Biologia Molecolare PDF - Struttura del DNA, Duplicazione, e Junk DNA

PARADOSSO C E JUNK DNA Se si analizzano le caratteristiche del genoma degli organismi è possibile osservare che non esiste alcun tipo di proporzionalità tra la complessità di esso, intesa come quantità di DNA, e la complessità dell’organismo. Ciò significa che l’uomo non è la specie vivente con un maggior numero di cromosomi rispetto ad altri esseri viventi. Tramite il sequenziamento del genoma umano, reso possibile grazie ad un progetto descritto su Nature nel febbraio 2001 (Humane genome project), è stato possibile comprendere che delle sequenze presenti nel DNA della cellula eucariote umana solo il 2% circa codifica per prodotti proteici, mentre il restante 98% è stato per anni definito come “junk DNA”, ovvero DNA spazzatura, in quanto non codificante. Il genoma procariote è invece quasi totalmente codificante; ciò significa che ciascuna sequenza è responsabile della produzione di uno specifico elemento proteico. Salendo sulla scala evolutiva e analizzando genomi più complessi è possibile notare come a sequenze codificanti si intervallino sempre più sequenze non codificanti. Ciò denota il fatto che più l’organismo è complesso e meno i geni che codificano per prodotti proteici sono strettamente impacchettati vicino l’uno all’altro. Più l’organismo gode di complessità e più il suo genoma è costituito da Junk DNA. Il Junk DNA viene considerato come quantità extra di DNA che va a rigenerare un possibile danneggiamento di quello codificante in modo da mantenere inalterato il patrimonio genetico ereditario nelle generazioni ed evitare che le eventuali mutazioni colpiscano il DNA codificante. Ricopre quindi funzione difensiva. Un’altra tesi attribuisce al junk DNA una funzione di regolazione. Questa tesi è sostenuta dal fatto che tra le sequenze del DNA non codificanti compaiono sequenze regolatrici, come ad esempio quelle che si occupano di modulare l’espressione genica. Tra le altre tesi vi è quella che intende il junk DNA come deposito di materiale genetico silenziato, perché non necessario alla sopravvivenza nell’ambiente. Tutte queste considerazioni sono state incluse nel concetto di trascrizione pervasiva o estensiva, con il quale si intende che il nostro genoma viene trascritto in molecole di RNA. Nonostante la maggior parte delle sequenze codificate non vadano a produrre mRNA, viene codificata una significativa quantità di piccoli RNA regolatori (circa 40mila), di cui solo in minima parte si conosce il ruolo. Sono quindi queste molecole di RNA regolatore a fare da cardine all’individualità genica di ciascuno organismo. Secondo recenti studi pare inoltre che questo tipo di molecole siano responsabili di fattori come orientamento sessuale, capacità di apprendimento, specifici caratteri psicologici e della personalità ed il silenziamento del cromosoma X. Il “paradosso C” è quindi spiegato: più l’organismo è semplice e meno ha bisogno di molecole di RNA regolatore che modulino l’espressione genica. NUOVO DOGMA Dopo il 2001 il dogma centrale è stato rivisitato. Oggi si riconosce che per il 2% del DNA (codificante per proteine), il flusso dell’informazione segue il percorso: trascrizione → mRNA → traduzione → prodotto proteico mentre per il 98% del DNA (che codifica per RNA regolatori e viene trascritto nella sua totalità), si ha come prodotto della trascrizione degli RNA non codificanti, in grado di influenzare sia l’espressione dei messaggeri a livello citoplasmatico, che l’espressione a livello del DNA di quel 2% che codifica per prodotti proteici. Dunque, gli RNA regolatori hanno la capacità di influenzare l’espressione proteica a livello di RNA messaggero già trascritto, quindi a livello citoplasmatico, ma è stato osservato che esistono anche classi ben precise di RNA regolatori in grado di andare a lavorare sulla cromatina e, quindi, a influire su quali e quanti geni devono essere “accesi” e trascritti, con un’azione diretta sull’attività dell’RNA polimerasi. Questo concetto comprende i microRNA e molte altre piccole molecole di RNA, la cui funzione è in gran parte ancora da chiarire. Dal punto di vista storico, oltre a Watson e Crick ci sono altri personaggi fondamentali per la ricerca come Rosalind Franklin, nota per aver acquisito la famosa fotografia 51 che determinò la struttura del DNA, e Wilkins che diede formula matematica alla struttura identificata ai raggi X. LA DENATURAZIONE La denaturazione è un processo che porta alla separazione dei due filamenti complementari. La denaturazione avviene anche durante il processo di sintesi, correzione e trascrizione del DNA a carico di macchine enzimatiche che sono in grado di superare quello che è il super avvolgimento, andando a riconoscere sequenze ben precise. I due filamenti denaturati, dopo un certo periodo di tempo possono riassumere spontaneamente la conformazione iniziale. Contribuiscono alla denaturazione del DNA - fattori intrinseci: si basano sulla composizione in base e peso molecolare della molecola stessa. Infatti, un filamento ricco di A e T sarà meno stabile di uno ricco di G e C - fattori estrinseci: sono temperatura, pH e forza ionica. Se si aumenta la temperatura o se si pone il filamento in una situazione lontana dalla neutralità del pH o aumentando la forza ionica di una soluzione il DNA si denatura. CURVA DI MELTING Tutte le molecole di DNA hanno una curva di melting (denaturazione) tracciata in base alla temperatura, sulla quale viene riportata la percentuale della molecola che passa da conformazione a doppio filamento a conformazione a filamento singolo. La temperatura di melting (punto di flesso del grafico) rappresenta la temperatura a cui il 50% del DNA è denaturato. La percentuale di DNA denaturato aumenta con la temperatura. Dato un filamento di DNA la temperatura di denaturazione sale se sono presenti G e C (a causa dei 3 legami a idrogeno da dover scindere). Ne consegue che è estremamente più probabile che l’origine della duplicazione/trascrizione del genoma avvenga in quelle regioni dove la cromatina è più accessibile e dove la frazione di nucleotidi con A e T è maggiore, poiché minore sarà l’energia necessaria a denaturare localmente il DNA. MECCANISMI DI DUPLICAZIONE È bene ricordare che la fase S è il momento della sintesi ma il cosiddetto imprinting cioè il destino di una cellula nell’entrare in una fase replicativa è decisa durante tutta la fase G1. Nell’articolo pubblicato nella rivista “Nature” nel 1953 Watson e Crick oltre a descrivere la struttura della doppia elica hanno ipotizzato che la struttura potesse far supporre un meccanismo replicativo della stessa. Pur non sapendo nulla dei dettagli chimici propri della doppia elica, solo in base alla sua struttura, si poteva intuire la fedeltà del meccanismo di replicazione ossia il mantenimento dell’appaiamento tra le basi azotate. La duplicazione o replicazione del DNA è un processo semiconservativo: da una molecola parentale si ottengono due molecole figlie costituite da una elica originale e da una seconda elica che viene sintetizzata ex novo, ottenendo due molecole ibride. Quando si passa alla seconda duplicazione, partendo dalle molecole ibride, ci sarà una molecola completamente nuova ed una che è ancora un ibrido tra il filamento parentale originale e un filamento nuovo. BOLLA DI DUPLICAZIONE La bolla di duplicazione è il punto in cui il DNA viene denaturato e dove si creano le forcelle di duplicazione a cavallo delle quali la macchina replicativa prende contatto con le sequenze di nucleotidi per copiare il filamento stampo. Una volta che l’origine è riconosciuta dalla macchina, il DNA si allarga e si denatura come una cerniera lampo, formando una bolla ai margini della quale ci sono le forcelle replicative. La duplicazione del genoma avviene in direzione opposta rispetto alla bolla di duplicazione, con due complessi molecolari replicativi che lavorano in direzione opposta l’uno rispetto all’altro. ORIGINE DI DUPLICAZIONE La duplicazione ha inizio in regioni precise chiamate origini di duplicazione, ovvero parti del cromosoma ricche di A e T in cui la denaturazione del DNA avviene in maniera più semplice. L’origine, quindi, è una regione di denaturazione localizzata in cui si forma una bolla di replicazione. I procarioti sono caratterizzati da un cromosoma circolare. La replicazione procede fino a dare origine a due molecole distinte, in un primo momento legate come gli anelli di una catena, che successivamente vengono liberate grazie all’azione enzimatica di una molecola chiamata topoisomerasi II. Questo tipo di duplicazione prende il nome di duplicazione teta ed è tipica delle cellule procariote, dei plasmidi e del DNA mitocondriale. La duplicazione teta inizia da una singola origine di replicazione, a differenza del processo che avviene nelle cellule eucariote in cui le origini sono moltissime. Infatti, se le cellule eucariote avessero una singola origine di replicazione i tempi della fase S sarebbero estremamente lunghi e non compatibili con la vita, hanno quindi attuato delle strategie che prevedono l’accensione di diverse origini di replicazione alle quali si legheranno diversi enzimi polimerasici che procederanno a completare il processo di copiatura dell’intero corredo. In tutti i processi enzimatici è fondamentale il concetto di sensing, ovvero della percezione della conformazione tridimensionale dei substrati da parte degli enzimi. Le reazioni all’interno della cellula sono catalizzate da enzimi, ovvero complessi proteici con una determinata conformazione, essi hanno dei precisi anfratti (sito attivo) in cui entra il substrato e nei quali avviene la reazione. Il processo che sta alla base di tutte le reazioni enzimatiche è quello del corretto incastro chiave – serratura tra il substrato e la proteina. La DNA polimerasi, a questo proposito, incorpora solamente desossiribonucleotidi, ma il nucleo è pieno di ribonucleotidi, la polimerasi riconosce quindi i desossiribonucleotidi grazie al meccanismo chiave serratura incorporando solo il substrato (i nucleotidi) che si incastrano perfettamente al suo sito attivo. La polimerasi inizia a duplicare quando trova le sequenze di origine. Essa riesce ad individuarle grazie a dei consensus, ovvero delle regioni conservate nel DNA che si suppone segnalino il sito in cui iniziare la duplicazione. Andando però ad analizzare tutte le sequenze esse hanno una variabilità enorme, perciò le cellule attuano una strategia: per segnalare l’origine legano una proteina bandiera, in modo tale che indipendentemente da quale sequenza ci sia intorno all’origine la polimerasi riesce a riconoscerla “colpendola”: la polimerasi e la subunità deputata ad agganciare il DNA si fermano. Quindi, nelle origini di replicazione, ci sono sequenze consensus che servono a reclutare proteine che segnalano l’intorno dell’origine di replicazione, In questo modo l’elicasi e successivamente la polimerasi vengono richiamate nei pressi della proteina e creano quella che è la bolla di replicazione. RICONOSCIMENTO DI ORI E TERMINAZIONE L’origine di duplicazione per i procarioti corrisponde ad una zona estremamente circoscritta, circa 200 bp, in cui la sequenza nucleotidica è ricca di A e T. L’origine viene segnalata con una proteina bandiera. A livello di questa regione viene richiamata una macchina molecolare speciale deputata a segnalare che quella regione è proprio una origine di duplicazione. Questo avviene sia nei procarioti che negli eucarioti. Nella fase finale le due forche continuano in direzione opposta fino ad ottenere le due molecole figlie interconnesse tra di loro. A 180 gradi rispetto al sito di origine, esiste un sito di terminazione: un sito in cui le due macchine molecolari si trovano faccia a faccia. Questo punto, in cui le forcelle si scontrano, ha una sequenza ben precisa ed è il punto dove interviene un particolare enzima: la topoisomerasi II. Questa fa un taglio in uno dei due anelli e libera nell’ambiente le due molecole. CONTROLLO DELLA DUPLICAZIONE Uno dei problemi che la cellula deve affrontare riguarda il rischio che, durante il ciclo cellulare, la polimerasi effettui più giri di copiatura della molecola di DNA, generando così una quantità di DNA superiore a quella tipica della specie. Se la duplicazione procede senza essere seguita dalla divisione cellulare, si parla di poliploidia, ovvero vi è una quantità ripetuta di DNA all’interno della stessa cellula. Sebbene questo in alcuni casi sia un processo fisiologico, normalmente ogni cellula deve mantenere un genoma diploide. Pertanto, è fondamentale che la polimerasi non continui a replicare il DNA in maniera eccessiva, specialmente nel caso di cromosomi circolari. Questo è possibile attraverso 2 livelli di regolazione: 1. Interazione della proteina iniziatrice con l’origine di replicazione: solo quando ci sono nutrienti a sufficienza; 2. Origine di replicazione: il punto di inizio della duplicazione deve essere utilizzato una sola volta per ciclo cellulare, per poi andare incontro ad un “periodo refrattario”, rappresentato da un ritardo nella metilazione delle nuove adenine sintetizzate, che blocca ulteriori inizi di replicazione. I TRE PRINCIPI DELLA DUPLICAZIONE 1) La duplicazione del genoma deve essere semiconservativa: la polimerasi non può inserire a caso sequenze nuove, deve copiare lo stampo. 