Praktikum: „batch“ Kultur ( → was bedeutet das?) Ergebnisse der Gruppen (Messwerte): Time (min) 28°C 28°C 32°C 32°C 37°C 37°C 42°C 42°C 0.037 0.037 0.05 0.064 0.041 0.038 0.04 0 20 0.041 0.041 0.06 0.06 0.044 0.044 0.049 0.049 40 0.049 0.049 0.084 0.087 0.069 0.071 0.068 0.072 60 0.061 0.062 0.136 0.135 0.123 0.116 0.123 0.118 80 0.086 0.087 0.199 0.192 0.171 0.173 0.17 0.173 100 0.122 0.12 0.279 0.268 0.252 0.257 0.207 0.208 Grundmodul -18-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Wachstumskurven bei verschiedener T Trendlinien mit exponentieller Anpassung Grundmodul arithmetische Auftragung → keine sinnvolle graphische Auswertung möglich ! -19-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Wachstumskurven bei verschiedener T Trendlinien mit exponentieller Verdoppelung in Anpassung ~ 45 min @ 37°C Grundmodul arithmetische Auftragung → keine sinnvolle graphische Auswertung möglich ! -20-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Letztes Jahr… Trendlinien mit exponentieller Anpassung Verdoppelung in ~ 20 min @ 37°C Grundmodul arithmetische Auftragung → keine sinnvolle graphische Auswertung möglich ! -21-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Halblogarithmische der normalisierten OD Werte Trendlinien mit linearer Anpassung Zeit in h → Steigung = Verdoppelungen pro h Grundmodul -22-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Letzes Jahr… Trendlinien mit linearer Anpassung Zeit in h → Steigung = Verdoppelungen pro h Grundmodul -23-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Exponentielles Wachstum: Wachstum → die Zellzahl verdoppelt sich innerhalb gleicher Zeitintervalle → Bestimmung der Zellzahl N zum Zeitpunkt t (Nt): mit n = Zahl der Zellteilungen, N0 = Zellzahl zum Zeitpunkt t0 (z.B. am Beginn der exponentiellen Phase) und Nt = Zellzahl zum Zeitpunkt t (z.B. aktuelle Zellzahl) gilt: Nt = N0 2n Nt = N0 2t/td Nt = N0 2νt ν – Teilungsrate (Teilungen / Zeit) Exponentielle Funktion mit Basis 2 → momentaner Zuwachs an Biomasse x zum Zeitpunkt t: abhängig von momentan vorhandener Masse x und µ = spezif. Wachstumsrate Umwandlung in Basis e: 2=eln(2) xt = x0 eln(2) ν t Spezif. Wachstumsrate µ = ln(2) ν Selbe exponentielle Funktion mit Basis e Grundmodul xt = x0 eµ(t-t0) Auflösen nach µ: -24-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Für die Zeit t – t0, in der sich die Zellzahl oder Biomasse x verdoppelt, gilt xt = 2 x0. ln(2x0) – ln(x0) ln(2) Dann ergibt sich µ= = td td ln(2) Verdopplungszeit td: td = µ Wenn Zellzahl und Zellmasse Begriffe: Lebendzellzahl Zellmasse in gleichem Maße zunehmen Verdopplungen (nämlich während der Teilungsrate v [1/h] Wachstumsrate µ [1/h] pro Zeiteinheit exponentiellen Wachstums- phase) sind Generationszeit g Zeitintervall der Generationszeit g [h] Verdopplungszeit td [h] und Verdopplungszeit td Verdopplungen (annähernd) einander gleich. Grundmodul -25-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Halblogarithmische der normalisierten OD Werte Trendlinien mit linearer Anpassung Zeit in h → Steigung = Verdoppelungen pro h = ν → graphische Auswertung möglich - linearen Bereich des Graphen wählen Grundmodul - y-Achse: Distanz ermitteln, in der sich die Zellzahl verdoppelt - x-Achse: entsprechende Zeitdifferenz ermitteln -26-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Grafische Bestimmung von µ z.B. für 37°C: Verdopplung der OD im linearen Bereich des Graphen → Verdoppelung in 39 min → Teilungsrate: ν = Steigung der Geraden = 1.51 (Teilungen / h) Grundmodul → Wachstumsrate: µ = ln(2) / td = ln(2) / 39 min = ln(2) * 1.51 = 1.05 -27-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstum Berechnung aus Messwerten bei 37°C ODt3: 0,12 