Allgemeine Mikrobiologie Seminar #2 - WS24/25 - PDF

Allgemeine Mikrobiologie Grundmodul WS24/25 (Bio) Seminar #2 Dr. Dimitri Meier Lehrstuhl Ökologische Mikrobiologie LS ÖMIK Grundmodul -1-  Jet...

Allgemeine Mikrobiologie Grundmodul WS24/25 (Bio) Seminar #2 Dr. Dimitri Meier Lehrstuhl Ökologische Mikrobiologie LS ÖMIK Grundmodul -1-  Jetzt: Testat (8 Min.) Abstand von den Nebensitzenden. Skripte bitte umdrehen! LS ÖMIK Grundmodul -2- Hinweis Dieses Skript ist urheberrechtsgeschützt (© Dr. Frank Müller) und nur für Ihren persönlichen Gebrauch im Rahmen des Grundpraktikums Mikrobiologie im Bachelor-Studiengang bestimmt. Jegliche Weitergabe an Dritte oder Verbreitung im Internet ist nicht gestattet ! LS ÖMIK Grundmodul -3-  Übersicht Keimgehalt der Luft - Überblick, Beispiele für häufige Vertreter - Steckbriefe einiger typischer Luftkeime Photooxidation & photodynamischer Effekt - Mechanismen - Schutz durch - Carotinoide - Enzymatische Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies LS ÖMIK Übertragung von Krankheitserregen durch die Luft Grundmodul  Übersicht Mikrobiom des Menschen - Einleitung, Beispiele - Verdauungstrakt (kurz) - Haut & Schleimhäute (Mund/Rachen) Bedeutung der Milchsäurebakterien & der Milchsäuregärung Beispiel Streptoccus salivarius Biofilme / Zahnbelag Staphylococcus aureus als potentiell pathogenes Mitglied des Mikrobioms LS ÖMIK Hämolyse Grundmodul  Der Keimgehalt der Luft Mikroorganismen sind zahl- und artenreich fast überall – auch in der Luft – zu finden Top 10 mikrobielle Gattungen in urbaner Luft Häufige Quellen von Luftkeimen (Beispiel Madrid) (globaler Datensatz) Luft-DNA basierte Daten LS ÖMIK Grundmodul -6- Núñez et al. 2021 (doi.org/gv7r5z) Zhao et al. 2022 (doi.org/gqz4zz)  Beispiele Keimgehalt Welche Bakterien kann man leicht aus der Luft isolieren? der Luft Micrococcus luteus Rhodococcus sp. Streptomyces sp. Bacillus sp. Mycobacterium sp. Corynebacterium sp. LS ÖMIK Grundmodul → Vor allem Gram-positive Bakterien bzw. deren Sporen -7-  Beispiele Keimgehalt Andere Mikroorganismen, die leicht durch die Luft verbreitet werden: Pilze der Luft Rhodotorula sp. Mucor mucedo (Rote Hefen) (Köpfchenschimmel) Penicillium sp. (Pinselschimmel, z.B. P. glaucum, Aspergillus niger P. notatum, (Gießkannenschimmel) P. chrysogenum) Alternaria sp. Cladosporium sp. LS ÖMIK Grundmodul → Pilzsporen sind allgegenwärtig. -8-  Beispiele Keimgehalt Micrococcus luteus: Dr. Gary Kaiser, microbewiki.kenyon.edu der Luft Gram-positiv obligat aerob Kolonien gelb, rund, glänzend Zellen kugel- oder kegelförmig (Kokken) 0,5-3,5 µm Durchmesser bildet Tetraden und Pakete (Sarcinen) ubiquitär in Boden, Wasser, Luft Corynebacterium: Gram-positiv obligat aerob keulenförmige Zellen („coryneform“) www.microbeworld.org unbeweglich LS ÖMIK 3 - 5 µm groß Grundmodul C. glutamicum: biotechnologisch -9- bedeutsam  Beispiele Keimgehalt Mycobacterium: der Luft Gram-positiv Kolonien mit faltiger Oberfläche z.T. gelbe Carotinoid-Pigmente pleomorph ubiquitär in Boden und Wasser wichtiges Pathogen: M. tuberculosis Nocardia: Gram-positiv aerob stäbchenförmig wächst filamentös und verzweigt LS ÖMIK Sporenbildner Grundmodul häufig in Boden und Wasser -10-  Beispiele Keimgehalt Serratia marcescens: der Luft Gram-negativ stäbchenförmig fakultativ anaerob beweglich (peritrich begeißelt) ubiquitär verbreitet, oft vergesellschaftet mit Säugern (gelegentlich Darmbewohner) auffallend pigmentiert: rotes Pyrrol-Pigment (Prodigiosin) färbt Zellen und Kolonien rot LS ÖMIK Grundmodul Pyrrol Prodigiosin -11-  „Luftkeime“… Keimgehalt …leben nicht in der Luft, werden aber durch die Luft bzw. Staubpartikel der Luft