Ronéo 2 Génétique - Techniques et Approches Diagnostiques des Maladies Génétiques PDF

Acide nucléique : ADN ET ARN Évolution technologique très rapide. **L'ADN est plus stable que l'ARN mais les deux sont vulnérable à la digestion par les nucléases une fois que la cellule a été lysée.** Nucléase : couper ; polymérase= copier ; ligase=coller. Le + courant c'est d'extraire l'ADN dan...

Acide nucléique : ADN ET ARN Évolution technologique très rapide. **L'ADN est plus stable que l'ARN mais les deux sont vulnérable à la digestion par les nucléases une fois que la cellule a été lysée.** Nucléase : couper ; polymérase= copier ; ligase=coller. Le + courant c'est d'extraire l'ADN dans le sang total. On peut séparer les 2 brins d'ADN en fragment simple brin juste en chauffant à 95° 25° reformation des liaisons hydrogènes. Et chute de température choc à 4° les liaisons n'ont pas le temps de se former et l'ADN reste à simple brin. Quelque ml de sang total suffise. Prélevé sur anticoagulant (EDTA ou acide éthylène diamine tétraédrique) GR : cellule anucléée pas de noyau donc pas d'ADN Prise de sang GB et grâce à une solution hypotonique les GR vont gonfler et exploser on peut donc s'en débarrasser. Garce à la centrifugeuse on récupère les leucocytes au fond soit les GB qu'on va laver pour enlever le reste comme le plasma hémoglobine le reste de GB lysés Solution de Phénol-chloroforme = éliminer les protéines. On rajoute de l\'éthanol qu\'on met dans un tube froid en présence de sel L\'ADN va précipiter dans le tube on retrouvera une solution aqueuse qui contient de l\'ADN qui est la phase supérieure lorsqu\'on met la solution pour l\'élimination définitive des protéines on obtient 2 phases différentes séparées par une galette de protéines dégradée dans la phase inférieure on trouvera du phénolique. Re suspension= dissolutions de l\'ADN qui étaient sous forme de précipités visibles blancs solides. On va quantifier L\'ADN A l\'aide d\'un spectromètre. Grâce au dosage d\'un petit échantillon de la suspension obtenue on connaît la concentration de notre ADN génomique, cette ADN est conservée à 4° dans une DNAthèque pendant extrêmement longtemps car très stable à cette température. 1. **Utilisation de l'ADN ancien pour des études génétiques** : On peut conserver et réutiliser l'ADN des patients des années plus tard pour des diagnostics grâce à de nouvelles connaissances scientifiques. 2. **Extraction de l'ARN** : L'ARN est plus difficile à manipuler que l'ADN car il est très instable et sensible aux ribonucléases, nécessitant des conditions très strictes de manipulation. 3. **ARN polyA+** : Les ARN messagers matures possèdent une queue poly-A, ce qui permet de les isoler lors de l'extraction pour des études spécifiques sur l'épissage ou l'expression des gènes. **Phrase à retenir** : "les ARN polyA+ représentent 1% des ARN totaux" +++ 4. **PCR (Polymerase Chain Reaction)** : Technique de base en biologie moléculaire pour amplifier une région spécifique de l'ADN à partir d'une petite quantité. **Phrase clé** : "Cette technique a été rendue possible grâce à la découverte de la Taq polymérase, une enzyme thermostable capable de fonctionner à 95°C." +++ **Point de vigilance** : **Contamination** -- très fréquente dans la PCR car elle est extrêmement sensible aux contaminations, notamment par l'air+++. 5. **Étapes de la PCR** : **Dénaturation à 95°C** **Hybridation des amorces à 55°C** **Élongation à 72°C** (Taq polymérase active) 6. **Nombre de cycles** : La PCR se répète entre **30 et 45 cycles**. Chaque cycle double la quantité d'ADN, aboutissant à des molécules au bout de n cycles. 7. **PCR en temps réel** : Technique permettant de quantifier l'ADN amplifié après chaque cycle, par mesure de fluorescence grâce à un agent intercalant (SYBR Green) +++. 8. **Gel analytique et électrophorèse** : Permet de visualiser la taille des fragments d'ADN. L'ADN migre du - vers le + grâce à sa charge négative+++. 9. **Bromure d'éthidium** : Agent intercalant mutagène utilisé pour visualiser l'ADN sous UV+++. **Rappels et avertissements :** Conserver l'ADN pour des études futures est essentiel et simple !! La PCR est **très sensible aux contaminations**+++, donc un flux monodirectionnel et des contrôles stricts sont indispensables+++. **Contamination** : Attention aux contaminations par l'air, les échantillons peuvent être très volatiles+++. V - Achondroplasie : 1. **Généralités** L'achondroplasie est une maladie rare, bien qu'elle soit la chondrodysplasie la plus fréquente (1/15 000 naissances). Les chondrodysplasies affectent les cartilages, essentiels à la croissance. Le diagnostic est généralement évoqué lors de l'échographie du deuxième trimestre, qui vise à détecter des anomalies morphologiques, avec comme signe d'appel principal des "fémurs courts". 2. **Signes cliniques** Pendant la surveillance du fœtus, des biométries fœtales sont réalisées, mesurant notamment les os longs comme les fémurs. Chez un fœtus atteint d'achondroplasie, ces fémurs sont significativement plus courts. D'autres symptômes incluent une petite taille (environ 130 cm), une hyperlordose, des mains courtes, une macrocéphalie, et une dysmorphie faciale avec un front haut et une ensellure nasale marquée. Cependant, l'intelligence reste normale. Des complications neurologiques, telles que la myélopathie, peuvent survenir. 3. **Transmission** L'achondroplasie est une maladie monogénique à transmission autosomique dominante : un individu atteint a 50 % de chances de transmettre la maladie à sa descendance. Cependant, 90 % des cas sont dus à une néomutation, c'est-à-dire que les parents ne sont pas atteints. Les formes homozygotes sont plus graves mais rares. 4. **Génétique** Le gène responsable est le *FGFR3* (Fibroblast Growth Factor Receptor 3), qui joue un rôle crucial dans la formation osseuse. La mutation impliquée dans l'achondroplasie se situe toujours au codon 380 du gène, où la glycine est remplacée par une arginine en raison d'une substitution de la guanine par une adénine ou une cytosine. 5. **Diagnostic et cas clinique** Le diagnostic est souvent effectué en prénatal, suite à des signes d'appel échographiques comme les fémurs courts. Voici les étapes pour diagnostiquer la maladie génétiquement : A. **Prélèvement amniotique et extraction de l'ADN** Grâce à une ponction amniotique, on extrait l'ADN des cellules fœtales présentes dans le liquide amniotique. B. **Amplification par PCR** La PCR permet d'amplifier un fragment d'ADN de 164 paires de bases incluant la position 1138, où se trouvent les mutations en cause. C. **Vérification des amplicons sur gel d'agarose** Une électrophorèse est réalisée pour vérifier la taille des amplicons (164 paires de bases). D. **Digestion enzymatique des amplicons** Ensuite, une digestion enzymatique est effectuée avec deux enzymes spécifiques (*Bfmi* et *Hpall*) pour déterminer la nature de la mutation (G → A ou G → C). E. **Vérification de la digestion enzymatique** L'électrophorèse permet d'analyser la digestion et de confirmer la présence ou l'absence de mutation. F. **Vérification par séquençage** Le séquençage, notamment par la méthode de Sanger, permet de confirmer le diagnostic en lisant directement la séquence de l'ADN, pour identifier précisément la mutation responsable.