Replicazione, Trascrizione e Traduzione DNA PDF

Replicazione del DNA Processo semiconservativo: ciascun filamento fa da stampo per la sintesi di un nuovo filamento. Quindi le due molecole di DNA neosintetizzate conterranno un filamento “vecchio” (detto parentale) e uno di nuova sintesi. La replicazione inizia quando un complesso proteico, detto com...

Replicazione del DNA Processo semiconservativo: ciascun filamento fa da stampo per la sintesi di un nuovo filamento. Quindi le due molecole di DNA neosintetizzate conterranno un filamento “vecchio” (detto parentale) e uno di nuova sintesi. La replicazione inizia quando un complesso proteico, detto complesso di replicazione, si lega ad una sequenza specifica di DNA, detta origine di replicazione o regione ori (N.B. sui cromosomi ce ne sono tante e si verifica contemporaneamente la duplicazione di tratti diversi, fin quando non è stato duplicato tutto il DNA). Processo: L’elicasi si lega alla regione ori e rompe i legami tra le basi aprendo l’elica. Si forma così la bolla di replicazione, alle cui estremità, nel punto dove i filamenti di DNA vengono separati, è presente una struttura ad Y detta forcella o forca di replicazione La primasi legge il DNA in prossimità dell’origine di replicazione e catalizza l’aggiunta di nucleotidi in base alla complementarità, sintetizzando in questo modo un piccolo tratto di RNA, chiamato primer o innesco, che definisce il punto di partenza per la DNA polimerasi per iniziare a sintetizzare il nuovo filamento La DNA polimerasi (DNApol), partendo dal primer, legge il filamento stampo e a sua volta catalizza l’aggiunta di nuovi nucleotidi in base alla complementarità (dove legge A lega T e viceversa; dove legge C lega G e viceversa)  La DNApol può aggiungere nucleotidi solo in direzione 5’->3’. Di conseguenza, su uno dei due filamenti stampo (filamento 1 in fig.) la DNApol, muovendosi in direzione 5’->3’, si muoverà nella stessa direzione della forca di replicazione. In questo caso la DNApol aggiunge nucleotidi senza interruzioni, spostandosi con la forca, e la duplicazione avviene in maniera continua. Il filamento neosintetizzato prende anche il nome di filamento veloce. Sull’altro filamento stampo (filamento 2 in fig.), invece, la DNApol non può muoversi nella stessa direzione della forca o lavorerebbe in direzione 3’->5’ (che non è possibile). Quindi, man mano che il DNA viene aperto, la primasi sintetizza un nuovo primer in prossimità della forca e la DNApol copia un tratto il DNA. La replicazione avviene in maniera discontinua e i tratti di DNA sintetizzati prendono il nome di frammenti di Okazaki. Il filamento neosintetizzato risultante (complessivamente) prende il nome di filamento lento. Poichè la replicazione avviene in due direzioni opposte è definita bidirezionale. Quando tutto il DNA è stato replicato i primer vengono eliminati e i frammenti di Okazaki vengono uniti tra loro da un enzima chiamato DNA ligasi. Infine, le due molecole di DNA si separano in due doppie eliche. Video 3D: https://www.youtube.com/watch?v=TNKWgcFPHqw&t=105s Quando i primer vengono rimossi, alla fine della replicazione, alle estremità dei nuovi filamenti di DNA neosintetizzati ci sarà un vuoto. Questo tratto sporgente di DNA a singolo filamento (indicato dalla freccia in figura) viene rimosso da specifici enzimi. Questo comporta, però, che ad ogni duplicazione le estremità del cromosoma si accorcino. Per evitare la perdita di informazioni genetiche, le estremità dei cromosomi presentano quindi lunghi tratti di DNA costituiti da sequenze ripetute, chiamate telomeri (non essendo sequenze codificanti, il fatto che si accorcino non causa problemi). Dopo 20-30 replicazioni, le estremità telomeriche però si consumano e la cellula va in apoptosi (morte cellulare). Le cellule che si dividono per tutta la vita (es. cellule staminali) o le cellule tumorali possiedono un enzima, chiamato telomerasi, che rigenera i telomeri permettendogli di proliferare continuamente. Sistemi di controllo del processo di replicazione La correttezza del processo di replicazione è garantita da due meccanismi: La selezione della basi: la DNApol, prima di aggiungere un nucleotide, controlla se è il nucleotide corretto. Forma, quindi, il legame tra il nucleotidi solo se questi sono appaiati correttamente