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TEMA 3 SOLUBILIDAD Y SEPARACIÓN POR CENTRIFUGACIÓN 1. Características de biomoléculas En las representaciones gráficas de aminoácidos, si no viene indicado en la imagen, se trata de cómo se presenta el aminoácido a pH neutro, es decir, pH 7. (isoleucina...

TEMA 3 SOLUBILIDAD Y SEPARACIÓN POR CENTRIFUGACIÓN 1. Características de biomoléculas En las representaciones gráficas de aminoácidos, si no viene indicado en la imagen, se trata de cómo se presenta el aminoácido a pH neutro, es decir, pH 7. (isoleucina) Las moléculas que presentan carga son polares, por lo que son hidrófilas o hidrofílicas. El ADN tiene carga negativa porque presenta grupos fosfato (que tienen carga negativa, valga la redundancia). El empaquetamiento o superenrollamiento del ADN sin que se produzcan repulsiones se logra gracias a la unión a las proteínas histonas, que tienen carga positiva. El grupo amida que se crea al formarse el enlace peptídico no es ionizable (en las proteínas, solo tienen carga los grupos amino y carboxilo terminales y los grupos amino y carboxilo que forman parte de la cadena lateral de determinados aminoácidos). La sacarosa (y cualquier otro disacárido) es soluble en agua puesto que presenta grupos hidroxilo que pueden formar puentes de hidrógeno con las moléculas de agua. Los fosfolípidos están compuestos por dos ácidos grasos (uno saturado y otro insaturado), una molécula glicerina, una molécula de ácido fosfórico y un compuesto polar que suele ser un aminoalcohol. Se trata de una molécula anfipática en la que los ácidos grasos y la glicerina constituyen la parte hidrófoba y el grupo fosfato y el aminoalcohol constituyen la parte hidrófila. El colesterol es un esteroide (lípidos derivados del ciclopentanoperhidrofenantreno o esterano) que también es una molécula anfipática. La parte polar es el grupo hidroxilo y el resto de la molécula (anillos de carbono y cadena hidrocarbonada) es la parte apolar. 2. Las moléculas hidrófilas en una disolución acuosa El agua funciona como disolvente universal en los medios intracelular y extracelular gracias a su tendencia a formar enlaces de hidrógeno y su carácter dipolar. Las sustancias que pueden disolverse fácilmente en agua se denominan hidrófilas o hidrofílicas. Las moléculas que presentan grupos capaces de formar enlaces de hidrógeno en sus superficies accesibles al disolvente tienden a unirse con el agua con este tipo de enlace (ej. grupos con carga o grupos hidroxilo, carbonilo o éster). Además, cuando las moléculas que tienen puentes de hidrógeno internos se disuelven en agua, algunos de estos enlaces de hidrógeno internos pueden intercambiarse por enlaces de hidrógeno con el agua. El agua es un disolvente excelente para los compuestos iónicos. Esto se debe a la naturaleza dipolar de la molécula de agua. Las interacciones de los extremos negativos de los dipolos del agua con los cationes y los extremos positivos con los aniones en una disolución acuosa hacen que los iones se hidraten, es decir, se rodeen de capas de moléculas de agua denominadas capas de hidratación. Esta tendencia se explica por dos factores: la formación de capas de hidratación es energéticamente favorable y la constante dieléctrica elevada del agua disminuye la fuerza electrostática entre lociones de cargas opuestas. La naturaleza dipolar de la molécula de agua favorece también su capacidad para disolver moléculas no iónicas polares, que a menudo tienen momentos dipolares elevados e interactúan con el dipolo de agua, favoreciendo su solubilidad en ella. 3. El efecto hidrofóbico Las sustancias que no pueden formar puentes de hidrógeno y, por tanto, no interactúan con el agua se denominan hidrófobas o hidrofóbicas. Cuando las moléculas hidrófobas se disuelven no están rodeadas por capas de hidratación, sino que la red regular del agua forma estructuras de clatrato similares a las del hielo, o “jaulas” alrededor de las moléculas no polares, sin establecer ningún tipo de interacción. Esta disposición ordenada de las moléculas de agua es desfavorable desde el punto de vista termodinámico ya que se produce por una disminución de la entropía (aleatoriedad o desorden de la mezcla). Esto explica la tendencia de las sustancias hidrófobas a autoasociarse. Se necesita más ordenación del agua para rodear dos moléculas hidrófobas con dos “jaulas” separadas que para rodearlas a ambas con una sola “jaula”. De este modo, las moléculas hidrofóbicas tienden a agruparse, porque al hacer esto liberan algunas moléculas de agua de los clatratos, aumentando la entropía del sistema. Este fenómeno se llama efecto hidrófobo, y es el causante del plegamiento de las proteínas y del autoensamblado de las bicapas lipídicas.  4. Medio de extracción Disolución acuosa que contiene sustancias que permiten preservar la molécula; por ej, si es una proteína, un medio con características que impidan su desnaturalización (pH óptimo, temperatura, etc.). Contiene: - Es un medio tamponado, es decir, contiene una sustancia que actúa como tampón o amortiguador de pH (ej. Tris, Hepes, fosfato…) - Antioxidante, como el 2-mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol). Presentan un grupo SH que permite mantener en estado reducido restos SH que hay en las proteínas (concretamente, en las cadenas laterales de la cisteína) para evitar que estos formen puentes disulfuro en el interior de las moléculas de cisteína. Estos puentes se forman porque al extraer las proteínas los restos SH se oxidan, así que requerimos de antioxidantes para mantenerlos reducidos. - Sales: mantenimiento del pH y cofactores metales - EDTA (eliminación de metales pesados) - Inhibidores de proteasas, como el PMSF - Cofactores enzimáticos, como el piridoxal fosfato, cofactor de aminotransferasas, para preservar la actividad enzimática. - PVP-polivinilpirrolidona (eliminar fenoles, importante en los extractos de plantas, depende de la especie y el tejido) - Azida sódica. Inhibidor de la cadena de transporte de electrones (inhibidor de respiración). Bactericida. - Detergente: son moléculas anfipáticas. Los más utilizados son Tritón X-100 y el SDS (dodecilsulfato sódico). Ambas moléculas son muy diferentes. El Tritón (izquierda) presenta una parte hidrocarbonada (hidrofóbica) que sirve para extraer moléculas hidrofóbicas, como componentes de membrana; y un grupo hidroxilo (no ionizable, lo que convierte al Tritón en un detergente no iónico). El SDS (derecha) presenta un grupo sulfato con carga negativa, por lo que, a diferencia del Tritón, sería un detergente iónico (más fuerte). En una proteína soluble, las cadenas hidrofóbicas de sus aminoácidos están mirando hacia el interior y las hidrofílicas hacia el exterior. Al añadir SDS, su grupo sulfato interaccionará con las moléculas de agua de la disolución, pero su cadena hidrocarbonada interaccionará con los residuos hidrofóbicos que se encuentran en el interior de la proteína, dejándolos expuestos al exterior, lo cual causa un cambio conformacional considerable, llevando a la pérdida de función y consecuente desnaturalización de la proteína (pierde las estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria, pero no la primaria pues esta está formada por enlaces peptídicos y no covalentes, y su ruptura sería ya la degradación de la proteína). El SDS se utiliza para desnaturalizar. En la desnaturalización la proteína pierde su función biológica (conformación nativa, estructura cuaternaria, terciaria y secundaria). La estructura primaria no se pierde puesto que para romper los enlaces peptídicos de los aminoácidos se necesitan enzimas como las proteasas.  