2) La replicazione deve incominciare solo e soltanto a partire dalle origini 3) La sintesi di un nuovo filamento deve avvenire con una direzionalità, ossia solo e soltanto in direzione 5’→3’ e deve essere bidirezionale ELICASI Sia in procarioti che eucarioti sono i complessi enzimatici che rompono i legami idrogeno presenti tra i due filamenti. Ogni forca replicativa ha il suo complesso polimerasico. Le elicasi, responsabili della rottura dei legami idrogeno, abbracciano la molecola di DNA e hanno la forma di una margherita. Sono complessi proteici esamerici (enzimatici) formati da monomeri simili ma non identici tra loro e al centro delle quali passa il singolo filamento di DNA. Tra i due filamenti di DNA agisce come una cerniera lampo, dando all’elica una conformazione ad Y, attraverso il consumo di ATP. Ogni forcella replicativa ha il proprio complesso polimerasico, perciò: nei procarioti, dove ci sono due forcelle, ci sono due complessi elicasici, mentre negli eucarioti, per ogni origine di replicazione attivata, vi sono due complessi elicasici. L’aumento dell’entropia durante la duplicazione rappresenta un momento critico per la sopravvivenza della cellula. METILAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI La metilazione del genoma è un processo fondamentale per controllare la replicazione. In seguito al completamento della duplicazione del DNA, una metiltransferasi aggiunge gruppi metile alle adenine della sequenza GATC su entrambi i filamenti parentali. Tuttavia, la molecola figlia viene definita “emimetilata” per un primo breve periodo, perché quando il DNA viene replicato viene metilato solo il filamento stampo, e non quello neosintetizzato (arancione), in quanto la DNA polimerasi non ha ancora terminato il suo compito. Questa emimetilazione impedisce alla DNA polimerasi di replicare nuovamente il DNA in quella zona, assicurando così che la replicazione avvenga una sola volta per ciclo cellulare. Solo quando entrambi i filamenti sono completamente metilati, il processo di replicazione può riprendere. La metilazione avrà un ruolo differente nelle cellule eucariote. IL PROCESSO DI TERMINAZIONE DELLA DUPLICAZIONE DEL DNA Gli step della duplicazione del DNA comprendono diversi passaggi: 1. Formazione della bolla di replicazione: la doppia elica di DNA deve essere aperta, denaturando parzialmente una porzione di DNA, in modo da consentire l’accesso dell’enzima alla forcella replicativa, dove avverrà la separazione dei due filamenti di DNA. 2. Formazione di un legame con le basi complementari, sia nel filamento continuo (leading strand), che nel filamento lento (lagging strand) 3. Creazione di due molecole di DNA identiche. IL RUOLO DELLA POLIMERASI A seguito dell’azione dell’elicasi, la polimerasi incorpora i nucleotidi aggiungendoli all’estremità 3’ ossidrilica (-OH) del primer a RNA, formando un legame fosfodiesterico con il gruppo fosfato 5’ del nucleotide aggiuntivo. I nucleotidi entrano quindi come nucleosidi trifosfati, apportando l’energia necessaria per la polimerizzazione, fornita dall’idrolisi di un legame fosfoanidride, con liberazione di pirofosfato. Il pirofosfato viene poi idrolizzato ulteriormente a fosfato inorganico, rendendo la reazione del tutto irreversibile. Il processo termina quando tutte le basi del templato (termine per indicare il DNA a singolo filamento) vengono appaiate con quelle del nucleotide complementare. A questo punto, come risultato, si ottengono due nuove molecole di DNA identiche, ciascuna composta da un filamento parentale (DNA template) e uno neosintetizzato. Piuttosto che riferirsi alla DNA polimerasi come singolo enzima, è più corretto parlare di “complesso di DNA polimerasico” o “replicasi”. Questo perché la duplicazione del genoma è gestita da un complesso multimerico formato da diverse subunità enzimatiche, con diverse attività catalitiche, che collaborano per garantire la corretta replicazione del DNA. Sebbene la replicasi sia l’enzima che catalizza la formazione del legame fosfodiesterico tra lo zucchero e il gruppo fosfato, da sola non è in grado di funzionare. Pertanto, solo all’interno del complesso polimerasico può compiere il suo lavoro. Il complesso di DNA polimerasi può essere rappresentato come una mano destra: - il palmo della “mano”: viene attraversato dal complesso “innesco-stampo”, in quanto fornisce una superficie piatta su cui può avvenire l’apertura della doppia elica del DNA, facilitando la lettura sequenziale delle basi azotate - le porzioni tra le “dita” del complesso consentono l’inserimento dei desossiribonucleotidi nella posizione corretta, dove vengono selezionati in base alla forma e inseriti nella catena in crescita. Il “palmo” semichiuso del complesso introduce il concetto di isolamento del processo di replicazione dal caos entropico presente nel nucleo delle cellule eucariotiche o nel citoplasma delle cellule procariotiche. Il complesso polimerasico, grazie alla sua conformazione altamente conservata e spazialmente organizzata, garantisce che la replicazione del genoma avvenga senza errori o mutazioni. FUNZIONI DELLE DIVERSE DNA POLIMERASI Tutte le DNA polimerasi incorporano solo desossiribonucleotidi, ma per funzionare necessitano di uno stampo da copiare, fornito dai filamenti di un’elica preesistente, e di un innesco (primer), in quanto non possono iniziare la sintesi di una catena ex-novo. Esistono diverse forme di DNA polimerasi, che vengono selezionate in base alle esigenze specifiche della cellula. Per esempio, durante la fase S del ciclo cellulare, la cellula deve duplicare il genoma, mentre in altre fasi potrebbe dover riparare il DNA o sintetizzare frammenti di Okazaki. In E.Coli esistono 5 tipologie di DNA polimerasi: - DNA polimerasi I: è abbondante, ma non ideale per la replicazione, in quanto è più lenta rispetto al movimento della forcella replicativa ed effettua pochi processi. La sua funzione principale è quella di riparare i danni del DNA in brevi regioni a singolo filamento - DNA polimerasi III: costituisce la principale DNA polimerasi coinvolta nella replicazione - DNA polimerasi II, IV, V: sono coinvolte nella riparazione dei danni nel DNA. LE PROTEINE ACCESSORIE Le proteine accessorie fanno parte del complesso polimerasico e intervengono nella bolla di replicazione. Come molti enzimi che devono interagire stabilmente con il DNA, queste proteine abbracciano la molecola di DNA ad anello: è interessante notare che i mutageni più aggressivi sono proprio quelli che si legano ad anello al DNA, come i chemioterapici. Per ogni origine di replicazione ci sono due complessi elicasici che vengono caricati sull’origine, segnando l’inizio del processo di duplicazione nelle cellule eucariotiche. Le proteine SSB (Single-Strand Binding proteins) sono proteine strutturali che si legano ai filamenti singoli di DNA per mantenerli distesi una volta sintetizzati, prevenendo la formazione di legami idrogeno che si verificherebbe in loro assenza. Senza il filamento disteso, la replicazione non può procedere, perché la polimerasi non riesce a copiare in modo fedele il templato e salta porzioni del DNA, causando grosse delezioni incompatibili con la sopravvivenza della cellula. L’innesco è rappresentato dal gruppo ossidrile del primer a RNA (sintetizzato dalla primasi), che funge da sito di inizio per la replicazione. La polimerasi infatti, essendo un enzima, per iniziare ha bisogno di un gruppo ossidrile esposto. È fondamentale avere un gruppo 3’ a cui legare i gruppi fosfato. Nella duplicazione del filamento lento, i frammenti di Okazaki vengono uniti dalla DNA ligasi che utilizza ATP per creare mosaici legando frammenti diversi di DNA. Per evitare dissociazioni spontanee dell’enzima DNA polimerasi dal suo templano, si è evoluta un’altra struttura tridimensionale ad anello, nota come pinza (PCNA). Questa presenta un’affinità straordinaria per afferrare il DNA e garantire un legame stabile della polimerasi al filamento di DNA. La chiusura della pinza è garantita dalla proteina “clamp loader”, che catalizza l’assemblaggio delle diverse subunità della pinza attorno al dsDNA (double strand DNA). La polimerasi ha un’affinità relativamente bassa nei confronti della doppia elica, per cui il DNA si attaccherebbe e si staccherebbe continuamente, impedendo una duplicazione fedele. È proprio per contrastare questo problema, che la pinza, data una particolare affinità con la polimerasi, abbraccia stabilmente il DNA nei pressi della forcella replicativa, consentendo alla polimerasi di “spostarsi” lungo il filamento. I MECCANISMI DI CORREZIONE Esistono diversi meccanismi di correzione del DNA, evoluti nel corso dei millenni, che garantiscono un tasso di errore pari a 1 su 1 miliardo di basi. Meccanismo di controllo di primo tipo: compatibilità nucleotide - sito catalitico della DNA polimerasi, si basa sulla compatibilità della conformazione tridimensionale del nucleotide rispetto alla forma della tasca catalitica della DNA polimerasi: un nucleotide che entra nel sito catalitico della DNA polimerasi, se non risulta complementare allo stampo, viene fatto uscire dalla tasca perché non alloggia in essa Meccanismo di controllo di secondo tipo: meccanismo di correzione delle bozze, si basa sull’attività di una delle subunità polimerasiche, che, in presenza di un nucleotide mal incorporato (potenziale fonte di una mutazione puntiforme), è in grado di erodere, in senso opposto al movimento di sintesi, il filamento neo-nascente, rimuovendo in questo modo il nucleotide a partire dall’estremità 3’. La sua attività è detta pertanto 3’ esonucleasica. Meccanismo di controllo di terzo tipo: meccanismo di controllo del DNA già replicato, verifica la fedeltà di duplicazione del genoma e rimuove l’eventuale mutazione rilevata sul DNA neosintetizzato. Questo sistema ha importanti risvolti in ambito patologico e diagnostico. In caso di mutazione, la macchina molecolare di correzione, individua l’alterazione, determinata dall’aberrante conformazione del legame idrogeno causato dall’unione di basi non complementari, effettua un taglio a valle e a monte del sito preciso in cui è presente la mutazione e degrada il frammento mutato. Lo spazio che prima era occupato dai nucleotidi errati viene riempito da una polimerasi di riparazione, e la DNA ligasi infine lega gli scheletri dei filamenti separati. Questo meccanismo nei procarioti è realizzato da 3 proteine: le Proteine Mut, che fanno parte di un complesso enzimatico a sé stante che controlla il DNA dopo che è stato replicato. La prima proteina coinvolta in questo tipo di controllo è la MutS (s per scanning), che assume una conformazione ad anello attorno alla molecola di DNA neosintetizzata, e la scansiona con un consumo di ATP, controllando che la distanza fra i due filamenti sia costante e che il numero dei legami ad idrogeno sia corretto. In caso di mal incorporazione di un nucleotide, la proteina MutS rileva una variazione nella distanza dei due filamenti e segnala alle proteine collaboranti che è presente un’alterazione. Sul punto in cui è presente la mutazione puntiforme richiama la proteina MutL (ligasi) che, assumendo a sua volta una conformazione ad anello e utilizzando l’energia dell’ATP, richiama