Extracción de ADN - Apuntes PDF

El machacán sale, es una acción mecánica para poder romper esta parez celular, recuerda que la parez celular está formada sin rosa, entonces es un polisacarido que le da soporte, eso quiere decir que es una parte que es rígida, entonces esta acción del machacán hace que justamente rompamos esa pare...

El machacán sale, es una acción mecánica para poder romper esta parez celular, recuerda que la parez celular está formada sin rosa, entonces es un polisacarido que le da soporte, eso quiere decir que es una parte que es rígida, entonces esta acción del machacán hace que justamente rompamos esa parez celular, después adicionamos la solución de lisins que tiene jabón, que tiene sal y que tiene agua, ¿cuál es la siguiente estructura que te sigue después de la parez? La membrana. La membrana de la citoplasmática, entonces de estos tres componentes, ¿cuándo se ayuda a degradar a esta membrana de la citoplasmática? El jabón. El jabón, parece que el jabón nos permite eliminar lípidos, ¿sí? Entonces, da la membrana citoplasmática y también va a eliminar la membrana de los organelos, ¿sale? Incluyendo la membrana nuclear. Eso quiere decir que ya en esta solución de lisins, ya yo me estoy, oh madre, estoy separando este DNA de más de los rastros celulares, pero todavía está dentro de la misma mezcla, ¿sale? solamente ya me veré el DNA. Después colocaron una cucharada de sal, ¿sale? Ese es, no, tomé agua que adentro y eso es mucha o mila sal. Mucha. Es mucha sal, una cucharada de sal para 100 mil 5 mililitros, es mucha sal, ¿sale? Entonces eso quiero decir y a la agregar gran cantidad de sal, lo que yo estoy haciendo es incrementando la fuerza ionica, ¿sale? Si se acuerdan de la sal es el oro de sodio y su tipo de enlace es una enlace ionico, entonces al incrementar los iones, tanto cátiones como aniones, yo estoy incrementando esa fuerza ionica, ¿sale? Al incrementar esa fuerza ionica ocurran dos situaciones. Primero, chicos, quedamos personalmente 20 minutos. Ok, eso no es pretexto, ¿quieres estar aquí a tiempo? Entonces, ¿qué es lo que pasa con esa fuerza ionica? Van a ocular, van a ocular dos situaciones, una que se conoce como sucking out. ¿Cómo? Sucking out, que es un proceso que es característico de las proteínas, que es lo que va a hacer altas incendraciones de sal, se van a resistir a las proteínas, eso es saltillados, ¿sale? Y además, en el caso de los eucariotes, el DNA que está asociado a unas proteínas que se conoce como istonas, entonces esa cantidad de sal también va a hacer que se separe de esas istonas del DNA, ¿sale? De esa manera ya liberamos al DNA de las proteínas y esa es una de las partes más importantes en la extracción del DNA, porque si nosotros tenemos un DNA que está contaminado con proteínas, no es seguro, no lo sirve, ¿sale? Entonces, es muy importante separar estas proteínas que están asociadas al DNA y por eso se utiliza la sal. Ahora, una vez que ya colocamos esta solución de lisis, entonces rompimos las membranas, separamos proteínas del DNA y precipitamos las demás proteínas, ¿sale? Cuando nosotros filtramos, entonces ya estamos separando todos esos componentes, que son las proteínas precipitadas, los restos de las membranas hidroplasmáticas, etcétera, y el DNA se va a encontrar aquí en el filtrado, ¿sale? Porque el DNA se caracteriza por tener una carga negativa, ¿sale? Al estar cargado negativamente va a ser soluble en agua, si se acuerda que dijimos, pero para que no se acerce a soluble en agua tiene que tener cálculo, entonces el DNA, al tener una carga negativa, y lo vamos a ver cuando veamos la clase de teoría, es soluble en agua, ¿sale? Y entonces todos los demás componentes se van a quedar aquí, por eso yo les decía, no lo aplazen, nada, sino que solito vaya a filtrar, porque si no, como el colado pues tiene un poquito