5. Solubilidad y grupos ionizables Los aminoácidos presentan un grupo amino con carácter básico (aceptor de protones) y un grupo carboxilo con carácter ácido (dador de protones). Como a pH fisiológico los aminoácidos se encuentran en forma de ión dipolar, en realidad el carácter ácido lo presenta el grupo amino protonado y el carácter básico el grupo carboxilo ionizado. Este tipo de sustancias que pueden actuar como ácidos o como bases se conocen como sustancias anfóteras. Además, algunos aminoácidos tienen un grupo ácido o básico en su cadena lateral. Nota: las moléculas NO TIENEN pH, es una característica del MEDIO. A medida que aumentamos el pH disminuye la concentración de protones y los grupos ionizables se desprotonan. A pH bajo están protonados puesto que hay una gran concentración de protones. El valor de pH determinado en el que se produce la desprotonación del grupo COOH a COO- es el pKa de dicho grupo. El valor de pH en el que el grupo NH3+ se desprotona dando lugar a NH2 es el pKa de dicho grupo. Cuando el grupo COOH se desprotona adquiere carga negativa y cuando el grupo NH3+ se desprotona pierde su carga positiva. En realidad, siguiendo la ecuación de Henderson-Hasselbach, el pKa es el valor de pH en el que la mitad de las moléculas de la especie están protonadas (para un determinado grupo ionizable) y la otra mitad están desprotonadas. Por encima de pKa, el grupo estará desprotonado (en la mayoría de las moléculas) y por debajo, protonado (en la mayoría de las moléculas). Si la concentración de R-COO- = a la concentración de R-COOh, implica que pH=pK puesto que log 1= 0. La especie que tiene carga 0 (presenta COO- y NH3+, es un ion dipolar) es el ión zwitterion. El punto isoeléctrico (pI) es el valor de pH en el que la especie está en forma de zwitterion (carga 0). Para calcular el pI, se hace la media entre los dos valores de pKa más cercanos a la forma de zwitterion del aminoácido. En el caso de los aminoácidos que presentan un grupo carboxilo en su cadena lateral, primero se desprotona el grupo carboxilo que está unido al carbono alfa, luego el grupo carboxilo de la cadena lateral y, por último, el grupo amino protonado que está unido al carbono alfa. En el caso de los aminoácidos que presentan un grupo amino protonado en su cadena lateral, primero se desprotona el grupo carboxilo que está unido al carbono alfa, luego el grupo amino protonado que está unido al carbono alfa y, por último, el grupo amino protonado de la cadena lateral. Decir si un aminoácido es ácido o básico depende del punto isoeléctrico (pI). Un grupo que está cargado positivamente no va a pasar a tener carga negativa y viceversa.  6. Efecto del pH sobre la solubilidad Una proteína es soluble si se ve rodeada de moléculas de agua, es decir si está solvatada. Si una proteína se ve afectada por un cambio de pH y cambia sus cargas, esta puede volverse insoluble. Los macroiones con carga neta similar se repelen mutuamente. Por esta razón, las proteínas tienden a ser solubles cuando tienen una carga neta, es decir, a valores de pH por encima y por debajo de sus puntos isoeléctricos. Si se mezclan macromoléculas con cargas positivas y negativas al mismo tiempo, la atracción electrostática hace que tiendan a asociarse unas con otras. La mayoría de las proteínas son muy solubles a pH elevado, donde todas sus moléculas están cargadas negativamente y se repelen entre sí. A pH bajo, las proteínas son solubles debido a que presentan carga positiva y también se produce repulsión entre sus moléculas. Sin embargo, en el punto isoeléctrico, donde una proteína no tiene carga neta, sus moléculas tienen zonas en la superficie con cargas positivas y negativas. Las interacciones electrostáticas entre estas cargas hacen que las moléculas tiendan a aglutinarse y precipitar. Por tanto, las proteínas tienen la mínima solubilidad en su punto isoeléctrico.  7. Efecto de la fuerza iónica en el medio (μ) ci = concentración del ión (en M, mol/L) Zi = carga del ión El aumento de la fuerza iónica (hasta un determinado punto) aumenta la solubilidad de las proteínas, incluso en el punto isoeléctrico. Las proteínas se encuentran interactuando con lociones de las sales y con las moléculas de agua. Este efecto de disolver las proteínas incrementando la concentración salina se denomina “salting in”. El aumento de la concentración salina hasta niveles muy elevados causa el efecto opuesto. En soluciones salinas muy concentradas, gran parte del agua que normalmente solvataría y ayudaría a solubilizar la molécula de proteína está enlazada en las capas de hidratación de numerosos iones salinos, impidiendo una hidratación suficiente de la proteína. Dicho de otra forma, todos los iones acaparan o secuestran todas las moléculas de agua y las proteínas se quedan sin moléculas de agua libres para disolverse, comenzando a precipitar. Así, con concentraciones salinas muy altas, la solubilidad de una proteína disminuye de nuevo, mediante un efecto denominado “salting out”. Puesto que las diferentes proteínas responden de manera diferente a estos dos efectos, con frecuencia se utilizan el “salting in” y el “salting out” para purificar (clasificar) las proteínas en una mezcla compleja. La sal que más se usa es la de sulfato de amonio [(NH4)2SO4], ya que es la de mayor fuerza iónica.  8. Cambio en la constante dieléctrica del medio (ε) Tiene que ver con las fuerzas de las interacciones electrostáticas entre partículas y cómo son influidas por el disolvente. F: fuerza de las interacciones electrostáticas ε: constante dieléctrica q1 y q2: carga de las partículas r: distancia entre las partículas Cuanto más pequeño es el valor de k, menos interacciones hay. Sabiendo lo anterior y el que k depende del medio, podemos decir que si añadimos un medio determinado haciendo que aumenten las interacciones entre proteínas, estas se volverán más inestables, por lo tanto precipitarán. Si comparamos qué ambiente tiene más interacciones, si el mar o el espacio, es el espacio el que más interacciones tiene, debido a que no hay nada que interfiera en estas; sin embargo en el mar, hay muchas partículas que las dificultan. En un entorno hidrofóbico la fuerza de interacción electrostática será alta, ya que la constante dieléctrica de las sustancias hidrófobas es baja y, por tanto, la k es mayor. Por el contrario, la fuerza de interacción electrostática en los entornos hidrófilos será muy baja, porque la constante dieléctrica de las sustancias hidrófilas es alta y, por tanto, la k es menor. Nada que ver esto aquí pero también hay que sabérselo:  9. Centrifugación La centrifugación es un proceso que emplea la fuerza centrífuga para separar y purificar mezclas de partículas biológicas en un medio líquido. Funciones: aislamiento y análisis de células, fracciones subcelulares, supramoléculas, complejos, macromoléculas aisladas (ultracentrifugación). La velocidad de sedimentación de una partícula en un líquido depende de: - Densidad y tamaño de partículas: cuanto mayor sea la densidad y la masa de la partícula mayor es su velocidad de sedimentación. - Densidad del medio: a mayor densidad del medio menor velocidad de sedimentación de la partícula. - Coeficiente de fricción: a mayor coeficiente de fricción menor velocidad de sedimentación. El coeficiente de fricción va en sentido contrario a la sedimentación de la partícula. Durante la centrifugación tenemos un campo centrífugo, una fuerza que se genera por el giro del rotor. Durante la centrifugación la velocidad de sedimentación depende de: - r = distancia radial de la partícula al eje de rotación en cm - ω = velocidad angular del rotor en rad/s Revoluciones por minuto (rpm) = cuántas veces gira la centrífuga en un minuto. El campo centrífugo suele expresarse como múltiplo del campo gravitacional de la tierra, en lo que se denomina campo centrífugo relativo (RCF). Ejemplo de ejercicio: Tenemos una precipitación de restos de tejido insolubles. Calcular el campo centrífugo relativo (RCF) sabiendo que el radio del rotor es 5cm y gira a 5000 rpm. Solución: ω = 2. 3,14. 5000 / 60 = 523,59 RCF = ω2. 5 / 981 = 1397 RCF no tiene unidades pero se suele poner g G = 1397 g Cálculo de rpm Velocidad de sedimentación y coeficiente de sedimentación radio de la partícula = r densidad de la partícula = pp densidad del medio = pm viscosidad del medio = η aceleración de la gravedad = g Los coeficientes de sedimentación de las subunidades de los ribosomas no son aditivos porque al componer el ribosoma no tienen la misma forma, y esto afecta al coeficiente de sedimentación. Tipos de centrífugas según el rotor - Centrífugas con rotores de ángulo fijo: el ángulo de la muestra siempre es el mismo. - Centrífugas con rotores verticales: la muestra está en vertical. - Centrífugas con rotores oscilantes: la muestra está suspendida y cuando empieza a girar se eleva. Es el que se ve en prácticas. Tipos de centrífugas según el tamaño: - Microcentrífugas (límite de 10.000 g): Separación de tejido en extractos. - Centrífugas de alta velocidad (límite de 100.000 g): Precipitación de proteínas, microorganismos, grandes orgánulos, etc. - Ultracentrífugas (900.000 g). Separación de estructuras subcelulares. Centrifugación diferencial Cuanto mayor sea el tamaño (y la densidad) de la partícula antes sedimenta, ya que su velocidad de sedimentación es mayor. La velocidad de sedimentación es directamente proporcional al tamaño de la partícula. De esta forma pueden separarse las partículas según su tamaño. Dejaremos la muestra más o menos tiempo en función de las moléculas que queramos extraer. Centrifugación isopícnica En una disolución podemos tener un gradiente de densidad, de manera que podemos tener un tubo de ensayo en la que se vierten, por ejemplo, una disolución de sacarosa (o ficol, o cloruro de cesio) al 40%, posteriormente (y despacio para que no perturbe la densidad del nivel anterior), otra disolución al 30% y así sucesivamente. En ese tubo de ensayo vertemos un extracto con moléculas de diferente densidad. Cuando la densidad de una partícula se iguala con la del medio, la velocidad de sedimentación es 0, por lo que se queda en el lugar del