ODt2: 0,07 ln (0,12) – ln (0,07) 0,539 0,539 = = = = 1.62 h-1 60 min – 40 min 20 min 1/3 h Grundmodul td = ln(2)/1.62 = 26 min (auf diesem Abschnitt!) -28-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstumskurven 2024 Welchen Bereich decken die Wachstum Messwerte des Praktikums- versuches ab? Lebendzellzahl Trübung (optische Dichte) Lag-Phase (kaum erkennbar, warum?) + Beginn der exponentiellen Phase Grundmodul -29-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstumsphase Ursachen Wachstum Anpassung an neue Bedingungen: Umstellung des Stoffwechsels, Induktion von Enzymen zur Verwertung der Kohlenstoffquelle und/oder anderer Anlaufphase, Nährstoffe lag-Phase Synthese von RNA, Ribosomen Reparatur von Zellschäden Zellwachstum Die Zellen nutzen die angebotenen Nährstoffe und Exponentielle Phase die gegebenen physikalischen Bedingungen optimal. Kohlenstoffquelle oder ein anderer Nährstoff ist verbraucht Anhäufung eines hemmenden Stoffwechselprodukts Stationäre Phase Durch Verbrauch eines Nährstoffs (meist Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle) oder durch Für die meisten Berechnungen wird Bildung eines Stoffwechselprodukts wurde der pH- Wert aus dem Toleranzbereich des Organismus die exponentielle Wachstumsphase © Mikrobiologisches Praktikum, Springer bewegt. herangezogen, weil hier die fehlende Energie durch Verbrauch der Energiequelle Beziehungen zwischen v, g, µ, t d bzw. des Elektronenakzeptors Absterbephase usw. nahezu konstant sind. Anwesenheit eines toxischen Stoffwechselprodukts Grundmodul Induktion lytischer Enzyme -30-  Versuch 8: Wachstumskurven Bakterielles Wachstumskurven bei verschiedener T Wachstum Offensichtlich gibt es Unterschiede zwischen den vier gemessenen Temperaturen (Anstieg der Graphen) 44°> 37°> 32°> 28° Warum?? 37°C sollte 37°C 28°C die optimale µ = 1.05 / h µ = 0.63 / h Wachstumstemperatur Grundmodul td = 39 min td = 66 min für E. coli sein -31-  Versuch 8: Temperaturabhängigkeit Bakterielles Wachstum E. coli hat sich als Darmbewohner an eine konstante Umgebungs- temperatur von ~37°C angepasst. Temperatur < 37°C: → Enzymreaktionen laufen mit suboptimaler Geschwindigkeit → Wachstumsrate ↓ Temperatur > 37°C: → zunächst leichte Zunahme, ab ca. 40°C Hitzestress, Membranintegrität gestört, Denaturierung von Proteinen/ Synthese von Hitzeschock- Grundmodul proteinen (Chaperonen) etc. → µ ↓ -32-  Versuch 8: Temperaturabhängigkeit Bakterielles Mikroorganismen haben sich an alle habitablen Lebensräume angepasst Wachstum Grundmodul -33- …solange Wasser flüssig ist  Rekordhalter aus der Tiefsee Geogemma barossii Strain 121 Wächst im Autoklav! Kashefi & Lovley 2003 (doi.org/b9mtdb) Grundmodul -34-  Fragen? ??? 10 min Pause, dann (pünktlich !!!) Fortsetzung des praktischen Teils Grundmodul -35-  6. Kurstag Grundmodul -36-  6. Kurstag Versuch 7: Identifizierung und Differenzierung - Auswertung von KOH-Test, Cytochrom c - Oxidase-Test und Katalase-Test - Durchführung der IMViC-Reaktionen und vollständige Zuordnung der Kulturen Versuch 8: Wirkung von Lysozym - Lyse von B. megaterium (Gram-positiv) und Abhängigkeit der Lysegeschwindigkeit von der Lysozymmenge - Lysierende Wirkung von Eiklar auf B. megaterium - Lyse von Escherichia coli (Gram-negativ) ohne und in Gegenwart von EDTA - Aktivität und Konzentration von Lysozym Grundmodul -37-  Differenzierung und Identifizierung Versuch 7 Bedeutung der Differenzierung - E. coli ist als harmloses Darmbakterium ein Indikator für fäkale Verunreinigungen - Enterobacter aerogenes ist ein Bodenbakterium und E. coli sehr ähnlich → Unterscheidung für z.B. Trinkwasseranalysen notwendig → Ausnutzen biochemischer Merkmale Aufgabe: Ordnen Sie unter Anwendung der folgenden