el polo más abierto, pues ahí se iban a ver que sos copones, ¿sale? Entonces la idea es que solamente se filtrara lo líquido y que ahí estuviera el modelo, ¿sale? Entonces ahora el DNA está aquí disuelto, ¿qué fue lo que hicimos para separarlo, adicionarle el tanro frío? Si se acuerdan que los alcoles se caracterizan a los alcoles, se caracterizan por tener este loco funcional, que es el OH, este OH hace puentes de hidrógeno con el agua, ¿sí? Y al hacer puentes de hidrógeno, entonces el entanol es más afín al agua que el DNA, ¿sale? Tiene mayor afinidad por el agua, y además si se acuerdan, también vamos a tener aquí la sal disuelta en el agua, porque este tiene en la silloni, o sea, este no lo separamos, este sigue estando disuelto en el agua. Entonces si ahora el entanol es más afín al agua, el DNA tratando de neutralizar su carga se va a unir a los cationes sodio, entonces el sodio ya tiene carga positiva, el DNA tiene carga negativa, entonces se van a unir y entonces al unirse el sodio con el DNA se neutraliza, y si se acuerdan que dijimos que una sustancia se encuentra neutra va a perder su solubilidad en el agua, se va a precipitar y en este caso por la densidad pues no precipita, sino que queda como flotante, ¿sale? Eso es por densidad nada más. Entonces la separación del DNA se logra por dos situaciones, una porque al agregar el entanol, el entanol es más afín al agua, el DNA, y la otra que los ciones sodio que tenemos en el exceso de sal se van a unir al DNA de carga negativa, lo neutralizan y lo separan, pierde su solubilidad en el agua, ¿sale? Otra vez. Ok, desde donde? Desde el filtrado. Del filtrado, ok. Entonces con la solución de liceis lo que nosotros hicimos fue separar los componentes celulares, ¿sale? Al filtrar estas proteínas precipitadas etcétera que quedan aquí, y lo único que pasa son las sustancias solubles en agua, dentro de estas sustancias tenemos el DNA porque dijimos que tiene carga negativa en su estructura y tenemos la sal, salera satana si es solvenada. Ahora, para poder separar el DNA del agua lo que hacemos es agregarle una sustancia que sea más afín por el agua, entonces el entanol es más afín por estos puentes de hidrógeno que yo le decía, al ser más afín pues entonces va a separar al DNA del agua, pero además para que nosotros lo podamos visualizar, los canciones de la sal que es el sodio con tener cargas positivas se van a unir al DNA que tiene carga negativa, que es simplemente por la tracción de cargas, ¿sale? Al atraerse al tener positivo y negativo va a neutralizar la carga del DNA y entonces el DNA ya no va a ser solublenada porque ya están neutralizados. ¿Sí? ¿Dudas? ¿No? Ahora, este proceso que nosotros hicimos aquí de extracción de DNA es de los más sencillos ¿sale? ¿Realmente la extracción de DNA es un proceso muy complejo? ¿Por qué? Porque en primeras se necesitan de ciertas situaciones ¿sale? Primero, los materiales que se utilizan deben estar libre de DNAs, hay unas enzimas que se encargan de degradar el DNA y nosotros lo tenemos en las manos, en las superficies de DNAs, en todos lados hay DNAs, entonces el DNA ustedes extranjeron, muy probablemente ya están degradados, ¿sí? Entonces el material que se utiliza para extrar el DNA debe estar libre de DNAs, así lo venden, ¿sale? Es un tratamiento específico que se le hacen. Lo siguiente, por lo mismo que nosotros tenemos DNAs en las manos, se tienen que utilizar once ¿sale? Lo siguiente, se tienen que hacer el frío ¿sale? En DNA también eso se tiene que degradar el temperatulamiento, entonces se tienen que hacer el frío y para poder extranjerlo, además de que todos los materiales tienen que ser libres de DNAs, o sea, el tratamiento específico, la solución de dices es una solución específica, etcétera, al final se tienen que hacer una cuantificación del DNA y también ver su