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APUNTES TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Master en Biotecnología Industrial y Ambiental Curso Académico 2020/21 Jorge Fernández Méndez Juan Manuel Vega...

APUNTES TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Master en Biotecnología Industrial y Ambiental Curso Académico 2020/21 Jorge Fernández Méndez Juan Manuel Vega Melero. Juan Manuel García Segura. Importante. El siguiente documento se corresponde con las anotaciones realizadas durante las clases teóricas. Si bien el texto y el contenido escrito son en su práctica totalidad propios, pueden existir recursos gráficos y referencias empleadas por los docentes de la asignatura. Estos apuntes son para uso interno dentro de la universidad complutense. Es responsabilidad individual utilizarlos del modo pertinente. TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez BLOQUE II. TÉCNICA DE ANÁLISIS. Tecnologías ómicas y técnicas de análisis. Las tecnologías -ómicas abarcan la totalidad de fenómenos involucrados en los procesos vitales de todo organismo. No obstante, los fenómenos biológicos presentan una elevada complejidad. Cada grupo de tecnologías -ómicas se enfoca en la obtención y análisis de elevadas cantidades de datos referentes a cada una de las etapas del proceso vital, desde la secuencia del DNA hasta los metabolitos finales. Así, mientras la genómica y afines (transcriptómica, epigenómica etc…) estudian información codificada en el material genético. Informan sobre la potencialidad de desarrollo de múltiples procesos biológicos. Se enfocan por tanto en el genoma y su expresión. Se fundamente en el estudio de la estructura e identificación de funciones de moléculas de un tamaño muy elevado, generalmente ácidos nucleicos y proteínas asociadas a este. La proteómica y afines estudian la información relativa a las proteínas expresadas por un organismo en un instante y circunstancias específicas (proteoma). Informan sobre el estado presente e inmediato del conjunto de procesos biológicos. Se fundamenta en el análisis global de muestras muy complejas, buscando la identificación cuali- o cuantitativa de la expresión en el proteoma. Estudian moléculas con pesos moleculares medios a elevados. La metabolómica y afines estudian la información relativa a los metabolitos presentes en un organismo en un instante y circunstancias específicas (metaboloma). Informan sobre los resultados de la expresión del genoma y actuación del proteoma; el producto final del metabolismo global del organismo. Esto implica los productos de todas aquellas enzimas y proteínas expresadas en la célula. Se fundamente en el análisis de especies moleculares de peso molecular bajo (generalmente < 1500 Da) Así mismo, la integración de estos tres grupos principales de tecnologías -ómicas se conoce como biología de sistemas, este enfoque permite el desarrollo de una visión global que permita una compresión holística de los procesos biológicos. El avance en el desarrollo de diversas tecnologías de análisis ha abierto la puerta a la posibilidad de analizar muestras biológicas con una elevada complejidad, permitiendo la obtención de ingentes cantidades de datos requeridas por las diferentes ramas de las tecnologías -ómicas. El caso de la espectrometría de masas es un ejemplo de esto. 80 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 8. Espectrometría de masas. 8.1 Introducción a la espectrometría de masas. La espectrometría de masas es una técnica basada en la separación de iones en fase gaseosa atendiendo a su relación masa / carga, permitiendo además así la determinación y clasificación de los iones separados. La espectrometría de masas ha sido una tecnología indispensable en múltiples campos de la ciencia. No obstante debido a la necesidad de ionizar en fase gaseosa los analitos a estudiar, moléculas de elevado tamaño o sensibles a la degradación no pudieron ser estudiadas hasta los años 90, cuando se desarrollaron nuevas metodologías de ionización de las muestras. (Gracias a los descubrimientos de Fenn y Tanaka (1988) ESI [Electrospray Ionization] y LDI [Laser Desorption/Ionization] Karas y Hillenkamp (1988) con el desarrollo de la tecnología MALDI [Matrix Assisted LDI]) 8.1.1 Principios de funcionamiento de un espectrómetro de masas. Existen dos procesos básicos acoplados: la generación de iones en fase gaseosa y la separación de los iones formados atendiendo a su relación masa/carga (m/z). Todo espectrómetro de masas integra tres partes principales: una fuente de ionización y un analizador de masas y un detector. Dependiendo del modo de funcionamiento de cada sistema, existirán diferentes tipos de equipos de espectroscopía de masas (MS). La necesidad de iones en fase gaseosa es debido a la inexistencia de interacciones entre los iones. El movimiento de los iones en fase gaseosa fácil de controlar mediante campos electromagnéticos. Las características de tales movimientos son de alguna forma proporcional a (m/z)2 El uso de iones en fase gaseosa produce una alta sensibilidad en MS permite el control y confinamiento de iones además los iones son transferidos con alta eficacia al detector. 81 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La espectrometría de masas aplicada a la proteómica consiste en la ionización de las proteínas, formando péptidos cargados en fase gaseosa. Cabe destacar que a efectos de evitar la interacción de los iones con otras especies precisa el trabajo en condiciones de vacío durante la ionización, separación y detección. De este modo la configuración habitual de un espectrómetro de masas consiste en En lo relativo al tipo de muestra introducida en la entrada del sistema, pueden introducirse muestras directas o acoplarse la entrada del MS a otro sistema de separación (generalmente cromatógrafos aunque pueden usarse otros equipos como membranas permeables selectivas u otros). En lo relativo a la ionización de las muestras, existen múltiples posibles fuentes de ionización. Para muestras en fase gas o líquidos volátiles puede ionizarse por Impacto de electrones (EI), ionización química (CI) o desorción por campo (FI). Para muestras sólidas o en fase líquida la ionización puede producirse mediante Electrospray (ESI), ionización química a PA (APCI), ionización por láser asistida por matriz (MALDI), ionización por iones secundarios (LSIMS) o ionización directa (DESI o DART). En el caso de las proteínas, debido a su sensibilidad intrínseca a la degradación, se recurre a la ionización mediante ESI (Electrospray o metodologías similares) o MALDI (desorción por láser asistida mediante una matriz). En cuanto al tipo de analizadores de masas; equipos que permiten la separación atendiendo al ratio m/z, existen múltiples configuraciones. De estas, las más empleadas son los analizadores cuadrupolo, las trampas de iones, o los analizadores de “tiempo de vuelo” (time-of-flight mass analyzers). Además de este tipo de analizadores convencionales, actualmente existen otro tipo de sistemas que integran otras aproximaciones además de la separación directa por 82 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez relación m/z. Entre estos destacan los Instrumentos de doble enfoque ( separación en un sector eléctrico+ sector magnético), los sistemas tipo Orbitrap (Analizadores por transformada de Fourier FTICR-MS, la espectrometría de movilidad iónica o los Instrumentos híbridos para MS en tándem (MS/MS). 8.1.2 Análisis de proteínas mediante espectrometría de masas. La configuración general de todo espectrómetro de masas para el análisis de proteínas presenta el mismo esquema que un espectrómetro convencional, donde la principal peculiaridad es el tipo de fuente de ionización empleada. Los datos obtenidos de la espectrometría de masas de una proteína son de dos categorías: masa de los fragmentos peptídicos que componen la proteína así como la secuencia de aa de los péptidos constituyentes. De modo general, las proteínas son fragmentadas en péptidos de pequeño tamaño, los cuales se ionizarán en función de los residuos de aquellos aminoácidos susceptibles de ionizarse. 