Tests die mit A bis D bezeichneten Kulturen, die Sie auf einer Agarplatte erhalten haben, den folgenden Mikroorganismen zu: Bacillus megaterium, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli und Pseudomonas putida : - KOH-Test (Unterscheidung Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien) - Oxidase-Test - Katalase-Test - Differenzierung und Identifizierung von E. coli und E. aerogenes mittels der IMViC- Grundmodul Reaktionen -38-  Differenzierung und Identifizierung Versuch 7 Auswertung: KOH-Test, Oxidase-Test, Katalase-Test Spezies Kultur Gram- Oxidase- Katalase- IMViC-Reaktionen (A – D) Typ Typ Typ (nur E. coli und E. aerogenes) Indol Säure Acetoin Citrat B. megaterium A + +/- + P. putida B - + + E. aerogenes ? - - + E. coli ? - - + Anhand der bisherigen Ergebnisse wurde ermittelt, bei welchen Kulturen es sich um E. coli oder E. aerogenes handelt. Heute: IMViC-Reaktionen zur Differenzierung von A und C. Grundmodul -39-  Differenzierung und Identifizierung Versuch 7 Zuletzt: Mit jeder der beiden übrigen Kulturen (B / C) wurden (mit ausgeglühter Impföse) folgende Röhrchen beimpft: 3 Röhrchen mit TNG-Lösung 1 Röhrchen mit Simmons-Citrat-Medium (grün) Heute: Biochemische Tests zur Identifikation von Bakterien / IMViC-Test - Indol - Methylrot als Säureindikator (→ gemischte Säuregärung?) - Voges-Proskauer-Test (→ Acetoin?) - Citratverwertung Grundmodul -40-  Differenzierung und Identifizierung: IMViC Versuch 7 Indolbildung: Nachweis der Tryptophanase Tryptophanase spaltet Tryptophan (aus Pepton) in Indol, Pyruvat und Ammoniak. Indol lässt sich durch eine Rotfärbung mit Kovacs-Reagenz (5% 4-N,N-Dimethyl- amino-benzaldehyd in 75% Isoamylalkohol und 25% HCl) nachweisen. Die Rotfärbung wird in der unpolaren Phase (Amylalkohol) beobachtet. Durchführung: → In je eine Enterobakterien-Kultur (schwarze Kappe! nicht Simmons-Citrat-Medium) faculty.lacitycollege.e _0.5_ ml Kovacs-Reagenz geben. du/hicksdr/indole.jpg → Gründlich vermischen und Röhrchen stehen lassen. → Innerhalb weniger Minuten wird das gebildete Indol Grundmodul durch eine Kirschrot-Färbung sichtbar. -41-  Differenzierung und Identifizierung: IMViC Versuch 7 Methylrot-Reaktion Die Enterobacteriaceae können anhand ihrer Gärungsprodukte in zwei Gruppen eingeteilt werden. Beispiele: Gattung Gärungsprodukte Escherichia, größtenteils gemischte Säuren, Salmonella, z.B. Lactat, Acetat, Succinat Enterobacter, größtenteils pH-neutrale Verbindungen Serratia, z.B. Acetoin, Butandiol Die Ansäuerung des Mediums wird durch den pH-Indikator Methylrot angezeigt. Glucose Pyruvat (1 Tag) Pyruvat Lactat, Acetat und Formiat (2-5 Tage) Beispiel: Escherichia coli Positives = verschiedene Säuren (pH 4,2) + Methylrot → rote Färbung = Ergebnis Glucose Pyruvat (1 Tag) Pyruvat neutrale Endprodukte wie Butandiol (2-5 Tage) Grundmodul neutrale Endprodukte (pH 6,0) + Methylrot → gelbe Färbung = Negatives Ergebnis Beispiel: Enterobacter aerogenes -42-  Differenzierung und Identifizierung: IMViC Voges-Proskauer-Reaktion (Acetoin-Nachweis, komplementär zu Methylrot-Reaktion) Versuch 7 Acetoin ist ein Intermediat bei der Butandiolgärung. Es wird an der Luft mit α-Naphthol in alkalischer Lösung zu Diacetyl oxidiert, das mit Komponenten des Mediums (Pepton) weiter zu einem roten Farbstoff reagiert. Glucose Pyruvat Pyruvat Acetoin VP+ VP- Brock, © Pearson 2013, http://de.wikipedia.or g/wiki/Voges- Proskauer-Reaktion Beispiel: Enterobacter aerogenes Positives Acetoin + a-Naphthol + KOH = roter Farbumschlag = Ergebnis Grundmodul Negatives Ergebnis Beispiel: Escherichia coli -43-  Differenzierung und Identifizierung: IMViC Versuch 7 Citrat-Verwertung Citrat kann von Bakterien, die das Enzym Citrat-Lyase