integridad, como lo podemos hacer hay un equipo que se conoce como un anudro, que es como un espectro fotómetro, entonces hace la absorbancia a diferente longitud desde otra, las proteínas absorben a 280 nanómetros y el DNA absorbe a 260 nanómetros, entonces es una relación, por en su muestra les da la absorbancia a 260 y la absorbancia a 280, entonces tiene que ser mayor la absorbancia a 260, si es mayor a 280 quiere decir que hay más proteínas que el DNA y ese el DNA no les va a hacer más, entonces es una forma de ver primero si está bueno, o sea que no tiene tanta proteína, siempre va a haber cierta cantidad de proteína asociada pero puede, la siguiente hay una técnica que se conoce como gel de electroporeces, es un gel así tal cual en donde hay hace unos pozitos, entonces ustedes colocan aquí su DNA y se le pone un marcador que tenga fluorescencia y que además se unan DNA, generalmente es el bromuro de tibio, porque no lo utilizamos porque si se unan DNA les puede causar cáncer, entonces se coloca aquí y se hace pasar una corriente eléctrica por cargas, el DNA va a migrar, sale y al final se le tiene electroporeces hasta que ya se utiliza un marcador, un control positivo en donde es un marcador que es un DNA que tiene cierto tamaño de pared de bases, entonces tú lo haces correr y hasta que el marcador te llegue hasta acá, parse, entonces dependiendo del DNA, cuando uno vea el marcador, entonces este marcador son varios tachitos de varios tamaños y tu DNA tiene que estar a la pared del tamaño del marcador, sale, ahí es donde vemos que es un DNA esta integrosa, no es tan roto, porque si fueran muchos tachitos pues en vez de verse solamente una banda de lo que nosotros esperamos del tamaño que tú estás esperando por la tu marcador, verías muchas bandas, entonces es un DNA negrada, sale, entonces son esas dos técnicas para evaluar la extracción de DNA y para que se utiliza la extracción de DNA pues tiene muchos usos, por ejemplo hay muchos test de biología molecular, por ejemplo se construye una vacuna, se trae el DNA de los virus, el RNA, etcétera, la parte específica y eso es con lo que se construye la vacuna, un ejemplo por ejemplo un clínico pues es por ejemplo las técnicas que utilizaron para la extracción de COVID, se acuerdan lo que ustedes requicieron, bueno había dos técnicas, PCR y anticuerpos, entonces la de anticuerpos era cuando ya se había cruzado la enfermedad, o sea que ya tenían cierta sintomatología, que existen monológicos y había reaccionado entonces ya habían fabricado los anticuerpos y eso era lo que se detectaba pero la PCR es más específica, porque recuerden que había personas que eran asintométicas, entonces la PCR lo que detecta es la presencia del virus, que lo que les hacían es extraer o les hacían un exudado en la soparigia, ahí debe de estar el virus, entonces esa muestra el DNA de DNA, al extraer el DNA después se hace una técnica que se conoce como PCR, que este fue un par de aguas en la biología molecular, porque la PCR emula la replicación, ustedes saben que la replicación es hacer una copia de DNA, entonces eso es lo que hacemos en las células cuando se divide, entonces la PCR es emular esa situación pero en el laboratorio, se diseñan, por ejemplo tienen ustedes el DNA aquí, y ustedes el del virus, y resulta que solamente este cachito es específico del virus, o sea es una es una secuencia de DNA que nosotros como humanos no la tenemos, solamente la tiene el virus, entonces polvia y formatica se sintetizan lo que se conoce como primers, que son este secuencias de DNA que van a ser compatibles con regiones que están antes de ese gen, entonces se pegan aquí por ser complementarios, después se pone una enzima que es una evademia polimerasa de una bacteria que resiste a altas temperaturas, porque la PCR se lleva a altas temperaturas, que es lo que nosotros