Lucrarea practică nr. 2 - Curba de creştere - PDF

Lucrarea practică nr. 2 STABILIREA CURBEI DE CREŞTERE A MICROORGANISMELOR ü În sens biotehnologic, prin fermentaţie se înţelege procesul de creştere controlată a microorganismelor pe medii de cultură adecvate, cu scopul de a obţine diverşi produşi utili, respectiv metaboliţi primari sau sec...

Lucrarea practică nr. 2 STABILIREA CURBEI DE CREŞTERE A MICROORGANISMELOR ü În sens biotehnologic, prin fermentaţie se înţelege procesul de creştere controlată a microorganismelor pe medii de cultură adecvate, cu scopul de a obţine diverşi produşi utili, respectiv metaboliţi primari sau secundari ai celulei microbiene. ü În funcţie de sistemul de cultivare, există două tipuri principale de culturi microbiene: Ø culturi discontinue Ø culturi continue ü Culturile discontinue (sistem batch, culturi asincrone) corespund cultivării în sisteme închise, în care un anumit volum de mediu este însămânţat cu microorganismele respective. ü În cazul acestui tip de cultivare ritmul de creştere este impus de compoziţia chimică a mediului de cultură care variază pe parcursul bioprocesului, numărul microorganismelor variază continuu, vârsta acestora este variabilă, iar numărul de generaţii posibile este limitat. ü Culturile continue presupun cultivarea microorganismelor în sisteme deschise, în care volumul de mediu însămânţat este suplimentat continuu cu nutrienţi. ü Cunoaşterea modificării în timp a unei populaţiei bacteriene cultivată în condiţii controlate este deosebit de importantă pentru conducerea proceselor de fermentaţie, deoarece biosinteza metaboliţilor de interes este strict corelată cu anumite stadii de evoluţie a culturii bacteriene, care se succed în mod constant.  FAZE DE CRESTERE 1. Faza de lag este cuprinsă între momentul introducerii celulelor în mediu (însămâţare) şi momentul începerii multiplicării. În cursul acestei faze, are loc adaptarea treptată a microorganismului la noile condiţiile de mediu, iar numărul celulelor rămâne constant sau chiar scade temporar. 2. Faza de creştere accelerată corespunde momentului de începere a multiplicării, care creşte progresiv. 3. Faza de creştere exponenţială (multiplicare logaritmică) se caracterizează prin faptul că multiplicarea microorganismelor se efectuează în progresie geometrică, cu ritm de creştere constant, numărul celulelor viabile în această fază este de peste 90%, iar durata unei generaţii este minimă. 4. Faza de încetinire a creşterii se caracterizează prin acumularea de produşi metabolici, scăderea vitezei de creştere şi a viabilităţii microorganismelor datorită epuizării mediului în nutrienţi. 5. Faza staţionară cu ritm de creştere nul corespunde unei scurte perioade, caracterizată prin faptul că numărul celulelor vii rămâne constant din cauza unui echilibru care se stabileşte între numărul de celule care mor şi al celor care apar printr-un proces de diviziune foarte lentă. Faza stationara este de biosinteza, când se formează metaboliți secundari de interes. 6. Faza de declin accelerat este aceea în care multiplicarea microorganismelor încetează, iar numărul celulelor vii scade progresiv. 7. Faza de declin logaritmic corespunde unei perioade în care numărul de celule continuă să scadă, într-un ritm logaritmic. ü Pentru a aprecia dinamica multiplicării microorganismelor, se recoltează probe din mediul de fermentaţie, la intervale egale de timp, care apoi sunt analizate, iar valorile logaritmice ale numărului de celule sunt reprezentate grafic.  Trasarea curbei de creştere prin măsurători de turbiditate ü Măsurarea turbidităţii se realizează prin spectrofotometrie, adică prin măsurarea modului în care suspensia microbiană reduce transmiterea luminii. ü Rezultatele se exprimă în procente de transmitere (X) sau ca densitate optică (DO), aceasta reprezentând o funcţie logaritmică a procentului de transmitere: DO = 2 x log10 X unde, X = % de transmitere a luminii dacă X = 100%, atunci log10 100 = 2, DO > 0, DO variază de la 0 la infinit ü La trecerea unui fascicul de lumină printr-un mediu lichid ce conţine microorganisme, acestea determină împrăştierea luminii la anumite lungimi de undă la care raportul dintre absorbanţă şi împrăştierea luminii este mică. ü Densitatea optică a suspensiei bacteriene se măsoară cu un spectofotometru şi este direct proporţională cu numărul celulelor în mediu. ü Valoarea DO la o anumită lungime de undă variază în funcţie de tulpină şi de condiţiile de mediu. ü Metoda turbidimetrică poate fi aplicată doar microorganismelor care manifestă o creştere uniformă, adică tulbură omogen mediul lichid în care sunt cultivate. ü Prin dezvoltarea microorganismelor într-o soluţie perfect limpede, mediul se tulbură în funcţie de gradul de dezvoltare al acestora. ü Determinarea DO la  = 550-570 nm a soluţiei respective, exprimă turbiditatea probei respective.  Aplicație practică ü Se prelevează din mediul de cultură, în condiţii sterile, câte 2 ml de probă, la intervale regulate de timp (0, 4, 8, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ore). ü Fiecare probă se diluează în raport de 1:50 (sau 1:25 in functie de situatie) astfel: 1 ml probă se aduce într-un balon cotat sau cilindru gradat la 50 ml cu apă distilată. ü Se determină extincţiile probelor la 570 nm, toate determinările realizându-se faţă de apă distilată. ü Curba de creştere este reprezentată grafic pe hârtie milimetrică prin înscrierea pe abscisă a timpului şi pe ordonată a DO la 570 nm.  Calculul rezultatelor D.O. = E 570 x D E570 = extincţia probei la λ = 570 nm D = diluţia D.O. (unități) Vârsta culturii (ore) D.O. λ=570 nm 0 4 8 12 16 18 20 22 Timp de cultivare (ore) 24