besitzen, verwertet werden. Positiver Nachweis: Sichtbares Wachstum und blauer Farbumschlag durch Anstieg des pH-Wertes (Indikator im Medium: Bromthymolblau) Citratlyase Citrat (Indikator grün) Oxalacetat + Acetat Oxalacetat Pyruvat + CO2 CO2 + Na+ Na2CO3 (höherer pH-Wert, Farbumschlag nach blau, Wachstum) Positives Ergebnis Beispiel: Enterobacter aerogenes Negatives Ergebnis Beispiel: Escherichia coli http://de.wikipedia.org/w iki/Bromthymolblau de.wikipedia.org/wiki/Bu nte_Reihe_(Labor) Grundmodul positiv negativ -44-  Aufgaben – IMViC Bitte mit den Röhrchen ans Ende der Bankreihen kommen! Versuch 7 Indolbildung: Tryptophanase-Nachweis: In je eine Enterobakterien-Kultur (nicht Simmons-Citrat-Medium) 0,5 ml (10 Tropfen) Kovacs- Reagenz geben. Gründlich vermischen und Röhrchen stehen lassen. Innerhalb weniger Minuten wird das gebildete Indol durch eine Kirschrot-Färbung sichtbar. Methylrot-Reaktion: In je eine Enterobakterien-Kultur (nicht Simmons-Citrat-Medium) 0.25 ml (5 Tropfen) Methylrot- Lösung geben. Die gebildete Säure (pH ≤ 4,4) wird durch eine kräftige Rotfärbung sichtbar. Eine leichte Rosafärbung bedeutet dagegen keine nennenswerte Säurebildung. Voges-Proskauer-Reaktion (Acetoinnachweis): In je eine Enterobakterien-Kultur (nicht Simmons-Citrat-Medium) 1 ml (20 Tropfen) einer 6%igen Naphthol-Lösung einmischen (“VP1”, in braunem Tropffläschchen!). Dann 5 Tropfen einer 40%igen KOH-Lösung (“VP2”, Vorsicht! Ätzend!) zugeben und ca. 15 min warten. Eine Rosa- bis Rotfärbung zeigt Acetoin-Bildung an. Citrat-Verwertung: Citrat kann von Bakterien, die das Enzym Citrat-Lyase besitzen, verwertet werden. Grundmodul Positiver Nachweis: Sichtbares Wachstum und blauer Farbumschlag durch Anstieg des pH- -45- Wertes.  Wirkung von Lysozym Versuch 8 Wie viel Lysozym ist im Eiklar? Grundmodul -46-  Wirkung von Lysozym Versuch 8 Aufgaben heute: 1. Untersuchen Sie die Abhängigkeit der Lysegeschwindigkeit von B. megaterium von der Lysozym-Menge! 2. Testen Sie die lysierende Wirkung von Eiklar auf B. megaterium ! 3. Untersuchen Sie die lysierende Wirkung von Lysozym auf Escherichia coli ohne und in Gegenwart von EDTA (Trübungsmessungen an Zellsuspensionen und Mikroskopie)! 4. Auswertung: Aktivität und Konzentration von Lysozym in der Eiklar- Lösung? Grundmodul -47-  Wirkung von Lysozym Versuch 8 Teil 1: Lyse von B. megaterium (Gram-positiv) mit Lysozym, Abhängigkeit der Lysegeschwindigkeit von der Lysozymmenge: 1. 3,0 ml Zellsuspension werden in jeweils eine Küvette (Schichtdicke 1 cm) pipettiert (Raumtemperatur). Kulturröhrchen vorher mit Parafilm verschließen und invertieren. 2. Die Küvette wird in ein Spektralphotometer gestellt (Referenz gegen Luft!) 3. Die optische Dichte der Zellsuspension in der Küvette wird bei 600 nm zwei Minuten lang gemessen und alle 30 s dokumentiert (Aufnahme der Basislinie) 4. Anschließend werden jeweils 50, 150 bzw. 400 µl Lysozym-Lösung zugegeben (jeweils getrennte Durchgänge) und mit dem Küvetteninhalt gründlich gemischt (Zahnstocher!) 5. Die OD bei 600 nm wird nach der Zugabe von Lysozym so lange gemessen und dokumentiert, bis nur noch minimale Änderungen zu verzeichnen sind (ca. 10 Minuten) Grundmodul 6. Nach Ende des Versuchs werden die mit Lysozym behandelten Zellsuspensionen -48- mit den unbehandelten am Mikroskop verglichen.  Wirkung von Lysozym Versuch 8 Teil 2: Lysierende Wirkung von Eiklar auf B. megaterium : Der Ansatz ist genauso durchzuführen wie die Lyse von B. megaterium mit Lysozym. Anstatt des Lysozyms verwenden Sie 100 µl Eiklarlösung. Herstellen der Eiklarlösung: - Eiklar (ohne Dotter) durch Teesieb filtrieren - 5 ml Filtrat unter Umschwenken in den vorbereiteten Erlenmeyerkolben mit 10 ml Phosphat-Puffer überführen - 150 µl Eisessig dazugeben (Vorsicht!) - 1 ml dieser Lösung im Mikroliter-Röhrchen 2 min abzentrifugieren - Lysozym ist im Überstand Grundmodul -49-  Wirkung von Lysozym Versuch 8 Teil 3: Lyse von E. coli Zellen (Gram-negativ) mit Lysozym: 1. 