besonders gut verbreitet und können hier längere Zeit überleben. Häufig isolierte Luftkeime stellen außerdem wenig Ansprüche an ihren Lebensraum und können daher leicht auf Standard-Medium kultiviert werden. Viele Luftkeime sind Gram-positiv, aerob und pigmentiert. Warum? Gram-positiv: Dicke ZW ➔ ertragen Trockenheit besser, viele bilden außerdem Sporen aerob: O2 immer verfügbar LS ÖMIK Pigmentiert? ➔ Schutz vor oxidativem Stress! Grundmodul -12-  Oxidativer Stress Keimgehalt Reaktiver Sauerstoff: der Luft O2 im Grundzustand - Triplett-Sauerstoff 3O2 O2 im angeregten Zustand - Singulett-Sauerstoff 1O2 LS ÖMIK Grundmodul -13-  Oxidativer Stress Keimgehalt Beobachtung: der Luft In Gegenwart von Luft-(Triplett-)O2 und sichtbarem Licht (nicht UV!) werden viele Mikroorganismen abgetötet (Photodynamischer Effekt). Erklärung: Katalysatoren (Photosensibilatoren) für den photodynamischen Effekt sind essentielle Zellpigmente (Flavine, Cytochrome), die Licht absorbieren können: Pigment + h → P* P* + O2 → P + 1O2 → Photooxidation von Zellbausteinen (z.B. Oxidation von Doppelbindungen) → … → Zelltod Luftkeime besitzen daher häufig Schutzpigmente (Quencher), wie z. B. Carotinoide in der Cytoplasmamembran, die die Zellen vor Photooxidation schützen. Funktion der Carotinoide: LS ÖMIK Absorption von Licht Grundmodul „Quenching“ von Singulett-Sauerstoff -14-  Oxidativer Stress Keimgehalt Beispiele für bakterielle Schutzpigmente der Luft LS ÖMIK Grundmodul -15-  Oxidativer Stress Keimgehalt Aber auch die respirative Reduktion von O2 (= reguläre Zellatmung) führt der Luft intermediär zur Bildung toxischer reaktiver Sauerstoff-Spezies: 1. Cytochrom-Oxidase O2 + 4e- → O2- + O2- Oxid-Anion O2- + 2H+ → 2 H 2O 2. Flavinhaltige Glucose-Oxidase, Xanthin-Oxidase O2 + 2e- → O22- Peroxid-Anion O22- + 2H+ → H2O2 Wasserstoffperoxid 3. Xanthin-Oxidase, Aldehyd-Oxidase, NADPH-Oxidase O2 + 1e- → O2- Superoxid-Anion LS ÖMIK O2- + H2O2 + H+ → O2 + H2O + OH Hydroxylradikal Grundmodul -16-  Oxidativer Stress Keimgehalt Neben Schutzpigmenten besitzen viele Bakterien deshalb spezielle der Luft Enzyme für die Vernichtung reaktiver Sauerstoff-Spezies: Wasserstoff- peroxid Superoxid- Anionen LS ÖMIK Grundmodul -17-  Oxidativer Stress Keimgehalt Neben Schutzpigmenten besitzen viele Bakterien deshalb spezielle der Luft Enzyme für die Vernichtung reaktiver Sauerstoff-Spezies: aerobe und fakultativ anaerobe O2 Bakterien: besitzen SOD + Katalase Photodynamischer Effekt, Stoffwechsel aerotolerante anaerobe Bakterien: O2 O22 O2 besitzen in der Regel SOD, aber keine Katalase Superoxid Peroxid Oxid strikt anaerobe Bakterien: keine Katalase, keine SOD Superoxid- Katalase, LS ÖMIK Dismutase Peroxidase Für strikt anaerobe Bakterien Grundmodul ist O2 toxisch! -18-  Bioaerosole Keimgehalt der Luft Auch potentiell pathogene Mikroorganismen können kurzfristig in der Luft überleben. Je mehr Menschen und je geringer deren Distanz, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit einer Übertragung. Besonders beim Husten oder Niesen können durch Tröpfcheninfektion Krankheiten übertragen werden. Schnappschuss eines nicht unterdrückten LS ÖMIK Niesens. Grundmodul -19-  Hunderte Arten besiedeln den Menschen Mikrobiom des Menschen Ein 70 Kilogramm schwerer Erwachsener hat rund 38 Billionen (3.8 x 1012) Bakterien- zellen am und im Körper. (~3 x 1012 eigene Zellen!) LS ÖMIK Details: ↑VL 13 Grundmodul (Med. Mikrobiol.) -20- und VL Fachmodul  Mikrobiom des Menschen „Normalflora“: Zum humanen Mikrobiom gehören Bakterien, Archaeen, Pilze, Protozoen, (Viren/Bacteriophagen) Auch opportunistische oder potentiell pathogene Mikroorganismen, gehören