Tema 9 Espectrometría de Masas PDF

ESPECTROMETRÍA DE MASAS 1. Introducción Es universal y específica Es cualitativa y cuantitativa Puede analizar mezclas complejas Posee gran sensibilidad Es muy versátil Suministra información isotópica Es una técnica muy rápida....

ESPECTROMETRÍA DE MASAS 1. Introducción Es universal y específica Es cualitativa y cuantitativa Puede analizar mezclas complejas Posee gran sensibilidad Es muy versátil Suministra información isotópica Es una técnica muy rápida. ➔ Señales no son barras, son picos con algo de anchura. 2. Partes de un espectrómetro de masas Introducción de la muestra: Directa, GC, LC.} Vacío Fuentes de iones: EI, CI, MALDI, ESI, APCI, APPI.} Vacío o atm (ESI y APCI) Analizador: Q, TOF, IT, Orbitrap, QqQ, QTOF, Q-Orbitrap} Vacío Detector: multiplicador de electrones (dinodos) canales multiplicadores de electrones (con corriente E amplificada → señal)} Vacío 1º vacío bajo (0,1 mbar), bomba externa 2º alto vacío (turbomoleculares), interna 3. Fuentes de iones Fase gas: EI, CI, APCI (Atmosphere Pressure Chemical Ionization), APPI (Atmospheric Pressure Photoionization) ➔ Necesidad de que las moléculas pasen a fase gas y sean estables Desorción: (f. líquida o sólida) ESI, MALDI ➔ No es necesario que pasen a fase gas Fuentes duras: la energía que se transfiere a la molécula es muy alta y hay mucha fragmentación, generarán espectros con muchos picos (m/z) por debajo de la masa molecular (fragmentos). Para obtener una “huella dactilar” de la molécula. Para ionizar elementos (ICP-MS) Fuentes blandas: generan poca fragmentación, se ve el ion molecular, se transmite menos energía a la molécula y el MI no rompe. Para conocer que molécula es exactamente. Impacto electrónico: Fase gas, fuente dura. La muestra se somete a una temperatura suficientemente elevada como para producir un vapor molecular, el cual posteriormente se ioniza, bombardeando las moléculas originadas con una de e- de elevada energía. Analito se pasa a fase gas y se introducen. Sobre ellas impactan electrones de alta energía con un filamento calentado a alta T. Los electrones salen con E=70 eV, tiene que ser mayor o igual al potencial de ionización de las moléculas (8-10 eV), se supera para alcanzar buena sensibilidad y evitar pérdidas de choques inefectivos. En el interior hay alto vacío. Los iones se enfocan y se aceleran con un potencial. Muchas veces no se observa el pico del ion molecular con este método. A la salida de GC siempre hay EI. M + e- →M+ + 2e- Ionización química: Solución a la pérdida del ion molecular en EI, menos energética a vacío también. Estructura similar a EI, exceptuando que está a vacío pero con cierta presión de un gas en su interior (gas en exceso). Los electrones impactan con ese gas y forman iones reactivos que pueden interaccionar entre sí dando lugar a especies reactivas de ese gas y estas interaccionan mediante interacciones ion-molécula con los analitos. A estos analitos les llega mucha menos energía. En la ionización química los átomos gaseoso de la muestra se ionizan al colisionar con los iones producidos al bombardear con electrones (ionización por IE) un exceso de gas reactivo. 1. El gas reactivo que se encuentra dentro de la cámara a una presión parcial 10 o 100 veces mayor que la muestra. Se ioniza por bombardeo con un haz de electrones de 200-500 eV 2. Los iones del gas formados reaccionan con moléculas neutras del mismo gas a través de mecanismos de reacción ión-molécula. Esto origina uno o más iones estables reactivos. 3. Las moléculas de la muestra se ionizan por reacciones ion-molécula en fase gas con los iones estables del gas reactivo. Se pueden generar tanto iones positivos como negativos: modo positivo o modo negativo Positiva: transferencia de protones (más común) cuando el analito tiene mayor afinidad protónica que el gas, sustracción de hidruros, reacciones de condensación, reacciones de intercambio de cargas. Negativa: captura de electrones (en EI no pasa porque las moléculas captarían solo electrones de baja E), captura de electrones disociativa, formación de pares iónicos y reacciones Ion-molécula. Ionización por electronebulización (ESI): Fuente blanda, no requiere que la muestra esté en fase gaseosa. La