la proteina MutH (elicasi) che va ad unirsi alle precedenti, innescando così un processo che prevede l’esecuzione di due tagli sul filamento neosintetizzato, a monte e a valle della mutazione. Successivamente si verifica la degradazione del filamento che contiene la mutazione, fase delicata dal punto di vista termodinamico, e intervengono le proteine accessorie single-strand binding protein (SSB) che aiutano la polimerasi a riempire correttamente il gap di DNA del filamento. Queste coprono il filamento che funge da stampo, distendendolo e permettendo alla polimerasi di riempire lo spazio lasciato dal frammento degradato con un DNA di neo-sintesi. Infine, la DNA ligasi salda i filamenti distaccati completando in questo modo la correzione della mutazione puntiforme. IL RUOLO DELLA METILAZIONE DEL FILAMENTO Considerato che la proteina MutS riconosce solo una distorsione localizzata dell’elica, ci si potrebbe chiedere come faccia la macchina di riparazione a capire quale dei due filamenti è il filamento di neo-sintesi e quale quello di stampo. Nei procarioti, dopo la replicazione, il DNA subisce delle modificazioni chimiche. In particolare, il filamento stampo (parentale) viene metilato sulle adenine delle sequenze GATC, mentre il filamento neosintetizzato è privo di metilazione perché la metiltransferasi lavora solo dopo l’accertamento della fedeltà della duplicazione. Il complesso MutH, MutS, MutL è in grado di correggere in maniera precisa esclusivamente il filamento di neo-sintesi in quanto non è metilato. Questo è il vero scopo del processo di metilazione del genoma dei procarioti. MECCANISMO DI CORREZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI Negli organismi eucarioti, la macchina molecolare è sovrapponibile. Questo sistema di riparazione funziona perfettamente nei procarioti, quindi, è stato mantenuto nelle cellule eucariote con l’eccezione che le subunità proteiche che partecipano al meccanismo sono più abbondanti e presentano dei nomi differenti, ma il concetto è esattamente lo stesso. Negli eucarioti inoltre c’è un arricchimento del tipo di mutazione che viene riconosciuto, ovvero se nei procarioti il meccanismo riconosce solo mutazioni puntiformi, negli eucarioti vengono riconosciute anche mutazioni su due basi adiacenti che comportano quindi anche microdelezioni. SITUAZIONI PATOLOGICHE LEGATE AI MECCANISMI DI CORREZIONE Il sistema di correzione del DNA è alla base dell’insorgenza di situazioni patologiche ben precise e in particolar modo di una intera classe di carcinomi colon rettali, descritti come sindrome di Linch. Questi carcinomi sono causati in maniera specifica da mutazioni nelle subunità proteiche del sistema di correzione, deputate alla rilevazione delle mutazioni puntiformi. Nel caso della sindrome sopracitata il meccanismo di controllo che scansiona la doppia elica non è efficiente e quindi le mutazioni non vengono rilevate, determinando un danno al genoma. Un tempo si pensava che questo tipo di mutazione fosse causativa soltanto di carcinomi colon-rettali ma evidenze recenti hanno correlato questo tipo di mutazione anche ad un grandissimo numero di tumori dell’ovaio, tra i più invalidanti e letali. Per osservare questo tipo di mutazioni, l’anatomopatologo usa colorazioni immunoistochimiche che prevedono l’uso di un anticorpo specifico per una determinata proteina da riconoscere in una sezione istologica su vetrino. La proteina deputata alla correzione dei sistemi di appaiamento sbagliati è una proteina nucleare. I pallini scuri presenti nella prima immagine corrispondono ai nuclei delle cellule presenti al fondo delle cripte intestinali. Essendo il nucleo ben colorato, significa che la proteina deputata al sistema di riparazione degli errori è presente. Invece, nel caso del carcinoma colon-rettale si osserva il DNA delle cellule colorato in violetto, i nuclei dei villi intestinali di una colorazione lilla priva di macchie marroni, e pertanto in questo caso non sono presenti le proteine esaminate nei nuclei e la scansione del DNA post replicativo non è in atto. Nel preparato istologico del carcinoma colon-rettale, si osserva inoltre una porzione caratterizzata da una certa densità di macchie scure: si tratta di un linfonodo sotto l’epitelio intestinale nella mucosa. Il linfonodo non è colpito dalla mucosa e quindi tutti i nuclei dei linfociti in esso presenti sono perfettamente normali. Grazie a questa immagine si può affermare che la reazione è avvenuta perché sono presenti dei tessuti normali, privi di mutazione, in cui la proteina è correttamente localizzata a livello nucleare nel linfonodo mentre il tessuto colon rettale presenta la mutazione tipica della patologia (cioè la mutazione di questa proteina che non viene espressa a livello nucleare) e infatti tutti i nuclei sono lilla, quindi senza questo tipo di proteina. PROCESSO DI DUPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI Il processo di formazione della forcella replicativa considerato dal punto di vista degli enzimi coinvolti trova una buona sovrapposizione tra procarioti ed eucarioti, questo perchè la cellula eucariote ha mantenuto durante il processo evolutivo le funzioni di quella procariote, arricchendole di subunità enzimatiche e proteine accessorie necessarie alla formazione di un complesso molto efficiente. I due processi replicativi non sono però completamente sovrapponibili, soprattutto quando il processo di replicazione del DNA eucariote presenta il DNA sotto forma di cromatina. Anche al momento della replicazione la macchina polimerasica deve affrontare la complessa struttura che caratterizza il DNA all’interno del nucleo, che rimane superavvolto anche in fase S in modo da poter stare nel nucleo. Il processo di replicazione eucariote è influenzato dalla presenza dei nucleosomi che impacchettano il DNA nelle sue strutture secondarie, terziarie e quaternarie. Se pensiamo che la lunghezza dei frammenti di Okazaki negli eucarioti è di 200 nucleotidi mentre nei procarioti è di 2.000, vediamo che c’è un motivo pratico di organizzazione in quanto 200 nucleotidi è la lunghezza del DNA tra due nucleosomi, quindi per comodità i frammenti di Okazaki sfruttano i nucleosomi come sito di aggregazione e di sintesi. STRUTTURA DELLA CROMATINA La cromatina ha una struttura dinamica in quanto nella sua struttura impacchettata, deve far fronte ai processi di replicazione e trascrizione. Per permettere la lettura della sequenza di basi del DNA a tutti gli enzimi coinvolti, il passo dell’elica, ovvero quanto la cromatina è densamente impacchettata, è in costante trasformazione. Nelle regioni in cui la trascrizione dei geni è particolarmente attiva la cromatina deve essere meno condensata per permettere l’attività enzimatica, mentre nelle regioni meno attive è più compatta. Il compattamento della cromatina è regolato da specifiche reazioni chimiche, e varia non solo nel corso del tempo all’interno del nucleo di una cellula, ma anche nelle diverse regioni di una stessa cellula. I NUCLEOSOMI I nucleosomi sono corpuscoli proteici formati da ottameri di istoni attorno ai quali la doppia elica si arrotola per 146 bp a dare quella che è la struttura primaria del DNA. I singoli nucleosomi sono compattati dall'istone H1 che determina il loro avvicinamento sigillando la posizione del DNA attorno ad ogni nucleosoma. Nella fase G1 del ciclo cellulare una cellula presenta un dato numero di nucleosomi. La cellula duplica il proprio genoma in fase S e nella fase G2 si prepara a dividersi in due cellule figlie. Nella fase G2 la cellula presenta il doppio del DNA rispetto alla fase G1 e deve quindi contenere 2+2 metri di DNA nel nucleo. Nel momento in cui la polimerasi sta portando a termine il processo di duplicazione si deve procedere con il compattamento del DNA, che richiede una quantità di nucleosomi doppia rispetto a quella della fase G1. L'ESPRESSIONE GENICA DEGLI ISTONI Gli istoni sono codificati da una serie di geni con caratteristiche uniche e sono trascritti in maniera precisa solo alla fine della fase G1, cioè quando la trascrizione subisce un picco che dura lungo la fase S e che crolla alla fine di questa, in modo da essere prodotti solo nel momento di necessità. Ci sono dei meccanismi molecolari che fanno in modo che l’entrata in fase S coincida con l’innalzamento del picco. Quindi i geni degli istoni sono compattati in due regioni precise del nostro genoma: nel cromosoma 1 e nel 6. La RNA polimerasi in entrata in S deve trascrivere molto mRNA per produrre le proteine istoniche, si sistema in quei locus precisi dei cromosomi 1 e 6 e trascrive dei geni che non hanno introni, in modo da avere una produzione dell’mRNA più veloce perché priva del processo di splicing. Inoltre, l’mRNA degli istoni, una volta che la cellula è entrata in fase S non è più degradato: dimostra una stabilità unica rispetto agli altri mRNA il che permette ad un'unica molecola che codifica per un dato istone, di rimanere interamente espresso per molto tempo, addirittura l’intera fase S. Alcune caratteristiche proprie degli istoni aiutano la necessità di una cellula di avere abbondanza di proteine all’entrata della fase S, ma una precisa regolazione di questi geni è aiutata anche dal fatto che la produzione dell’mRNA istonico è accesa in modo specifico da una proteina che all’interno della cellula eucariota segnala il passaggio dalla fase G1 alla fase S. REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE DEGLI ISTONI La trascrizione degli istoni subisce lo stesso tipo di regolazione: viene attivato un fattore di trascrizione (molecola che in maniera specifica attiva la trascrizione del gene degli istoni) all'inizio della fase S che non è espresso in altre fasi del ciclo perché non viene sprecata energia in quanto la polimerasi non è stimolata ad andare a riconoscere il gene degli istoni. Il trascritto di mRNA passa quindi ai ribosomi dove viene controllato ed avviene il processo di control-sintesi. Ci sono 10mila complessi polimerasici che cominciano a duplicare il contenuto di DNA di una cellula, quindi il numero di nucleosomi necessari a compattare il duplicato deve essere preciso. La cellula ha bisogno di più nucleosomi perché altrimenti il compattamento della cromatina non si ottiene. CINETICA DEL COMPATTAMENTO DELLA CROMATINA Al momento del passaggio nella forca i nucleosomi del filamento parentale vengono suddivisi tra i due filamenti che si creano all’inizio della fase S, metá su quello vecchio e metá sulla molecola neosintetizzata per iniziare il compattamento del DNA in fase di sintesi. Quindi i nucleosomi, dimezzati, non sono sufficienti perché con metà nucleosomi sul filamento parentale e metà sul filamento neosintetizzato vi è un compattamento instabile e si va incontro al rischio di collasso durante la fase S. Nuovi istoni cominciano ad esser prodotti e si assemblano in nucleosomi, e questi, guidati da molecole specifiche, si posizionano sui due filamenti ogni circa 200 nucleotidi in modo da garantire un corretto folding. Quindi all’inizio della fase S abbiamo nucleosomi vecchi e nuovi che compattano entrambi i filamenti. Durante la fase S si ha una sorta di perdita di identità sia del filamento parentale che di quello neosintetizzato in quanto ognuno di questi presenta metà nucleosomi specifici e metà nucleosomi nuovi, aspecifici. Quindi dopo che i nuovi nucleosomi si depositano sul filamento neosintetizzato, una macchina di modificazioni chimiche riconosce i nucleosomi vecchi e le loro modificazioni chimiche e le copia in maniera fedele sui nucleosomi di neosintesi appena deposti, passaggio molto importante per mantenere le caratteristiche proprie di una cellula. IL RUOLO DEGLI ISTONI AL TERMINE DELLA FASE S I nucleosomi sono stati trattati finora come elementi strutturali responsabili del compattamento del DNA nella cromatina ma di fatto hanno anche funzione fondamentale nella regolazione della trascrizione, cioè del numero e della qualità degli mRNA prodotti da una cellula. Gli istoni presenti nei nucleosomi subiscono una serie di modificazioni chimiche post-traduzionali fondamentali per attirare o repellere le RNA-polimerasi, aumentarne l’efficienza catalitica e reprimere completamente la produzione di RNA messaggero. Dopo la fase S, queste modificazioni conferiscono ad ogni