Inducción de la Expresión de Proteína Recombinante

Para realizar un experimento de inducción de la expresión de una proteína recombinante de interés es necesario primero establecer un cultivo celular hasta alcanzar una concentración de biomasa deseada. Para ello se prepara un pre-cultivo o cultivo inicial de la cepa transformada con el plásmido q...

Para realizar un experimento de inducción de la expresión de una proteína recombinante de interés es necesario primero establecer un cultivo celular hasta alcanzar una concentración de biomasa deseada. Para ello se prepara un pre-cultivo o cultivo inicial de la cepa transformada con el plásmido que contiene el gen de la proteína, en este caso usaremos las cepas transformadas con los plásmidos pColdIV-API3 y pET21a-LdTR en la práctica de laboratorio anterior. Estos pre-cultivos se usarán para inocular el cultivo donde se realizará la inducción de la expresión de API3. Para inducir la expresión es necesario que se alcance una densidad celular o cantidad de biomasa correspondiente a un valor de absorbancia a 600 nm entre 0.4 a 0.8. En el caso del plásmido pColdIV, la inducción se logra mediante un "shock" térmico. Estos plásmidos presentan el promotor cspA (cold shock protein A), la región 5´UTR del gen cspA y el sitio de terminación 3´del mismo gen. Estos son elementos que permiten la expresión y estabilización del gen insertado en el plásmido durante la reducción de la temperatura del cultivo. Adicionalmente, este vector contiene el operador lac y una copia del gen lacI, lo que permite controlar la expresión indeseada de la proteína de interés. Para inducir la expresión de la proteían API3 es necesario disminuir rápidamente la temperatura (15°C) y añadir isopropil β-D-tiogalactopiranósido (IPTG). Para la expresión de la proteína LdTR la expresión se inducirá mediante la adición de IPTG, al encontrarse en un vector pET. La concentración de IPTG, el punto de la curva de crecimiento en la que se induce la expresión y la velocidad de agitación son algunos de los parámetros que pueden influir en la solubilidad de la proteína.