3,0 ml der Zellsuspension werden in eine Küvette (Schichtdicke 1 cm) pipettiert (Raumtemperatur) 2. Die Küvette wird in ein Spektralphotometer gestellt (→ Referenz nicht vergessen) 3. Die optische Dichte der Zellsuspension in der Küvette wird bei 600 nm zwei Minuten lang gemessen und alle 30 s dokumentiert (Aufnahme der Basislinie) 4. Anschließend werden 25 µl Lysozym-Lösung zugegeben und gründlich gemischt 5. Die OD-Änderung bei 600 nm wird nach der Zugabe von Lysozym weitere drei Minuten lang gemessen und alle 30 s dokumentiert 6. Anschließend werden 250 µl EDTA-Lösung zugegeben, die Küvette sofort mit Parafilm verschlossen und gründlich gemischt 7. OD-Änderung weiter verfolgen und alle 30 s dokumentieren (ca. 10 min) Grundmodul -50-  Wirkung von Lysozym Versuch 8 Auswertung: Konzentration und Aktivität von Lysozym in der Eiklar-Lösung? 1. Bestimmen Sie den Proportionalitätsbereich zwischen der eingesetzten Lysozym-Menge und der Lysegeschwindigkeit der B. megaterium -Zellen. 2. Vergleichen Sie die Lysegeschwindigkeit der B. megaterium und der E. coli -Zellen. Berechnen Sie dafür die Lysegeschwindigkeit in OD600 min-1 mgLysozym-1. 3. Bestimmen Sie anschließend a) die Konzentration von Lysozym in der Eiklarlösung (µg ml-1) b) die Aktivität in U ml-1 c) die Zahl der Lysozym-Moleküle pro ml. Grundmodul → Hierfür ist etwas „biochemisches Rechnen“ notwendig! -51-  1. Bestimmung des Proportionalitätsbereiches Versuch 8 …zwischen zugegebener Menge Lysozym und Lysegeschwindigkeit der B. megaterium –Zellen (Das heißt, in welchem Bereich ist sinnvolles Messen überhaupt möglich?): 1,6 2550 µl µl einer Lysozymlösung 1,4 150µlµl 100 bekannter 1,2 400µlµl 400 Konzentration 1 ∆OD550 OD600 0,8 0,6 Steigungsgeraden 0,4 im linearen Bereich eintragen (hier ändern sich die OD- 0,2 Werte mit konstanter Rate) 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 OD-Änderungen pro Zeit (min) M u e bes e … Lysozym-Lösung (µl) ∆OD600 / min 50 0,5 a a … 150 1,4 Grundmodul 400 1,2 -52-  1. Bestimmung des Proportionalitätsbereiches Versuch 8 …zwischen zugegebener Menge Lysozym und Lysegeschwindigkeit der B. megaterium –Zellen (Das heißt, in welchem Bereich ist sinnvolles Messen überhaupt möglich?): 1.6 1.4 1.2 / min 1 0.8 Eine zu hohe Lysozymkonzentration wirkt 600 hemmend → Lysozym-Moleküle behindern 0.6 sich gegenseitig bei der Hydrolyse des ∆ 0.4 Substrats 0.2 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Lysozym-Lösung [µl] → Proportionalitätsbereich zwischen eingesetzter Lysozymmenge und Lysegeschwindigkeit erstreckt sich von 0 bis ~150 µl. Grundmodul (Das bedeutet, dass innerhalb dieses Bereiches ein direkter Zusammenhang zwischen zugesetzter Lysozymmenge und der Geschwindigkeit, mit der sich die OD600 ändert, besteht.) -53-  2. Vergleich der Lysegeschwindigkeit Versuch 8 …von B. megaterium und E. coli nach Zugabe einer Lysozymlösung 25 µl Lysozym 250 µl EDTA B. megaterium bei E. coli ist Lysozym erst nach Zugabe von EDTA wirksam → Schwächung der äußeren Membran 600 Steigung = 0,14 ∆OD600 /min scheinbarer Abbruch der Lyse → zu geringe EDTA- Konzentration, hohe z.B. Steigung = 0,4 ∆OD600 /min Absorption der „outer- membrane“ → 3. Berechnung der Lysegeschwindigkeiten (als ∆OD600 min-1 mgLysozym-1 Grundmodul = Maß für die „Empfindlichkeit“) -54- → µl in mg Lysozym umrechnen…  3. Lysegeschwindigkeit als ∆OD600 min-1 mgLysozym-1 (Beispiel) Versuch 8 Es wurden jeweils 25 µl Lysozym-Lösung zugegeben