Replicazione DNA PDF

# Replicazione DNA Il DNA è un acido nucleico ed è un polimero costituito da monomeri che sono i nucleotidi. ## Evidenze fisiche della struttura Un apporto cruciale nel determinare la struttura del DNA venne dalla **diffrazione dei raggi X** negli anni'50. Una sostanza chimica purificata può esse...

# Replicazione DNA Il DNA è un acido nucleico ed è un polimero costituito da monomeri che sono i nucleotidi. ## Evidenze fisiche della struttura Un apporto cruciale nel determinare la struttura del DNA venne dalla **diffrazione dei raggi X** negli anni'50. Una sostanza chimica purificata può essere indotta a formare cristalli. Quando i raggi X la attraversano, la posizione degli atomi viene dedotta dal profilo di diffrazione. La cristallografa Franklin ha analizzato queste immagini dalle quali capì la struttura del DNA: * Le sue immagini suggerirono un'elica a **doppio filamento**, con 10 nucleotidi ad ogni giro completo. * Il diametro di 2 nm suggeriva che lo **scheletro zucchero-fosfato** di ciascun filamento fosse **esterno**. ## Evidenze chimiche Il biochimico Erwin Chargaff notò che nel DNA (anche di specie diverse) la quantità di purine è uguale alla quantità di pirimidine. L'abbondanza relativa di A + T rispetto a G + C varia tra le specie. Nell'uomo: A = T = 30% ; G = C = 20%. Per cui c'è un rapporto di 60 a 40 per A + TeG+C ## Il modello Francis Crick (fisico) e James Watson (genetista) elaborarono un modello, con prove fisiche e chimiche, per risolvere la struttura del DNA. Essi pubblicarono i loro risultati nel 1953. Il modello aveva: * I due filamenti di DNA orientati secondo direzioni opposte: erano **antiparalleli**. * Le basi erano **all'interno** e i gruppi fosfato-zucchero **all'esterno** di ogni filamento Per soddisfare la regola di Chargaff, il modello appaiava una purina in un filamento con una pirimidina nell'altro filamento, ottenendo un'ampiezza uniforme. Quattro caratteristiche chiave della struttura del DNA: * E' un'elica a doppio filamento * E' **destrorsa** * E' **antiparallela** * I bordi esterni delle basi sono esposti in **solchi maggiori e minori**. Le due catene sono tenute insieme da: 1. **Legami a idrogeno** tra le basi. Una purina (A o G) con una pirimidina (To C). Appaiamento complementare delle basi. 2. **Forze di Van der Waals** tra basi adiacenti sullo stesso filamento ## Come cresce il filamento * In un'estremità della catena c'è un gruppo fosfato (-OPO3) libero in 5': **estremità 5'**. * Nell'altra estremità della catena c'è un gruppo ossidrilico (-OH) libero in 3': **estremità 3'**. La catena cresce allungandosi aggiungendo unità sul terminale 3', quindi in direzione 5'-3' Gli scheletri dei due filamenti di DNA sono più vicini tra loro in una parte della doppia elica (formando il **solco minore**) rispetto all'altra parte (rappresentate il **solco maggiore**). All'interno dei solchi le basi si configurano in diversi modi, le basi sono unite da legami a idrogeno, tuttavia sono presenti atomi liberi che sono disponibili a formare legami a idrogeno con altre molecole, questo permette l'interazione con proteine specifiche durante la replicazione del DNA. ## Il DNA immagazzina informazione genetica: * Con milioni di nucleotidi, le sequenze di basi immagazzinano un'enorme quantità di informazione. * Il DNA è suscettibile alle **mutazioni**: alterazioni nella sequenza delle basi. Alcune mutazione possono non avere conseguenza altre possono essere pericolose. * Il materiale genetico è replicato con precisione nella divisione cellulare mediante appaiamento complementare delle basi. * Il materiale genetico (l'informazione codificata nel DNA) è espressa in un **fenotipo** (l'informazione nel DNA viene codificata nell'RNA e trova una concretizzazione nella sintesi delle proteine). ## Replicazione Processo molecolare attraverso il