tipo di cellula una certa particolarità in termini di geni espressi, e questo avviene perchè vengono prodotti mRNA diversi per poi tradurre diverse proteine; quindi le modificazioni chimiche degli istoni sono responsabili della regolazione dell’espressione genica. LA DISTRIBUZIONE DELLE ORIGINI DI REPLICAZIONE La replicazione incomincia in regioni specifiche, dette origini (ori), che sono multiple negli organismi con genoma lineare. L’accensione del processo, quindi la denaturazione localizzata del DNA a livello delle singole origini porta alla formazione di due forche replicative per origine che si incontrano determinando l'espansione della bolla di replicazione con il procedere della replicazione stessa. L’accensione delle origini non avviene in contemporanea lungo tutto il genoma, ma alcune (precoci o early) vengono accese prima di altre (tardive, late). Vengono duplicate prima le porzioni del genoma che sono meno compattate, ovvero l’eucromatina (più accessibile, lassa, normalmente in attiva trascrizione), e successivamente quelle più compattate, ovvero le zone di eterocromatina (non accessibile agli enzimi, più compattate). DIFFERENZE IN EUCARIOTI E PROCARIOTI Nei procarioti, considerando il loro cromosoma circolare, non sussistono problemi nell’ effettuare in maniera efficiente la duplicazione del genoma durante la fase S. Questo accade poiché le due forche replicative si muovono in senso opposto l’una rispetto all’altra, e si incrociano a 180° in corrispondenza della sequenza di terminazione. Ciascun eucariote è organizzato in molteplici unità di replicazione dette repliconi, che comprendono 50-80 origini, spaziate da 30.000-300.000 nt. Negli eucarioti, al contrario dei procarioti, si è visto che l’organizzazione lineare del genoma comporta che, durante la fase S, vengano accese più origini di replicazione, ciascuna caratterizzata da forcelle di replicazione che si muovono in maniera opposta l’una rispetto all’altra. In questo modo, le varie origini si fondono, via via, l’una con l’altra fino a portare alla completa duplicazione dei cromosomi. É per questo necessario identificare sul cromosoma le caratteristiche proprie delle origini. Esiste un consensus, cioè una sequenza di DNA, RNA o proteine tipica delle origini di replicazione ricco di A e di T. ORC - COMPLESSO DI RICONOSCIMENTO DELL’ORIGINE La sequenza consensus ha lo scopo di legarsi in modo specifico all’ORC, ovvero il complesso di riconoscimento delle origini. Questo complesso ATP dipendente, riconosce la sequenza tipica dell’origine di replicazione e si lega al DNA. In questo modo, ORC avvia il processo di replicazione del DNA. Così facendo, esso funge da “bandierina”, quindi da segnale di riconoscimento del sito di inizio della duplicazione e da punto di reclutamento delle altre componenti proteiche necessarie a rendere possibile l’inizio della duplicazione. ORC lega le origini durante tutta la durata del ciclo quindi non è un complesso molecolare che lavora insieme alla macchina replicativa ma è intrinseco all’organizzazione della cromatina che rende possibile l’individuazione delle origini di replicazione durante tutta la durata del ciclo cellulare. Si è compreso che queste sequenze ripetute servono per il legame di questo complesso proteico, per segnalare alla macchina enzimatica che lavora sul nucleo da dove deve cominciare la duplicazione del genoma. Il complesso proteico ORC è composto da 6 subunità distinte. In tutte le specie, ORC svolge un ruolo di riconoscimento dell’origine, senza però svolgere attività enzimatica, caratteristica piuttosto unica tra le proteine prodotte dalla cellula. Anche ORC ha conformazione a ciambella. Una cellula eucariote, dopo aver duplicato il proprio genoma, e aver verificato l’accuratezza di questa duplicazione, entra nella fase G2. Durante questa fase viene eseguita la trascrizione degli mRNA, mantenendo comunque visibile il sito di inizio della duplicazione MAPPATURA DELLE ORIGINI DI REPLICAZIONE Il numero delle origini di replicazione risulta essere solamente stimato (da 20.000 a 50.000), in quanto la mappatura delle origini di replicazione, soprattutto in homo sapiens è stata minima nel corso degli anni. Le origini di replicazione non sono state mappate perché non vengono accese contemporaneamente nel genoma, la loro accensione infatti varia durante le diverse fasi in cui la cellula si trova (inizio S, centrale S, e fine S) ed è legata alla posizione che i nucleosomi assumono sulla cromatina. INFLUENZA DEI NUCLEOSOMI SULLE ORIGINI DI REPLICAZIONE I nucleosomi sono in grado, non soltanto di influenzare la produzione in quantità e in qualità degli mRNA, ma la loro posizione è in grado di influenzare il tipo e l’identità delle origini di replicazione accese in un preciso momento. Ciò avviene perché ORC non si occupa tanto della sequenza di riconoscimento sul DNA dell’origine come avviene nel lievito, al contrario, lega il DNA in punti precisi in corrispondenza dei quali i nucleosomi sono più diradati, in cui la cromatina è meno impacchettata e in punti in cui solo alcune isoforme degli istoni sono incluse nel nucleosoma. Questa è una finezza di regolazione tipica solo dell’apice della scala evolutiva. Quindi, ORC nei lieviti e nei procarioti, per riconoscere un’origine di replicazione legge sul DNA un consensus, si ferma e la lega. L’evoluzione ha fatto sì che la duplicazione negli eucarioti superiori sia molto più complicata. In quest’ultimi non è la sequenza nucleotidica ad essere l’elemento che va a influenzare il punto in cui la DNA polimerasi va a generare la bolla di duplicazione, bensì è l’intorno nucleosomico e la struttura tridimensionale della cromatina. Nel 2020 uno studio ha evidenziato che i nucleosomi legati da ORC, vanno, in maniera preferenziale, ad incorporare alcune varianti degli istoni piuttosto che altre. Pertanto, ciascun nucleosoma ha una propria identità molecolare, la quale prende parte nel decidere da quale punto del genoma deve avere inizio la replicazione. In inglese firing è il termine tecnico che si usa per indicare la denaturazione del DNA e l’accensione della macchina replicativa in corrispondenza di un’origine di replicazione. FASE G1 E FORMAZIONE DEL COMPLESSO DI PRE-REPLICAZIONE Nel ciclo cellulare, le singole fasi non hanno una vita a sé, ma sono coordinate fra loro in modo da rendere lineare l’esistenza della cellula e il passaggio da una fase alla successiva. La fase S (duplicazione genoma) è preceduta da una lenta preparazione molecolare che culmina con l’attivazione della DNA polimerasi. La vera e propria macchina replicativa prende forma in tarda fase G1, quando tutto il macchinario cellulare di organelli viene duplicato, ad eccezione dei cromosomi, in vista della formazione di due cellule figlie. Durante questa precisa fase si ha la formazione del Pre-Replication Complex. Con questo termine si indica l’insieme delle reazioni che portano al riconoscimento delle origini di replicazione e al sistemarsi sull’origine delle proteine che innescano la reazione. Il complesso ORC viene poi legato da due proteine: cdt1 e cdc6, due molecole che fungono da attrattori nei confronti delle due elicasi, le quali con la loro conformazione a margherita si legano, una per forca replicativa, e denaturano il DNA una volta iniziata la reazione. La DNA elicasi nelle cellule eucariotiche ha l’acronimo di MCM2-7. Pertanto, alla fine della fase G1 l’origine ha una conformazione con una regione relativamente libera da nucleosomi, è legata da ORC, dalle due proteine chiave, e infine lega l’elicasi. Ovviamente anche l’elicasi, che deve legare stabilmente il DNA, ripropone la conformazione ad anello con le 6 subunità che avvolgono il filamento singolo, in modo tale da denaturare la doppia elica. IL RUOLO DELLE CICLINE E DELLE CHINASI La cellula deve evitare che il DNA venga replicato n+1 volte nello stesso ciclo, al fine di evitare una poliploidia o una perdita di identità di specie. Questo monitoraggio è reso possibile grazie alle cicline, proteine che guidano biochimicamente la cellula nelle diverse fasi. Le cicline sono molecole segnale che comunicano il completamento di ogni fase del ciclo cellulare e la possibilità di proseguire alla fase successiva. Vengono attivate chimicamente da chinasi, enzimi che le fosforilano attivandone la funzione. Nella maggior parte dei casi ogni ciclina ha la propria chinasi. Viene usata la fosforilazione poiché essa è una reazione completamente reversibile e viene spesso usata dalle cellule come interruttore ON/OFF nelle diverse reazioni. È la ciclina A fosforilata dalla chinasi 2 all’inizio della fase S, a guidare questo processo. La ciclina A è espressa solo in questa fase e la sua sintesi aumenta insieme a quella degli istoni all’inizio della fase S. Di conseguenza, collegare l’accensione delle origini di replicazione all’espressione della ciclina, costituisce una strategia molecolare significativa. Non si può correre il rischio di attivare la duplicazione durante le fasi G2 o M, poiché manca l’apparato enzimatico necessario per assemblare le proteine che riconoscono l’origine di replicazione. RUOLO DELLE CHINASI NEL COMPLESSO DI PRE-REPLICAZIONE Di pari passo vengono sintetizzate cdt1 e cdc6, le due subunità proteiche che si legano all’ORC nel complesso di pre-replicazione. La fosforilazione di cdc1 e cdt6 porta alla loro degradazione. Quando la cellula entra nella fase S, il complesso viene rinominato complesso di pre-inizio. A questo punto cdt1 e cdt6 scompaiono dalla bolla di replicazione e vengono sostituiti da tutte le subunità proteiche incontrate in precedenza: L’elicasi che inizia a creare la bolla di replicazione e allarga la zona denaturata in modo da poter ospitare la pinza Le primasi e tutto l’insieme già descritto La pinza, che tiene adesa al DNA la polimerasi Le polimerasi che lavorano sul filamento ritardato LA PROTEINA GEMININ Per evitare errori esiste un’ulteriore meccanismo di sicurezza ed è basato sull’espressione di un’altra proteina chiamata GEMININ, attiva in fasi precise del ciclo. Questo controllo impedisce che residui di cdt1 si leghino in maniera casuale ad ORC e portino all’aberrante accensione delle origini di replicazione. Le proteine fondamentali per l’ingresso nella fase S sono cdt1 e cdc6. Queste due proteine vengono fosforilate e degradate; tuttavia, nel contesto biologico non esistono stati completamente attivi o inattivi. Infatti il meccanismo che porta alla degradazione di bersagli precisi non é mai al 100% efficace, così come non lo è l’attivazione di una reazione. Nella maggior parte dei casi le reazioni biologiche si trovano in un equilibrio dinamico, che può essere spostato in una direzione, piuttosto che in un’altra. In un sistema cellulare in cui si ha ORC sempre legato alle origini, nonostante l’entrata in S sia regolata dalle fosforilazioni, cdt1 e cdc6 possono essere espresse a livello basale e quindi la cellula può correre il rischio che queste due molecole leghino ORC in fasi non lecite del ciclo cellulare. STRATEGIA DI CONTROLLO DEI LIVELLI CDT1 E CDT6 La strategia è quindi quella di abbassare al massimo i livelli di cdc6 e cdt1, in modo che anche se le due proteine venissero trascritte e tradotte in altre fasi, esse non avrebbero accessibilità al DNA. Questo è proprio ciò che accade con cdt1, e data la collaborazione delle due proteine, essendo cdt1 e cdc6 l’una necessaria al funzionamento dell’altra, è sufficiente eliminarne una sola. È cdt1, soprattutto in fase G2, ad essere legata a GEMININ, la quale è una proteina senza ruolo enzimatico, il cui compito è quello di fungere da spugna molecolare, e quindi di tenere lontano dal DNA la proteina cdt1. Grazie a tale processo, quando la cellula passa in fase M, avviene la degradazione di GEMININ, e quindi le molecole di cdt1 di vecchia e di nuova sintesi sono pronte a prendere contatto con il complesso di pre-replicazione. IL PROBLEMA DELLA FINE DELLA REPLICAZIONE E LA TELOMERASI Il problema legato alla necessità di duplicare solo durante le 8 ore della fase S è quindi risolto. Esiste però un altro problema che risiede nella struttura lineare del genoma. In un cromosoma lineare, infatti, il primer di RNA, che dovrebbe essere degradato e sostituito da un inserto di DNA, non può essere sostituito