dazu, völlig apathogen sind nur wenige (z.B. Lactobacillus- Arten) Haben sich an den Wirt angepasst, halten sich lebenslang, sind normalerweise unschädlich (effiziente Barrieren oder Kontrolle durch das Immunsystem), viele sind nützlich Schwächung des Wirtes kann zu Infektionen durch die Normalflora führen Bei Gesunden sind die äußere Haut sowie die Schleimhäute des Oro- und Nasopharynx, des Intestinaltraktes und des LS ÖMIK Urogenitaltraktes stets besiedelt Grundmodul Residente Flora und transiente Flora -21-  Mikrobiom des Menschen Mikrobiom des Menschen Frühere Sichtweise: Bakterien besiedeln den Menschen und sind mehr oder weniger schädlich Heutige Sichtweise: „Mensch“ = Holobiont: Wirt + Mikroorganismen funktionieren zusammen als ein Superorganismus : Der Mensch braucht Mikroorganismen für Verdauung Natürliche Flora verhindert Besiedlung durch Pathogene Der Mensch gibt Mikroorganismen Nährstoffe + konstante T, pH, H2O gegenseitige Anpassung und Co-Evolution Die größte Dichte und Vielfalt an Bakterien befindet sich im LS ÖMIK Verdauungstrakt Details: ↑VL 13 Grundmodul (Med. Mikrobio.) -22- und VL Fachmodul  Test auf Darmbakterien in der mikrobiologischen Trinkwasseranalyse Mikrobiom des Menschen Pathogene Darmbewohner werden leicht durch Nahrungsmittel oder kontaminiertes Wasser übertragen (z.B. Verunreinigung von Trinkwasser durch Abwasser), sind oft aber schwer oder nur langsam nachweisbar. Daher dient E. coli (meist harmlos und leicht zu kultivieren) stellvertretend als Indikator einer Trinkwasserverunreinigung.  Routinemäßige mikrobiologische Trinkwasseranalyse: Regel 1: in 100 ml Trinkwasser darf E. coli nicht nachweisbar sein Regel 2: die Gesamtkeimzahl des Trinkwassers muss unter 100 lebende Zellen (colony forming units, cfu) pro ml liegen LS ÖMIK → sonst keine mikrobiologische Trinkwasserqualität Grundmodul -23-  Haut und Schleimhäute Mikrobiom des Menschen Die Haut ist sehr unregelmäßig mit Mikroorganismen besiedelt, Bakterien befinden sich vor allem in Schweißdrüsen und Haarfollikeln. Die normale Bakterienflora der Haut (viele Milchsäurebakterien) produziert Säuren und bietet dadurch Schutz vor Pathogenen (pHHaut: 4-6). Außerdem: Hoher Salzgehalt verringert Wasseraktivität → begünstigt Gram-positive (Milchsäure-)Bakterien LS ÖMIK Grundmodul  Haut und Schleimhäute Mikrobiom des Menschen Details: VL Fachmodul http://www.genome.g ov/dmd/img.cfm?node =Photos/Graphics&id =85320 → Bestimmte Regionen werden von spezifischen Gemeinschaften besiedelt LS ÖMIK → Die Zusammensetzung der Gemeinschaften ist individuell verschieden und so Grundmodul Die charakteristisch, dass ein Mensch anhand seiner Mikroben identifiziert werden kann. -25-  Haut und Schleimhäute Mikrobiom des Mikroorganismen in Schweißgängen, Talgdrüsen und Haarfollikeln Menschen der äußeren Haut  Mell Fisher Microbial Me, 2015. Submission for Microbe Art Competition 2019. Made with a cast of my face in Agar and my own bacteria grown over the duration of a month. LS ÖMIK Grundmodul -26-  Haut und Schleimhäute Mikrobiom des Menschen Schleimhäute Beispiel: Bakterien der Mund und Rachenhöhle Aerotolerante und anaerobe Bakterien (vor allem Streptokokken, Staphylokokken, Corynebakterien, Bacteroides sowie Spirochäten u.v.a.) Bakterien des Zungenbelags Santacroce et al., Biology, 2021, 10.3390/biology9100318 LS ÖMIK Grundmodul Typische Vertreter: Milchsäurebakterien Bakterien des Zungenbelags -27- (Lactobacteriaceae)  Milchsäurebakterien Mikrobiom des Menschen Familie Lactobacteriaceae Gram-positive Stäbchen oder Kokken Natürliches Vorkommen: Schleimhäute von Mensch und Säugern, Darm, Milch und Milchprodukte, Früchte, Pflanzen