8.2 Espectrómetros de masas. Metodologías de ionización. El primer espectrómetro de masas fue construido por Francis William Aston, diseñado para la separación de isótopos. En este diseño, la muestra gaseosa se ionizaba mediante un haz de electrones, los iones formados se aceleraban mediante un campo eléctrico y posteriormente se curvaba su trayectoria empleando el campo magnético de un imán. 83 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La separación conforme a la relación (m/z) permite la resolución de especies con una diferencia de masa atómica de incluso 1 Da. 8.2.1 Metodologías de ionización. 0) Fast Atom Bombardment (FAB) & Liquid Ion Mass Spectrometry (LSIMS). El empleo de compuestos de alta viscosidad combinados con las muestras a analizar fue el paso previo al desarrollo de las metodologías de MS actuales. En estas aproximaciones, se empleaba el bombardeo con átomos (Cs o Xe) a altas energías, dirigido sobre la mezcla matriz- analito. Se seleccionaban matrices como glicerol, tioglicerol, 3- ntirobenzyl alcohol (3-NBA), 2- nitrophenyloctyl eter, sulfolane, diethanolamine, trietanolamina y similares. Las moléculas de la matriz se volatilizan, así como protegen a los péptidos presentes en el analito. Algunos de estos habrán captado un protón y se habrán volatilizado junto a la matriz en fase gaseosa, permitiendo su análisis. A) IONIZADOR. Matrix-Assisted laser desorption/ionization (MALDI). Consiste en la metodología de ionización más empleada en la actualidad, reemplaza el bombardeo con átomos del FAB o LSIMS por un láser con la longitud de onda específica de absorción de la matriz empleada. Esto permite que la matriz se volatilice, arrastrando parte de las moléculas del analito a la fase gaseosa. Este proceso requiere la co-cristalización del péptido a analizar y la matriz, esto permite la volatilización de las partículas del péptido en fase gaseosa directamente de su constitución en estado sólido. El péptido de volatiliza sin un aporte de energía excesivo y evitando su presencia en una solución (donde la cesión de energía al analito lo degradaría). 84 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Los péptidos volatilizados en la fase gaseosa, en conjunto con las moléculas de la matriz, se encuentran altamente diluidos y aislados de otros analitos. La matriz ionizada actúa como un donante de protones, cediendo un H+ a los péptidos volatilizados. Posteriormente, estos péptidos cargados (junto a los iones de la matriz), son atraídos hacia un tubo de vuelo mediante una placa conductora cargada negativamente. De este modo, la función de la matriz es la absorción casi total de la energía del láser, evitando la degradación de la muestra. Del mismo modo, un complejo mecanismo de reacciones fotoquímicas, lleva a la ionización de la matriz y la transferencia de un único protón a los péptido/s en la muestra. Se obtienen así péptidos ionizados con carga +1 volatilizados en la fase gaseosa. Dependiendo del tipo de matriz y láser empleados existirán diferentes configuraciones de ionizadores tipo MALDI. De modo general, las características del sistema MALDI son. 85 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez B) ANALIZADOR. Time of flight mass analyzer (TOF). Los analizadores de tiempo de vuelo consisten en la aceleración de los iones formados mediante un campo eléctrico. Aquellas partículas con una relación m/z menor, adquirirán una mayo r velocidad, llegando antes al detector ubicado al final del tubo. Los equipos de MS más empleados en la actualidad se basan en el acople MALDI- TOF para la ionización y separación de las muestras introducidas. 86 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez C) IONIZADOR. Ionización por electrosprays. El electrospray es un método donde una solución de iones es vaporizada en fase gaseosa, donde cada ion de presente en la solución se volatiliza de forma individual. La formación de los iones en forma gaseosa atiende a dos mecanismos principales, la evaporación de iones (común en moléculas de reducida relación m/z) y el mecanismo de residuos cargados (charge residue, común en macromoléculas de alta relación m/z. El mecanismo de evaporación iónica, consiste en, partiendo de una nanogota de solución, el abandono de alguno de los iones de la misma de modo espontánea. El mecanismo de residuos cargados considera múltiples etapas. Una gota de solución altamente cargada reduce su volumen conforme el solvente se evapora, lo cual concentra los iones cargados en su interior. El aumento de la densidad de carga en el interior de la gota, origina su deformación en presencia de un campo eléctrico, formando el denominado cono de Taylor. Tras la formación del cono de Taylor, se produce una disgregación “explosiva” de la gota, liberando nanogotas de solvente con iones individuales aislados en su interior. El solvente posteriormente continuará evaporándose hasta quedar únicamente el analito de interés cargado. 87 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La formación del cono de Taylor se encuentra mediada por la atracción electrostática de los iones de la muestra en presencia de un campo eléctrico. Si el potencial eléctrico super un valor umbral, denominado potencial de Taylor. En dicho caso la tensión superficial será de menor intensidad que la atracción electrostática, produciendo la nebulización de los iones a modo de spray. El empleo de este tipo de metodología de ionización para la MS aplicada a proteínas se efectúa median el manejo de nano- y micro- capilares de electrospray. Debido al reducido tamaño de estos capilares, permite reducir al mínimo las etapas de desolvatación de las gotículas formadas. En el caso de los nanocapilares, estas nanogotas no tienen que ir reduciéndose poco a poco por desolvatación. Así, la sensibilidad del aparato aumenta del orden de 500 veces El principal inconvenientes es el manejo y mantenimiento complejo de los nanocapilares. Las soluciones deben ser muy puras. Una alternativa a estos es el empleo de microcapilares para evitar los problemas de obstrucción. De modo general, la metodología de electrospray ofrece unos buenos resultados, especialmente con proteínas de pesos moleculares reducidos. Así mismo, permite la formación de péptidos con carga múltiple. De modo que la carga máxima de un péptido puede aportar información estructural. Así mismo, debido a la elevada eficacia de ionización sin degradación de la muestra, ofrecen una buena sensibilidad analítica. 88  TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Comparativa general de los diferentes sistemas de ionización de muestras. 8.3 Parámetros de un espectro de masas y MS de proteínas 8.3.1 Masa molecular e isótopos. En el empleo de técnicas de espectrometría de masas, resulta crucial conocer la definición de masa molecular promedio y masa isotópica y masa molecular/atómica. Masa molecular / atómica nominal. Es las masa teórica del átomo/ molécula tomando la masa molecular del isótopo más abundante en la naturaleza, generalmente para el carbono sería de 12 por definición. Masa isotópica. Se corresponde con la masa atómica real de un isótopo concreto. Masa atómica promedio. Es la masa promedio de cualquier átomo del elemento, donde se considera la abundancia relativa de cada isótopo y su masa isotópica. La abundancia relativa de los diferentes isótopos resulta de gran relevancia en la espectrometría de masas de proteínas, esto es debido a que debido al elevado número de carbonos de cualquier macromolécula, existe la probabilidad de que algunos de ellos sea un isótopo diferente al C12, como por ejemplo C13, debido a esto una misma molécula proteica contendrá por estadística uno o varios átomos de diferentes isótopos. Así, su análisis por espectrometría de masa generará múltiples picos, donde cada uno de ellos corresponderá a grupos de moléculas con la misma masa molecular. Se define masa monoisotópica a la masa real de una molécula proteica formada exclusivamente por átomos de un único tipo de isótopo (e.g C12). Al grupo de picos asociados a un único tipo de molécula, se le denomina clúster de isótopos. Existirá una distribución gaussiana de la señal para cada macromolécula analizada conforme a la probabilidad de las distintas configuraciones de los distintos isótopos en la macromolécula. A medida que aumenta la masa molecular del péptido a considerar, la probabilidad de encontrar picos correspondientes con la masa monoisotópica de la molécula estudiada 89 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez será menor, debido a la mayor probabilidad de encontrar otros isótopos de carbono en la molécula. 