quale si ottiene una copia di DNA ### Tre possibili modelli di replicazione (meccanismo molecolare attraverso cui viene prodotta una copia del DNA cellulare): * **Semiconservativa**: ogni filamento parentale fa da stampo. Le nuove molecole di DNA avranno un filamento vecchio (originale) ed uno nuovo. * **Conservativa**: la molecola originale serve solo da stampo per la sintesi di una molecola completamente nuova. * **Dispersiva**: frammenti di DNA fanno da stampo; parti vecchie e nuove vengono assemblate casualmente in nuove molecole di DNA. ### Due fasi nella replicazione del DNA: 1. Viene svolta (aperta) la doppia elica, ottenendo due filamenti stampo. 2. Nuovi nucleotidi formano appaiamenti complementari di basi col DNA stampo e vengono legati tra loro da **legami fosfodiestere** tramite una reazione di **condensazione** formando un polimeri con una sequenza di basi complementari a quelle del filamento stampo. I legami che collegano i gruppi fosfato dei nucleosidi trifosfati (dNTP), ovvero i monomeri che devono essere aggiunti alla catena, vengono rotti, liberando energia che alimenta la reazione di **condensazione**. I due gruppi fosfato legati ai nucleotidi in arrivo vengono rimossi come **ione pirofosfato** e a loro volta si separano liberando ulteriore energia. La replicazione del DNA inizia quando un grande complesso proteico (complesso di pre-replicazione) si lega ad una regione del DNA detta origine di replicazione (ori). * In E. coli, che ha un solo cromosoma circolare, si ha un sito ori, il DNA viene svolto e la replicazione procede in entrambe le direzioni, formando due forcelle replicative. * I cromosomi eucariotici sono molto più lunghi, ed hanno numerose origini di replicazione, in corrispondenza delle quali si formano le 2 forche di replicazione. Diversamente, occorrerebbero settimane per replicare i cromosomi, i quali possono essere lunghi fino a milioni di coppie di basi. La **DNA polimerasi** (parte del complesso proteico iniziale) allunga il nuovo filamento aggiungendo nucleotidi a un filamento esistente. Tuttavia, richiede un primer, un breve filamento innesco, solitamente RNA. Il primer è complementare al DNA stampo ed è sintetizzato da un enzima detto **primasi**. Successivamente, la **DNA polimerasi III** aggiunge nucleotidi all'estremità 3' fino a che la sezione è completa, il primer viene degradato e sostituito con nuovo DNA. I frammenti sono poi legati da un enzima detto **ligasi**. Le **DNA polimerasi** sono più ampie dei propri substrati, i dNTPs (nucleotidi), e del DNA stampo. L'enzima è conformato come una mano destra aperta – nel "palmo" c'è il sito attivo dell'enzima che unisce I dNTP (desossiribonucleosidi trifosfato: dATP, dTTP, dCTP, dGTP) al DNA stampo. Le "dita" riconoscono le basi nucleotidiche. Altre proteine rivestono un ruolo nella replicazione: * La **DNA elicasi** usa energia dall'idrolisi di ATP per svolgere il DNA, allontanare i due filamenti. * Le **proteine leganti i singoli filamenti (SSB)** impediscono ai filamenti di tornare appaiati tra loro. Alla forcella di replicazione il DNA si apre come una cerniera in una direzione. * Il **filamento guida (leading strand)** cresce alla sua estremità 3' all'aprirsi della forcella. * Nel **filamento copia o lento (lagging strand)** l'estremità 3' è lontana dalla forca e si forma un'interruzione non replicata. La sintesi del filamento lento avviene in brevi filamenti discontinui detti **frammenti di Okazaki**. Ogni frammento richiede il proprio primer, sintetizzato dalla primasi. La DNA polimerasi III aggiunge nucleotidi all'estremità 3', fino a raggiungere il primer del frammento precedente. La **DNA polimerasi I** sostituisce poi il primer con DNA. Il legame finale fosfodiestere tra i frammenti viene catalizzato dalla DNA ligasi. Le DNA polimerasi lavorano velocemente perchè: * **Esse sono