Lactococcus sp. Biosynthetische Fähigkeiten stark eingeschränkt („verkümmert“, = Anpassung an ihre Habitate, in denen viele komplexe Nährstoffe vorhanden sind) Daher: Anreicherung nur in komplexen Nährmedien (Kohlenhydrate, Aminosäuren, Vitamine, Purine/Pyrimidine, pH 5,0) Auch der Katabolismus ist eingeschränkt: VieIe können nur Kohlenhydrate als C-Quelle nutzen (v.a. Lactose - Name!) Besitzen keine Atmungskette: aerotolerante Anaerobier (obligate Gärer) Science photo library Milchsäuregärung: hetero- oder homofermentativ (= als Produkt wird stets Lactat gebildet, aber zu unterschiedlichem Anteil) LS ÖMIK Große Bedeutung in der Lebensmittelindustrie, z.T. medizinisch relevant Grundmodul -28-  Milchsäurebakterien in der Lebens- und Futtermittelherstellung Lactobacteria (Milchsäure- Käse bakterien) Joghurt Sauermilchprodukte Kefir Kimchi „probiotische“ Lebensmittel Sauerkraut Sauerteig Rohwurst Silage u.a. LS ÖMIK Was haben diese Produkte gemeinsam? Haltbarkeit! Wieso? Grundmodul Absenkung des pH-Wertes hemmt potentiell schädliche Bakterien -29- (z.B. viele Enterobakterien, Listerien, Clostridien)  Homo- und heterofermentative Milchsäuregärung Lactobacteria (Milchsäure- Homofermentative Milchsäuregärung bakterien) → es entsteht ein Produkt (Lactat) Heterofermentative Milchsäuregärung → Lactat + weitere(s) Produkt(e) LS ÖMIK Grundmodul -30- Details: ↑VL  Zellmorphologie: Kugelförmige Zellen Exkurs Viele Bakterien haben kugelförmige Zellen → Kokken. Die Anordnung der Kokken ist meist charakteristisch für eine Bakterienart. Welche Anordnungsmuster gibt es? Ketten: Streptokokken Wie entstehen die regelmäßigen Muster? Zweiergruppen: Diplokokken → Ketten: Teilungsebene bleibt (z.B. Neisseria) immer gleich → Tetraden / Sarcinen: Vierergruppen: Tetraden (z.B. Micrococcus) neue Teilungsebene steht jeweils senkrecht zur vorhergehenden Achtergruppen: Paketkokken (Sarcinen) (z.B. Sarcina) 2 Floc’h et al., Nat Comm 2019 1 3 Unregelmäßig: Haufenkokken (Staphylokokken) LS ÖMIK (Staphylos → Traube, z.B. Staphylococcus) Grundmodul Deinococcus radiodurans  Beispiel: Streptococcus salivarius Lactobacteria (Milchsäure- bakterien) …Ketten Kokken in wie? angeordnet → Streptokokken Größe 0,5 – 1 µm homofermentative Milchsäuregärung (bildet nahezu reines Laktat, baut Glucose Streptococcus sp., durch Fructosebisphosphatweg ab) REM-Aufnahme Typischer Bewohner der Schleimhäute des Menschen, vor allem der Mundhöhle (saliva = Speichel) einer der Erreger von Karies Ausbildung einer Schleimhülle aus Polysacchariden LS ÖMIK → gutes Beispiel für die Bildung von Biofilmen Grundmodul  Biofilme – „Cities of microbes“ Viele Bakterien leben auf Grenzflächen in engen Assoziationen (Biofilm oder Biokruste auf festen Oberflächen, Kahmhaut schwimmend auf flüssigen) Zellverbände sind in viskose Schicht („Schleim“) aus Polysacchariden und eDNA eingehüllt Zweck: Festsetzung, Immobilisierung Bildung eines geeigneten Mikrohabitats: Nährstoffe werden besser absorbiert Aufbau mikro- / anoxischer Zonen Brock Mikrobiologie © Pearson 2013, Erleichterte Kommunikation Falcón García et al. Nature Microbiology (z.B. quorum sensing) 2020 Schutz vor toxischen Umwelteinflüssen, Hydrophobe Antibiotika, Prädation Schichten LS ÖMIK verhindern z.B. Schutz vor Immunabwehr das Eindringen Grundmodul (Antikörper, Phagocytose) gelöster Antibiotika  Biofilme in der Mundhöhle Mikrobiom des Menschen Plaque auf Zähnen = Biofilm Hauptsächlich durch Milchsäurebakterien der Gattung Streptococcus (S. salivarius, S. mutans) Entstehung von Baktus und Karies: Mikroorganismen produzieren Polysaccharide aus Saccharose (n Glucose, = Dextran) oder n- Fructose (= Laevan) also einen Biofilm auf Zähnen. Mit produzierten Säuren lösen die Mikroorganismen Mineralien aus den Zähnen Brock Mikrobiologie © Pearson 2013 (z. B. Ca2+). Der Zahnschmelz wird durch Säuren und LS ÖMIK Proteasen abgebaut, Einbau von Fluoridionen Grundmodul erhöht dessen Widerstandsfähigkeit.  