8.3.2 Consideraciones de precisión y resolución. En todo análisis por MS, la precisión de medida de la masa molecular resultará crucial, especialmente en el caso de especies moleculares de reducido tamaño. Esto es así, debido a que conforme al error sistemático de medida de la masa “m”, podrían existir diferentes moléculas que se correspondan con dicha señal de “m”. Poder conocer con exactitud el erro en la medida de la masa atómica de un compuesto, resulta por tanto crucial. Además, en todo espectrómetro de masas, la resolución resultará crucial, debido a que cuanto mayor sea la resolución del analizador, más sencilla será la distinción de los clústeres de isótopos. La resolución de todos los picos permite además conocer la carga de los iones analizados. 90  TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La relación m/z se mide en Thomson. Todos los picos del clúster de isótopos deberán diferenciarse en ± 1 Da (carga +1) debido a la probabilidad sucesiva de incluir desde 0 a múltiples átomos de isótopos de carbono (con C13 más habitualmente). Cuando todas las moléculas presentan carga +1, los picos del clúster se encontraran separados por ± 1 Th. Cuando algunas de las moléculas presentan carga +2, los picos del clúster de isótopos se encontrarán separados por ± 0.5 Th, debido que al duplicar la carga en algunas moléculas, cambia también la separación entre los picos. Del mismo modo, cuando la moléculas presentan una carga +3, la distancia entre los picos será de ± 0.33 Th. Masa monoisotópica. La masa monoisotópica, se corresponde con el valor de aquel pico del clúster con una menor masa; aquella proteína compuesta idealmente del isótopo de menor peso molecular. Resulta especialmente útil cuando existe una buena resolución del clúster de isótopos. 91 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Masa promedio. Cuando no existe una buena resolución del clúster de isótopos, se recurre a la definición de un valor promedio, correspondiente al centroide (media aritmética) del la señal ofrecida por el clúster. Cabe considerar que se trata de un valor irreal, no correspondiente al peso real de ninguna de las moléculas analizadas, sino una representación del total de la población de moléculas. Ejemplo. Como la resolución afecta en la identificación de dos péptidos diferentes. 92 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 8.4 Tipos de analizadores en MS Un analizador es aquel componente de todo espectrómetro de masas que permite la separación de los iones formados. La resolución y separación de los analitos de interés en un analizador, dependerá en parte de la metodología de ionización empleada, además del tipo de analizador. Existen cuatro tipos principales de analizadores: De sector magnético, tipo cuadropolo, las trampas de iones y los analizadores de tiempo de vuelo. 8.4.1 Analizadores de tiempo de vuelo. Espectrómetros tipo MALDI-TOF. Los analizadores de tiempo de vuelo permiten la separación de los distintos iones en base al tiempo que tarda las moléculas cargadas y aceleradas en presencia de un campo eléctrico en recorrer una distancia determinada. Tras la aceleración bajo un mismo potencial de los iones formados, estos se introducen en el tubo de vuelo donde no existe campo eléctrico. Considerando e la carga del electrón, E el campo eléctrico, z el número de carga neta del ion y s el espacio recorrido. Todos los iones de igual carga, presentarán la misma fuerza electrostática de atracción. 1 𝐷 𝑚 𝒎 𝒕 𝟐 𝑚𝑣 2 = 𝑧𝑒𝐸 𝐷𝑒 𝑚𝑜𝑑𝑜 𝑞𝑢𝑒 𝑡 = =( 1 ) 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑜 𝑡𝑎𝑛𝑡𝑜 → = 𝟐𝒆𝑬𝒔 ( ) 2 𝑣 (2𝑧𝑒𝐸𝑠)2 𝒛 𝑫 El tiempo de llegada al detector es por tanto proporcional al cuadrado de la relación m/z. La principal ventaja de esto sistemas es su gran robustez y simplicidad de funcionamiento, además de su rango virtualmente ilimitado (hasta 300 kDa) respecto a la masa de los analitos. Sin embargo, la resolución del sistema es reducida. Cuanto mayor sea la longitud del tubo, generalmente se esperará una mayor resolución entre los analitos. Este tipo de analizadores se encuentra acoplado a sistemas de ionización de tipo MALDI, esto permite que los espectrómetros de tipo MALDI-TOF permiten la resolución de muestras con concentración de sales (hasta nivel mM) además de permitir la resolución de muestras con matrices complejas. 93 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La reducida resolución de este tipo de sistemas se debe principalmente a la distribución energética de las moléculas ionizadas y aceleradas bajo el campo eléctrico. Conforme a una distribución gaussiana, algunas moléculas adquieren una mayor o menor energía con respecto al promedio. Este fenómeno es el responsable que los picos sean dispersos y no líneas verticales. Así mismo la trayectoria arbitraria de los iones formados, se corrige mediante el empleo de colimadores del haz. Para la mejora de la resolución se emplean dos estrategias principales: la extracción retardada (DE o delayed extraction) y el uso de reflectores. Delayed Extraction (DE). La extracción retardada, consiste en la aceleración de los iones mediante un pulso eléctrico retardado con respecto a la ionización de la muestra. La aplicación del pulso eléctrico se produce de modo que genere un gradiente del campo E entre ambas placas (placa de ionización y entrada del tubo de vuelo). Este gradiente producirá una mayor aceleración de aquellas partículas más lentas, consiguiente una mayor homogeneización de las velocidades. Empleo de reflectores. La segunda posibilidad consiste la introducción de un reflector, este consiste en un conjunto de elementos cargados, capaces de producir un campo eléctrico que frena las partículas y curva su trayectoria para dirigirlas al detector. Aquellas partículas con mayor energía lograrán penetrar con mayor profundidad en el reflector, tomando un mayor tiempo en ser redirigidas, de este modo, la velocidad de llegada de todos los iones. 94 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez El empleo de un reflector permite además el incremento de la resolución debido a que amplia el recorrido de los iones. Mejoras e implementación de sistemas adiccionales. Cabe destacar además la influencia de la presión en el tubo de vuelo, a menores presiones se obtendrá una mejor sensibilidad, debido a la reducción del ruido de fondo en el sistema. Todo aumento de la resolución incrementa la exactitud del espectro de masas, lo cual favorece en gran medida la identificación de especies. Existe además la posibilidad de combinar sistemas TOF en tándem. El acople de una trampa de iones a la salida del primer TOF, permite confinar de forma casi indefinida los iones obtenidos de la muestra. Posteriormente, aquellos picos más significativos del primer espectro, pueden ser posteriormente ampliados en un segundo experimento, para ello, estos iones son selectivamente extraídos de la trampa de iones e introducidos en un nuevo tubo de vuelo. 