processive**: catalizzano molti legami ogni volta che si legano al DNA, anziché un solo legame (non legano un nucleotide per volte, aggiunge simultaneamente molti nucleotidi) * Il complesso DNA polimerasi-DNA è stabilizzato da una **pinza scorrevole** (formata da una serie di subunità) sul DNA, una proteina che mantiene l'enzima e il DNA a stretto contatto. All'inizio si pensava che il complesso si muovesse lungo il filamento di DNA successivamente si è capito che negli eucarioti il **complesso di replicazione rimane stazionario mentre si muove il DNA**. ## I telomeri I cromosomi eucariotici hanno **sequenze ripetitive alle estremità**, dette **telomeri**. Negli esseri umani la sequenza è TTAGGG, ripetuta circa 2500 volte all'estremità dei cromosomi. Essa impedisce al sistema di riparazione del DNA di interpretare l'estremità del cromosoma come una rottura ed eventualmente unire due cromosomi. Nei filamenti lenti, quando viene rimosso il primer di Okazaki terminale, non può essere sintetizzato DNA per rimpiazzarlo (non c'è un'estremità 3' da allungare). La breve sequenza di DNA viene rimossa, ed il cromosoma diventa più corto ad ogni replicazione. Dopo molte divisioni, i geni potrebbero essere persi e la cellula morire. * Cellule in continua divisione, come le cellule staminali del midollo osseo, hanno la **telomerasi**, un enzima che catalizza l'aggiunta di sequenze telomeriche perse. ## Riparazione Le DNA polimerasi possono inizialmente fare errori, oppure il DNA può essere danneggiato da sostanze chimiche, radiazione UV o altri agenti. Le cellule hanno tre meccanismi di riparazione: * **Correzione di bozze o "Profreading"** * **Riparazione di appaiamenti erronei ("mismatch")** * **Riparazione per escissione** ### Correzione di bozze Mentre la DNA polimerasi aggiunge un nucleotide ad un filamento in crescita, può riconoscere gli appaiamenti errati. Se le basi sono appaiate in modo errato, il nucleotide viene rimosso. ### Riparazione degli appaiamenti erronei Il DNA di nuova sintesi viene controllato da altre proteine, alla ricerca di errori; gli appaiamenti errati vengono corretti. Se il sistema di riparazione degli appaiamenti errati fallisce, il DNA sarà alterato. ### Riparazione per escissione Degli enzimi controllano costantemente il DNA durante la sua vita alla ricerca di basi danneggiate da elementi esterni, queste vengono escisse e la DNA polimerasi I aggiunge quelle corrette. ## Reazione a catena della polimerasi (PCR) Per studiare il DNA è sempre utile disporre di copie identiche del DNA, questo è possibile grazie al processo di **amplificazione del DNA**. I principi della replicazione del DNA sono stati usati per sviluppare la tecnica della reazione a catena della polimerasi (polymerase chain reaction o PCR) per ottenere numerose copie dello stesso DNA. Un processo automatizzato produce numerose copie di brevi sequenze di DNA, da utilizzare per la manipolazione genetica e la ricerca (amplificazione del DNA). ### Una miscela di PCR contiene: 1. Un campione di DNA a doppio filamento (lo stampo) 2. Due primer sintetizzati artificialmente 3. I quattro dNTPs 4. Una DNA polimerasi che possa tollerare le alte temperature 5. Sali e tampone per mantenere un pH neutro ### L'amplificazione PCR è un processo ciclico: 1. I filamenti di DNA vengono separati (**denaturazione**) per riscaldamento (era stato notato che la DNA polimerasi tendeva a distruggersi ad alte temperature successivamente è stata usata la DNA polimerasi di un batterio delle acque termali, Thermus aquaticus che resiste ai 90 °C). 2. La reazione viene raffreddata per permettere ai primer di appaiarsi ("**annealing**") ai filamenti stampo. 3. La reazione viene scaldata alla temperatura ideale alla quale la DNA polimerasi catalizza nuovi filamenti (**sintesi**). 4. Questa sequenza di passaggi viene ripetuta molte volte