Haut und Schleimhäute Mikrobiom des Gattung Staphylococcus Menschen fakultativ anaerobe Bakterien, die in Form von Haufen-Kokken wachsen können entweder opportunistisch pathogen oder apathogen sein apathogene Mitglieder werden in der Nahrungsmittelbereitung, z. B. in der Fermentation von Rohwurst eingesetzt (S. carnosus) klassisches Habitat der Staphylokokken ist die Hautoberfläche von Warmblütern wikipedia LS ÖMIK Grundmodul Staphylococcus aureus -35-  Haut und Schleimhäute: Staph. aureus Mikrobiom des Kann bei etwa 30% der Bevölkerung auf den Nasenschleimhäuten gefunden Menschen werden, aber auch andere Stellen werden besiedelt (z.B. Achselhöhle) Pathogene Stämme: verfügen über ausgefeilte Anpassungen, die die Immunabwehr ausschalten (z.B. Protein A: Bindung von IgG-Antikörpern; Abtötung von B-Lymphocyten → eitrige Infektionen) Etwa 80% produzieren ß-Lactamase, d.h. Penicillin G ist unwirksam kann durch zusätzlich erworbene multiple Antibiotika-Resistenzen zu einem ernsten medizinischen Problem werden („MRSA“: Methicillin-resistenter S. aureus) diseasepictures.com LS ÖMIK Grundmodul -36- Pathogene Stämme besitzen häufig die Fähigkeit zur Hämolyse  Hämolyse Mikrobiom des Menschen = Auflösung der roten Blutkörperchen Erythrocyten (Erythrozyten) Hämolysine: bakterielle Proteine (Exotoxine) die Lyse die Lyse der roten Blutzellen verursachen ist ein Virulenzfaktor („verbessert“ die Hämoglobin Pathogenität) Warum? Häm Häm-Gruppe dient als Fe-Quelle, CO Umgehen der „nutritional immunity“ Fe3+ Drei Hämolysetypen: , ,  Nährstoffe für Biliverdin LS ÖMIK Analyse auf Blutagar: Bakterien Grundmodul -37-  Hämolyse Mikrobiom des Menschen -Hämolyse: Vergrünung des Agars um die Bakterienkolonien unvollständiger Abbau des Hämoglobins zu Biliverdin (grün) es werden keine Hämolysine gebildet -Hämolyse, z.B. Streptococcus salivarius, Vergrünung von Blutagar Bei der -Hämolyse werden Erythrocyten nicht oder nur zum kleinen Teil aufgelöst. Das Hämoglobin wird in vivo zum Methämoglobin umgewandelt: Fe(II) → Fe(III). LS ÖMIK → Braune Farbe von abgehangenem Fleisch Grundmodul bzw. trockenem Blut. -38-  Hämolyse Mikrobiom des Menschen -Hämolyse („echte“ Hämolyse): Bildung von Hämolysinen (z.B. Streptolysin O) klarer Hämolysehof um die Bakterienkolonien vollständiger Abbau der Erythrozyten und des Hämoglobins -Hämolyse, z.B. Streptococcus pyogenes Bei der –Hämolyse zeigt ein heller (Scharlach), S. aureus Hämolysehof die vollständige Auflösung der Erythrocyten und Abbau des Hämoglobins an. -Hämolyse: LS ÖMIK keine sichtbare Veränderung des Agars Grundmodul ( „-Hämolyse“ = keine Hämolyse ) -39-  Fragen? ??? 10 min Pause, dann (pünktlich !!!) Fortsetzung des praktischen Teils LS ÖMIK Grundmodul -41-  2. Kurstag Praktikum LS ÖMIK Grundmodul -42-  2. Kurstag Übersicht Versuch 4 Keimgehalt der Luft Auswertung Versuch 1 Sterilisationsmethoden Versuch 2 Anreicherung und Kultivierung aerober und anaerober Bakterien aus Umweltproben Versuch 3 Mikrobiom des Menschen: Isolierung von Bakterien des LS ÖMIK eigenen Körpers, Hygiene Grundmodul -43-  2. Kurstag Versuch 4 Untersuchung des Keimgehaltes der Luft Direkte Methode: 1. Klebrige Objektträger werden ausgelegt 2. Aufgeflogene Keime werden fixiert, angefärbt und mikroskopisch ausgezählt 3. Berechnung des Keimgehalts in Abhängigkeit von Zeit und Fläche Nachteil: Es werden lebende, tote