95 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 8.4.2 Analizadores de tipo cuadropolo A) PRINCÍPIOS DE OPERACIÓN. Los analizadores cuadropolares se basan en la creación de un campo eléctrico cuadropolar. Su estructura consiste en cuatro varillas metálicas de forma hiperbólica o cilíndrica, sobre las que se aplica la combinación de un voltaje con corriente continua y otro de corriente alterna en el rango de la radiofrecuencia. La modificación de estas dos corrientes permite modificar el campo cuadrupolar presente en el interior de las varillas. La interacción de las partículas cargadas, con el campo cuadrupolar produce modificaciones en la trayectoria de las partículas, se producirán trayectorias oscilatorias para los iones, dependientes de su relación m/z. Estas trayectorias generadas podrán ser trayectorias inestables (Deflexión), terminando con el impacto de los iones sobre las varillas o saliendo del sistema, o trayectorias estables (Transmisión) las cuales permiten a los iones atravesar el analizador. Así, el cuadrupolo actúa como un filtro de iones. El nombre de campo cuadrupolar, deriva de que el campo eléctrico experimentado por cada partícula, depende del cuadrado de las posiciones de la partícula en coordenadas x e y. De este modo, el conjunto de pares U-V (potencial aplicado en las varillas del cuadrupolo) que generan trayectorias estables, será función de la relación m/z de cada ión particular. Esto da lugar a las curvas de estabilidad, donde para cada ión concreto existirá un conjunto de pares V-Z que garantizarán la estabilidad de su trayectoria. 96 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Esto permite efectuar un escaneado de los distintos iones que atraviesan el cuadrupolo, modificando de forma creciente U y V simultáneamente, se producirá un incrementó del valor del campo contínuo. Así, el ajuste de la pendiente del incremento de U- V permite separar diferentes iones donde puede mejorarse la resolución o la sensibilidad del sistema en función de los valores del incremento. B) EMPELO DE CUADRUPOLOS COMO GUÍAS DE IONES. Cuando un cuadrupolo se opera con un valor nulo de la componente U (no existe componente continua), este actúa como una lente de banda ancha. La operación en modo RF exclusivo, permite que los iones pierdan una reducida cantidad de energía cinética en su componente radial, conservando la componente axial. Esto permite concentrar los iones en un haz compacto. No obstante, los Hexa u octapolos (multipolos) resultan más eficaces para la concentración de haces de iones. Así, los multipolos operaos en modo RF-only transmiten mejor los iones con vacío moderado (10-3-10-2 mbar). El fenómeno de reducción de la energía cinética se denomina collisional cooling, permitiendo la concentración de los iones en el eje Z. Una de las principales aplicaciones de este tipo de guías de iones es su empleo como cámaras de colisión. En estos sistemas, se introduce en el interior del multipolo un gas inerte (N2,He,Ar...), donde la colisión con el gas de los iones, producirá su fragmentación. 97 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La escisión de los iones en distintos fragmentos generará dos tipos de productos: iones de menor tamaño que conservan la carga de su precursor y fragmentos no cargados, denominados como pérdidas neutras. Este proceso de fragmentación se denomina como CID (Collision-induced-disociation). Estos sistemas. Permiten estudiar los productos de disociación de péptidos cargados de mayor tamaño. La implementación como sistemas de análisis son los analizadores de triple cuadrupolo. El primer cuadropolo actúa como analizador primario (filtro de iones), el segundo cuadrupolo actúa como cámara de colisión, mientras que el tercer cuadrupolo vuelve a actuar como un analizador. En este proceso, se selecciona específicamente uno de los iones de la muestra de interés (péptido completo ionizado), mediante el ajuste del cuadrupolo primario. Posteriormente se fragmenta en la cámara de colisión (cuadrupolo secundario) y se procede al análisis selectivo de los fragmentos resultantes. La identificación de los productos de fragmentación, permitirá la secuenciación de péptidos e incluso el estudio de posibles modificaciones post-traducionales. 98 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez El análisis en este tipo de sistemas de triple cuadrupolo, puede realizarse conforme a distintos modos de barrido para los iones formados. Este tipo de sistemas se denominan MS/MS o sistemas de espectrometría de masas en tándem. Al igual que para los analizadores cuadrupolo uno de sus principales inconvenientes es el requerimiento de elevadas cantidades de muestra, debido a que el flujo de iones debe de ser contínuo para poder distinguir entre las diferentes especies producidas. 8.4.3 Trampas iónicas. Las trampas iónicas son sistemas que permiten el confinamiento selectivo de iones basándose en su relación m/z. Estos sistemas se basan en tres electrodos, uno circular y dos con perfil parabólico. La aplicación de dos corrientes eléctricas: una componente DC y otra RF (alterna en el nivel de las radiofrecuencias), permite el confinamiento selectivo de iones en función de su relación m/z. También, pueden actuar como filtros de masas, al generar trayectorias inestables (y la salida de la trampa) de aquellos iones con una relación m/z específica. El voltaje en el anillo se aplica a un espacio 3D. La carga de los polos varía y los iones oscilan en la trampa. Al aumentar la componente RF, se inestabilizan las oscilaciones de los sucesivos iones con diferentes m/z y escapan de manera ordenada de la trampa iónica. La fuente de iones acoplada a la entrada de una trampa iónica es generalmente la salida de un HPLC+ESI y una lente de multipolo que dirige los iones de manera muy efectiva hasta la trampa iónica. La trampa escanea el nº de cargas confinadas y cuando acumula un exceso deja salir un conjunto de m/z’s. El empleo de He a baja presión permite el confinamiento de los iones en el centro del sistema, gracias a la reducción de su energía cinética. La operación de este tipo de trampas puede realizarse conforme a diferentes modos. 99  TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Barrido de inestabilidad selectiva de masas. Consiste en la variación de los voltajes aplicados, los iones de un cierto m/z son inducidos a adoptar trayectorias inestables que terminan colisionando con los electrodos o saliendo del sistema. Resonancia de expulsión (eyección resonante). Aplicando voltaje adicional en la componente RF a las dos tapaderas laterales, los iones de un m/z dado, entran en resonancia con la frecuencia aplicada, aumenta su energía traslacional y son expulsados (resonancia de expulsión). Los iones salen antes de lo que deberían si solo hubiera un único electrodo con componente RF. De modo general, una trampa iónico permite incrementar la sensibilidad de detección en 500 veces con respecto a los valores obtenidos con analizadores de tipo cuadrupolo. 8.5 Sistemas MS/MS de espectroscopía en tándem. Los sistemas MS/MS han resultado cruciales para el análisis espectrofotométrico de proteínas. Su principal característica consiste en la capacidad de tras realizar un análisis de MS general, estudiar con mayor detalle regiones concretas de los resultados obtenidos en el primer espectro de masa. Esto abarca el confinamiento de iones y su fraccionamiento selectivo, permitiendo su posterior caracterización individualizada. Los sistemas MS/MS más empleados principalmente son los sistemas de triple cuadrupolo, y los sistemas tipo MALDI-TOF-TOF. 100 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 9. Técnicas de separación cromatográfica. 9.1 Técnicas cromatográficas. Conceptos básicos y clasificación. 