gradiente en el que su densidad es igual a la del medio. De esta forma podemos extraer cada fracción (tras la centrifugación) y las moléculas quedan separadas. La centrifugación no rompe el gradiente de densidad, pero si nosotros lo agitamos sí que se rompe. Centrifugación zonal En este tipo de centrifugación tenemos otro gradiente de densidades pero todas las moléculas del extracto tienen mayor densidad que la máxima densidad del gradiente. Las partículas sedimentan según su tamaño, y se clasifican de esa manera. Fraccionamiento subcelular Es el proceso de centrifugación mediante el cual se consigue separar todos los elementos de la célula. Se trata de una centrifugación diferencial puesto que las partículas van sedimentando en función de su masa y densidad (y no existe un gradiente de densidades). Por ejemplo, el núcleo es el más denso de todos los componentes celulares (porque contiene la cromatina), por lo que será el primero en sedimentar,tal y como podemos observar en la imagen. Fraccionamiento mitocondrial En las mitocondrias podemos encontrar las siguientes enzimas: - Glutatión transferasa. Está en la membrana externa pero en puntos de contacto con la membrana interna. - Monoamino oxidasa. Está en la membrana externa. - Succinato deshidrogenasa. Está en la membrana interna. Se pueden obtener mitocondrias intactas mediante centrifugación diferencial, tal y como se puede ver en el apartado del fraccionamiento subcelular. Mediante un proceso de sonicación, la mitocondria se divide en vesículas con materiales de la membrana interna, otras con materiales de la membrana externa y otras con materiales de las zonas de contacto. Esta mezcla de vesículas se centrifuga durante 20 horas a 150.000 g, quedando al fondo las vesículas de membrana interna, después las de los sitios de contacto y, por último, la de la membrana exterior en la superficie. Se trata de una centrifugación isopícnica porque la clasificación se produce en un gradiente de sacarosa del 30-70%. Se puede comprobar que la separación de estas vesículas ha sido correcta midiendo la cantidad de las enzimas en el gradiente que corresponden a cada vesícula (mencionadas anteriormente) a través de un ensayo enzimático. Luego se llevan al espectrofotómetro para medir la actividad de estas enzimas. Ultracentrifugación Se usa para calcular coeficientes de sedimentación. El coeficiente de sedimentación es la velocidad de sedimentación con respecto a la fuerza centrífuga. La ultracentrifugación puede llegar hasta los 900.000 g. Las ultracentrífugas tienen un sistema óptico que es capaz de ver como la molécula avanza (su sedimentación) a lo largo de la centrifugación. De esta forma se obtiene el valor del coeficiente de sedimentación de moléculas aisladas, generalmente de una sola molécula cada vez. Tipos de centrifugación: resumen ❖ Centrifugación preparativa - Clarificación de extractos. - Extracción de ADN, lipoproteínas, etc. - Fraccionamiento subcelular. ❖ Centrifugación analítica - Determinación del coeficiente de sedimentación. - Determinación de la masa molecular. - Cambios conformacionales. - Estudio de complejos moleculares. - Estudios de unión ligando-receptor. La centrífuga preparativa, que es la que usamos nosotros en el laboratorio, lleva a cabo la centrifugación diferencial. La ultracentrifugadora lleva a cabo la centrifugación zonal y la isopícnica.  TEMA 4 Absorción de luz – Espectrofotometría y Luminiscencia 1. Absorción de luz y transición electrónica La transición electrónica es el cambio en el estado cuántico de un electrón. Para explicar la absorción de la luz, debemos saber que existen: - Un estado basal (ground state), que corresponde a un orbital molecular enlazante. Tiene menor energía que el estado excitado. - Un estado excitado (excited state), que corresponde a un orbital molecular antienlazante. Tiene mayor energía que el estado basal; de hecho, tiene más energía de la que debería y por eso es inestable. La energía en los átomos se encuentra cuantizada, es decir, está restringida a determinados valores. La emisión de radiación electromagnética no es continua,sino que se produce en forma de “paquetes” de energía llamados fotones. La luz es una radiación electromagnética, se transmite como partícula y como onda. Para que un electrón que se encuentra en el estado basal pase al estado excitado, es decir para que se promueva un electrón, se necesita absorber un fotón que tenga una energía similar a la diferencia de energía entre ambos niveles energéticos. Tanto el estado basal como el estado excitado no tienen un nivel energético concreto, sino que son una colección de estados. Por ello, se absorben varios fotones con energías similares cuando se promociona un electrón. Para representar estos orbitales, se utiliza un método en el que cada uno consta de 4 líneas, cada una de ellas referida a un tipo diferente de suborbital atómico (s,p,d,f). El conjunto completo de líneas se denomina singlete. La energía de un fotón se calcula mediante la ecuación de Planck:  2. Absorción de luz - orbital π Los electrones solo pueden captar la energía de fotones de una longitud de onda determinada. No todos los electrones de todos los enlaces son capaces de absorber luz, sino solamente los enlaces π. Cuando tenemos dos enlaces dobles la energía media de los OM enlazantes es la misma que si tuviésemos un solo enlace doble en la molécula. Lo mismo ocurre en los OM antienlazantes. Sin embargo, la energía necesaria para promocionar un electrón del estado basal al estado excitado es menor que si tuviésemos un solo enlace, es decir, que la longitud de onda del fotón necesario es mayor. Esto ocurre cuanto mayor sea el número de enlaces dobles conjugados (con un enlace simple en medio) que estén presentes en la molécula. A mayor número de dobles enlaces conjugados en la molécula, mayor longitud de onda del fotón. - Disolución con color = molécula que absorbe luz visible = tiene 7 o más enlaces conjugados. - Disolución transparente = molécula que absorbe luz UV = tiene 6 o menos enlaces conjugados.  3. Espectro de radiación electromagnética 4. Espectrofotómetro El espectrofotómetro permite ver la absorción de luz de una disolución (las muestras deben estar disueltas). Las técnicas espectrofotométricas permiten la cuantificación de moléculas a partir de la medida de la radiación absorbida por éstas a diferentes longitudes de onda. Nota: unidades del cromatograma son absorbancia/nm PROCESO: 1º Fuente de luz: emite luz UV (lámpara de deuterio) o luz visible (lámpara de tungsteno). 2º Monocromador que actúa como selector y encargado de aislar una radiación de una determinada longitud de onda. 3º Cubeta espectrofotométrica que contiene la muestra 4º Detector mecánico que detecta radiaciones no absorbidas por la muestra.  5. Ley de Lambert-Beer En los espectrofotómetros, la anchura de la cubeta suele ser 1 cm, por conveniencia. La gráfica de la absorbancia es una línea recta. 6. Espectro de absorción NAD+ / NADH El espectro de absorción de una materia muestra la fracción de la radiación electromagnética incidente que un material absorbe dentro de un rango de frecuencias. Es, en cierto sentido, el opuesto de un espectro de emisión. En una gráfica de un espectro de absorción se representa la absorbancia en el eje Y y la longitud de onda en el eje X, osea, muestra la variación de la absorbancia conforme aumenta la longitud de onda. Los espectros de absorción de distintos cromóforos en la misma disolución son aditivos, es decir, cuando hay dos sustancias en una disolución existen máximos de absorción cuando ambas moléculas tienen máximos de absorción. La absorción de luz se produce por la promoción de los electrones situados en los dobles enlaces conjugados. NAD+ NADH es una enzima que interviene en las reacciones de transporte electrónico. Las moléculas de NAD+ tienen un número pequeño de enlaces dobles conjugados (que se encuentran en las bases nitrogenadas), por lo que absorbe longitudes de onda en el espectro de luz UV. Al pasar al NADH, cambia la disposición de los enlaces dobles y cambia el método de absorción. Existen diferencias en el espectro de absorción entre el NAD+ y el NADH debido a que presentan una disposición distinta de dobles enlaces. Ambos tienen un máximo de absorción en 260nm (todos los ácidos nucleicos tienen un pico de absorción en 260nm), pero el NADH tiene un pico adicional en 340nm. 7. Espectro de absorción de la clorofila La clorofila es un pigmento que participa en el proceso de la fotosíntesis (forma parte de los complejos proteicos Fotosistema I y II (PSI y PSII) en el cloroplasto). Tiene una cadena hidrocarbonada que le da propiedad hidrofóbica y que determina que se encuentre dentro de la membrana del tilacoide. La parte de la clorofila que absorbe la luz se denomina anillo tetrapirrólico, la cual contiene una gran cantidad de enlaces dobles conjugados. La clorofila A tiene 5 máximos de absorción. Los mayores se encuentran a 675 nm y 425 nm aprox. La clorofila B tiene 3 máximos, los mayores en 450 nm y 650 nm aprox. De manera que la clorofila tiene 2 zonas básicas de absorción: entre 300-500 nm (tonos azules y violetas, mayor energía), y entre 600-700 nm (tonos amarillos y rojos, menor energía). La clorofila absorbe el rango del morado, azul y el rojo, reflejando el color verde. Otros pigmentos fotosintéticos como el beta-caroteno, la luteína y otras xantofilas absorben la luz mediante los dobles enlaces conjugados de sus cadenas de carbono.  - Estados de excitación de la clorofila Los electrones pueden experimentar 3 tipos de cambios: - Transición electrónica. Es el paso de un electrón de un estado energético a otro. Es el cambio electrónico que necesita más energía. - Cambios vibracionales y rotacionales. - Cambio en el espín. Dependiendo del fotón absorbido, los electrones saltarán a un nivel u otro: Fotón azul →Menor longitud de onda→Mayor frecuencia de onda→Mayor energía→Saltan al segundo nivel (segundo singlete) Fotón rojo→Mayor longitud de onda→Menor frecuencia de onda→Menor energía→Saltan al primer nivel (primer singlete) Los electrones del enlace pi van a tener un estado de excitación en el color azul y otro en el rojo, absorberán fotones de esas energías llegando a los estados estables de excitación, e irán perdiendo energía gradualmente en forma de calor. En el nivel más alto de energía, la vida media del electrón es de un picosegundo (después de ese tiempo perderá energía y bajará al primer singlete) , mientras que, en el primer estado, es de un nanosegundo (después de ese tiempo perderá energía y bajará al estado basal). Los electrones bajan de un singlete a otro mediante cambios vibracionales y rotacionales. Llegará un punto en el que el electrón desprenderá energía desde el estado excitado directamente al estado basal. Esta energía se puede desprender de 4 formas: - Trabajo químico (se lleva a cabo en la fotosíntesis). - Transferencia de energía a otras moléculas. - Fluorescencia: Se emite luz (un fotón) de una longitud de onda mayor (menor energía) que la energía que se ha absorbido. Presenta una energía menor que la de absorción porque ha perdido anteriormente energía (cuando se absorbe un fotón no llega directamente al singlete, sino que pierde un poco de energía antes de estabilizarse en el mismo). - Fosforescencia: Los electrones, partiendo del primer singlete y perdiendo energía (desprendiendo calor), pueden pasar del primer singlete a un estado intermedio llamado triplete, que supone un cambio en el espín del electrón, siendo su vida media de 0,1 milisegundo a 10 milisegundos. La fosforescencia es la emisión de luz que tiene lugar cuando se pierde energía partiendo del triplete. Esta energía se puede transmitir al oxígeno dando lugar a las especies reactivas del oxígeno (proceso peligroso para el sistema). No ocurre ni en la transferencia de una energía a otra molécula ni en la luminiscencia ni en la transición electrónica, solo aquí. Por ello, la planta tiene pigmentos accesorios, que se encargan de que estas especies no sean dañinas para la planta. La fluorescencia y la fosforescencia se diferencian en el tiempo que los electrones tarden en emitir esa energía. La fluorescencia es prácticamente instantánea (ocurre durante la incidencia de los fotones) mientras que la fosforescencia tarda más, permitiendo que, si el haz de luz que incide sobre la molécula es cortado, la emisión de luz de la molécula se siga produciendo (en la fosforescencia la energía se acumula).  - Espectro de absorción / espectro de emisión de fluorescencia Existen algunas moléculas que sirven como marcadores para algunas sustancias, que al unirse producen un cambio en el espectro de absorción y cambian de color - Ans: permite detectar cambios en la conformación de las proteínas. - Fluoresceína: se une a anticuerpos. Al incidir una longitud de onda que excite a la fluoresceína emite luz. Permite ver donde esta una proteína específica en un corte histológico. - Fura-2: Sirve para medir los niveles de calcio en diferentes procesos. - Dansyl: Se une a los Aa y permite seguir su composición.  8. Cuantificación de moléculas mediante espectrofotometría UV/Vis - Cálculo del coeficiente de extinción molar - Se hacen disoluciones de distinta molaridad y a cada una le corresponde un valor de absorbancia distinto. - Anotamos los resultados en una gráfica y hacemos una recta que se ajuste a la nube de puntos representados. - Se toman 2 ptos aleatorios con sus correspondientes coordenadas (X1, Y1) y (X2,Y2) y se realizan operaciones de la siguiente manera: A la fórmula A= coef · l · c le corresponde Y=a+ bX ; se restan los valores X1 e Y1 con X2 e Y2, respectivamente, quedando que Y1-Y2=b(X1-X2) donde: A= Y1-Y2 Coef · l= b c= (X1-X2) Otra manera: El coeficiente de extinción molar será la pendiente de la recta creada, que puede ser obtenida restando dos valores de absorbancia, dividido entre la resta de las concentraciones respectivas. - Reacción colorimétrica Existen dos tipos de moléculas, las que poseen absorbancia directa y las que poseen absorbancia indirecta. - Absorbancia directa: naturalmente absorben luz. Ejemplo: ácidos nucleicos. - Absorbancia indirecta: necesitan combinarse con otros reactivos para producir complejos coloreados que absorben luz (método colorimétrico). Los Aa no tienen absorbancia porque no presentan dobles enlaces conjugados, pero si se combinan con sales cúpricas su absorbancia aumenta pudiendo cuantificar las proteínas. Una reacción colorimétrica es aquella en la que una molécula incolora reacciona con un tinte para crear un complejo coloreado. Existen proteínas con dobles enlaces y proteínas sin dobles enlaces, por lo que, para calcular la absorbancia de una, se ha de purificar (separar del resto). Al juntar aminoácidos o proteínas con otras sustancias, haciendo una reacción colorimétrica, se puede obtener su absorbancia. En el caso en el que una molécula no tenga dobles enlaces, no podemos medir su absorbancia por espectrofotometría. Las coenzimas, los pigmentos (carotenoides), y las porfirinas (clorofila) tienen absorbancia directa, su absorbancia se puede medir de forma directa. Algunas proteínas pueden medirse de forma directa. Se deben fundamentalmente a la tirosina y al triptófano, que poseen dobles enlaces conjugados en los anillos de sus cadenas laterales (absorben longitudes de onda de 278 nm), y al enlace peptídico, que tiene carácter parcial de doble enlace (absorben longitudes de onda de 190 nm). Se usa sobre todo la de la tirosina y el triptófano. No obstante, se suele realizar el estudio de las proteínas de forma indirecta, fundamentalmente mezclandolas con azul de coomassie (absorbe longitudes de onda de 595 nm). Tanto el ARN, como el ADN y los nucleótidos libres absorben a 260 nm, por lo que hay baja especificidad. Cuando se utiliza la difenilamina se puede detectar la desoxirribosa de las purinas, por lo que es específico para el ADN (método indirecto). Métodos colorimétricos enzimáticos: se utilizan para realizar el estudio espectrofotométrico de lípidos como el colesterol, e implican la presencia de enzimas. Los azúcares necesitan reacciones colorimétricas para poder determinarlos y el espectro de absorción es en la zona de luz visible. Los azúcares no presentan dobles enlaces conjugados. - Determinación de la actividad enzimática Podemos determinar una actividad enzimática gracias a la absorbancia. Conociendo la absorbancia de un producto, como en la reacción de reducción del NADH, podemos determinar su concentración. Conociendo cuánto ha tardado en darse la reacción, podremos determinar cuál es la actividad enzimática, expresada en mol/s o en mmol/s. Si desconocemos los productos de una reacción (o no son sustancias que podamos medir su absorbancia porque no tienen dobles enlaces conjugados), podemos realizar reacciones colorimétricas o reacciones acopladas con los productos. En caso de dar con una reacción secundaria en cuyos productos conocemos la absorbancia, podremos determinar las concentraciones de los reactivos, es decir, de los primeros productos. De la misma forma, obtendremos la actividad enzimática y la cantidad de enzima empleada. La diferencia entre una reacción acoplada y una colorimétrica es que la acoplada puede darse a la misma vez que la reacción primera.  