dall’inserto perché manca lo spazio per permettere agli enzimi deputati al riempimento del gap di alloggiare. Questo causa il progressivo accorciamento dei cromosomi ad ogni ciclo replicativo infatti si perdono dai 50 ai 200 nucleotidi ad ogni divisione. Il problema viene risolto dalla presenza dei telomeri, ovvero sequenze ripetitive di DNA codificate dall’enzima telomerasi che si trovano alle estremità di ogni cromosoma. La telomerasi è una ribonucleoproteina: essa è costituita da una parte proteica e uno scheletro a RNA. Altri esempi di ribonucleoproteina sono il ribosoma e le proteine dello splicing. La telomerasi ha anche una particolare attività catalitica perché è una trascrittasi inversa, è quindi in grado di sintetizzare un filamento a DNA a partire dallo stampo a RNA contenuto al suo interno. La telomerasi riconosce l’estremità 3’ ossidrile libera del filamento principale in corrispondenza di un intorno nucleotidico ricco di guanosine; è importante la presenza delle numerose guanosine perchè permettono alla telomerasi di riconoscere che quella è la zona terminale di un cromosoma. Questo “meccanismo di riconoscimento” impedisce alla telomerasi di legarsi ad esempio, ad un cromosoma rotto o a qualsiasi altra struttura che abbia un’estremità 3’ OH libera. A questo punto la telomerasi inizia la sua attività catalitica agendo da trascrittasi inversa, usando la molecola di RNA come stampo per allungare il filamento principale. Procede poi aggiungendo nucleotidi a gruppi di 6 e creando una lunga sequenza che è uguale per tutti gli eucarioti (TTAGGG) che non codifica per alcuna proteina. L’attività della telomerasi è svolta durante la vita embrionale, quando essa aggiunge i telomeri a tutte le nostre cellule. Nella vita adulta la telomerasi generalmente non è attiva, lo è solo nelle cellule staminali, come quelle del midollo osseo, nelle cellule germinali e in quelle tumorali. Le cellule prive di attività telomerasica vanno incontro all’accorciamento progressivo dei telomeri fino a quando entrano in uno stato di senescenza: fase della vita di una cellula durante la quale sono preservate tutte le attività metaboliche ad eccezione della divisione cellulare. Per preservare i telomeri, vengono compattati da alcune proteine in strutture tridimensionali per evitare l’aggressione da parte di enzimi degradativi. I telomeri costituiscono l’orologio biologico FUNZIONAMENTO DELL'RNA POLIMERASI Le RNA polimerasi eucariote sono di tre tipi: RNA polimerasi I, RNA polimerasi II e RNA polimerasi III. In particolare, la RNA polimerasi II è incaricata di trascrivere gli mRNA e la maggior parte degli RNA regolatori. Il processo di trascrizione è svolto da diverse componenti enzimatiche in cui l'RNA polimerasi svolge una funzione semplice; tuttavia, tale funzione è integrata dal ruolo svolto da tutte le diverse componenti che prendono accesso alle regioni più o meno prossimali, rispetto alla polimerasi, sul DNA. Ogni cellula è caratterizzata dal corredo proteico che esprime, dunque la cellula trascrive solo alcuni geni funzionali al suo ruolo. In maniera unica nelle cellule degli eucarioti la regolazione degli mRNA trascritti avviene anche a livello citoplasmatico. Le polimerasi eucariotiche hanno due caratteristiche che sono fondamentali per il loro funzionamento: 1. La RNA polimerasi II svolge la propria azione sulla cromatina (non sul DNA disteso), quindi deve far fronte al compattamento e al superavvolgimento del DNA, risolvendo l'inaccessibilità della sequenza delle basi azotate lungo i cromosomi. 2. La RNA polimerasi II degli eucarioti richiede un set di proteine aggiuntive chiamate fattori generali della trascrizione FATTORI GENERALI DELLA TRASCRIZIONE I fattori generali della trascrizione sono proteine definite generali perché funzionano su tutti i promotori eucariotici riconosciuti dalla polimerasi II. Senza questo corredo di proteine la RNA polimerasi II non è in grado di riconoscere alcun promotore. La RNA polimerasi II è un oloenzima: necessita di un set di proteine accessorie che sono funzionali solo a lei. Questo tipo di enzima deve prendere contatto con il DNA in corrispondenza dei promotori, cioè regioni situate a monte rispetto al sito d'inizio della trascrizione che mostrano delle “consensus”, sequenze conservate nelle diverse specie in grado di essere riconosciute in maniera univoca dalla macchina trascrizionale. Nel lievito è presente la TATA box (sequenza di A e T) pronta alla creazione della bolla di trascrizione. È una sequenza posizionata a circa un centinaio di nucleotidi a monte che viene riconosciuta da fattori specifici in grado di validare la sequenza del promotore e di autorizzare l'inizio. PROMOTORI NEGLI EUCARIOTI Negli eucarioti superiori il promotore è più complesso: c'è una TATA box e un altro elemento di riconoscimento a monte, ma ci sono più segmenti in grado di essere riconosciuti in maniera precisa da un fattore generale della trascrizione ben definito. Lo spazio e l'estensione del promotore sono estremamente ampi, arrivando a coprire fino a 10.000 nucleotidi a monte del sito d'inizio di trascrizione. Infatti, si riconosce un promotore minimo a ridosso del sito d'inizio della trascrizione e immediatamente nelle regioni a valle; questo intorno nucleotidico comprende la TATA box e le sequenze prossime al sito d'inizio, che vengono riconosciute dall’RNA polimerasi e dai fattori generali della trascrizione. Poco più a monte sono presenti degli elementi di controllo detti “prossimali”, perché prossime al sito d'inizio, quindi sequenze sul DNA che vengono riconosciute in modo specifico da proteine che collaborano al processo di trascrizione. Infine, sono presenti gli elementi di controllo distali, sequenze lontane anche decine di migliaia di nucleotidi rispetto al sito d'inizio della trascrizione, che legano delle proteine specifiche e influenzano l'attività della RNA polimerasi. Quindi il promotore minimo viene legato dall'RNA polimerasi e dai fattori generali; gli elementi di controllo prossimali sono legati da un insieme di proteine note come fattori di trascrizione che sono o espresse in tutte le cellule (ubiquitari), poiché necessarie al funzionamento dell'enzima, o espresse in modo tessuto-specifico, in grado di andare a modulare la trascrizione di un solo tipo cellulare. Gli elementi di controllo distali si dividono in due grandi famiglie: sequenze enhancers: rafforzano l'attività della polimerasi sequenze silencers: svolgono un'attività inibitoria nei confronti della polimerasi Queste sequenze, quindi, sono legate da attivatori o repressori trascrizionali che lavorano in remoto sull'attività della polimerasi. A ridosso del sito d’inizio la polimerasi, in quanto oloenzima, prende contatto, in multipli punti del DNA, con il promotore prossimale. I fattori di trascrizione aiutano l'accensione e danno tessuto specificità ai geni che vengono trascritti e poi, in maniera remota, altre proteine fungono da attivatori o da repressori nei confronti della polimerasi permettendo un ulteriore livello di modulazione dell'efficienza catalitica dell’enzima. Per iniziare la trascrizione molecole distanti comunicano con la polimerasi grazie alla plasticità della conformazione tridimensionale del DNA tale per cui il filamento di DNA, in corrispondenza dei promotori, si piega così da rendere spazialmente vicine regioni linearmente molto distanti. Quindi gli elementi di controllo distali legati dagli attivatori, dai repressori e dai modulatori riescono direttamente a comunicare all'RNA polimerasi II i segnali di trascrizione di un dato gene. Il contatto non è diretto ma c'è un mediatore, ovvero un complesso proteico che intercede tra gli elementi di controllo distali e la RNA polimerasi. Questa molecola ha una forma a cupola in grado di abbracciare il cuore della polimerasi II, riesce a prendere contatto con i fattori generali chiave necessari all'accensione dell'enzima e nella porzione superiore prende contatto con le proteine che legano gli elementi di regolazione distali facendo una sommatoria di impulsi negativi e positivi, trasmettendo il segnale alla polimerasi. Questa architettura molecolare è presente su ogni singolo promotore. TESSUTO SPECIFICITÀ Tutte le proteine citate precedentemente sono ubiquitarie (cioè si trovano in tutte o nella maggior parte delle cellule) e prendono contatto con regioni specifiche del DNA. Tuttavia le cellule richiedono che solo alcuni mRNA vengano tradotti per formare proteine conformi alla specificità delle cellule in questione. I fattori di trascrizione tessuto-specifici, ad esempio, sono espressi solo e soltanto nelle cellule beta del pancreas e quindi solo lì riconoscono i propri consensus, si legano al promotore e guidano la RNA polimerasi alla trascrizione del gene dell'insulina. Di fatto la tessuto-specificità è data dall'espressione in un particolare contesto cellulare del fattore di trascrizione tessuto-specifico che guiderà l'RNA polimerasi a trascrivere il gene d'interesse in quel determinato tessuto. I PROMOTORI PRIVI DI TATA BOX Leggendo la sequenza del genoma, ci si trova spesso di fronte a promotori di geni privi degli elementi superiormente accennati e del TATA box che, dal lievito all'homo sapiens, è l'unico elemento la cui presenza è fondamentale, anche nei procarioti. Eppure, una porzione rilevante dei promotori nei nostri geni ne sono privi (TATAless promoters). Questi promotori sono quelli che vanno a regolare l'espressione dei geni house-keeping (geni espressi in ogni tipo cellulare, ad esempio actina, proteine strutturali, tubulina, proteine ribosomiali). Al posto della TATA box, i TATAless promoters hanno delle sequenze ricche di citosina e una guanosina che si ripetono per centinaia di volte lungo tutto il promotore sia prossimale sia nel core-promoter. Queste sequenze sono state definite CpG islands (CpG=citosina-fosfato-guanosina) perché guardando la cromatina appaiono come “isolotti” lungo il corso del DNA. La chiave della loro trascrizione è legata ad un unico fattore di trascrizione ubiquitario che le riconosce tutte. Questa strategia è funzionale alla necessità di tenere alti i livelli di espressione di questi geni perché un unico fattore di trascrizione in multiple copie riconosce la consensus ed è in grado di attivare così la polimerasi. MECCANISMO DI TRASCRIZIONE La RNA polimerasi II degli eucarioti è simile a quella batterica ma differisce perché: deve operare su DNA organizzato in cromatina presenta una coda COOH-terminale con una importante funzione necessita di fattori generali di trascrizione Siamo quindi in presenza di un oloenzima che per funzionare deve prendere contatto con dei promotori e le proteine a loro collegate. Il meccanismo di trascrizione presenta: 1. Un “core” o promotore minimo eucariotico formato dalla TATA box (a circa -25 bp) e da una sequenza iniziatore, a cui si legano l'RNA polimerasi II e i fattori generali di trascrizione. Esistono promotori privi di TATA box (TATAless) che sono quelli che regolano l’espressione dei geni housekeeping. Queste regioni sono chiamate CpG islands e sono legate a un unico fattore di trascrizione ubiquitario SP1, non sono mai metilate. 2. Elementi prossimali (-50/-100 bp) come la CCAAT-box o la GC-box a cui si legano fattori di trascrizione ubiquitari o tessuto specifici. La tessuto specificità quindi non dipende dalle sequenze presenti nel DNA ma dalla regolazione della trascrizione. 