9.1.1 Técnicas de separación, factores de selección. Las técnicas de separación cromatográfica permiten la resolución de muestras con alta complejidad en sus distintos componentes, encontrándose generalmente acopladas a un sistema de detección que permite obtener información sobre la muestra analizada. Existe una enorme diversidad de técnicas cromatográficas, donde la selección de una u otra dependerá de los requisitos del análisis y otros factores a considerar. FACTORES ANALÍTICOS FACTORES TÉCNO-ECONÓMICOS Naturaleza de la muestra Coste del equipo. Información a obtener Necesidad de personal especializado. Intervalo de concentración del analito en Número de muestras. la muestra Velocidad de muestreo requerida. Sensibilidad y selectividad del método Tiempo de análisis. Exactitud y precisión del método. Complejidad química del análisis. Cantidad de muestra disponible. Atendiendo a la combinación de estos factores, podrá determinarse el sistema de separación idóneo para cada muestra y situación particular. Así mismo, en muchas ocasiones, las técnicas de separación no se emplean para el análisis directo de la muestra, sino que permiten la preconcentración de los analitos de interés de la muestra y/o la reducción de componentes de la matriz. Dos conceptos clave son la sensibilidad y selectividad. Sensibilidad. Consiste en la detección del analito, dentro de márgenes de concentración limitados. Por debajo del límite de detección no se obtiene respuesta instrumental, por encima, la respuesta no será correlacionable con la cantidad de analito. Selectividad. Consiste en la capacidad de discernir las señales producidas por el analito de interés con respecto a otros componentes presentes en la muestra. 9.1.2 Cromatografía. Conceptos básicos. La cromatografía es un método físico de separación en el cual los componentes de una mezcla se transportan a través de una fase estacionaria por medio de una fase móvil que fluye a través de la misma. La fase estacionaria podrá ser sólida o líquida. La fase móvil podrá ser un gas, líquido o fluidos supercríticos. El principio básico de separación se fundamenta en la diferencia de afinidad de cada analito en la muestra tanto por la fase estacionaria, como por la fase móvil. Estas diferencias en la afinidad llevarán a distintas velocidades de migración de cada analito a 101 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez través de la fase estacionaria, permitiendo fraccionar su salida del sistema y su posterior detección. En función de la configuración del lecho cromatográfico, el tipo de fase móvil y el tipo de mecanismo de separación. Podrán clasificarse los diferente tipos de cromatografía. Tras la separación cromatográfica de los analitos, estos pueden ser detectados conforme a distintos sistemas, la representación gráfica de las señales analíticas obtenidas frente al tiempo, se denomina cromatograma. En un cromatograma podrá observarse por tanto una señal correspondiente a cada analito separado, esta señal se presenta generalmente en forma de pico cromatográfico, el cual podrá caracterizarse conforme a varios parámetros de carácter tanto termodinámico como cinético. En su aplicación al ámbito biológico, estacan alas cromatografías de exclusión, las cuales se basan en la diferencia de tamaño y/o forma de las moléculas. Se emplea generalmente para la separación de polímeros. Suele emplearse una fase móvil acuosa con agentes estabilizadores de la fuerza iónica, el pH etc. Permitiendo así la solubilización y estabilización de los analitos. Se emplean tanto para muestras biológicas como polímeros sintéticos (empleándose para la caracterización de las distintas masas moleculares e.g.). Parámetros termodinámicos. (Factor de retención, tiempo de retención y selectividad). 102 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Todo compuesto que atraviesa el lecho cromatográfico presentará un grado de retención distinto en el interior del sistema. Al tiempo que la fase móvil tarda en atravesar el sistema se le denomina como tiempo muerto (tD). Así mismo, cada analito particular, tardará en salir del sistema un tiempo dado, conocido como tiempo de retención (tr). A efectos de expresar independientemente la retención de cada componente con respecto a las características intrínsecas del sistema, se emplea la definición de factores de retención (Kr). El valor de este factor de retención puede relacionarse directamente con el equilibrio de asociación con la fase estacionaria del lecho. Otro concepto de origen termodinámico de gran relevancia es el de plato teórico. Un plato teórico se corresponde con una unidad de la medida de la capacidad de la columna para realizar la separación de un analito conforme al estado de equilibrio (reparto entre fase móvil y estacionaria) alcanzable. Así, la capacidad de resolución de una columna cromatográfica se definirá conforme a su número de platos. La altura equivalente de plato teórico (HETP) se define para cada columna como el número total de platos teóricos (N), calculado conforme 103 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Parámetros cinéticos. (Factor de retención, tiempo de retención y selectividad). Estudiando la capacidad de resolución cromatográfica de un sistema (definida como la HETP (H)), conforme a las distintas variables cinéticas del proceso, se puede determinar las condiciones óptimas de operación del sistema. La ecuación de Van Deemter estudia la modificación de la H de una columna con la velocidad de elución (medida como velocidad lineal (u). En esta ecuación, se observa como existe un parámetro constante A (relacionado con la difusividad en el interior del lecho cromatográfico). A mayor homogeneidad del lecho (partículas de reducido tamaño, esféricas y distribución de diámetro estrecha) ofrecerán menores H. El parámetro B se relaciona inversamente con la velocidad de elución, mientras el parámetro C (correlacionado con la naturaleza de la fase estacionaria Cs y móvil Cm) lo hace directamente. Debido a esto, debe operarse en aquellas condiciones de velocidad de elución, que permitan alcanzar un compromiso entre la velocidad de elución y los tiempos de operación que minimice la H del sistema. Deben considerarse además los efectos de difusión longitudinal, conforme más tiempo pasa una fracción cromatográfica en el sistema, está experimentará fenómenos de dispersión. Cada molécula de analito tomará diferentes caminos a través del lecho, lo cual deriva en la salida del sistema de dicha fracción en diferentes tiempos. Debido a ello los picos del cromatograma final se ensanchan, reduciendo la sensibilidad. Otros factores que incrementan la difusión longitudinal son la propia difusividad de los analitos en la fase móvil (a mayor difusividad, mayor tendencia existirá a igualarse las concentraciones, provocando el la difusión hacia las regiones posteriores y anteriores del lecho con menor concentración del sistema). Así mismo, la transferencia de materia también resulta muy significativa. La irregularidad de las partículas del lecho, así como su tamaño y distribución afectarán al ensanchamiento de los picos. 104 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Evaluación de la resolución en un cromatograma. Considerando dos componentes en un cromatograma, se definen dos parámetros cruciales que definen la calidad de la separación: el factor de selectividad y la resolución experimental. De modo general, se calcula la señal del sistema como el área bajo la curva de un pico cromatográfico dado. Se define el rango de los picos como un 95% de la totalidad de la señal. El objetivo principal es incrementar la resolución de la cromatografía, sin embargo existe otro parámetro de gran relevancia; la eficacia. Este parámetro mide la distribución en los picos del cromatograma; la capacidad del sistema de eluir en una ventana temporal lo más estrecha posible los analitos separados. Se contrapone en cierto modo con la selectividad, la cual mide la capacidad del sistema de separar la salida de dos analitos, aunque el tiempo de elución de cada origine picos muy anchos. En todo sistema cromatográfico, debe operarse la separación en unas condiciones tales, que permitan obtener la mayor eficacia y resolución posible. Del mismo modo, considerando dos picos de la misma altura puede calcularse la resolución de modo aproximado como. 9.1.3 Optimización de las condiciones de operación. En la separación cromatográfica, es habitual encontrar grupos de sustancias que la proximidad de sus tiempos de retención son tales, que: - Pueden solaparse si el tiempo de elución es demasiado rápido. - Pueden ensancharse excesivamente perdiendo eficacia en los picos. 