9. Luminometría / Bioluminiscencia La bioluminiscencia (o luminometría) es el proceso a través del cual organismos vivos producen luz, resultado de una reacción bioquímica en la que comúnmente interviene la enzima luciferasa. Vamos a intentar explicar dos experimentos que están relacionados con este fenómeno, ambos realizados en plantas y ambos relacionados con la expresión génica. EXPERIMENTO 1 Tenemos el gen que codifica la enzima luciferasa. Para que comience la codificación de esta enzima, es necesario que se una un promotor. Este promotor va a corresponder al promotor que se une al gen que codifica una proteína determinada (imaginemos que es, por ejemplo, la rubisco). Esto hace que la luciferasa se forme en aquellos lugares en los que se debería haber formado aquella proteína determinada (en el caso de la rubisco, las partes fotosintéticas de la planta, las hojas). El objetivo de este experimento es saber dónde podemos encontrar esta proteína determinada en la planta y, por tanto, dónde realiza su función, dado que este lugar es donde va a tener lugar la reacción en la que participa la luciferasa y que desprende luz. En este experimento, lo que no sabemos es el factor de transcripción (proteína) que induce que el promotor comience la expresión del gen. EXPERIMENTO 2: Análisis de interacción factor de transcripción-promotor Este experimento se utiliza para saber qué promotor es más compatible con la síntesis de la luciferasa (por tanto, el más compatible con el factor de transcripción). Se introducen dos pares de plásmidos en la planta: la condición de control y la condición experimental. El primer par contiene dos plásmidos, uno de los cuales lleva un factor de transcripción, y el otro lleva el promotor (uno de los que se quiere probar) y el gen que codifica la luciferasa. El segundo par contiene otros dos plásmidos: uno de ellos no tiene nada (vector vacío) y el otro también lleva el promotor y el gen que codifica la luciferasa. Una vez que se ha formado la luciferasa, se extrae y se somete a un ensayo enzimático y medida luminométrica. El promotor que haya dado lugar a una luciferasa que catalice la reacción con mayor bioluminiscencia (la más exitosa) será el más compatible.  Tema 5 Cromato ra ía 1. Fundamento de la cromatografía Coeficiente de reparto (o de distribución) entre fases no miscibles en equilibrio Nos da una idea de cómo se distribuye una molécula entre dos fases no miscibles (no se mezclan) cuando se encuentra en equilibrio. Se utiliza para determinar el destino final de las sustancias químicas en el medio ambiente y en los seres vivos. También se utiliza para ver el potencial para generar daños de una sustancia tóxica, en función de si tiende o no a acumularse en los seres vivos (depende de lo soluble que sea en agua, a + solubilidad en agua + potencial para acumularse en seres vivos). Además, se utiliza para averiguar cual es el potencial que tiene un compuesto, un principio activo, para entrar en nuestras células (en función de su liposolubilidad, para que pueda atravesar la membrana plasmática de nuestras células). Ejemplo de la clorofila Estructura de la clorofila: - Cadena de fitol (hidrofóbica, apolar). Permite que la clorofila se una a las membranas de tilacoides de los cloroplastos. - Anillo tetrapirrólico: Contiene anillos con dobles enlaces, gracias a los cuales absorbe la luz (toda menos las longitudes de ondas que corresponden al verde, que la refleja, por eso es verde). Existe una enzima llamada clorofilasa que separa la cola apolar de la clorofila del anillo. Si extraemos clorofila con acetona (o hexano), la clorofila estará disuelta en el disolvente orgánico (por la cola apolar). Si añadimos agua y clorofilasa, la cola se separa del anillo y el anillo (parte verde porque es la que absorbe la luz) se disuelve en el agua porque es polar. La otra fase (hidrofóbica) queda separada de la polar, y en ella se encuentra la cola apolar. Ejemplo ácidos nucleicos Tanto el ADN como el ARN tienen carga negativa a ph 7-8 por sus grupos fosfato. Cuando el pH es ácido (4-5), los fosfatos se protonan, por lo que el ADN pierde su carga. Sin embargo, el ARN tiene otros grupos ionizables (OH) que tienen una pka menor, por lo que queda con carga. De esta forma, el ARN se queda en la fase de tampón de lisis (hidrófilo) y el ADN se queda en la fase de fenol/cloroformo. Los ácidos nucleicos no son solubles en alcohol, por lo que si cogemos la fase hidrofílica que contiene el ARN y la introducimos en alcohol, el ARN precipitará. Ejemplo con fase tampón de lisis y fase fenol/cloroformo En el tampón de lisis se encontrarán las moléculas polares (glúcidos, sales, iones, ARN a pH ácido). En el fenol/cloroformo, se encontrarán los apolares (lípidos). En la interfase se encontrarán las moléculas anfipáticas (proteínas con cadenas laterales polares y apolares, fosfolípidos,etc). 2. Distribución en contracorriente Sirve para calcular la solubilidad relativa de una molécula determinada en un sistema compuesto por dos fases inmiscibles entre sí, en equilibrio, a una temperatura específica. Consiste en un tubo que presenta una fase acuosa y una fase orgánica, no miscibles entre ellas; con este método se tiene el objetivo de aumentar la separación entre los dos solutos. La posición de las fases depende de la densidad de la fase orgánica con respecto a la fase acuosa (si es más densa estará abajo y si es menos densa estará arriba). El procedimiento consiste en el paso continuo de la fase acuosa a un nuevo recipiente una vez que ha alcanzado el equilibrio con la fase orgánica, para que luego en el recipiente donde se encuentra la fase orgánica se alcance un nuevo equilibrio que permita la separación de las sustancias de la fase orgánica (transportando un cierto número de sustancias a la fase acuosa, y quedando sustancias aún en la fase orgánica).  3. Cromatografía en columna Se presenta un recipiente (columna) que se va a llenar en su mayoría con una fase estacionaria(matriz sólida porosa); el resto del espacio se llena con la mezcla que se desea separar y justo encima, con una fase móvil, que por acción de la gravedad (o por acción de una bomba) irá transportando la muestra a través de la columna. Debido a que cada componente de la muestra presentará distintas interacciones con la fase estacionaria o la móvil, las sustancias se irán transportando a distintas velocidades consiguiendo su separación. Las moléculas que interaccionan menos con la fase estacionaria irán más rápido que las que interaccionan con ellas. El retardo que sufren las moléculas al atravesar la fase estacionaria viene determinado por el coeficiente de distribución entre las fases estacionaria y móvil. El tiempo de retención de cada molécula es distinto. Cada molécula entonces se puede recolectar por separado porque salen a diferente velocidad. Todo equipo cromatográfico cuenta con: - Columna: De diferente material, según la aplicación. Matriz cuidadosamente empaquetada: separaciones fiables y reproducibles. Suele ser transparente para ver si se forman burbujas que impiden el paso de las moléculas. Si tiene la longitud necesaria, se podrán separar moléculas con distinta velocidad de migración. - Sistema inyector: Deposita la muestra sobre la matriz de forma controlada, a una velocidad de flujo constante y reproducible. - Recolector de fracciones: En la placa roja se colocan distintos tubos, de manera que cuando gira se sitúa un tubo diferente debajo de la columna. Cuanto más rápido gire, menor será el volumen de líquido en cada tubo. Recoge volúmenes pequeños de forma separada para su posterior análisis. El análisis sirve para ver en cuál o cuáles de las fracciones se encuentra la molécula que me interesa. Elución en gradiente Es el control de tiempo de retención de cada componente de la mezcla variando las características de la fase móvil. Básicamente, el eluyente (fase móvil) que añadimos tiene cada vez más concentración de sales (por ejemplo), va aumentando poco a poco. Esto es porque tenemos dos tubos conectados, uno con eluyente a mucha concentración de sales y otro con poca concentración. Estos tubos están conectados y se van mezclando conforme pasa el tiempo, dando lugar a que el eluyente tenga cada vez más concentración de sales. Se utiliza para variar la interacción de las moléculas de la sustancia a separar con el eluyente. Equipo HPLC HPLC: cromatografía líquida de alta resolución “High performance liquid chromatography” Si la resolución es alta quiere decir que podemos separar con facilidad moléculas con características muy similares. Si, por ejemplo, estamos llevando a cabo una cromatografía por tamaño y podemos separar dos moléculas con un tamaño muy parecido, el sistema tendrá una alta resolución. La cromatografía se utiliza en laboratorio sobre todo para separar ácidos nucleicos y proteínas. Se combina con la espectrofotometría para poder diferenciarlos en función de su absorbancia a determinadas longitudes de onda. El tiempo de retención es el que tarda un soluto en pasar a través de una columna, es decir, el tiempo transcurrido entre la introducción de la muestra y la máxima señal del compuesto registrada en el detector. La señal es mayor cuanto mayor sea la cantidad del soluto, es decir, cuanto mayor sea la absorbancia. La cromatografía en columna explota las características de las moléculas en cuanto a su interacción con la fase estacionaria. Según la característica explotada de la interacción tenemos distintos tipos de cromatografía: - Débiles: de adsorción - Carga: de intercambio iónico - Hidrofobicidad: hidrofóbica - Capacidad de unión: de afinidad - Tamaño: de filtración en gel 4. Cromatografía de adsorción Explota la capacidad de la fase estacionaria de retener las moléculas de la fase móvil. Fase estacionaria: es un adsorbente (sólido poroso) con la capacidad de retener moléculas en su superficie mediante fuerzas débiles (fuerzas de van der waals, puentes de H) Las moléculas a separar compiten con el eluyente poor interactuar con la fase estacionaria, o sea, es una discriminación entre tipos de moléculas en función de la fuerza relativa de interacción. La elución de la muestra será tanto más rápida cuanto mayor sea la fuerza de interacción del eluyente con el soporte. Esta técnica tiene una resolución tan alta que incluso puede separar ADN bicatenario del monocatenario. El ADN monocatenario cuando variamos las condiciones sale antes que el bicatenario a igualdad de longitud de la hebra. 