3. Elementi distali detti enhancers e silencers (fino a -10 kb) a seconda che svolgano funzioni attivatorie o inibitorie sull’espressione genica. La serie di proteine che lega il promotore viene chiamato “complesso di pre-inizio”, il quale è bloccato se non in presenza di attivatori. Tutte le proteine che legano elementi prossimali, distali e minimi sono in contatto tra di loro grazie a un enorme complesso proteico chiamato mediatore (circa 20 subunità) che sfrutta l’avvolgimento del DNA per mettere in contatto tra loro zone anche distanti migliaia di basi. IL MEDIATORE è un complesso proteico di circa 20 subunità che ha una forma a cupola in grado di abbracciare il cuore della polimerasi II e prendere contatto con i fattori generali necessari all’accensione dell’enzima e nella porzione superiore prende contatto con le proteine che legano gli elementi di regolazione distale. Il mediatore quando prende contatto con la porzione prossimale dei promotori, interagisce con la coda della polimerasi ed è il mediatore ad accendere l’attività chinasica di TFIID. Le conseguenze sono che il mediatore deve raccogliere tutti gli impulsi che arrivano dalle regioni distali e quindi stimola l’attività catalitica di TFIID solo se il messaggio è pro-trascrizionale. Se al contrario la trascrizione del gene deve essere inibita è il mediatore a impedire la fosforilazione della coda carbossiterminale della polimerasi stessa. Quando la RNA polimerasi parte e procede con la trascrizione il mediatore si stacca e viene riutilizzato o sullo stesso promotore o su un promotore diverso così come succede per tutti i fattori di trascrizione e i fattori generali della trascrizione che avevano occupato il promotore ad eccezione di TFIID che rimane legato al promotore in maniera tale da segnalare alla polimerasi che deve fare n+1 cicli per produrre una quantità rilevante di RNA messaggero, far guadagnare tempo all’RNA polimerasi e passare alle fasi successive e al riconoscimento della tata box. ACCENSIONE Nel momento in cui la trascrizione deve accendersi sul promotore, il fattore generale della trascrizione D (TFIID), si avvicina al promotore e una sua subunità, ovvero la TATA-binding protein (TBP) riconosce la TATA-box. A questo punto il TFIID rinsalda il legame a ridosso del sito di inizio della trascrizione sia a monte che a valle. Questo è un momento cruciale perché il legame della TBP alla TATA-box determina un alterazione della conformazione tridimensionale della cromatina a ridosso del promotore. Questo cambiamento funge da catalizzatore delle reazioni che seguono. Il legame della TATA-Binding protein con TFIID è rinforzato da altri 2 fattori generali e quindi una volta che questo piccolo nucleo è saldamente assemblato a ridosso del promotore viene richiamata la RNA pol II che grazie all’altissima affinità per i fattori generali che hanno già preso posizione abbraccia la doppia elica e prende posizione senza tuttavia essere attivata. Questo perché RNA polimerasi II non è in grado di denaturare la doppia elica da sola. Ha bisogno del fattore generale del TFIIH (H sta per elicasi), un insieme di subunità proteiche che hanno funzioni enzimatiche diverse le une dalle altre. Ha 2 funzioni: - Metà della proteina (XBP) svolge funzione elicasica (è in grado usando l’energia dell’ATP, di denaturare la doppia elica di DNA, creando la bolla di trascrizione) - L’altra metà della proteina (CDK7) è deputata a svolgere attività enzimatica chinasica (enzima in grado di fosforilare precisi residui di serina o di treonina) Se leggiamo la sequenza amminoacidica che caratterizza la regione carbossi terminale dell’RNA polimerasi II (solo quella eucariotica), si trova una serie di amminoacidi ripetuti sempre uguali: YSPTSPS. Tra questi amminoacidi c’è la prolina, che determina in una sequenza primaria di amminoacidi dei cambi di direzione andando a influenzare la conformazione del filamento che lo contiene. Tutti gli altri 5 amminoacidi possono essere fosforilati. Questi 7 amminoacidi identificati sulla carbossiterminale della polimerasi ll sono ripetuti 52 volte. La fosforilazione della coda carbossiterminale della RNA polimerasi II determina il cosidetto “firing” ovvero l’accensione della piena attività catalitica dell’enzima, il quale lascia il promotore e inizia a sintetizzare RNA messaggero. RNA FACTORY L’mRNA eucariotico viene trascritto come mRNA primario che deve subire capping, poliadenilazione e splicing, queste modificazioni non vengono svolte in fase successiva all’azione dell’RNA polimerasi, ma in contemporanea. Le macchine enzimatiche deputate a svolgere le modificazioni post trascrizionali sull’RNA messaggero, non girano a caso nel nucleo delle cellule, bensì gli enzimi deputati a capping, poliadenilazione e splicing, hanno affinità enorme per la coda della RNA polimerasi a tal punto che rimangono legati durante l’intera sintesi di RNA messaggero, in maniera tale da creare un mRNA maturo. MECCANISMO DI FOSFORILAZIONE L’RNA polimerasi ha riconosciuto la tata box e i fattori visti prima ed è pronta a interagire con TFIIH. l’interazione tra TFIIH e l’RNA polimerasi scatena l’attività elicasica del TFllH tale per cui l’RNA polimerasi può entrare nella bolla di trascrizione e prendere contatto diretto con la sequenza delle basi azotate presenti sul proprio templato. Il fatto che incominci la propria attività catalitica fa scatenare l’attività chinasica di TFllH. La chinasi fosforila in modo sequenziale precisi residui presenti sulla coda carbossiterminale della RNA polimerasi dando il via alla sintesi della molecola di mRNA. Dapprima viene fosforilata la serina in posizione 5’. Questo tipo di fosforilazione costituisce un interruttore per far si che RNA polimerasi abbandoni il promotore e inizi a sintetizzare una molecola di RNA vera e propria. La fosforilazione della serina fa sbalzare via dalla coda della polimerasi gli enzimi deputati al capping. Successivamente viene fosforilata la serina 7 che fa sbalzare la macchina dello splicing dalla coda della RNA polimerasi sull’RNA primario che è in fase di trascrizione. La macchina dello splicing comincia così a effettuare splicing sull’mRNA che è appena stato trascritto e che è già dotato di capping. Ultimo residuo fosforilato è la serina 2 che non viene fosforilato da TFllH, perché l’RNA polimerasi è oramai lontana dal promotore, ma da una subunità del fattore di elongazione che garantisce durante il processo di trascrizione che l’RNA polimerasi arrivi fino al punto terminale del gene. Quest’ultimo evento di fosforilazione ad opera del fattore di elongazione attiva la macchina enzimatica deputata alla poliadenilazione dell’mRNA che è stato trascritto dando quindi luogo alla terminazione della trascrizione. Sono stati mappati i residui di serina che scatenano gli eventi del ciclo di trascrizione. Questi eventi si ripetono per 52 volte a fosforilazione. Perciò il brusco cambio di carica che si ha per ogni singola fosforilazione è tanto da far staccare gli enzimi che normalmente sono adesi all’estremità carbossiterminale della polimerasi e farli aderire all’RNA messaggero in fase di sintesi. TERMINAZIONE L’RNA messaggero che è stato trascritto viene liberato dal complesso polimerasico. Nel frattempo, tutti i fattori che avevano legato il promotore lo hanno abbandonano tranne TFIID e quindi l’RNA polimerasi torna disponibile per eseguire un altro ciclo. Possiamo associare a modificazioni chimiche su precisi residui della polimerasi momenti precisi della sintesi di RNA messaggero. Capping, splicing e poliadenilazione sono delle modificazioni cotrascrizionali, non post-trascrizionali. CAPPING Il capping è una modificazione che l’mRNA subisce in seguito alla fosforilazione di un preciso residuo di serina sulla RNA Pol II ed è molto importante perché viene conservato dai procarioti fino agli eucarioti mantenendo questo tipo di modificazione, soprattutto per queste due funzioni 1. Un mRNA senza CAP non esce dal nucleo o esce in maniera poco efficiente 2. Se non inizia il capping dell’mRNA tutte le modificazioni che seguono, in seguito alla fosforilazione dei residui di serina, sono gravemente impedite Quindi la polimerasi, in caso di mancato funzionamento della successione delle diverse modifiche, abbandona il gene e l’mRNA in corso di trascrizione viene degradato. La RNA polimerasi non ha un meccanismo di proof-reading (a differenza della DNA polimerasi) e non ha alcun sistema di correzione, dunque se c’è un errore l’RNA polimerasi lascia lo stampo e ricomincia. L’mRNA errato viene degradato e utilizzato come fonte di nucleotidi per la sintesi di nuove molecole. Senza CAP l’mRNA non passa attraverso il poro nucleare, una delle sue subunità è in grado di riconoscere il CAP al 5’ dell’mRNA, di legarlo e permettere il transito dell’mRNA correttamente dotato di CAP attraverso il poro. POLIADENILAZIONE è un processo a sé, non dipende dall'attività catalitica dell’RNA polimerasi. Quando la polimerasi riconosce una sequenza consensus all’estremità 3’ del gene che è in corso di trascrizione, questa sequenza viene legata da un fattore specifico che taglia l’mRNA in corso di trascrizione, liberandolo. A questo punto rimanendo adeso al proprio templato l’mRNA libero viene riconosciuto da una poli-A polimerasi che incomincia ad attaccare adenine al 3’ OH libero dell’mRNA che è appena stato liberato dal fattore di taglio. La coda di poli-A è costantemente legata da una famiglia di proteine che legano la coda di poli-A, ossia le poli-A binding proteins. Questo elemento sarà fondamentale nel silencing, e nel modo in cui, nella cellula eucariota, l’mRNA possa essere modulato nel processo di trasformazione in una proteina da piccole molecole di RNA non codificante. SPLICING è un meccanismo guidato da ribonucleoproteine che permette un efficiente eliminazione degli introni, con conseguente formazione di mRNA maturo. In seguito allo splicing abbiamo l’unione di due esoni. Se lo splicing viene effettuato correttamente le giunzioni esone-esone vengono legate da una classe di proteine che controlla che il processo dell’mRNA sia avvenuto correttamente. Queste sono le proteine di legame delle giunzioni esone-esone (proteine EJC). Queste proteine lungo tutta la sequenza dell’mRNA in corrispondenza delle giunzioni esone-esone si depositano con lo scopo di esportare l’mRNA. Quando l’mRNA passa attraverso il poro e viene destinato al citoplasma, le proteine EJC vengono riconosciute dalle proteine del poro e solo se lo splicing è avvenuto correttamente l’mRNA passa il citoplasma. Queste proteine segnalano alla membrana nucleare e al meccanismo che filtra ciò che passa attraverso il poro, che l’mRNA abbia subito correttamente tutte le sue modificazioni post trascrizionali, quindi che sia una molecola matura pronta per passare al ribosoma. EPIGENETICA L’epigenetica è ciò che caratterizza gli organismi eucarioti evoluti, intesi come individui complessi. Si occupa dell’insieme delle modificazioni che sono ereditabili da una generazione di individui alla successiva che però non è determinata da una modificazione della sequenza di DNA ma che tuttavia altera in maniera significativa il comportamento biochimico e molecolare di organi e tessuti all'interno dell’individuo. Esempi: - l’importanza dei comportamenti che una mamma ha durante la gestazione, i quali sono in grado di influenzare la salute, il comportamento e il metabolismo del bambino - le caratteristiche del microbiota che ciascuno ha come patrimonio individuale. A seconda di ciò che si mangia, la flora batterica che ospitiamo all’interno delle viscere cambia e porta ad alterazioni grossolane del metabolismo globale del nostro organismo. - gli effetti dannosi di fumo e alcool sulla fertilità soprattutto del genere maschile L’ambiente esterno va a modificare l’espressione genica attraverso specifiche sequenze biochimiche. Gli studi di epigenetica sono cominciati circa 25-30 anni fa dall’analisi del profilo trascrizionale dei gemelli omozigoti. I gemelli omozigoti hanno lo stesso DNA in tutte le cellule, finchè condividono lo stesso stile di vita hanno un profilo di attivazione di quella che è l’attività trascrizionale della RNA polimerasi identico. Quindi non soltanto avevano lo stesso DNA, ma producevano circa gli stessi mRNA. Quando le attività di vita cambiano cambia anche l’attività trascrizionale dell’RNA polimerasi. La spiegazione sta sulla struttura della cromatina: la struttura quaternaria del DNA intorno ai nucleosomi è una struttura dinamica, sentendo le esigenze trascrizionali di una cellula in un preciso momento si spostano permettendo l’accessibilità di varie zone della cromatina ai diversi enzimi. La scelta da parte della polimerasi di quali geni andare a trascrivere è guidata da diverse modificazioni chimiche che sono presenti sugli istoni e guidano la minore o maggiore accessibilità del DNA alla macchina trascrizionale. La seconda classe di modificazioni è direttamente a carico delle basi presenti all’interno della sequenza del genoma, sono legate al destino che ciascuna cellula assume durante la vita embrionale all’interno di un organismo. CODICE ISTONICO