105 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Es posible jugar con aquellos parámetros (composición de la fase móvil, velocidad de elución y/o temperatura) que permitan alterar los tiempos de residencia de la especies a separar. En muestras elevado número de analitos, donde algunos se agrupan en picos próximos, esto es necesario, permitiendo evitar el solapamiento de picos, o la pérdida de eficacia en la determinación de aquellos componentes que eluyen inicialmente del sistema. (La imagen muestra el cromatograma resultante de un sistema operado con composiciones crecientes de polaridad en la fase móvil y analistas polares). La cromatografía en gradiente (de composición, temperatura etc…) permite la resolución y maximización de la eficacia. 9.2 Análisis cuantitativo. Una de las principales ventajas de la cromatografía es la capacidad de determinar cuantitativamente la concentración de múltiples analitos en una muestra. Esta determinación cuantitativa, se realiza basándose en la medida de la altura o generalmente el área de pico. Para la determinación cuantitativa, se requiere la calibración de la configuración cromatográfica conforme a una serie de estándares de referencia de concentración conocida. 9.2.1 Métodos de calibración. - Calibración mediante estándares (patrón externo). Consiste en la preparación de una serie de muestras de concentración conocida del analito. Se estudia la respuesta del sistema ante cada concentración, elaborándose una recta de calibrado. - Calibración mediante estándares con patrón interno. Debido a la baja reproducibilidad en la inyección en el cromatógrafo, es conveniente poder reducir este error experimental mediante la referencia de los resultados a un compuesto de referencia no presente en las muestras. En un calibrado con patrón interno, se añade un compuesto de naturaleza similar al analito y ausente en la muestra (e.g. Muestras con n-butanol, puede añadirse isobutanol como patrón interno siempre y cuando este ausente en la muestra.). Posteriormente, la señal obtenida, se normaliza conforme a la señal del patrón interno, realizando el calibrado con dichos valores. 106 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 9.3 Cromatografía de gases (GC) La cromatografía de gases ofrece un elevado poder de resolución para compuestos orgánicos volátiles y térmicamente estables. La separación se fundamenta en las diferencias de punto de ebullición, además de las distintas afinidades por la fase estacionaria. En función de la naturaleza de la fase estacionaria, existirán diferentes mecanismos de separación de los componentes así como diferentes aplicaciones. Destacan principalmente la adsorción del gas sobre soportes sólidos o el reparto (partición) entre la fase líquida y la fase acuosa. Todo cromatógrafo de gases cuenta con una serie de componentes básicos. 9.3.1 Gas Portador. El gas portador es aquel gas inerte capaz de actuar como diluyente de las muestras y agente de transporte de la muestra volatilizada a través del sistema. Los gases empleados deben ser inertes y minimizar en un amplio rango de condiciones la HETP. De modo general, todo gas portador… 107 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez - Debe poseer alta pureza (>99.99%) - Químicamente inerte respecto a los componentes de la muestra, a los materiales de la columna y del cromatógrafo - No dar respuesta (o que esta sea mínima) en el detector. - Debe ofrecer un reducido coeficiente de difusión. El hidrógeno es una de las mejores opciones, no obstante debido a su explosividad se recurren a otras opciones como gases nobles. Los más utilizados son: nitrógeno y helio donde su elección depende de la naturaleza de la muestra, de la fase estacionaria o del detector utilizado. Así mismo, el hidrógeno, debida a su menor viscosidad y cambios con la temperatura, permite operar en un mayor rango de velocidades de elución y T con menores variaciones de la HEPT. 9.3.2 Tipo de muestras e inyector. Las muestras deben recorrer la columna cromatográfica en fase vapor, por ello, existen tres opciones principales de introducción de la muestra en el sistema: muestras gaseosas, muestras líquidas o sólidos volatilizables disueltos en un disolvente adecuado. Otra alternativa es la derivatización de muestras no volatilizables sensibles, a otros compuestos susceptibles de analizarse por GC. Cabe destacar que los líquidos y disoluciones deben convertirse en vapor utilizando altas temperaturas dentro del sistema de inyección. La cantidad de muestra a inyectar en el sistema se encuentra en el rango de 1 L. Para ello se emplean jeringuillas especiales para GC. Así mismo, la inyección debe realizarse de forma rápida y decidida, de modo que el volumen inyectado debe llegar a la cabeza de la columna a modo de una banda estrecha. Deben evitarse tanto las posibles contaminaciones como las pérdidas de muestra. 108  TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez El inyector es el componente responsable de la inyección de las muestras en el sistema, estando compuesto de un bloque metálico calentado a temperaturas ligeramente superiores a las de la columna, permitiendo así la vaporización eficaz de la muestra. En esta misma región se incluye la entrada del gas portador en el bloque metálico. Este espacio de vaporización y mezcla con el gas portador se denomina cámara de mezcla. Así mismo, las columnas cromatográficas empleadas habitualmente requieren volúmenes inferiores a 1 L, debido a la dificultad de inyectar cantidades inferiores, se recurre al empleo de inyectores con purga parcial de la muestra. Además de los inyectores directos (empleados normalmente en columnas de relleno), existen diferentes configuraciones de inyectores, que permiten la purga parcial de la muestra inyectada. La selección de la temperatura y tipo de disolvente de la muestra resultan parámetros cruciales para el empleo de una metodología u otra. 9.3.2.1 Sistemas de inyección de muestras. A) Sistemas con división. (Split) Consisten en la introducción de una válvula divisora a la salida de la cámara de mezcla, de modo que parte de la muestra inyectada sale del sistema, mientras una fracción entra en la columna cromatográfica. Se basa en una evaporación rápida de la muestra, donde no obstante puede existir un reparto de los componentes durante su vaporización en el inyector. B) Sistemas de tipo Split/Splitless Consisten en un sistema donde la salida del divisor esta cerrada inicialmente, siendo posible su apertura tras la vaporización total de la muestra, o manteniéndola cerrada. Se emplean para muestras con una concentración del analito a nivel de traza. 109 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez C) Sistemas de inyección en columna. Se emplean para la inyección de muestras (líquidas normalmente) de forma directa en la columna cromatográfica. Permiten evitar la pérdida parcial de la muestra. Se encuentran a temperatura baja, dado que la evaporación de la muestra tiene lugar directamente en la columna. Requieren el uso de jeringas de inyección muy delicadas, con agujas capilares de sílice fundida de un diámetro inferior al de la propia columna cromatográfica. D) Válvulas de inyección de gases Consisten en sistemas de inyección basados en válvulas de 6 puertos. En una configuración se posible la introducción de la muestra en el bucle de carga de la válvula, con un volumen definido. Posteriormente el cambio a la posición de inyección de la válvula introduce gas portador en el bucle de carga y lo conecta a la columna. Estos sistemas ofrecen una gran precisión en la inyección de la muestra. 9.3.2.2 Tipo de muestras Las muestras a analizar por GC deben ser compuestos que dentro del sistema recorran la columna como especies gaseosas. Para ello, la muestra a introducir puede ser líquida (donde los analitos se encuentran en un disolvente adecuado) o más habitualmente gaseosa. En el caso de la toma de muestras gaseosas, estas pueden proceder directamente de un gas recogido o de una muestra líquida donde los analitos volátiles pueden estudiarse conforme al equilibrio líquido-vapor establecido en un recipiente cerrado. En este caso, existirán tres posibles aproximaciones, en función de la volatilidad y abundancia de los analitos. 