queremos primero, abrir el DNA, entonces para abrir el DNA se sube la temperatura a 96 grados en día, una enzima normal como la de nosotros, no sería el funcional de esa temperatura, entonces utilizan enzimas que se extraen de bacterias que son extremofiles, o sea que no existen esas altas temperaturas, entonces la temperatura alta permite que la cadena de DNA esté abierta, no tiene que estar abierta para que se coge, después se unen estos iniciadores que se diseñan por bien formatica y se sintetizan in vitro, se le pones a mezcla, se pegan estas regiones que reconoce específicamente, no se van a pegar a otra región, solamente esta del virus, y después viene la enzima que empieza a sintetizar la cadena complementaria de esa parte del virus, y otra vez son varios ciclos de PCR, otra vez se abre, se ponen los iniciadores y vuelven a sintetizar, el chiste es que hacen muchas copias, muchas copias desde gen nada más, nada más de la del virus, entonces después esa mezcla se pone aquí en el gen de electrocorecis, se pone en el marcado, se ve que tamaño es el específico del gen que yo estoy amplificando, y si hay una banda y presente, quiere decir que el virus se estaba presente en la muestra, ¿qué pasaría si el virus no estaba? Yo haya extraído el DNA aunque haya hecho la PCR, como no está en la región del virus específica, pues los iniciadores no reconocen nada, y entonces no se va a identificar nada, y entonces no se va a ver ninguna banda aquí, entonces ese es el principio de la PCR de entera o hígela, hay muchas cositas específicas, pero para que vean la importancia de tener un DNA integral y puro, ahora imagínense si ustedes extraen y resulta que este DNA está todo cortado, entonces no se va a identificar absolutamente nada, y entonces, aunque esté presente el virus, ¿sí? Entonces esa ya es la técnica, pero es importante que usted no la saca, para poder hacer diagnóstico, pero bueno eso ya es más para las personas que se dedican, etcétera, ¿sí? Ok, esto del DNA, por ahorita les parece un poquito complicado lo de la aplicación de la PCR, pero lo vamos a ver en teoría, ya que expliquemos cómo se lleva como la replicación, lo van a entender un poquito más Entonces nada, no es otra, porque se queda desde que la PCR es una imitación de la replicación in vitro, es importante, ¿vale? La proteínas, y hasta ahí quedaría la elección, ¿vale? Es el único que les voy a dejar una tarea de investigar las principales enfermedades asociadas en el metabolismo y los aminoácidos, ¿vale? Para que vean esa parte, ¿por qué esa parte sí es importante? ¿Quién fue en medias, están asociadas a deficiencias en el metabolismo? Perdón, el siguiente sábado es el examen del laboratorio? ¿Yo no lo pido? O sea, están dormidos todos. Ya la opresión y los asociados al primer. Mi pregunta, ¿no sé si lo que es fácil para la práctica de la PCR? No, cuál es lo que es? Sí, sí, no es para la replicación, no es para los asociados, no es para los asociados. Con ello no sé si es lo que es completo para la primera semana. Ok, ¿va a ser entonces de las dos prácticas que hicimos? Sí, solo de las dos prácticas. No teoría. Yo, no, solo de las dos. La clarea, la voy a dejar y voy a hacer. Es... Todavía no la deciden bien. ¿Solo va a ver que no vean el metabolismo? No, es para ver que hay unos para que lo traen en esos semanas y diámenos para que ya se digan estudios. No, no, más que eso. A ver, ¿qué es lo que es lo que es? Sí, nos va a descargar un formulario que le da el profesor. ¿Qué van a hacer el examen unas diez preguntas? No, de hecho, ahorita lo estoy haciendo, son 45. No pasa, no es como regalo de navidad. Pero la teoría de los proteínas es que... Pero es el de teoría, las de 45? No, las de la laboratoria son bonitas, porque lo hicimos la... No, es como regalo de la laboratoria. Ok. ¿Este se tira aquí o no? Ese, es de...