l’ottamero istonico ha una struttura tale per cui l’estremità N-terminale di ciascuno degli istoni protrude dal nucleosoma e sono libere di essere a contatto con le diverse proteine presenti all’interno del nucleo. Su ciascuna coda ammino terminale degli istoni la sequenza di amminoacidi ha residui di lisina, tirosina, serina che se analizzati si è visto che possono subire sempre le stesse modificazioni: fosforilazione, ubiquitinazione, metilazione, acetilazione. Ciascuna estremità va a modificare chimicamente sempre e soltanto gli stessi residui, a volte lo stesso residuo può subire diverse modificazioni. Queste modificazioni poste su precisi residui non avvengono a caso ma sono una sorta di codice chimico che viene letto da una macchina dedicata e in seguito alla lettura di questa combinazione di modifiche chimiche, l’RNA polimerasi si comporta in un certo modo. A seconda della combinazione delle modifiche chimiche presenti sui residui nelle estremità ammino-terminali degli istoni, la trascrizione avviene in maniera più o meno efficiente e questo va a determinare quantità e qualità dei geni che l’RNA polimerasi trascrive. Queste modifiche vanno a influenzare il compattamento della cromatina. Ci sono tre classi di enzimi che coordinano le informazioni epigenetiche in un tratto di DNA: acetilasi, metilasi, chinasi. Le reazioni che avvengono sugli amminoacidi chiave sono sempre reversibili writing = proteine scrittrici depongono gruppi funzionali precisi su alcuni amminoacidi erasing = cancellano il codice se le condizioni biochimiche della cellula cambiano reading = complessi che leggono le diverse modificazioni chimiche e influenzano direttamente l’attività dell’RNA polimerasi guidando una risposta trascrizionale specifica Non c’è una regola precisa che correli un certo tipo di modificazioni a carico delle lisine e una risposta trascrizionale. In ogni momento di vita di una cellula l’intorno istonico stabilisce il tipo, la quantità e la qualità degli RNA che vengono gestiti senza che ci sia una regola fissa, ma è l'insieme delle modificazioni che in un preciso momento da un preciso stimolo. Gli enzimi che si fanno carico di queste modificazioni svolgono un'attività reversibile rendendo possibile la modulazione del segnale. Tuttavia, sebbene si possa trovare scritto su alcuni articoli, non è vero che l'acetilazione degli istoni è un meccanismo tipico dell’eucromatina, cioè della cromatina accessibile e quindi facilmente trascrivibile da parte dell’RNA polimerasi. Quest’affermazione risulta scorretta perché è la specifica lisina che, se subisce una modificazione, correla con un certo output trascrizionale. Piuttosto è possibile stabilire solo correlazioni, non una regola fissa e precisa. L’acetilazione può essere inibitoria della trascrizione se fatta, ad esempio, sulla lisina 27 dell’istone H3, e contemporaneamente può essere attivatoria se fatta sulla lisina 4 dell’ istone H3. In poche parole, non è vero che acetilazione correla con eucromatina e attivazione trascrizionale. LE MODIFICHE EPIGENETICHE SUGLI ISTONI Le modificazioni epigenetiche sono ereditabili da una generazione cellulare all’altra, ma non sono codificate nel genoma. Per esemplificare questo aspetto, si consideri il caso dei nucleosomi. I nucleosomi, che hanno istoni con specifiche mutazioni post-traduzionali, al momento del passaggio della forca vengono equamente suddivisi tra i due filamenti neosintetizzati. Tuttavia, così facendo, i due filamenti figli hanno soltanto la metà dei nucleosomi con modificazioni chimiche e il restante 50% dei nucleosomi è di neosintesi. Siccome è fondamentale mantenere l’identità biochimica degli istoni, esistono dei fattori proteici che leggono le modificazioni degli istoni dei nucleosomi parentali, per poi attivare la macchina molecolare deputata a far sì che anche i nucleosomi di neosintesi abbiano le stesse modifiche chimiche (acetilazione, metilazione, fosforilazione e ubiquitinazione). Ciò permette agli RNA trascritti da un certo tipo di cellula di essere trascritti anche nella cellula della generazione successiva, mantenendo lo stesso profilo genetico. Inoltre, è fondamentale tenere a mente che l’attività della polimerasi non è legata solo ai fattori generali, ai fattori di trascrizione, ai silencers, agli enhancers e così via, ma anche all’ambiente istonico in cui la polimerasi lavora. LE MODIFICHE EPIGENETICHE SULLE BASI AZOTATE Guanosina e citosina, subiscono una metilazione come strumento di repressione trascrizionale. L’attività della polimerasi, diversa in base alla cellula, è il cardine della variazione dell’espressione genica. La metilazione diretta del DNA è uno degli strumenti per inibire trascrizionalmente alcune regioni del genoma; questa inibizione trascrizionale viene ereditata di generazione in generazione. Ciò fa sì che un neurone, in caso di divisione, continui ad essere un neurone e un fibroblasto, in caso di divisione, continui a rimanere un fibroblasto. Al momento della duplicazione del genoma, il profilo di metilazione del filamento parentale deve essere necessariamente trasferito sul filamento di neosintesi. Si è visto che le regioni del genoma metilate mostrano una famiglia di proteine (MeCP2) in grado di riconoscere i residui di guanosina e citosina metilati, di avvolgerli in maniera stabile e di renderli inattaccabili da qualsiasi tipo di enzima in grado di alterare il profilo di metilazione. Le proteine MeCP2 sono una sorta di chiusura di sicurezza proteica che nasconde le zone metilate del genoma e le rende inattaccabili. METILTRANSFERASI Le metiltransferasi hanno una struttura relativamente conservata all’interno delle cellule eucariote e appartengono a due grandi famiglie: - metiltransferasi di tipo 1 definite di mantenimento perchè al momento del passaggio della forca replicativa riconoscono le sequenze metilate sul filamento parentale e riportano sul filamento neosintetizzato la metilazione esattamente nella stessa posizione portando quindi i residui di citosina alla forma 5 metilcitosina che viene poi riconosciuta dalle proteine MeCP2 per essere avvolta e blindata - metiltransferasi de novo questi enzimi lavorano in maniera esclusiva durante la vita embrionale e sono le metiltransferasi che guidano lo sviluppo embrionale nelle diverse fasi determinando il destino delle singole cellule all’interno dei tessuti fino a dar forma all’embrione. Entrambe le classi sono fondamentali per la formazione di un embrione: se venisse abolita la metiltransferasi di mantenimento a circa un terzo dello sviluppo di un embrione, vi sarebbe la comparsa di un insieme di cellule completamente aberrante. La stessa cosa, anche se meno grave, avverrebbe eliminando le metiltransferasi de novo. Cpg ISLAND Data l’elevata presenza di guanosine e citosine, le sequenze dei promotori TATA-less, o CpG islands, sarebbero candidate perfette per il processo di metilazione da parte delle metiltransferasi. Ciò, tuttavia, non avviene: si parla, quindi, di “ossimoro biochimico”, in quanto nonostante le CpG islands siano ricche di guanosine e citosine e promotori di geni espressi ad alto livello, avrebbero tutte le caratteristiche chimiche ideali per essere metilate, ma sono proprio le zone che non devono essere metilate. Sui testi si trovano i promotori TATA-less definiti come CpG islands, perché nel panorama di metilazione globale normalmente a carico delle citosine sul genoma degli eucarioti, i siti di legame del fattore di trascrizione Sp1 sono aree precise libere dalla metilazione. Tutte le CpG island sono a monte degli housekeeping genes e non vengono mai metilati, il meccanismo non è ancora noto perché la sequenza tipica delle CpG islands non ha nessuna evidenza per repellere quella che è la replicazione da parte delle metiltransferasi. Quindi, ad oggi, non si conosce il modo in cui questi promotori sfuggano alla metilazione. Vi è un’eccezione alla non metilazione delle CpG islands nel cromosoma X inattivo: in questo caso hanno la possibilità di essere metilate. L’IMPORTANZA DELLA METILAZIONE DEL DNA La metilazione del DNA è la chiave per la repressione trascrizionale; infatti, a essere metilato, nella maggior parte dei casi, è il promotore del gene che deve essere represso. La metilazione del promotore, incappucciata da MeCP2, vieta l’accesso alla polimerasi e a tutti i fattori visti precedentemente al promotore, e quindi rende nulla la trascrizione del gene. Questo meccanismo è fondamentale perché l’essere umano ha molte proteine che subiscono variazioni di espressione durante le varie fasi della vita embrionale e post-natale: proteine espresse durante la vita embrionale devono poi essere cambiate nella vita post-natale. Ciò avviene grazie alla metilazione del promotore delle proteine embrionali, che quindi non vengono più trascritte nella vita post-natale. L’y emoglobina embrionale è trascritta e tradotta nella vita embrionale perché ha affinità maggiore per l’ossigeno e, quindi, ottimizza la respirazione nell’embrione che deve trarre ossigeno dal sangue materno. Quando il mammifero nasce, esso respira, quindi comincia ad essere trascritta e tradotta l’isoforma della globina che ha un'affinità propria per l’ossigeno degli organismi che respirano aria. Quindi al momento della nascita il promotore della γ globina viene metilato. D’altra parte, invece, l’emoglobina β, che prima non c’era perché il suo promotore era metilato, al momento della nascita viene prodotta in quanto il promotore viene demetilato. Si era stabilito che la metilazione del DNA fosse un fenomeno irreversibile e definitivo, tuttavia nel caso dell’emoglobina avviene la demetilazione di geni specifici durante lo sviluppo. DNA demetilazione Esiste la possibilità per la doppia elica di subire demetilazione. Può avvenire in due modi: demetilazione passiva → prevede la mancata metilazione del DNA nei momenti di divisione cellulare. Si ottiene impedendo l’azione della metiltransferasi di mantenimento. Se ad ogni ciclo replicativo la metiltransferasi non funziona il DNA nel corso delle divisione perde completamente il profilo metilato. Partendo da un DNA con entrambi i filamenti metilati, se la metilazione è bloccata, alla prima generazione si avranno due cellule figlie emi-metilate, mentre nella seconda ci sarà il 50% della progenie non metilata. demetilazione attiva → è il modo più semplice, prevede la presenza di un enzima in grado di revertire l’azione delle metiltransferasi ovvero la demetilasi. Sono state identificate nelle cellule dei vertebrati una classe di enzimi chiamate TET-ossigenasi che sono in grado di identificare la metilcitosina e attraverso una serie di reazioni arrivano a formare un prodotto che viene percepito dalla macchina di controllo di duplicazione come una mutazione puntiforme. La formil-citosina (metil-citosina ossigenata) che si forma come prodotto di queste reazioni di ossigenazione viene eliminata come meccanismo di correzione del DNA neosintetizzato. Questo tipo di risultato ha cambiato l’interpretazione di quelle che sono le ondate di trascrizione che avvengono durante lo sviluppo embrionale dei mammiferi. Solo nei mammiferi assistiamo ad uno sviluppo dell'embrione in utero a partire da uno zigote dove ciascun passaggio è regolato da profili di metilazione specifici per ciascuna famiglia di cellule che andranno a formare l’embrione. Nella maggior parte dei casi di trasformazione neoplastica si ha una riattivazione dei meccanismi di specializzazione cellulare che lavorano durante la vita embrionale. ONDATE DI RIPROGRAMMAZIONE DELL’EMBRIONE I gameti al momento della formazione dello zigote devono perdere le proprie caratteristiche fisiche, perché devono smetterla di comportarsi da cellula uovo e spermatozoo per essere riprogrammati a generare un nuovo individuo. Questo avviene tramite la demetilazione del genoma dei gameti sia maschili che femminili che avviene gradualmente nelle fasi successive alla fertilizzazione grazie a due meccanismi diversi: - il gamete maschile subisce demetilazione attiva quindi attraverso le TET - il gamete femminile subisce demetilazione passiva cioè perde gradualmente le caratteristiche epigenetiche del DNA di origine materna in quanto la metilasi di mantenimento viene esclusa dal nucleo delle cellule in divisione nelle primissime fasi