muestra, en fase líquida, se introduce a través de un capilar al que se aplica un potencial elevado (2000-4000 V). Este potencial genera una separación de carga (dipolos) en las moléculas de disolvente que transportan el analito. Las cargas positivas son atraídas hacia el electrodo negativo. En el extremo del capilar, las moléculas forman un menisco cónico (cono de Taylor), que se rompe debido a las fuerzas electrostáticas, formando un jet o chorro. Este chorro se fragmenta aún más, creando un spray bajo la influencia del campo eléctrico. Para optimizar la formación del spray, se utiliza: o Un flujo pequeño de líquido (apropiado para nanoHPLC, no para HPLC convencional). o Insuflación de gas (generalmente N2) para mejorar la nebulización. o N2 caliente a contracorriente para reducir el tamaño de las gotas mediante evaporación del disolvente. A medida que el tamaño de las gotas disminuye, la densidad de carga superficial aumenta mientras se mantiene la tensión superficial. Cuando la tensión coulómbica supera la tensión superficial, las gotas se dividen en otras más pequeñas, en un proceso continuo que lleva a tamaños nanométricos. Finalmente, ocurre la desorción de los iones tras la completa vaporización del disolvente. Ventajas y aplicaciones: Funciona eficazmente con moléculas ya ionizadas o ionizables. Es ideal para proteínas con grupos ácidos y amino, ya que permite su ionización múltiple. La ionización múltiple reduce la relación m/z, facilitando la detección incluso con detectores de menor rango. Reconocimiento: Este método fue galardonado con el Premio Nobel en 2002 debido a su impacto en la ionización de macromoléculas como proteínas, algo que no era posible con métodos como EI (ionización por impacto electrónico) La ionización por electronebulización se realiza en condiciones atmosféricas de presión y temperatura. Indicada para moléculas ionizadas o fácilmente ionizables en disolución. Es posible el análisis de moléculas con pesos de hasta 106 uma Poca fragmentación, se obtiene el ion molecular Se pueden utilizar disolventes orgánicos (metanol, etanol, isopropanol, acetonitrilo...) y mezclas con agua. A veces se añaden ácidos o bases orgánicos para favorecer la ionización al igual que pequeñas concentraciones de buffers volátiles. Ionización Química a Presión Atmosférica (APCI): Este método puede acoplarse a cromatografía líquida (LC). En todas las fuentes de ionización química (CI), la ionización ocurre mediante interacciones ion- molécula en fase gas antes de que se produzca la ionización directa del analito. El esquema de funcionamiento es similar al electrospray (ESI), pero con diferencias clave: o La muestra disuelta se introduce a través de un capilar, mientras que alrededor de este capilar se inyecta gas nitrógeno (N₂) de forma concéntrica. o En este caso, el gas provoca la nebulización del líquido, sin formación de un spray por campo eléctrico. Proceso de ionización: 1. Nebulización y vaporización: o El líquido nebulizado se calienta en un horno, pasando de gotas a fase gas. Esto genera una mezcla de moléculas gaseosas del analito, del disolvente y del gas portador. 2. Ionización por efecto corona: o Se utiliza un electrodo de superficie pequeña, conocido como aguja corona, al que se aplica una diferencia de potencial muy alta (2000-4000 V). o Este campo eléctrico intenso genera el efecto corona, que ioniza inicialmente el gas portador. o La ionización del gas desencadena una serie de interacciones ion-molécula: ▪ Primero, se ioniza el gas portador. ▪ Posteriormente, el disolvente se ioniza mediante estas interacciones. ▪ Finalmente, se ioniza el analito. 