Extracció i Purificació de l'ADN PDF

# EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE L'ADN ## 1. PRETRACTAMENT DE LA MOSTRA ### OBTÉNCIO DE SUSPENSIONS CEL·LULARS - El primer pas en l'extracció i purificació de l'ADN és obtenir una suspensió cel·lular de la mostra. ### EXTRACCIÓ D'ACIDS NUCLEICS - Treure i alliberar els acids nucleics. - Aqu...

# EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE L'ADN ## 1. PRETRACTAMENT DE LA MOSTRA ### OBTÉNCIO DE SUSPENSIONS CEL·LULARS - El primer pas en l'extracció i purificació de l'ADN és obtenir una suspensió cel·lular de la mostra. ### EXTRACCIÓ D'ACIDS NUCLEICS - Treure i alliberar els acids nucleics. - Aquest pas implica treure i alliberar els acids nucleics de la mostra per a poder purificar-los. ### PURIFICACIÓ D'ACIDS NUCLEICS - Una vegada s'han alliberat els acids nucleics, aquests són aillats per a una purificació més eficaç. ## 2. BARRERES PER A L'ACCÉS ALS ÀCIDS NUCLEICS ### DIVERSITAT DE MOSTRES - Hi ha una gran diversitat de mostres a partir de les quals es poden obtenir acids nucleics, cada una amb diferents requisits de tractament. ### NECESSITAT DE TRENCAR BARRERES - Per a poder accedir als acids nucleics, s'han de trencar diverses barreres com la paret cel·lular o la presencia de nucleases. ## 3. PRETRACTAMENTS ESPECÍFICS PER A DIFERENTS MOSTRES ### TRACTAMENT DE LA SANG - La sang és una de les mostres més comunes i requereix un pretraçtament específic per a obtenir els acids nucleics desitjats. ### OBTENCIÓ DE PBMC - Per a estudiar acids nucleics de virus que infecten limfòcits, es pot utilitzar un gradient de densitat per a obtenir PBMC. ### TRACTAMENTS PER A ALTRES MOSTRES - Altres mostres com teixits vegetals o animals frescos, cultius cel·lulars o teixits fixats en formol inclosos en parafina requereixen diferents pretratcaments per a obtenir els acids nucleics desitjats. # EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE L'ADN ## 4. LISI CEL·LULAR I INACTIVACIÓ DE NUCLEASES ### FUNCIÓ DELS DETERGENTS - Els detergents són utilitzats per a desestructurar la bicapa lipidica i desnaturalitzar les proteïnes de la membrana, facilitant així la lisi cel·lular i alliberant els acids nucleics. ### IMPORTÀNCIA DE L'EDTA - L'EDTA és un quelant de cations divalents que inhibeix l'activitat de les DNases, evitant la degradació dels acids nucleics durant el procés d'extracció i purificació ### CONSIDERACIONS PER A LA PURIFICACIÓ D'ADN O ARN - Depenent del tipus d'estudi, s'han d'utilitzar diferents enzims com arnasas o adnasas per a eliminar l'ARN o l'ADN de la mostra i obtenir una purificació més precisa. ## 5. PROTEASES ### FUNCIÓ - Les proteases són enzymes que digereixen proteïnes per facilitar el trencament de la membrana i inactivar nucleases ### TIPUS ### PROTEÏNASA K - La proteïnasa K és un tipus de proteasa utilitzada en la purificació de l'ADN per inactivar nucleases. ### AGENTS CAOTROPICS - Els agents caotropics són susbtàncies que desnaturalitzen macromolecules per inactivar nucleases, com l'isotiocianat de guanidino que inactiva les arnasas. ## 6. EXTRACCIÓ I PURIFICACIÓ DE L'ADN ### MÈTODES DE PURIFICACIÓ - Hi ha diferents mètodes de purificació de l'ADN, com la purificació amb solvents orgànics, la precipitació amb sals, la cromatografia i la purificació mitjançant esferes magnètiques. ### SISTEMES AUTOMÀTICS - En laboratoris amb moltes mostres per analitzar, s'utilitzen sistemes automàtics per a l'extracció i purificació de l'ADN, que utilitzen cromatografia o esferes magnètiques. ### AVANTATGES - Els sistemes automàtics d'extracció i purificació de l'ADN ofereixen avantatges com una alta puresa i una minimització de la contaminació per proteïnes i contaminants creuats. ### INTEGRITAT - La integritat de l'ADN es pot determinar mitjançant una electroforesi en gel d'agarosa per comprovar si ha mantingut la seva mida original durant el procés de purificació. ## 7. QUALITAT DE LA PURIFICACIÓ DE L'ADN ### PURESA - La puresa de l'ADN es pot determinar mitjançant el quocient A260/A280, on un valor adequat indica una baixa contaminació per proteïnes o fenols. ### CONCENTRACIÓ - La concentració de l'ADN es pot determinar mitjançant l'absorbança a 260 nm, on un valor elevat pot indicar una alta concentració d'ARN en l'ADN purificat # AMPLIFICACIÓ DE L'ADN PER PCR ## 1. INTRODUCCIÓ ### DEFINICIÓ DE PCR - La PCR és una tècnica in vitro que permet obtenir milions de còpies d'una sequència d'ADN específica. ### FUNCIONAMENT DE LA PCR - El funcionament de la PCR es basa en la repetició de cicles de temperatura per aconseguir un augment exponencial del nombre de copies d'ADN. ### DESCRIPCIÓ DE LA PCR ESTANDARD - La PCR estandard és la forma més senzilla de PCR, en la qual s'amplifica un únic fragment d'ADN amb un parell d'encebadors en un únic procés d'amplifiació a temps final. ### ADN MOTLLE - L'ADN motlle conté el fragment d'interés que serveix com a motlle per a la síntesi. ## 2. COMPONENTS DE LA PCR ### CEBADORS ### CEBADOR 1 - El cebador 1 s'uneix a una de les cadenes d'ADN i es situa a l'extrem de la sequencia a ampliar. ### CEBADOR 2 - El cebador 2 s'uneix a l'altra cadena d'ADN i es situa a l'extrem de la sequencia a ampliar. ### ADN POLIMERASA - L'ADN polimerasa síntetitza la nova cadena d'ADN a partir dels encebadors i els dNTps complementaris als nucleotids de la cadena motlle. ## 3. FASES DEL PROCÉS ### DESNATURALITZACIÓ - La calor provoca la separació de les dues cadenes d'ADN motlle. ### HIBRIDACIÓ O ANELLATGE - Els primers s'uneixen a les sequencies complementaries de l'ADN motlle. ### ELONGACIÓ O POLIMERITZACIÓ - L'ADN polimerasa síntetitza la nova cadena d'ADN a partir dels encebadors i els dNTps complementaris als nucleotids de la cadena motlle. ## 4. PROGRAMA DEL TERMOCICLAC ### DESNATURALITZACIÓ INICIAL - Es realitza una desnaturalització inicial per assegurar la completa separació de les molècules d'ADN. ### CICLES DE REPLICACIÓ - Es repeteix un cicle de desnaturalització, hibridació i elongació un nombre determinat de vegades. ### EXTENSIÓ FINAL - Es realitza una incubació a la temperatura òptima de polimerització per assegurar la completitud dels productes en forma de doble helix. ### MANTENIMENT - ÉS realitza una incubació fins que es retiren les mostres, sense activitat enzimàtica. # ELECTROFORESI EN GEL D'AGAROSA ## 1. INTRODUCCIÓ A L'ELECTROFORESI ### FUNCIÓ DE L'ELECTROFORESI - L'electroforesi permet separar i visualitzar fragments de DNA, confirmar la presència de sequències de DNA i estimar el pes molecular dels fragments. ### RESOLUCIÓ DE LA SEPARACIÓ DELS FRAGMENTS DE DNA ### CONCENTRACIÓ DEL GEL D'AGAROSA - La concentració del gel d'agarosa afecta la resolució de la separació dels fragments de DNA, sent més alta per a fragments més curts. ## 2. NUCLEOTIDS D'ADN ### CÀRREGA DELS NUCLEOTIDS - Els grups fosfat dels nucleotids confereixen carrega negativa al DNA, permetent la seva migració durant l'electroforesi. ### FUNCIÓ DELS NUCLEOTIDS EN L'ELECTROFORESI - Els nucleotids són els components bàsics del DNA que es separen i visualitzen durant l'electroforesi en gel d'agarosa. ## 3. MARCADOR DE PES MOLECULAR ### CONTÉ 10 FRAGMENTS DE DNA DE 100 A 1000PB - El marcador de pes molecular conté 10 fragments de DNA de 100 a 1000pb. ### BANDA DE 500PB - La banda de 500pb és més intensa. ### INTENSITAT DE LES BANDES - La banda de 500pb és més intensa que les altres bandes del marcador de pes molecular. ## 4. BROMUR D'ETIDI VS SYBR GREEN ### AGENTS INTERCALANTS - Tant el bromur d'etidi com el Sybr Green són agents intercalants que s'intercalen entre les bases del DNA. ### PROPIETATS DELS COLORANTS - El bromur d'etidi és alttament tòxic i té propietats mutagèniques, mentre que s'han desenvolupat colorants com el Sybr Green per reduir el risc de toxicitat. ### ÚS DELS COLORANTS EN ELECTROFORESI - Tant el bromur d'etidi com el Sybr Green són utilitzats en electroforesi per permetre la visualització de les bandes de DNA sota llum UV. ## 5. PROTOCOL D'ELECTROFORESI ### PREPARACIÓ DEL GEL D'AGAROSA - El gel d'agarosa s'ha de preparar en un motlle amb cinta d'autoclau i tampó TBE 0,5X, i s'ha de deixar refredar abans de dipositar-lo a la cubeta. ### PREPARACIÓ DE MOSTRES, CONTROLS I MARCADORS DE PES MOLECULAR - Les mostres, controls i marcadors de pes molecular s'han de barrejar amb tampó de càrrega abans de ser carregats al gel. ### MIGRACIÓ I OBSERVACIÓ DE RESULTATS - El gel s'ha de carregar a la cubeta amb tampó TBE 0,5X i s'ha de connectar a una font d'alimentació per permetre la migració de les molècules de DNA, i después s'ha de posar al transil·luminador UV per observar les bandes de DNA.