di sviluppo embrionale. Il livello più basso di metilazione si ha quando l’embrione raggiunge la struttura di blastocisti che va ad impiantarsi in utero, da questa struttura deriveranno gli annessi embrionali (villi coriali e placenta) e tutti i tessuti dell’embrione. Nella blastocisti, gli unici geni metilati sono quelli di imprinting, i quali rappresentano la memoria storica familiare che ciascun mammifero eredita e mantiene dalla linea materna e paterna. Nella fase successiva la blastocisti si impianta, e deve dare origine ad un nuovo embrione caratterizzato da una struttura cellulare precisa tale per cui tutti i tessuti presenti si organizzano in tre foglietti distinti (ectoderma, mesoderma, endoderma) ciascuno dei quali darà origine a tessuti ed organi specifici. Dal momento dell’impianto a circa metà dello sviluppo embrionale, si assiste ad una massiccia ondata di ri-metilazione de novo del genoma, ad opera di dnmt3a e dnmt3b in modo da definire l’identità di ogni singola cellula nell’embrione in sviluppo. A ⅓ circa dello sviluppo embrionale il destino di ciascuna cellula è stabilito e, con minime variazioni, i singoli campi cellulari vanno incontro a proliferazione e morfogenesi. In questa fase si formano all’interno di quelle che saranno le gonadi delle piccole popolazioni germinali costituite dai progenitori delle cellule germinali. Questo avviene poiché le cellule germinali hanno bisogno di mantenere la capacità di differenziazione maggiore rispetto alle somatiche; in un contesto in cui l’embrione raggiunge la metilazione massima, solo i progenitori delle cellule germinali vanno incontro a demetilazione. Nel resto dello sviluppo embrionale, questi precursori sono privi di metilazione e perdono le caratteristiche epigenetiche dell’embrione. Riacquistano individualità al momento della maturazione. I gameti maschili, prima della nascita, riascquistano completamente il profilo di metilazione proprio dell’individuo. Quelli femminili rimangono demetilati per tutta l’esistenza dell’organismo, la metilazione viene riacquistata solo nell'oocita in ogni ciclo ovulatorio. All’interno delle ovaie ci sono delle cellule che vengono mantenute “pulite” dalle varie ondate di metilazione. CELLULE ß DEL PANCREAS La produzione di insulina è limitata alle cellule beta del pancreas (tessuto-specificità). Durante le ondate di metilazione che avvengono durante lo sviluppo, nelle cellule beta del pancreas non viene metilato il fattore di trascrizione tessuto specifico che va a legare il promotore dell’insulina, mentre in tutte le altre cellule il gene è metilato e quindi silenziato. PECORA DOLLY La pecora Dolly è il primo mammifero clonato della storia. Oggi si trova a Cambridge e nel 1996 fu clonata da Ian Wilmut. Tale scoperta ha sconvolto il mondo scientifico: tuttora si lavora su cellule clonate di pazienti e su clonazione. Yamanaka e John B.Gurdon hanno ricevuto il premio Nobel per la medicina nel 2012, per merito dei loro studi alla base della clonazione. Gurdon ha portato avanti degli studi che sono stati alla base della clonazione: ha esposto il meccanismo di trasferimento nucleare che ha reso possibile la clonazione di Dolly. Ha svelato quali sono le potenzialità dell’oocita che da solo è in grado, col proprio corredo di organelli e enzimi, di guidare lo sviluppo dell’intero embrione. Ha lavorato sugli anfibi e ha dimostrato che un oocita enucleato, quindi privato del nucleo, può dare origine a un nuovo organismo, se viene “fertilizzato” da un nucleo di una cellula differenziata, quindi somatica. Un organismo adulto può avere origine a partire da un oocita enucleato all’interno del quale è iniettato il nucleo di una cellula differenziata. Quindi non è necessario il gamete maschile: al citoplasma del gamete femminile è sufficiente il nucleo di qualunque cellula somatica. Questo è quanto fatto per clonare Dolly. Questo ibrido è stato coltivato in vitro, poi trasferito nell’utero di una madre surrogata. Da qui è nata Dolly con una percentuale di successo pari a 0.4%. SCELTA DELL’ANIMALE DA CLONARE In Inghilterra alla fine del secolo scorso si era pensato di sfruttare il latte degli ovini come veicolo per la somministrazione di farmaci ricombinanti. Questi erano destinati ai bambini nati prematuri: è un latte leggero e digeribile. Si è passati poi alla clonazione del maiale: il trattamento dei pazienti diabetici era a base di insulina prodotta nel maiale. Si sarebbero create delle “fabbriche” di farmaci ricombinati derivati dagli animali. Il maiale è l’unico animale che viene usato per gli xenotrapianti, ovvero un trapianto fatto utilizzando degli organi di altre specie. Un paziente cardiopatico negli Stati Uniti ha subito il trapianto di un cuore di maiale. La clonazione serve anche ad ovviare alla scarsità di organi. Dalla clonazione della pecora Dolly ad oggi, gli animali clonati sono i più vari. Negli Stati Uniti e in estremo oriente la tecnica della clonazione è stata sfruttata da aziende deputate alla clonazione di animali di compagnia in cambio di un notevole profitto economico. Inoltre è stata usata per clonare gli animali in via di estinzione e i cloni sono fertili, un furetto clonato ha generato 2 cuccioli. Uno dei grandi problemi degli animali clonati era legato alla poca fertilità dei cloni, ma adesso le tecniche sono avanzate e la fertilità nei cloni è aumentata. Dolly è morta per 2 motivi principali: 1. Presentava sintomi tipici dell’artrite, malattia generalmente associata alla vecchiaia. Ciò è avvenuto poiché Dolly è stata creata da un oocita enucleato, al cui interno è stato iniettato il nucleo di una cellula somatica di un individuo adulto: l’organismo generato presentava la lunghezza dei telomeri tipica dell'età del donatore, ovvero 6 anni 2. Il nucleo che viene trasferito nella cellula uovo è un nucleo somatico: porta la firma epigenetica tipica delle cellule somatiche. Una cellula somatica non è programmata per dare origine a un embrione, quindi la demetilazione che dovrebbe fare perdere la memoria del tessuto d’origine non avviene POTENZA DELLE CELLULE Man mano che lo zigote va incontro al differenziamento cellulare l’organismo si forma e le cellule assumono un destino ed una identità precisi. Il differenziamento cellulare quindi coincide con una perdita del grado di potenza della cellula. I livelli di potenza sono: Totipotenza può essere osservata nello zigote e coincide con lo stadio di potenza maggiore. Una cellula totipotente è infatti in grado di dare vita ad un intero organismo in maniera indipendente. Le cellule dello zigote da cui originano i gemelli monozigoti sfruttano questa caratteristica. Pluripotenza può essere osservata nella fase della vita embrionale definita blastocisti. Nello stadio di blastocisti le cellule dell’organismo presentano il più basso livello di metilazione: si tratta di un gruppo di cellule indifferenziato in grado di dare origine a tutte le linee cellulari dei tre foglietti embrionali (endoderma, mesoderma, ectoderma) Multipotenza la troviamo nelle cellule staminali adulte presenti, ad esempio, a livello del midollo osseo rosso; queste cellule sono in grado di dare vita ai diversi tipi cellulari che fanno parte di una data linea cellulare (in questo caso la linea sarà quella ematica) Unipotenza tipica delle cellule in grado di proliferare e dare vita ad un solo tipo cellulare STUDI DI YAMANAKA Una cellula completamente differenziata come un fibroblasto o una cellula muscolare scheletrica in seguito al trattamento in vitro con particolari metodi che permettono di iper esprimere precisi fattori di trascrizione è in grado di perdere i propri tratti di cellula differenziata fino a ritornare allo stadio di cellula pluripotente. Le cellule riprogrammate allo stadio di pluripotenza sono definite cellule pluripotenti indotte e sono state identificate per la prima volta nel 2006 a partire da cellule di topo. La ricerca e la sperimentazione hanno poi permesso nel 2007 di creare le prime cellule pluripotenti indotte umane. Il processo di riprogrammazione che consente ad una cellula di tornare ad uno stadio di pluripotenza è chiaro solo in parte: di fatto si sa come fare tornare le cellule allo stato pluripotente, ma non è stato ancora del tutto chiarito come mai l’azione di specifici fattori di trascrizione sia in grado di far perdere la propria identità ad una cellula già differenziata. Si capisce fin da subito la portata rivoluzionaria di questo studio: fino a questo momento si era affermato che il destino delle cellule negli organismi pluricellulari era definito da ondate di metilazioni durante lo sviluppo embrionale. Il processo di metilazione permette infatti di dare origine ad un profilo di metilazione definitivo nel quale ogni cellula presenta un’identità ben specifica e immutabile. Viceversa Yamanaka ha dimostrato come cellule già differenziate possano andare incontro ad una riprogrammazione fino ad uno stadio di pluripotenza tipico dell’embrione in via di sviluppo. MEDICINA MOLECOLARE E TERAPIA PERSONALIZZATA La scoperta di Yamanaka risulta rivoluzionaria da un punto di vista medico: si supponga di avere un paziente con una patologia pancreatica determinata da una mutazione sconosciuta e che quindi non sia noto il suo meccanismo molecolare. Il medico può agire prima prelevando delle cellule del paziente e portandole allo stadio di pluripotenza, poi spingendole al differenziamento pancreatico. In questa maniera, in un periodo di tempo relativamente breve (circa un mese) è in grado di dare origine a delle cellule pancreatiche in vitro che risultano perfettamente sovrapponibili a quelle del paziente in cura. Ciò può essere fatto anche solo partendo da un prelievo ematico. Tutto questo tipo di lavoro presuppone la nascita di un nuovo concetto: il concetto di medicina molecolare. Di fatto si possono usare le cellule di un paziente riportate ad uno stadio di pluripotenza indotta e poi differenziate in un determinato tipo cellulare per osservare i meccanismi molecolari di una patologia o per definire il trattamento farmacologico più efficace per il singolo paziente grazie alla presenza di cellule in vitro. Un futuro sbocco della scoperta di Yamanaka potrebbe essere quello della sua applicazione in ambito della correzione genetica. Si può infatti pensare di correggere in vitro l’errore genetico e reinfondere nel paziente le cellule corrette sperando in una reversione più o meno totale del fenotipo patologico. GLI ORGANOIDI L’organoide è un modello tridimensionale in vitro che ripropone l’architettura dell’organo oggetto di indagine. Risulta importante in quanto può essere osservato il comportamento dell’organo di interesse in diverse situazioni. Si pensi alle cellule cardiache: sull’organoide di queste può essere svolta elettrofisiologia, così come è possibile mimare condizioni patologiche ben precise come l’infarto del miocardio. Grazie agli organoidi è quindi possibile analizzare miglioramenti o peggioramenti della patologia in base a diversi stimoli. REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE Nel 2024, Ambros e Ruvkun vengono insigniti del Nobel per la medicina. Negli anni 80, svolgevano la propria attività post-dottorato nel laboratorio di Horvitz, anch'esso insignito del premio Nobel per aver scoperto i meccanismi di morte cellulare (apoptosi). Horvitz usava come modello un piccolo verme, molto usato nella ricerca preclinica. Il laboratorio si occupava di biologia dello sviluppo ovvero di come da un oocita si originasse un intero embrione. A seconda della posizione topografica in cui la cellula viene analizzata si ha un'espressione differenziale di geni, specifica per ogni tipo cellulare. Ambros e Ruvkun erano interessati a studiare quali e quanti geni guidano il processo che porta dall'oocita fertilizzato alla cellula differenziata. I biologi dello sviluppo che adottano come modello biologico vermi o moscerini della frutta hanno come approccio quello di andare a mutare il DNA dell'organismo in posizioni precise e di verificare l'effetto di queste mutazioni sul fenotipo. I due ricercatori si sono occupati di studiare due ceppi mutanti di vermi, Lin-14 (Ruvkun) e Lin-4 (Ambros),

Biologia Molecolare PDF - Struttura del DNA, Duplicazione, e Junk DNA

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