110 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez En el caso de analitos en cantidad abundante y volátiles, pueden medirse directamente en las fase gaseosa presente (headspace) en un vial cerrado con muestra líquida. La muestra es termostatizada, permitiéndola alcanzar el equilibrio L-V. La toma de muestra se realiza directamente, esta metodología se denomina como muestreo estático en el espacio de cabeza. En otras ocasiones, en vez de recurrirse a la toma de muestra directa, se introduce un gas inerte en el vial, desplazando la fase gaseosa presente. A la salida se incluye un adsorbente que permite concentrar el analito a muestrear en el. Esta metodología se denomina como espacio de cabeza dinámico. Cuando el analito sea muy poco volátil, puede forzarse su vaporización por burbujeo contínuo de un gas portador en la fase líquida, adsorbiéndose posteriormente en una columna. Esta metodología se denomina como muestreo por arrastre y atrapamiento. En los dos últimos casos, tras la concentración de la muestra en un adsorbente, este es desorbido térmicamente e introducido en el GC. 9.3.3 Control de la temperatura. En GC, se puede operar en dos modos principales: isotermo y de temperatura programada. El primer caso suele emplearse cuando los analitos guardan gran similitud entre ellos, no obstante, cuando existe un analito/grupos de analitos con naturalezas muy distintas, aquellos analitos más retenidos presentarán un mayor ensanchamiento de los picos, reduciendo la eficacia del sistema. Para mejorar la eficacia y resolución del sistema, se recurre a la elución cromatográfica en un gradiente (generalmente creciente) de temperatura. Atendiendo al equilibrio termodinámico de cada componente, será posible predecir la modificación del tiempo de elución (tR) de cada analito a una nueva temperatura. 111 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Habitualmente se combina la operación e modo isotermo y en temperatura programada, permitiendo la resolución de la totalidad de grupos de analitos con la máxima eficacia posible. 9.3.4 Tipos de columnas cromatográficas. La selección de una columna cromatográfica se realizará en función de la eficacia deseada para el proceso (HEPT), así como la capacidad total de la columna y las condiciones de operación que permiten. Encontramos dos categorías principales de columnas: empaquetadas y capilares. Las primeras consisten en una columna de diámetro amplio, rellena de una matriz sólida que constituye la fase estacionaria. Las segundas consisten en un capilar hueco cuyas paredes se encuentran recubiertas de la fase estacionaria. Columnas empaquetadas. Presentan diámetros mayores y una mayor capacidad de carga y trabajo a caudales y velocidades mayores, sin embargo su resolución y eficacia son más reducidos. El relleno son partículas sólidas de 120-185 m de diámetro. Columnas capilares. Presentan diámetros muy reducidos, baja capacidad de carga (precisando volúmenes pequeños de muestra) y operan a menores caudales y velocidades de elución. Sin embargo, su resolución y eficacia es elevada. Existen tres variantes principales en función de la naturaleza de la fase estacionaria. 112 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Cabe destacar que en las columnas donde la fase líquida se encuentra inmovilizada sobre las paredes del capilar (u sobre soportes sólidos), existirá unas condiciones de operación máximas que eviten su desprendimiento (sangrado de la columna). 9.3.5 Tipos de detectores cromatográficos. Así mismo, al final de la columna, existirá un sistema de detección que permite obtener las respuestas a cada analito eluido en forma de cromatograma. Atendiendo a su sensibilidad, funcionamiento y tipo de analitos identificables, existen diversas opciones. Los detectores de conductividad térmica solo son utilizables en el caso de operación en isotermo, dado que a temperaturas crecientes se modifica la conductividad y no se dispone de una referencia con la que comparar. No obstante son universales y no destructivos de la muestra. Los detectores de FID (Flame Ionization Detector) ofrecen un amplio rango de señal, no obstante solo permiten la detección de compuestos orgánicos (o carbonados). Existen algunas modificaciones del FID que permiten incrementar su rango de aplicabilidad y sensibilidad. o Los detectores de captura electrónica sirven para la detección de compuestos electronegativos (halogenados etc…) ofreciendo una gran sensibilidad ( ~ fg). o Los detectores de nitrógeno-fósforo permiten la identificación de estos elementos en los analitos, ofreciendo una buena sensibilidad. Los detectores infrarrojos de transformada de Fourier (FTIR) son universales, no obstante presentan un reducido límite de detección. Los espectrómetros de masas son sistemas de detección universales con una gran sensibilidad, empleándose habitualmente en muchas determinaciones de muestras complejas. 113 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 9.4 Cromatografía de líquidos (LC) 9.4.1 Características de la cromatografía de liquidos. Este tipo de cromatografías permite se aplica para la separación de compuestos polares y/o inestables térmicamente. Se puede emplear incluso a compuestos iónicos siempre que cumplan el requisito de ser solubles en la fase móvil. La competencia de interacciones entre los analitos disueltos y la fase móvil por la fase estacionaria permite controlar la interacción cambiando la composición de la fase móvil mediante la adición de modificadores. Esta posibilidad de controlar la constante de distribución a través de la composición de la fase móvil sumada a la diversidad de mecanismos de interacción hace que la cromatografía de líquidos sea mucho más versátil que la de gases, a efectos de regular la separación deseada de los componentes. Los mecanismos de reparto que tienen lugar durante la cromatografía de líquidos son múltiples (adsorción, partición, intercambio iónico o incluso exclusión por tamaño). Además, no existe un mecanismo predominante durante el proceso, sino que la separación producida es fruto de la combinación de todos ellos. Atendiendo a la naturaleza de las fases del sistema (estacionaria/móvil), encontraremos dos modos principales de operación para la separación cromatográfica. Dependiendo de esta configuración, la modificación de las características de la fase móvil, generará diferentes comportamientos en el sistema. 114 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez El modo de operación más habitual es la cromatografía en fase inversa, empleando rellenos apolares basados en partículas o monolitos de sílice funcionalizada y fases polares. 9.4.2 Mecanismos de separación. ADSORCIÓN. Se produce normalmente por interacción de los analitos con los grupos silanol presentes en la superficie de las partículas de sílice de la fase estacionaria. En este caso, la fase estacionaria resulta polar. PARTICIÓN. Consiste en el equilibrio de reparto entre la fase móvil (polar) y la fase estacionaria (apolar). Este mecanismo es predominante cuando el relleno de sílice empleado, se encuentra funcionalizado. Existen cadenas alifáticas (C8 / C18) inmovilizadas sobre la superficie de la sílice. Además, los grupos silanol libres (hidrofílicos) se encuentran bloqueados con un grupo metilo-terminal. CAMBIO IÓNICO. Consiste en el equilibrio de intercambio de cationes/aniones en la muestra con los grupos cargados de una resina de intercambio. Dependiendo del tipo de resina empleada (catiónica / iónica), se favorecerá la retención de determinadas espécies. 