Wieviel mg sind das? Beispiel: Lysozym-Einwaage = 10 mg / ml x mg → 25 µl x= 250 µg → 0,25 mg Lysozym wurden zugegeben Die Steigung ist also 0,4 OD600 min-1 / 0,25 mg Lysozym. Auf 1 mg umgerechnet beträgt die → Lysegeschwindigkeit für B. megaterium = 1,6 OD600 min-1 / mgLysozym (tatsächlich wurden nur 5 mg / ml Lysozym zugegeben, die ∆OD600 liegt dann bei 3,2 OD600 min-1 / mgLysozym) Grundmodul (Lysegeschwindigkeit für E. coli : 0,56 ∆OD600 min-1 mg Lysozym-1 ) -55-  3a: Enzymkonzentration in der Eiklarlösung (Beispielrechnung) Versuch 8 Da die Lysegeschwindigkeit mit einer Lysozymlösung bekannter Konzentration gemessen wurde, kann anhand dieser Werte nun die Lysozymkonzentration in einer unbekannten Probe bestimmt werden (Prinzip „Eichkurve“ oder Referenzwert). Wir messen mit 100 µl zugegebener Eiklar-Lösung z.B. Steigung = 0,5 → Dann ist diese Steigung äquivalent zu 0,3125 mg ∆OD600 /min reinem Lysozym. mögliche Verdünnungsfaktoren 600 berücksichtigen: − vom Eiklar werden 5 ml in 10 ml Phosphatpuffer gegeben → Verdünnungsfaktor 3 → In 100 µl reinem Eiklar befinden sich ca. Grundmodul 0,94 mg Lysozym (= 9,4 mg Lysozym / ml Eiklar)  3b: Enzymaktivität in der Eiklarlösung (Beispielrechnung) Versuch 8 Von der Konzentration kann auf die Aktivität geschlossen werden. Hierfür sind weitere Angaben nötig: 1 mg des eingesetzten Lysozyms hat eine Aktivität von ~ 40.000 Units (U)* (kann z.B. auf dem Gebinde abgelesen werden) Damit entspricht 1,6 ∆OD600 min-1 / mg gleich 1,6 ∆OD600 min-1 / 40.000 U Auf eine U umgerechnet: 1 U führt zu einer ∆OD600 von 0,00004 / min (= 4 10-5 / min) Eiklar: Bei einer gemessenen ∆OD600 min-1 von 0,5 für 100 µl, ergibt sich eine Aktivität von 12.500 U (= 1,25 104 U) in 100 µl bzw. 1,25 105 U / ml x Verdünnungsfaktor 3: → Die Lysozymaktivität in reinem Eiklar beträgt 3,75 105 U / ml Alternative Berechnung: Bei einer gemessenen Lysozymkonzentration von 9,4 mg/ml (siehe vorige Folie) Grundmodul ergeben sich 9,4 mg/ml x 40.000 U/mg = 376.000 U = 3,76 10 5 U / ml. (Abweichung durch Rundung) * 1 U Enzym setzt 1 µmol Substratmoleküle in 1 min um  3c: Wieviele Lysozymmoleküle enthält unser Eiklar? (Beispielrechnung) Versuch 8 Hierfür sind weitere Angaben nötig: Molekulargewicht des Lysozyms: 14,4 kDa = 14.400 g/mol (14.400 g Lysozym entsprechen 1 mol) Avogadro-Konstante: NA = 6,023 1023 Moleküle/mol (1 mol enthält 6,023 1023 Moleküle Lysozym) Die ermittelten 9,4 mg Lysozym / ml Eiklar sind damit 0,0094 g / 14.400 g mol-1 = 6,53 10-7 mol oder 0,653 µmol Wenn 1 mol = 6,023 1023 Molekülen entspricht, dann sind 6,53 10-7 mol = 3,93 1017 Moleküle → Es befinden sich ~ 3,93 1017 Moleküle Lysozym in 1 ml Eiklar (ca. 400 Billiarden oder 0,4 Trillionen) Mögliche Fehlerquellen? eigene lytische Enzyme von B. megaterium werden freigesetzt → scheinbare Aktivität  Grundmodul Proteasen werden freigesetzt (bauen eventuell auch Lysozym ab) → scheinbare Aktivität  -58- Reste lysierter Zellen verändern die Lichtstreuung → zunehmender Messfehler  Aufgaben – Anschließend Messwerte austauschen und Diagramme zeichnen! – Lyse von E. coli Zellen (Gram- Lysierende Wirkung von Lyse von B. megaterium (Gram-positiv) mit Versuch 8 negativ) mit Lysozym: Eiklar auf B. megaterium : Lysozym, Abhängigkeit der Lyse- geschwindigkeit von der Lysozymmenge: 1. Zellen gut suspendieren! (Röhrchen Der Ansatz ist genauso schütteln/invertieren) durchzuführen wie die Lyse 1. Zellen gut suspendieren! (Röhrchen 2. 3,0 ml der Zellsuspension werden in eine von B. megaterium mit schütteln/invertieren) Küvette (Schichtdicke 1 cm) pipettiert Lysozym (siehe rechts →). 2. 