5. Cromatografía de intercambio iónico La matriz de la fase estacionaria está compuesta por celulosa o agarosa + un intercambiador de aniones o cationes. La afinidad de unión de una molécula en particular depende de la presencia de otros iones (que compiten por interactuar con la matriz) y el pH de la disolución (que influye en la carga neta de la molécula) Las proteínas de la mezcla a separar se eluyen selectivamente conforme aumenta la concentración de iones del eluyente. Estos iones del eluyente compiten con las proteínas para unirse a la matriz, de manera que la proteína más débilmente cargada eludirá a menor concentración de sal (o sea, más rápido/antes).  6. Cromatografía hidrofóbica La fase estacionaria está compuesta por una matriz sustituida con grupos no polares. La fase móvil es un tampón con una alta concentración de sales. Las interacciones son hidrofóbicas. Las partes hidrofóbicas de la proteína se pegan a la fase estacionaria, las partes hidrofílicas no. Las fuerzas hidrofóbicas se pueden maximizar aumentando la concentración de sales (ya que el efecto hidrófobo aumenta con el incremento de la fuerza iónica), provocando que estas queden más unidas a la fase estacionaria, o pueden minimizarse disminuyendo la concentración de sales, haciendo que las proteínas se despeguen. Las proteínas salen de la columna en orden de hidrofobicidad creciente. En realidad el eluyente puede tener una concentración decreciente de sal, ser un detergente o producir cambios de pH (esto no lo pillo jsjsj). 7. Cromatografía de afinidad Se basa en que las proteínas de la muestra se unirán a la matriz o fase estacionaria si esta presenta un ligando que encaje con la muestra (esta es una interacción específica no covalente). Podremos despegar la proteína si se añade un sustrato que presente el ligando de forma libre (que no forma parte de la fase estacionaria). Entonces, la fase estacionaria tiene ligandos inmovilizados (análogos estructurales del sustrato de una enzima). El eluyente tiene una concentración elevada del ligando libre, o bien un pH o fuerza iónica diferente. La ventaja de este método es que emplea las características bioquímicas únicas de la proteína de interés en lugar de las pequeñas diferencias en las propiedades físico-químicas entre proteínas. Se puede utilizar para separar nucleótidos y ácidos nucleicos, inmunoglobulinas, receptores de membrana y células y fragmentos celulares. Se emplea en la cromatografía de inmunoafinidad y en la cromatografía de complejo metal-quelato. Una proteína recombinante es una proteína a la que se le añade una cola con aminoácidos extra por clonación molecular. En la cromatografía de complejo metal-quelato, la cola de la proteína (por ejemplo, de histidina) se une a átomos de níquel que se encuentran en la matriz de la fase estacionaria. Ejemplo: Cromatografía de afinidad de la enzima isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP+. La actividad de la enzima se mide mediante espectrofotometría. La fase estacionaria es Matrex Gel Red.  8. Filtración en gel La fase estacionaria es una matriz de gel con porosidad variable. La matriz de gel está compuesta por numerosas bolitas de gel, que tienen un tamaño de poro variable. Una vez que se ha colocado la muestra, se añade más solvente (el solvente en el que están las moléculas a separar) para que empuje a las moléculas y favorezca su avance. Es importante aplicar una capa fina de moléculas a separar. La filtración en gel es una separación por tamaño. De esta manera, las moléculas que tienen un tamaño adecuado para atravesar los poros avanzarán más lento al atravesar los poros de la matriz de gel, mientras que las moléculas más grandes pasarían sin interactuar con la matriz, mucho más deprisa. Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) Kav: coeficiente de partición Ve: Volumen de elución Vo: Volumen de vacío Vt: Volumen total El volumen de elución corresponde a la fracción en la que se encuentra la mayor parte de la molécula de interés. Si las fracciones son de 1 mL y la mayor concentración de la molécula está en la fracción 5, el volumen de elución es 5 mL. El volumen de vacío es el volumen de líquido que queda entre el gel, y es igual al volumen de elución de la molécula más grande (que no penetra en el gel) Cuando Kav=0 , quiere decir que la molécula de interés es una molécula que no atraviesa los poros del gel. Es decir, Ve=Vo. El perfil de elución es el gráfico que representa la cantidad de soluto con respecto al volumen de elución. En este gráfico, la molécula azul es la molécula grande, la que no pasa por los poros de la matriz de gel. La molécula rosa es la pequeña, la que pasa por los poros del gel. El volumen de elución de la molécula rosa es mayor porque es la que sale de la columna después. Resinas para filtración en gel Cada una de estas resinas solamente se puede utilizar para filtrar moléculas que estén dentro de su rango. Ejemplo de la glutamina sintetasa La glutamina sintetasa es una enzima que cataliza la reacción de transformación del glutamato a glutamina. Es un octámero, es decir, su estructura cuaternaria (que es a su vez su conformación nativa) está compuesta por 8 monómeros de glutamina sintetasa. En un experimento se crea un chopo transgénico inplantándole el gen que codifica la glutamina sintetasa del pino (GS1). El chopo tiene otras dos glutaminas sintetasas propias, la GS1 y la GS2. Se puede observar que los chopos transgénicos crecen más que los normales. La masa molecular de las moléculas se mide en Dalton, D (unidad de masa atómica, u de toda la vida pero con otro nombre). Las masas moleculares de las glutaminas sintetasas son las siguientes: - GS1 Chopo: 320 kD (40 kD por monómero) - GS2 Chopo: 418 kD (52,25 kD por monómero) - GS1 Pino: 340 kD (42,5 kD por monómero) Entonces, mirando la tabla anterior, las resinas que podrían utilizarse para separar estas tres enzimas mediante filtración en gel son: - Sephadex G-200 (5-600 kD) - Sepharose 6B (10-4.000 kD) - Sepharose 4B (60-20.000 kD) - Sepharose 2B (70-40.000 kD) - Bio-Gel A-5 (10-5.000 kD) - Bio-Gel A-50 (100-50.000 kD)  9. Cromatografía en papel La fase estacionaria es una tira de papel de celulosa y la fase móvil es un solvente (etanol o agua). El procedimiento es el siguiente: - w es la distancia que recorre la muestra B desde el inicio del papela la posición final de la molécula sobre la fase móvil - x es la distancia que recorre la muestra C desde el inicio del papela la posición final de la molécula sobre la fase móvil - y es la distancia total que avanza el solvente en el papel 10. Cromatografía de gases (GC) La fase estacionaria es un líquido o sólido resistente a altas temperaturas y la fase móvil es un gas inerte (inactivo). La fase móvil implica que tienes una muestra líquida que se calienta, se convierte en gas e interactúa con un gas inerte, como el helio. Este es no reactivo, pero permite el desplazamiento de la molécula a través de la columna. Se utiliza para separar compuestos orgánicos que evaporen a menos de 400ºC y que no se descompongan al evaporarse, es decir, compuestos volátiles. Los diferentes compuestos de la muestra interaccionan de distinta forma con la fase estacionaria (según su nivel de evaporación) y salen de la columna a distinto tiempo (las más volátiles salen antes). El detector va grabando el tiempo de salida de cada compuesto de la columna, convirtiendo la cantidad de cada componente en una señal eléctrica que llega a la unidad de procesamiento de datos. En este tipo de cromatografía se utiliza una columna muy larga, de entre 1 y 100 metros de longitud. 