sul filamento stampo (se il nucleotide non è quello giusto, viene scartato) Attività di proofreading (o correttore di bozze): la DNApol verifica se il nucleotide aggiunto è corretto e, se è sbagliato, lo rimuove inserendo il nucleotide giusto. Nonostante l’elevata efficienza della DNApol possono verificarsi degli errori, come appaiamenti errati di basi (detti anche mal appaiamenti), o può verificarsi che una base venga danneggiata. Entrambi gli eventi causano un’alterazione della sequenza. Un cambiamento nella sequenza di basi del DNA di definisce mutazione. Nel primo caso si tratta di mutazioni spontanee (dette anche casuali), dovute ad errori commessi nella replicazione che sfuggono ai sistemi di controllo della DNApol. Nel secondo caso si tratta di mutazioni indotte, dovute all’esposizione ad agenti mutageni (es. fumo, raggi X, raggi UV ecc). Riparazione degli errori del processo di replicazione Esistono dei meccanismi con cui la cellula cerca di riparare il danno. Uno di questi è il: Mismatch repair system (per riparare danni da mutazioni casuali): o Dopo che il DNA è stato replicato, una serie di proteine, tra cui la DNApol, cerca eventuali mal appaiamenti sfuggiti all’attività di proofreading o Riconosciuto il mal appaiamento, la DNApol deve distinguere il filamento parentale dal filamento neosintetizzato e rimuovere la base mal appaiata sul filamento neosintetizzato. Per farlo utilizza i gruppi metilici (CH3). Il DNA presenta normalmente gruppi metilici su entrambi i filamenti. Subito dopo la replicazione, però, sul filamento neosintetizzato non sono stati ancora aggiunti. La DNApol, quindi, usa l’assenza di questi gruppi per individuare il filamento neosintetizzato o La DNApol taglia il DNA qualche base prima e qualche base dopo la base mal appaiata. o Il tratto di DNA contenente il mal appaiamento viene rimosso e la DNApol riempie il vuoto sintetizzando la parte mancante  o La DNA ligasi salda le due estremità del nuovo frammento di DNA appena sintetizzato con il resto del filamento Trascrizione Attraverso la trascrizione sono prodotte molecole di mRNA a partire da uno dei filamenti di DNA. Il processo è il seguente: L’enzima RNA polimerasi (RNApol) si lega ad una regione sul DNA, chiamata promotore, situata vicino al gene che codifica per la proteina da sintetizzare Il DNA si apre e l’RNApol aggiunge nuovi nucleotidi sulla base della complementarità con il filamento di DNA, in direzione 5’->3’ Quando l’RNApol raggiunge una sequenza sul DNA detta terminatore il processo termina. L’mRNA sintetizzato viene rilasciato, l’RNApol si stacca e il DNA si richiude. Video trascrizione: https://www.youtube.com/watch?v=_Zyb8bpGMR0 Modifiche post-trascrizionali L’mRNA prodotto al termine della trascrizione prende il nome di trascritto primario. Il trascritto primario, affinché possa funzionare, deve subire una serie di modifiche per essere trasformato in un trascritto maturo. Il processo di maturazione consiste in: Aggiunta di un cappuccio di guanina all’estremità 5’ del trascritto primario (servirà per far legare l’mRNA al ribosoma) Aggiunta di una catena di adenina, chiamata catena di poli-A, all’estremità 3’ del trascritto primario Rimozione degli introni (=sequenze non codificanti) dal trascritto primario. Questo processo prende il nome di splicing. A partire da uno stesso trascritto primario, attraverso un processo detto splicing alternativo, possono essere eliminate combinazioni diverse di introni e si possono ottenere, quindi, trascritti maturi diversi. Poiché ogni trascritto codifica per una proteina, a partire dallo stesso mRNA, a seguito dello splicing alternativo, potranno essere sintetizzate proteine diverse.  