3,0 ml Zellsuspension werden in jeweils eine 3. Die Küvette wird in ein Anstatt des Lysozyms Küvette (Schichtdicke 1 cm) pipettiert Spektralphotometer gestellt (→ Referenz verwenden Sie jedoch 100 µl 3. Referenzmessung gegen Puffer → = ohne gegen Puffer) Eiklarlösung. Zellen! 4. Die optische Dichte der Zellsuspension in 4. Die Küvette wird in ein Spektralphotometer Herstellen der Eiklarlösung: gestellt, Küvette vorher mit Parafilm der Küvette wird bei 600 nm zwei Minuten lang gemessen und alle 30 s - Eiklar (ohne Dotter) durch verschließen und invertieren dokumentiert (Aufnahme der Basislinie) Teesieb filtrieren 5. Die optische Dichte der Zellsuspension in der 5. Anschließend werden 25 µl Lysozym- - 5 ml Filtrat unter Küvette wird bei 600 nm zwei Minuten lang Lösung zugegeben und gründlich Umschwenken in den gemessen und alle 30 s dokumentiert gemischt vorbereiteten (Aufnahme der Basislinie) 6. Die OD-Änderung bei 600 nm wird nach Erlenmeyerkolben mit 10 ml 6. Anschließend werden jeweils 50, 150 bzw. der Zugabe von Lysozym weitere drei Phosphat-Puffer überführen 400 µl Lysozym-Lösung zugegeben und mit dem Minuten lang gemessen und alle 30 s - 150 µl Eisessig dazugeben Küvetteninhalt gründlich gemischt dokumentiert (Vorsicht!) (Zahnstocher!) → 3 separate Ansätze! 7. Anschließend werden 250 µl EDTA- 7. Die OD-Änderung bei 600 nm wird nach der Lösung zugegeben, die Küvette sofort mit Zugabe von Lysozym so lange gemessen und Parafilm verschlossen und gründlich dokumentiert, bis nur noch minimale gemischt - 1 ml dieser Lösung im Änderungen zu verzeichnen sind (ca. 10 min) 8. OD-Änderung weiter verfolgen und alle Mikroliter-Röhrchen 2 min 8. Nach Ende des Versuchs werden die mit 30 s dokumentieren (ca. 10 min) abzentrifugieren Lysozym behandelten Zellsuspensionen mit den - Lysozym ist im Überstand unbehandelten am Mikroskop verglichen. Grundmodul -59-  Aufgaben – Teil 2 – Auswertung Versuch 8 Aktivität und Konzentration von Lysozym in der Eiklar-Lösung? Bestimmen Sie den Proportionalitätsbereich zwischen der eingesetzten Lysozym- Menge und der Lysegeschwindigkeit der B. megaterium -Zellen. Vergleichen Sie die Lysegeschwindigkeit der B. megaterium und der E. coli Zellen. Dafür berechnen Sie die Lysegeschwindigkeit in OD600 min-1 mg Lysozym-1. Bestimmen Sie die Konzentration von Lysozym in der Eiklarlösung (µg ml-1) und die Zahl der Lysozym-Moleküle pro ml. Grundmodul -60-  Lehr-Evaluierungen Wir bitten um Ihre Rückmeldungen und konstruktive Kritik Seminar Praktikum e u a eb e e ea sa u e a u a u e e e e u a eb e e ea sa u a u e e eM b e M b e a e su e a e a e su e a e s e a u ba eu eu e sus e s e Grundmodul https://eval.uni-bayreuth.de/unizensus/de/sl/cAgscHpNS1w4 https://eval.uni-bayreuth.de/unizensus/de/sl/1QRe6Y6Y6BQw -61-  Aufräumen… Küvetten, Zahnstocher, Lysozym, EDTA: Tischabfall Kulturröhrchen: entschriften, vorbringen und in die Ständer einsortieren Glaspipetten: vorbringen (Köcher mit Desinfektionslösung) Objektträger und Deckgläser: Glasabfall Mikroskope reinigen (v.a. Öl vom 100er Objektiv mit weichem Toilettenpapier abwischen) und nach Nummern sortiert in die Schränke zurückbringen Pipettierhilfen: zurück in die Stehsammler Siebe: gründlich auswaschen, abtrocknen und vor bringen Arbeitsplatz: reinigen und desinfizieren Eigelb und Eiklar: Mensa… ☺ Grundmodul -62- Danach: kurze Zusammenfassung  Was sollte man mindestens wissen, kennen & können? Zusammen- Grundlegende Definitionen (z.B. Was bedeutet steril? Was sind Antibiotika?) fassung Sterilisationstechniken, incl. deren wichtigste technische Parameter, Wofür ist welche Technik am besten geeignet? Grundlagen steriler Arbeitstechniken Medien: Einteilung, Inhaltsstoffe, Verfestigungsmittel, Kulturbedingungen Organismen: Unterschied Gram-negativ, Gram-positiv, Begeißelungstypen Charakteristische