11. Espectrometría de masas (MS) Suele acoplarse a la cromatografía de gases. Los compuestos separados por el CG se ionizan y se separan en función a su masa y su carga (ratio m/z). Permite que las moléculas, además de separarse por su volatilidad, se separen por su masa y por su carga. Se utiliza para: - Confirmar la identidad de un compuesto - Identificar compuestos desconocidos - Determinar propiedades estructurales y químicas de compuestos  Tema 6 Electroforesis 1. Fundamento de la electroforesis Es una técnica que permite separar moléculas mediante la acción de fuerzas eléctricas. La electroforesis es el movimiento de una molécula cargada en un campo eléctrico; por ejemplo: aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos o nucleótidos. v = velocidad de una molécula cargada en un campo eléctrico f = coeficiente de fricción con el medio, depende de la forma y masa de la molécula E = campo eléctrico (voltaje/cm) q = carga neta de la molécula r = radio de la molécula Tipos de soporte - Poliacrilamida: electroforesis en gel de Poliacrilamida (separar proteínas y ácidos nucleicos) - Agarosa: tiene un poder de reducción muy bajo (se usan para separar moléculas de ácidos nucleicos) - Almidón: en desuso Tipos de electroforesis de proteínas - Nativa: Las proteínas están en estado nativo, conservan sus estructuras. Se separan por tamaño y pI. - Desnaturalizante: Se usan proteínas desnaturalizadas, solo habrá una cadena de aa. Se usan SDS y calor para desnaturalizar. Solo se separan por tamaño. Las proteínas están cargadas negativamente, por lo que se desplazan hacia el polo positivo. - Isoelectroenfoque: Las proteínas están en su pI (ion dipolar). El gel es un gel especial, tiene una serie de moléculas llamadas anfolitos. Solo se separan por su pI  2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) Formación de la poliacrilamida: 3. Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) El SDS o dodecil sulfato sódico es un detergente que se utiliza para desnaturalizar proteínas. El SDS se une a todas las cargas positivas de las proteínas, que pasan a tener carga neta negativa. Además, la cadena hidrocarbonada del SDS interactúa con los residuos hidrofóbicos que se encuentran en el interior de la proteína, dejándolos expuestos al exterior. Procedimiento 1. El gel se coloca entre dos placas de vidrio finas, que se encuentran en contacto con dos tampones: uno superior con un polo negativo (cátodo, que atrae cationes) y otro inferior con un polo positivo (ánodo, que atrae aniones). El gel tiene agentes polimerizantes (tiene que formarse la poliacrilamida antes de colocar el gel concentrador). 2. Se coloca un gel concentrador en la parte superior, que hará que todas las proteínas se concentren antes de pasar por el gel separador. El gel concentrador se prensa con un peine que deja unos huecos donde se colocarán las muestras. 3. Las muestras se someten a un campo eléctrico y se desplazan hacía el polo positivo debido a que las proteínas han sido desnaturalizadas y tienen un polo negativo al estar unidas al SDS. A menor tamaño, mayor velocidad de desplazamiento y más distancia recorrida. Las proteínas se tiñen con un colorante llamado azul de Coomassie, de manera que se puede ver el lugar del gel donde queda la proteína. El método de experimentación consiste en poner en el primer hueco del gel concentrador proteínas con tamaño molecular conocido, para contrastar con las proteínas que se quieren determinar. Lo que se contrasta es la posición relativa de la proteína, es decir, la colocación determinada de la proteína en el gel según su masa molecular (medida en kiloDalton). La gráfica nos muestra que a menor masa molecular, mayor es la movilidad relativa. Proceso de purificación de una muestra de proteínas usando diferentes técnicas En la primera calle se representa la electroforesis del extracto crudo, sin haber separado aún ninguna proteína. A la izquierda aparece un patrón guía con masas moleculares en kD. En la segunda calle se representa la electroforesis de las proteínas extraídas al realizar una precipitación fraccionada (por salting out) con sulfato de amonio. En la tercera calle se representa la electroforesis de las proteínas extraídas mediante una cromatografía de intercambio iónico y en la última calle una electroforesis después de haber realizado una cromatografía de afinidad. Finalmente se ha obtenido la proteína de interés, gracias al uso de todas estas técnicas.  4. Western blot Una vez que hemos realizado la electroforesis desnaturalizante y tenemos en el gel las marcas de las proteínas, queremos saber cuál de todas ellas es nuestra proteína de interés. En primer lugar, se coloca el gel entre dos esponjas, una orientada hacia el polo positivo del campo eléctrico y otra orientada al campo negativo. Entre la esponja orientada al polo positivo y el gel hay una membrana de nitrocelulosa a la cual van a pasar las proteínas del gel, que están cargadas con carga negativa y se mueven hacia el polo positivo. Una vez en esta membrana, se añaden anticuerpos que se unen a mi proteína de interés (anticuerpo primario, anti-proteína de interés) Este proceso se conoce como HIBRIDACIÓN ANTI-PROTEÍNA. Al anticuerpo primario se une un anticuerpo secundario que lleva unido una enzima que al unirse a su sustrato desprende partículas coloreadas. Así podemos localizar visualmente nuestra proteína de interés. Para llevar a cabo este proceso es necesario conocer nuestra proteína de interés y tener el anticuerpo que se une a ella. El western blot nos sirve para saber dónde se expresan determinadas proteínas en los tejidos. Se puede aplicar a cualquier tipo de electroforesis SDS-PAGE. 5. Isoelectroenfoque (IEF) Las proteínas se van a separar en función de sus puntos isoeléctricos. El gel está formado por anfolitos (sustancias anfóteras), que contienen gran cantidad de grupos ionizables. Estos anfolitos van a crear un gradiente de pH al añadirle una diferencia de potencial. Las proteínas cargadas positivamente van a avanzar a través de este gradiente hacia el polo negativo (a mayor pH) hasta que alcancen el nivel de pH en el que se encuentran en forma de ion zwitterion, es decir, tienen carga neutra (pI). Las proteínas con carga negativa avanzarán hacia el polo positivo hasta alcanzar su pI. Una vez que han alcanzado su pI, las proteínas dejan de desplazarse porque su carga neta es 0.  6. Electroforesis en 2D Se puede hacer una separación en dos dimensiones, primero se separa por el pI y después se separan por tamaño. No se puede hacer en el sentido contrario ya que en la separación por tamaño las proteínas son desnaturalizadas y adquieren carga negativa, por lo que no podrán ser separadas por su pI. 1º Dimensión: Isoelectroenfoque con urea y detergente no iónico. En este caso, al ser un detergente no iónico, las proteínas se desnaturalizan pero no adquieren carga, sino que se quedan con su carga para clasificarlas según su pI. 2º Dimensión: Incubación en SDS y electroforesis en SDS-PAGE. Una vez que tenemos las proteínas separadas según su pI, se incuban en SDS y adquieren carga negativa. En el SDS-PAGE, estas proteínas se separan (de nuevo) según su tamaño. Esta técnica se utiliza para identificar enzimas con pequeñas modificaciones, por ejemplo, dos enzimas que se diferencian en sus fosforilaciones. En este caso, tienen el mismo tamaño pero diferente pI. Después de realizar esto puede someterse a un Western Blot para ver si mi proteína de interés presenta diferentes pI en distintas partes del organismo. Ejercicio ejemplo: ¿A qué pH dejaría de moverse en un isoelectroenfoque un dipéptido formado por Serina e Histidina cuyos pKa son pKa1=2, pKa2=6 y pKa3=9? 1. Dibujar dipéptido 2. Dibujar desprotonación (tener en cuenta orden desprotonación grupos ionizables) 3. Hacer media entre los pka entre los que se encuentre el zwitterion 7. Electroforesis de ácidos nucleicos La electroforesis de ácidos nucleicos sigue el mismo principio que la electroforesis de las proteínas, solo que suele realizarse en horizontal en lugar de en vertical (se introduce un peine en el centro para dejar marcados los huecos donde se introducen las muestras). El gel que se utiliza en este caso es el gel de agarosa. También hay un patrón guía con masas moleculares. Como los ácidos nucleicos tienen carga negativa se van a desplazar hacia el polo positivo cuando apliquemos el campo eléctrico. El desplazamiento de los ácidos nucleicos es exactamente igual que el de las proteínas: a mayor tamaño menor velocidad, a menor tamaño mayor velocidad. Para poder visualizar en qué parte del gel quedan las muestras el gel de agarosa se tiñe con bromuro de etidio. El bromuro de etidio es una molécula que se intercala en el ADN y genera mutaciones (por esta razón se ha venido sustituyendo por otros compuestos que también tiñen ADN pero no son tan dañinos). Gracias a este compuesto, el gel es fluorescente a la luz ultravioleta. Se necesita un sistema de protección para observar esta fluorescencia porque la luz ultravioleta daña la retina. Equipo de electroforesis En horizontal En vertical Todos tienen que tener una fuente de alimentación porque tiene que aplicarse un campo eléctrico.  