3. Condiciones óptimas: o Las interacciones ion-molécula están favorecidas a presión atmosférica, lo que reduce la fragmentación en comparación con la ionización química tradicional (CI), ya que la energía se disipa en forma de calor. Uso del octapolo: Un octapolo actúa como guía de iones, dirigiéndolos hacia el analizador para su posterior detección. APCI Efecto corona Se pueden formar iones positivos y negativos (con potencial positivo en la aguja corona → iones positivos y con potencial negativo → iones negativos). Positiva Negativa Descarga corona + N2 → N2+· + e- (baja energía) Solvente + e- → [Solvente]- N2+ + Solvente → [Solvente + H]+ + N2 [Solvente]- + Analito → [Analito]- + Solvente [Solvente+ H]+ + Analito → [Analito + H]+ + Solvente [Analito] + OH- → [Analito-H]- + H₂O También se pueden formar aductos con los iones presentes (NH4+, Na+, K+…) a nivel de trazas en los disolventes o en el sistema. La ionización se produce a presión atmosférica. Las moléculas tienen que encontrarse en fase gas antes de producirse la formación de iones. Indicada para moléculas apolares o de baja-media polaridad. Espectros con baja fragmentación. Fotoionización a presión atmosférica (APPI): Es una técnica menos utilizada. La energía necesaria para la ionización se aporta mediante una lámpara de gas Kriptón (lámpara UV), que tiene la capacidad de fotoionizar muchos compuestos, aunque no los disolventes comúnmente utilizados. El sistema consta de: o Un capilar por el que se introduce el compuesto. o Un capilar concéntrico para la introducción de un gas. o Todo el sistema está termostatado y utiliza una ventana de cuarzo para permitir el paso de la radiación UV. Proceso de ionización: 1. Excitación inicial: ▪ Cuando la radiación UV incide en el analito, este pasa a un estado excitado. 2. La energía puede liberarse mediante: ▪ Emisión de radiación (relajación radiativa). ▪ Colisiones no radiativas. 3. Ionización directa o química: ▪ La excitación directa del analito no siempre es el proceso más probable. En muchos casos, la ionización ocurre a través de interacciones ion-molécula, similares a la ionización química. ▪ Es más común que los fotones UV ionicen el gas portador o el disolvente. Uso de dopantes: Si el disolvente no se ioniza de manera eficiente, se introduce un dopante junto con el gas. El dopante se ioniza bajo la radiación UV y, mediante interacciones ion-molécula, transfiere la ionización al disolvente y finalmente al analito. Moléculas de baja polarizad, mismos mecanismos que APCI. Tanto iones positivos como negativos se forman.  La corona-descarga se sustituye por una lámpara UV (Kr) Tubo de cuarzo para guiar el vapor Los fotones emitidos por la lámpara ionizan el gas reactivo y las moléculas del analito en fase gas se ionizan mediante reacciones ion-molécula con aquellos iones. Si el disolvente no se fotoioniza, es necesario añadir un dopante (que absorba la radiación UV, p. ej. acetona) para mejorar la ionización del analito Modo positivo: Moléculas con elevada afinidad protónica: [M + H]+ Moléculas apolares: [M]+· Modo negativo: Moléculas ácidas: [M – H]- Moléculas con elevada: [M]-· Campo de Aplicación Analizadores Como el corazón del espectro de masas Rango de masas: máxima masa que el analizador puede transmitir. Eficacia en la transmisión de iones: no todos los iones que llegan al analizador llegan al detector, relacionado con la sensibilidad del analizador. Velocidad de barrido: tiempo que tarda en hacer un barrido entre la toma de espectros. Sensibilidad Resolución: capacidad de distinguir dos picos que salen juntos, adimensional R= m/m. Mayore resolución, mayor capacidad para distinguir dos picos. Exactitud en la medida de la masa: diferencia entre la masa real del ion y la que se esta midiendo. Se da en térmicos relaticos (en ppm). Cuanto más pequeña es, mejor. El valor real estará cerca del valor calculado. | 𝑚𝑟𝑒𝑎𝑙 – 𝑚𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 | 𝐸𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑 (𝑝𝑝𝑚) = ∗ 106 𝑚𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑎 Cuadrupolo El cuadrupolo es un sistema que actúa como un filtro de masas basado en trayectorias estables de los iones en un campo eléctrico oscilante. Su funcionamiento se basa en los siguientes principios: 1. Campo eléctrico y potenciales: o Los electrodos del cuadrupolo están conectados en pares opuestos, con un potencial de radiofrecuencia aplicado de igual amplitud pero desfasado 180°. o Esto genera un campo eléctrico sinusoidal en los ejes x y y, mientras los iones avanzan a lo largo del eje z. o Los iones se desplazan siguiendo trayectorias complejas dentro de la cavidad del cuadrupolo. 