und nicht vermehrungsfähige Zellen erfasst LS ÖMIK Grundmodul -44-  Keimgehalt der Luft Indirekte Methode: Versuch 4 1. Agar-Platten werden ausgelegt und anschließend bebrütet 2. Auszählen der aus den aufgeflogenen Keimen hervorgegangenen Kolonien Nachteil: kein exaktes Bild der tatsächlichen Verhältnisse in der Luft → nur ein Teil der Keime ist unter den gegebenen Bedingungen vermehrungsfähig und langsam wachsende Arten werden übersehen oder überwachsen Auf Luftplatten findet man vorwiegend Bakterien der Gattungen o Micrococcus o Corynebacterium o Mycobacterium o Nocardia LS ÖMIK Grundmodul Auch „Schimmel“pilze (Ascomyceten und Mucorales) -45- wachsen auf den Luftplatten Serratia marcescens  Keimgehalt der Luft Versuch 4 Ziele des Versuchs: Keimzahlbestimmung der Luft an verschiedenen Standorten Überblick über die Mikroorganismenflora der Luft Untersuchung verschiedener Oberflächen mit Hilfe von Abklatschplatten Micrococcus luteus kommt in Boden, Wasser und Luft (Luftkeim) vor und ist Teil der natürlichen Hautflora Kolonien sind von gelber Farbe, haben eine durchsichtige stark glänzende Oberfläche und sind kreisförmig LS ÖMIK Grundmodul -46-  Luftkeimplatten LS ÖMIK Grundmodul -47-  Luftkeimplatten LS ÖMIK Grundmodul © Dr. Armin Quentmeier, Biozentrum, TU Dortmund -48-  Versuch: Luftkeime Versuch 4 WICHTIG! Mit diesem Versuch beginnen! Sie erhalten zwei der am ersten Praktikumstag hergestellten Nähragarplatten Exponieren Sie die Platten ohne Deckel an verschiedenen Untersuchungsorten, z.B.: o Mikroskopiersaal o Raucherbereich o Toilette (XX oder XY) o Eingang NW I o Gänge o Parkplatz usw. Die Agaroberfläche soll bis zum Ende des Praktikums der Umgebung ausgesetzt werden Die Luftplatten werden eingesammelt und beschriftet: ✓ Nährbodenart ✓ Aufstellungsort ✓ Expositionszeit ✓ Gruppennummer Zusätzlich wird eine „Abklatschplatte“ angelegt, mit der verschiedene Oberflächen beprobt LS ÖMIK werden (Fingerkuppe, Geldstück, Türklinke…) Grundmodul Bebrütung der Platten bei 30°C -49-  Keimgehalt der Luft Versuch 4 Jetzt Platten auslegen, Fortsetzung des Praktikums in 10 min LS ÖMIK Grundmodul -50-  Experimentelle Bestimmung der thermal death time von E. aerogenes Versuch 1 Auswertung der einzelnen Sektoren der drei Platten anhand des bakteriellen Wachstums Bedingung Abtötungszeit bei 55°C 0 min 10 min 20 min 30 min A: Leitungswasser B: saurer pH C: kolloidaler Schutz Effekt der drei Bedingungen auf die thermal death time von Enterobacter aerogenes Bedingung thermal death time (min) A: Leitungswasser LS ÖMIK B: saurer pH Grundmodul C: kolloidaler Schutz -51-  Sterilfiltration Versuch 1 Beurteilung des Wachstums vor bzw. nach der Sterilfiltration mit Einweg-Sterilfilter (Porengröße 0,2 - 0,45 µm) Bedingung Wachstum Beurteilung der Filterwirkung vor der Filtration nach der Filtration Jetzt Platten auswerten LS ÖMIK Grundmodul -52-  Anreicherung & Kultivierung von Mikroorganismen Versuch 2 → Grundprinzipien von Anreicherung und Isolierung kennenlernen → Drei Mikroorganismen anhand ihrer Besonderheiten aus Umweltproben isolieren: ©DSMZ ©Mikrobiologisches Praktikum, Springer Bacillus megaterium Clostridium pasteurianum Azotobacter sp. LS ÖMIK Grundmodul -53-  Anreicherung & Kultivierung von Mikroorganismen Versuch 2 Gemeinsamkeiten und Unterschiede von Bacillus megaterium und - Teil 1 - Clostridium pasteurianum: Eigenschaft B. megaterium C. pasteurianum Gram-Typ positiv Zellform Stäbchen Beweglichkeit + Begeißelung peritrich Endosporenbildung + Stärkeverwertung + Aerob / anaerob Vorkommen strikt aerob u.a. Boden strikt anaerob N2-Fixierung - + LS ÖMIK Speicherstoff PHB Granulose Grundmodul (Poly-β- (stärkeähnliches -54- hydroxybuttersäure) Polysaccharid)  Anreicherung & Kultivierung von Mikroorganismen Versuch 2 Für Anreicherung und Isolierung nützliche Eigenschaften: - Teil 1 - Eigenschaft B. megaterium C. pasteurianum Endosporenbildung Hitzeresistenz der Endosporen (überdauern im Gegensatz zu vegetativen Zellen das Pasteurisieren (10 min feuchte Hitze bei 80°C) → abtöten aller nicht-Endosporenbildner Stärkeverwertung Als Substrat verwenden O2 Inkubation in Anwesenheit Inkubation in Abwesenheit von Sauerstoff von Sauerstoff N2-Fixierung Medium enthält gebundenen Medium enthält keinen Stickstoff gebundenen Stickstoff LS ÖMIK Grundmodul -55-  Anreicherung & Kultivierung von Mikroorganismen Versuch 2 Bacillus megaterium: - Aufgaben - 6 mittelgroße, ungewaschene, rohe Kartoffeln werden in Scheiben geschnitten, in ein 1 L Becherglas gegeben, mit Leitungswasser bedeckt und 10 min lang gekocht (Bunsenbrenner) Das Kochwasser wird dekantiert. Jede Gruppe erhält eine Kartoffelscheibe, die in einer sterilen Petrischale bei 30°C im Dunkeln bebrütet wird. Clostridium pasteurianum: Sterile Reagenzröhrchen mit ca. 5 ml Anreicherungsmedium werden gestellt Röhrchen mit einigen Krumen der ausstehenden Ackererde beimpfen Pasteurisieren (10 min, feuchte Hitze, 80°C) im Anaeroben-Topf unter anaeroben Bedingungen mit Gas-Pak bei 30°C ohne LS ÖMIK Schütteln ca. 2 Wochen bebrüten Grundmodul Atmosphäre im Gas Pack ist O2-frei: 80% N2 + H2 + CO2 -56-  Anreicherung & Kultivierung von Mikroorganismen Versuch 2 Kultivierung von Clostridium pasteurianum unter anaeroben Bedingungen - Aufgaben - im Anaeroben-Topf: LS ÖMIK Grundmodul -57-  Anreicherung & Kultivierung von Mikroorganismen Versuch 2 Azotobacter - Teil 2 - freilebende, Stickstoff-fixierende Gammaproteo- bakterien (Gram-negativ) Bedeutsam für Bodenfruchtbarkeit Dauerformen: Cysten (keine echten Sporen) Anreicherung aus getrockneter Erde mit Mannit als bevorzugter C-Quelle und ohne gebundenen Stickstoff: Mannit-Platten fein bestäuben und bei 30°C inkubieren Am nächsten Kurstag werden von diesen Platten Kolonien, die stark Schleim gebildet haben (Schleimbildung ist eine charakteristische Eigenschaft von Azotobacter) mit Hilfe einer Tuschefärbung auf Zellen LS ÖMIK untersucht, die elliptisch bis kokkoid sind, meist in Diplokokken- Grundmodul Assoziation vorliegen und eine starke Schleimkapsel um sich ausbilden. -58-  Anreicherung & Kultivierung von Mikroorganismen Versuch 2 - Aufgaben - Jetzt: Kartoffelscheibe abholen Clostridienröhrchen beimpfen & pasteurisieren Azotobacter-Platten beimpfen Clostridienröhrchen nach dem Pasteurisieren vor bringen LS ÖMIK Grundmodul -59-  Bakterien der menschlichen Haut und der Schleimhäute Versuch 3 Bakterien des Zahnbelags - Teil 1 - Aufgabe Das Vorhandensein und der Hämolysetyp des im Zahnplaque vorkommenden Bakteriums Streptococcus salivarius, das durch Schleim- bzw. Biofilmbildung sehr hartnäckig in den Zwischenräumen der Zähne festsitzt, soll bestimmt werden. LS ÖMIK Grundmodul Streptococcus salivarius: Dieses Bakterium bildet schleimige Kolonien auf fast allen festen Nährmedien. -60-  Bakterien der menschlichen Haut und der Schleimhäute Versuch 3 Bakterien des Zahnbelags - Teil 1 - 1. Utensilien: steriles Reagenzröhrchen mit 3 sterilen Wattestäbchen und zwei Agarplatten mit MST (Mitis-Salivarius-Tellurit)-Agar 1. Mit einem sterilen Wattestäbchen zwischen den Zähnen oder von der Innenseite der Molaren den Zahnbelag (Plaque) entnehmen und in Form mehrerer Striche unter Drehen auf die MST-Agarplatte überimpfen 1. Die Platte wird bei 30°C bebrütet. LS ÖMIK Grundmodul -61-  Bakterien der menschlichen Haut und der Schleimhäute Versuch 3 Staphylococcus - Teil 2 - Aufgabe Das Vorhandensein und der Hämolysetyp der in der Nasenhöhle und auf feuchten Hautstellen vorkommenden Bakterien der Gattung Staphylococcus soll bestimmt werden. 