Tema 7 Hibridación y PCR 1. Características del ADN Una molécula de ADN está formada por dos cadenas de polinucleótidos, enrolladas alrededor de un eje imaginario formando una doble hélice. Las dos cadenas de polinucleótidos son antiparalelas, es decir, sus enlaces fosfodiéster 5’, 3’ tienen sentidos opuestos. Existe complementariedad entre ambas cadenas, ya que sus bases nitrogenadas están enfrentadas formando puentes de hidrógeno entre ellas. La adenina se une a la timina mediante dos enlaces de hidrógeno y la citosina se une a la guanina mediante tres enlaces de hidrógeno. Las bases nitrogenadas absorben radiación en el rango UV, con un máximo de absorción a 260 nm. Cuando el ADN está en forma de doble cadena absorbe mucho menos que cuando se encuentra en forma de cadenas simples (dos cadenas simples). La desnaturalización del ADN consiste en la separación de las dos hebras, es decir, en la rotura de los puentes de hidrógeno que las mantienen unidas. Esto se logra con calor. Tm (melting temperature) es la temperatura en la que la mitad de las moléculas de ADN están en forma de doble hélice y la otra mitad están desnaturalizadas. Depende de la longitud de la cadena y de la cantidad de bases G y C.  2. Southern blot Sirve para reconocer una molécula de ADN específica. Las moléculas se encuentran dentro del gel (de agarosa) y estas se extraen mediante la colocación del siguiente sistema: En un recipiente que presenta un buffer, se coloca un papel cromatográfico en contacto con el mismo; sobre el papel, se coloca el gel y sobre este, se colocará otro papel de nitrocelulosa que será al que se adhieran las moléculas. Por encima se colocan otro papel cromatográfico, una sustancia absorbente y peso. El papel que está en contacto con el buffer servirá para que la sustancia suba por capilaridad pasando por el gel y haciendo que el ADN se mueva hasta el papel de nitrocelulosa, ordenándose por tamaño. Procedimiento 1. Se hace una extracción de ADN. El ADNbc sufre un tratamiento con calor para que se desnaturalice y se convierta en ADNmc. 2. El ADNmc se digiere por enzimas de restricción, es decir, se corta por partes obteniendo secuencias más pequeñas. 3. Las secuencias de ADN obtenidas se separan mediante electroforesis. Posteriormente se someten a una separación por tratamiento alcalino. 4. Transferencia de las secuencias del gel a membrana de nitrocelulosa o nylon. Se produce por capilaridad. El buffer asciende por capilaridad y arrastra al DNA hasta la membrana. 5. Hibridación con sonda específica marcada. La sonda específica es una secuencia de ADN complementaria a mi secuencia de interés. Se realiza una sonda (ver siguiente apartado) y se incuba sobre el papel de nitrocelulosa para que se hibride con el ADN presente en el papel. Tras un lavado, se observará qué partes se han unido y con ello se confirmará la presencia del fragmento de ADN buscado (al hibridar con la sonda se muestran marcas de hibridación). Imaginemos que hemos estado trabajando con una proteína. Con la técnica de southern blot podemos saber cuántos genes codifican para una proteína determinada. Quizás en un tejido se expresa la proteína por un gen X y en otro tejido se expresa por un gen Y (una proteína puede estar codificada por varios genes diferentes). 3. Producción de una sonda marcada e hibridación 1. Marcaje de la sonda con fósforo 32 Se desnaturaliza la doble hélice de ADNbc por calor para obtener ADNmc. Una vez tenemos una cadena simple de DNA, añadimos unos oligonucleótidos hexámeros, formados por seis nucleótidos aleatorios. Algunos, si son compatibles, se unirán a la cadena simple (alguno se pegará a la secuencia específica 100%). Como los hexámeros funcionan como primers (crean el extremo 3’ -OH libre), añadimos el fragmento klenow y desoxi-ATP marcado con un isótopo radiactivo (³²P -dATP). El fragmento klenow añade desoxirribonucleótidos al oligonucleótido (el primer oligonucleótido que se haya unido) por el extremo 3’ -OH (si no no puede añadir nucleótidos) y va polimerizando la hebra complementaria. Con esto se consigue que la cadena complementaria que se está formando esté cargada y marcada. Así se obtiene la sonda. 2. Hibridación de la sonda marcada con la membrana de nitrocelulosa Una vez creada la cadena complementaria, se vuelve a calentar para separar las moléculas formadas (sondas) y se añaden al filtro de nitrocelulosa creado en el southern blot para observar qué cadenas complementarias se hibridan con las cadenas en el papel. 3. Incubación de película autorradiográfica con la membrana hibridada con sonda marcada y revelado de la señal Las cadenas de la membrana de nitrocelulosa que no se han unido a ninguna sonda se eliminan. Posteriormente, se transfieren las moléculas que quedan (las hibridadas) a una película autorradiográfica y se obtienen las marcas de hibridación. 4. Northern blot Sirve para reconocer una molécula de ARN específica. En este caso, no es necesario realizar desnaturalización, porque el ARN (suele ser monocatenario) se puede unir directamente con la sonda. Procedimiento 1. Extracción de ARNm 2. Separación mediante electroforesis 3. Transferencia a membrana de nitrocelulosa o nylon 4. Hibridación con sonda específica marcada El ARNm es la expresión de los genes, el paso previo a la síntesis de proteínas. Con esto se puede observar, en las distintas etapas de crecimiento de una planta, la cantidad de proteínas que se codifican, es decir, seguir la expresión de un gen a lo largo del crecimiento de la planta. Abajo se representa todo el ARN teñido con azul de metileno. Mediante estos experimentos podemos determinar la etapa del crecimiento de la planta en la que cada una de las proteínas tiene mayor expresión. 5. PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) Consiste en una amplificación exponencial de la información genética. Sirve para multiplicar las moléculas de ADN. En definitiva, es la replicación de una secuencia de ADN específica in vitro, en un tubo, de forma artificial. Procedimiento (un ciclo) 1. Desnaturalización. En primer lugar partimos de un ADN molde, bicatenario. El ADN se desnaturaliza a 95ºC y obtenemos ADN monocatenario (dos hebras separadas). 2. Hibridación. Las hebras se hibridan a 50º-65ºC. Se añaden el oligonucleótido en sentido y el oligonucleótido en antisentido. Los oligonucleótidos están diseñados para que sean complementarios a mi gen (las hebras). El oligonucleótido en sentido (5’-3’) se une a la cadena 3’-5’; el oligonucleótido en antisentido (3’-5’) se une en la cadena (5’-3’). 3. Extensión (72ºC). La polimerasa se une a los oligonucleótidos y añade desoxirribonucleótidos para completar la hebra complementaria. Este ciclo se repite unas 30-35 veces, obteniendo aproximadamente 68 billones de copias del gen seleccionado. Solo amplificando las moléculas se pueden ver las moléculas del virus (la cantidad de moléculas del virus es tan poca que hace falta amplificarla para verla). Cuando se amplifica la molécula vírica, se somete a electroforesis para ver si hay bandas. 6. qPCR (PCR cuantitativa) Tiene los mismos componentes que una PCR normal y sigue los mismos pasos, pero añadiendo SYBR GREEN. Es una molécula que se une a la doble hebra de ADN haciendo que sea fluorescente. Hoy en día la qPCR ha sustituído al Northern Blot en los análisis rutinarios de expresión génica. 1. Extracción de ARNm 2. Síntesis de cDNA 3. qPCR usando el cDNA como molde Cada una de las copias de la doble hélice va a estar marcada con esta molécula. Conforme avanzan los ciclos aumenta la fluorescencia pq vamos aumentando el número de moléculas. Si partimos de más moléculas, la fluorescencia se alcanzará antes. En función del ciclo en el que comience la fluorescencia (o llegue a cierto nivel de fluorescencia) podemos determinar el número de moléculas del que se parte antes de amplificar. Por ejemplo, el paciente cuya qPCR comience a fluorecer antes tendrá una mayor carga vírica, porque se parte de un mayor número de moléculas. Entonces, la qPCR se puede utilizar tanto para detectar la enfermedad como la carga vírica del paciente (a mayor carga vírica, mayor potencial para contagiar; una carga vírica baja indica que el paciente se encuentra en las fases tardías de la enfermedad). El termociclador es el aparato que mide la fluorescencia de las muestras en cada ciclo. Aplicaciones qPCR - Amplificación de ADN de interés. Realización de sonda. El ADN del cual se crea la sonda específica se obtiene mediante PCR. - Análisis de ADN en sangre, superficies, etc (escenas del crimen y eso) - Descubrimiento de nuevos genes - Creación de mutaciones, cambiando los nucleótidos de los oligonucleótidos que se utilizan en la PCR - Detección de enfermedades (actividad microbiana). - Secuenciación de DNA de dinosaurios, animales extintos, etc - Producción de proteínas nuevas