Rappresentazione modifiche post-trascrizionali: Traduzione La traduzione, detta anche sintesi proteica, è il processo attraverso il quale l’mRNA trascritto viene convertito (tradotto) in una proteina. Negli eucarioti, la traduzione avviene dopo che la trascrizione (che si verifica nel nucleo) è terminata e dopo che l’mRNA trascritto si è spostato dal nucleo al citoplasma. Quindi negli eucarioti trascrizione e traduzione sono separate sia temporalmente che spazialmente, perché avvengono in due tempi e due luoghi diversi. Nei procarioti, invece, la traduzione avviene nel citoplasma, dove avviene anche la trascrizione (perché non c’è il nucleo), e i due processi possono avvenire contemporaneamente (cioè mentre l’mRNA viene sintetizzato, la parte sintetizzata può iniziare ad essere tradotta). Come viene letto l’mRNA? Ogni tripletta di basi presenti sull’mRNA viene chiamata codone e ogni codone codifica (cioè viene usato per sintetizzare) 1 amminoacido. Le molecole coinvolte nel processo di traduzione sono: mRNA, tRNA, ribosomi Fasi del processo di traduzione: 1. Fase di inizio: o l’mRNA si lega con il suo cap, che è presente all’estremità 5’, alla subunità minore del ribosoma. Il ribosoma, quindi, inizia a scorrere sull’mRNA in direzione 5’->3’, fin quando incontra il codone di inizio AUG (fig. 1 sotto) o Un tRNA, quello che presenta l’anticodone complementare al codone di inizio AUG, raggiunge il complesso e si lega al codone AUG sull’mRNA (che abbiamo appena detto essere legato a sua volta alla sub. minore del ribosoma). Questo tRNA, che presenta l’anticodone complementare al codone di inizio, trasporta sempre e solo l’amminoacido metionina (che si indica con Met) negli eucarioti, e l’amminoacido formil-metionina (che si indica con f-Met) nei procarioti. Questa associazione tRNA+mRNA+sub minore ribosoma prende il nome di complesso di inizio (fig. 2 sotto).  o A questo punto la subunità maggiore del ribosoma si aggancia al complesso, chiudendo il ribosoma. In questo modo il tRNA viene a trovarsi nel sito P, mentre nel sito A sporgere il codone successivo (fig. 3 sotto). 2. Fase di allungamento: o Nel sito A entra un secondo tRNA, il cui codone è complementare a quello presente sull’mRNA che sporge nel sito A. Questo tRNA trasporta anche ‘esso un amminoacido (fig 4 sotto) o Il ribosoma rompe il legame tra l’amminoacido e il tRNA presente nel sito P (in questo caso quindi il tRNA che si era legato al codone AUG e che trasportava l’amminoacido f-Met). Forma poi un legame tra l’amminoacido appena staccato dal tRNA e l’amminoacido legato al tRNA presente nel sito A (fig 5 sotto). La catena, formata da due amminoacidi, resta attaccata al t-RNA presente nel sito A.  o A questo punto il tRNA presente nel sito P, che ha ceduto il suo amminoacido, si sposta nel sito E e, subito dopo, lascia il ribosoma. Il tRNA presente nel sito A si sposta invece nel sito P, che è diventato libero. Il ribosoma si sposta in direzione 5’->3’ per esporre un nuovo codone nel sito A. Il sito A può così accogliere un altro tRNA che trasporterà un altro amminoacido (fig. 6 e 7 sotto). Questa fase di allungamento, con tutti gli step sopra descritti, si ripete numerose volte, allungando così la catena amminoacidica nascente (cioè la proteina). 3. Terminazione: o Quado l’mRNA espone uno dei codoni stop nel sito A, Poiché non ci sono tRNA con anticodoni complementari ai codoni stop, nel sito A si lega una proteina, chiamata fattore di rilascio. Di conseguenza: la traduzione di interrompe, la  proteina neosintetizzata viene rilasciata nel citosol, le due subunità del ribosoma si separano e l’mRNA si stacca dalla subunità minore. Il processo termina così. Video traduzione: https://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ https://www.youtube.com/watch?v=K90Ps7XoFV8&t=139s La proteina neosintetizzata può rimanere nel citosol o essere destinata ad altri organelli. Nel secondo caso, la proteina presenterà un peptide segnale (cioè un tratto di proteina) che la indirizzerà verso la sua sede finale. N.B. Speciale procarioti: nei procarioti, lo stesso mRNA può essere tradotto contemporaneamente da più ribosomi (cioè mentre si verifica la fase di allungamento, nella parte iniziale dell’mRNA si forma un secondo complesso di inizio e comincia un altro ciclo di traduzione). In questo modo, dallo stesso mRNA saranno sintetizzate più copie della stessa proteina contemporaneamente. L’insieme di ribosomi che lega lo stesso mRNA prende il nome di polisoma Modifiche post-traduzionali Dopo essere state sintetizzate, le proteine devono essere modificate per funzionare correttamente. Le modifiche che una proteina deve subire sono le seguenti: essere ripiegata subire delle modifiche chimiche (es. aggiunta di gruppi chimici) Queste modifiche possono avvenire nel citosol, dove la proteina viene rilasciata dopo la traduzione, oppure negli organelli dove la proteina è destinata ad andare.