Eigenschaften und speziell behandelte Besonderheiten der vorgestellten Mikroorganismen sowie deren phylogenetische Zuordnung (z.B. Entero-, Milchsäure-, Cyanobakterien etc.) Aufbau der Gram-negativen und Gram-positiven Zellhülle Testverfahren zur Differenzierung und Identifizierung, deren Hintergrund und Grundmodul Beispiele für positive Testergebnisse -63-  Was sollte man mindestens wissen, kennen & können? Zusammen- fassung Methoden der Anreicherung und Isolation Mikroskopie: Größenverhältnisse, lichtmikroskopische Techniken und deren Hintergrund (Hellfeld, Phasenkontrast), Einflussgrößen und Berechnung des Auflösungsvermögens, numerische Apertur, Kontrast, Färbetechniken Antibiotika: Gruppen und deren Wirkungsweise / zellulären Zielstrukturen Wirkmechanismus von Betalactamantibiotika auf molekularer Ebene (incl. Strukturformel), Resistenzmechanismen und deren Anwendung, Tests auf Antibiotikasensitivität / Antibiogramm, Kochscher Plattenguß Mikrobiom des Menschen: Beispiele für typische Mikroorganismen und deren Bedeutung, Schleime & Biofilmbildung, Hämolyse, Hygiene, Verfahren zur Anreicherung und Differenzierung Grundmodul -64-  Was sollte man mindestens wissen, kennen & können? Zusammen- Luftkeime: - Typische Vertreter und deren Eigenschaften, fassung - Photooxidation & photodynamischer Effekt, Schutz durch Carotinoide - Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies incl. der zugehörigen Schutzenzyme (Katalase, Peroxidase, Superoxiddismutase) - Unterscheidung: aerob fakultativ aerob aerotolerant mikroaerophil anaerob Abbau von Makromolekülen: - Stärke, Casein - Tests und Nachweismethoden Methoden der Zellzahlbestimmung - Direkte und indirekte Methoden - Lebend- und Gesamtzellzahl Lysozym & Wachstumskurve - Gesetzmäßigkeiten bakteriellen Wachstums - Wachstumskurve und Wachstumsphasen - Wirkung von Lysozym, Einfluss von EDTA …u.a.! Grundmodul Wie weiter? -65-  Interesse und Spaß an der Mikrobiologie? Ausblick 6. Semester: (LS Mikrobiologie, Prof Schüler) - Spezialisierungsmodul „Molekulare und angewandte Mikrobiologie“ - enthält 3-wöchiges Praktikum, in dem verschiedene Versuche mit selbst gesammelten Umweltproben und Reinkulturen durchgeführt werden, u.a. - magnetotaktische Bakterien - fruchtkörperbildende, „multizelluläre“ Myxobakterien - marine Leuchtbakterien gentechnisch gearbeitet wird für - Naturstoffisolation / Fluoreszenzmikroskopie und - biogene Magnetisierung von Bakterien - Voraussetzung: - gutes Klausurergebnis - gute Praktikumsergebnisse Grundmodul … außerdem: Forschungsmodul/Bachelorarbeit am LS Mikrobiologie… -66-  Interesse und Spaß an der Mikrobiologie? Ausblick 6. Semester: (LS Ökologische Mikrobiologie, Prof Lüders) - Spezialisierungsmodul „Mikrobielle Ökologie des Bodens“ - geteiltes Modul mit Abt. Mykologie / Prof. Ökologie der Pilze - enthält 2 x 1-wöchiges Praktikum Inhalte: - Boden als mikrobielles Habitat - Physiologie, Biochemie und Ökologie wichtiger Mikroben-Gruppen im Boden - Kohlenstoff-Kreislauf, Nährstoffkreisläufe - Rhizosphäre und Pflanzenwachstum - Treibhausgase - Mikrobielle Interaktionen - Methoden der Bodenmikrobiologie Grundmodul … außerdem: Forschungsmodul/Bachelorarbeit am LS ÖMIK… -67-  Lab-Tour LS Mikrobiologie Hinweis Besichtigung der Labore am LS Mikrobiologie für BSc Biologie: Tag: Mi., 27.11.2024 Zeit: 18.00 Uhr Treffpunkt: Großer Mikroskopiersaal Wichtig: Bitte melden Sie sich dafür bis zum 26.11. im E-Learning-Kurs an! Kittel mitbringen Grundmodul Rückfragen: [email protected] -68-  Dankeschön… Kursassistenten: Anita, Ralf, Sascha, Manuel, Aileen Viel Erfolg in der Klausur!! Rundgang LS Mikrobiologie: Mi. 27.11. (18.00 Uhr) Treffpunkt: hier Grundmodul That’s it! -69-