2. Trayectorias estables: o Para que un ion atraviese la cavidad y llegue al detector, su trayectoria debe ser estable, es decir, mantenerse dentro del espacio delimitado por los electrodos. o Si un ion choca con los electrodos, pierde su carga y no puede ser detectado. o Solo los iones con una relación masa/carga (m/z) que permita trayectorias estables en el campo eléctrico aplicado atravesarán el cuadrupolo. 3. Filtros de masas: o Los electrodos positivos actúan como filtros de masas altas para iones positivos. ▪ Los iones con menor m/z son más susceptibles de cambiar su trayectoria rápidamente debido a su baja inercia y son repelidos hacia las barras positivas, perdiéndose en el sistema. o Los electrodos negativos funcionan como filtros de masas bajas para iones positivos. ▪ Los iones con mayor m/z tienen trayectorias más estables y pueden atravesar el cuadrupolo. o La combinación de corriente continua (DC) y alterna (AC) permite definir un rango específico de m/z que puede atravesar el sistema. 4. Regiones de estabilidad: o Cada m/z tiene una región de estabilidad definida por los valores de los potenciales de corriente continua (A) y alterna (Q). o Estas regiones de estabilidad se representan gráficamente como triángulos. o Solo los iones cuya relación m/z se encuentra dentro de estas regiones podrán ser transmitidos. 5. Calibración y barrido (Auto-tune): o Antes de realizar mediciones, se calibra el sistema utilizando un patrón con un rango conocido de masas. o Se impone una relación constante entre los potenciales de corriente continua y alterna, mientras se varían sus valores para realizar un barrido (scan line). o Solo los iones dentro de su región de estabilidad serán transmitidos y detectados.  6. Intervalo de masas: o El intervalo de masas transmitido depende de los parámetros aplicados. o A medida que aumenta el intervalo de masas, la sensibilidad y eficacia del sistema tienden a disminuir. Resolución baja: pKa (pH básico) para que entre en su forma negativa. Se trabaja con un valor de |pH - pKa| = 2. Electrospray por campo: Es importante que la carga acuosa de la fase móvil no sea alta, ya que se elimina mejor el disolvente con una carga acuosa baja. La carga acuosa no influye tanto en la ionización. Es mejor usar tampones volátiles en concentraciones bajas. Se forman aductos con Na y K. El solvente orgánico de la fase móvil apenas afecta a la ionización. [Tampón volátil] < 25 mM. Las concentraciones elevadas pueden dificultar la evaporación/ionización debido a la formación de pares iónicos. [Tampón no volátil] < 5-10 mM. Los tampones no volátiles dificultan la desolvatación/ionización. El fosfato dificulta menos la ionización con polaridad negativa, pero ensucia más el detector. Los aductos con Na y K se forman fácilmente, con concentraciones de 25-100 µM. Los aductos con NH4 son menos estables. La formación de aductos dificulta la fragmentación.  APCI (APPI): La sensibilidad depende de la cantidad de analito; por lo tanto, no conviene usar flujos muy bajos. El pH de la fase móvil no es crítico y no requiere el uso de tampones. El solvente orgánico de la fase móvil afecta significativamente la ionización. El metanol o la acetona (y aún más el agua) son mejores que el acetonitrilo. [Tampón volátil] < 100 mM. [Tampón no volátil] < 5-10 mM. No forma aductos con Na y K, pero puede formar aductos con NH4. LC-MS. Influencia del pH en ESI Fijar pH de la fase móvil con un tampón, evitar TFA (forma pares iónicos), HAcO, Ac fórmico, TEA, DEA… Hay que llegar a un compromiso con el pH adecuado de separación y un pH para ionizar el analito, a veces se puede adicionar un tampón a la salida de la columna para ajustar pH. Tampones típicos: RESUMEN Importante fijar voltaje de ESI, malo es alto (Emisión de rim y descarga en corona) y bajo (no ionización). Fuera del intervalo idónea → mucho ruido en el detector. Si es posible evitar sales: posibilidad de formar aductos [M+Na], [M+K] Seleccionar de forma adecuada el disolvente de la fase móvil Voltaje del cono de entrada. Flujo de N en el nebulizador y temperatura (si se usa agua, más de todo) Ajustar pH para favorecer la ionización o Analitos ácidos: 2 unidades por encima del pka o Analitos básicos. 2 unidades por debajo pka Evitar supresión de la ionización por presencia de otros electrolitos (pares iónicos) TFA, TEA Calibrar el equipo: Auto-tune