1. Mit Hilfe eines sterilen Wattestäbchens Abstriche bevorzugt von folgenden Stellen nehmen: oberer Nasenraum, Gehörgang, (zusätzlich ggf. Innenseite von Gelenken wie Armbeuge, Achsel, Zehenzwischenräume) 1. Ausstreichen auf Lithium-Tellurit- (nicht MST-!) Agarplatte LS ÖMIK 1. Die Platte wird bei 30°C bebrütet. Grundmodul -62-  Bakterien der menschlichen Haut und der Schleimhäute Versuch 3 - Teil 2 - → Beprobung und Ausstriche jetzt vornehmen! → Bestimmung des Hämolysetyps und anderer Eigenschaften an den folgenden Kurstagen LS ÖMIK Grundmodul -63-  Bakterien des menschlichen Verdauungstraktes Versuch 3 Durchlässigkeit von Toilettenpapier für Bakterien (Demonstrationsversuch Hygiene) - Teil 3 - - Kultivierung von E. coli auf EMB-Agar (Eosin-Methylenblau-Agar) Selektivmedium für Gram-negative Bakterien → Resistenz gegenüber dem Eosin-Methylenblau-Komplex Differenzierung von Enterobakterien o E. coli → Kolonien mit Stahlglanz o E. aerogenes → „Fischaugen“-Kolonien Aufgabe 1. Nachweis des Indikatorkeims E. coli für fäkale Verschmutzung auf den Fingern a. nach der simulierten Toilettenbenutzung LS ÖMIK b. nach dem Händewaschen Grundmodul 2. Vergleich verschiedener Sorten von Toilettenpapier bezüglich ihrer -64- Durchlässigkeit für E. coli  Bakterien des menschlichen Verdauungstraktes Versuch 3 Durchlässigkeit von Toilettenpapier für Bakterien (Demonstrationsversuch Hygiene) - Teil 3 - 1. 5 ml E. coli - Kultur wird auf eine NB-Agar-Platte gegeben. 1. Nach 5 min wird überschüssige Flüssigkeit in einen anderen Behälter abgegossen. Der Nährboden hat jetzt etwa die Besiedlung eines „Stuhlgangs“. 1. Die EMB (Eosin-Methylenblau)-Agar-Platte wird in 2 Sektoren geteilt. 1. Wickeln Sie 2-3 Finger in Toilettenpapier ein und wischen Sie über die Oberfläche des Agars. Benutzen Sie unterschiedliches Toilettenpapier! 1. Entsorgen Sie das kontaminierte Toilettenpapier im Tischabfall. 1. Reiben Sie vorsichtig mit den verschmutzten Fingern über eine Hälfte der EMB (Eosin- Methylenblau)-Agar-Platte. 1. Waschen Sie sich anschließend die Hände. 1. Reiben Sie mit den gewaschenen Fingern über die zweite Hälfte der EMB-Agar-Platte. LS ÖMIK 1. Die Platte wird bei 30°C inkubiert und am nächsten Kurstag ausgewertet. Grundmodul -65-  Bakterien des menschlichen Verdauungstraktes Versuch 3 Durchlässigkeit von Toilettenpapier für Bakterien (Demonstrationsversuch Hygiene) - Teil 3 - 1. Sind nach dem simulierten Toilettengang Fäkalkeime durch das Papier auf die Finger gekommen? 2. Hat das Händewaschen einen Einfluss auf die Keimzahl an den Fingern? 3. Hat die Papierqualität Einfluss auf die Kontamination der Finger? vor dem Händewaschen nach dem Händewaschen viele Kolonien mit Stahlglanz kaum / keine Kolonien → E.coli Händewaschen und Fäkalkeime können durch das anschließendes Abtrocknen Klopapier dringen reduziert den Keimgehalt der Finger deutlich LS ÖMIK Übertragung von Grundmodul Darmkrankheiten möglich -66- Jetzt durchführen!  Aufräumen… Luftkeimplatten (Versuch 4): einsammeln !!! (Bio-Kurs) Alle neuen Platten: beschriftet? Neu angelegte Platten: → nach Versuchen geordnet auf dem Tisch stehenlassen Alte Platten (E. aerogenes, Versuch 1 und NB mit E. coli vom Toilettenpapierversuch) → in blaue Tonne vorn entsorgen Röhrchen und Ständer → vorbringen, Röhrchen ausleeren, entschriften & einsortieren Arbeitsplatz → aufräumen (Utensilien zurück in Stehsammler) und Tische LS ÖMIK desinfizieren Grundmodul -67-