115 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Exclusión. Consiste en el empleo de un relleno de porosidad controlada, en cuyo interior tiene lugar la interacción analito-fase estacionaria. Aquellas moléculas de elevado tamaño no accederán a los poros, eluyéndose rápidamente sin experimentar retención. Por otra parte, conforme a su tamaño las moléculas de medio-bajo tamaño circularán a través de los poros de las partículas, experimentando una retención distinta conforme a su naturaleza. 9.4.3 Tipos de columnas para HPLC y LC. Las columnas de LC son columnas cilíndricas generalmente de relleno o capilares, donde en su interior se encuentra una fase estacionaria sólida, en ocasiones constituida por un único monolito (especialmente en el caso de las columnas capilares). Debido a la viscosidad de las muestras líquidas, así como el reducido tamaño de las partículas del relleno (o porosidad de los monolitos), este tipo de columnas generan una elevada pérdida de carga, precisando la impulsión del fluido a su través a altas presiones. Esto implica que la longitud máxima de las columnas será limitada. Así mismo, los requerimientos técnicos de los equipos necesarios son complejos (inyección a presiones de incluso 40-400 bar, bombas de impulsión sin pulsos y alta resistencia, válvulas de inyección a alta presión y volúmenes precisos etc…). 9.4.4 Sistemas de inyección en la columna. En la columna cromatográfica deben introducirse tanto la muestra en un momento puntual como la fase móvil de forma contina. Cabe destacar que la posibilidad de eluir en gradientes es necesaria, empleando generalmente dos disolventes diferentes para la elución Introducción de fase móvil. Generalmente existen dos disolventes para la elución en gradiente, aunque existen sistemas de elución con mezclas ternarias, lo más habitual es encontrar dos posibles configuraciones. 116 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La primera configuración emplea una única bomba de alta presión, resultando mucho más económica y sencilla. El mezclado de los dos disolventes de elución se realiza en una proporción concreta determinada por una válvula proporcional. El principal inconveniente de este sistema es que en rangos de composición donde uno de los disolventes es predominante (e.g. 90% - 10 % o proporciones inferiores). El segundo sistema permite la elución con fases móviles en el rango de cualquier composición. Para ello, el flujo de cada disolvente se controla mediante una bomba de alta presión individual acoplada a un controlador de caudal. A la salida de ambas bombas se encuentra una cámara de mezcla, donde ambos disolventes se combinan previamente a la introducción, evitando la formación de burbujas de gas debido a la contracción de volumen debida a la mezcla. Válvulas de inyección. Para la inyección de muestras se emplean válvulas de seis vías, similares a las encontradas en los sistemas de GC. Estas válvulas presentan un bucle de carga con capacidad conocida, permitiendo inyectar con gran precisión en la columna la cantidad de muestra deseada. 9.4.5 Detectores den HPLC. A la salida de la columna cromatográfica se acopla un sistema de detección para la identificación y cuantificación de los diferentes analitos detectados. Los detectores más empleados son de tipo espectrofotométrico, fluorimétrico, refractométrico, amperométrico o espectrómetros de masas. 117 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La espectroscopía de absorción UV-Vis. Consiste en una técnica basada en la interacción de los analitos de la muestra con radiación electromagnética. La señal de detector se relaciona con la absorbancia de las diferentes fracciones eluidas. Únicamente permitirá la detección de analitos con grupos cromóforos que absorban en el UV-Vis. El detector del sistema puede ser un tubo fotomultiplicador (midiendo una única longitud de onda) o arrays de fotodiodos donde se registra la absorción en el espectro UV- Vis dado. Cabe destacar que tanto el metanol como el acetonitrilo pueden generar una señal de fondo debido a su absorbancia. Los detectores fluorimétricos. Presentan un mecanismo similar a la espectroscopía UV- Vis. No obstante en este caso se registra la radiación correspondiente a la longitud de onda de emisión del analito fluorescente. Precisan determinar tanto la longitud de onda de excitación del compuesto como la longitud de onda de emisión. Los analitos a detectar deben presentar fluorescencia, o ser derivatizados para presentarla. Los detectores amperométricos. Determinan las variaciones en la conductividad de las diferentes fracciones eluidas. Otros detectores. Refractómetros (comparando el índice de refracción entre la fase móvil pura y la fase eluida de la columna), o espectrómetros de masas. En el caso de los detectores tipo MS, se emplean columnas capilares de muy reducido diámetro, operadas a bajo caudal. Esto es debido a la necesidad de los MS de emplear muy reducidas cantidades del analito. De todos estos sistemas de detección, únicamente los refractómetros y los sistemas basados en MS son detectores universales para todo analito. 118 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 9.5 Electroforesis capilar. 9.5.1 Introducción general. La electroforesis capilar es un método de separación no cromatográfico pero que guarda ciertas similitudes con este tipo de procesos. Se fundamente en la migración de las especies cargadas en un soporte adecuado durante la aplicación de un campo eléctrico. La fenomenología del proceso electroforético consiste por tanto la migración de diferentes especies químicas cargadas en función de su tamaño y carga total. Se emplean normalmente tubos capilares (electroforesis capilar), los cuales favorecen estos fenómenos de flujo electro-osmótico. La detección de las especies químicas separadas puede realizarse con diferentes detectores, recogiendo la respuesta instrumental en un electroferograma, con apariencia similar a un cromatograma convencional. Así mismo, la teoría cromatográfica es aplicable a este tipo de procesos, permitiendo la optimización de la resolución y eficacia para la separación. 9.5.2 Factores relacionados con la movilidad de los solutos. La electroforesis capilar presenta dos mecanismos principales que determinan la migración de los solutos: la movilidad electroforética, así como el flujo electrostático. La combinación de ambos factores permite determinar el tiempo de migración para cada analito 𝑙 𝑙 𝐿 𝑡𝑚 = = ∙ Dónde 𝑣𝑎𝑝 es la velocidad global de migración para cada 𝑣𝑎𝑝 (𝜇𝑒 +𝜇𝑒𝑜 ) 𝑉 especie (velocidad aparente). Siendo 𝜇𝑒 y 𝜇𝑒𝑜 los potenciales de migración electroforética (de las diferentes especies) y electro-osmótica (de la disolución) A) Movilidad electroforética. Se trata de un factor relativo a cada analito resulta dependiente de la relación carga-tamaño. La velocidad de migración de los analitos será de sentidos opuestos para las moléculas cargadas con distinto signo. Los cationes migrarán hacia el cátodo, mientras los aniones lo harán hacia el ánodo. Todas aquellas especies neutras quedarán estáticas. Cabe destacar que la relación carga/tamaño considera la carga y tamaño de los iones en su forma solvatada. B) Flujo electro-osmótico. Consiste en el movimiento global de un fluido en el interior de un capilar, debido a la aplicación de un campo eléctrico sobre el mismo. En la mayoría de las modalidades de electroforesis capilar, este movimiento se da hacia el cátodo. 119 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez De forma general, la componente de velocidad por flujo electro-osmótico tiende a ser superior a la de la propia movilidad electroforética de las especies cargadas. Ambas componentes resultan cruciales a efectos de definir el proceso electroforético global. El flujo electro-osmótico global compensará la diferencia en el sentido de las velocidades por movilidad electroforética. Cabe destacar que los capilares empleados son de sílice. Los grupos silanol presentes en la superficie del material pueden experimentar un equilibrio de tipo ácido-base. Este equilibrio producirá la acumulación de protones en las proximidades de las paredes del capilar, regulada conforme al pH de la solución tampón de la que se encuentra relleno el capilar. Estas cargas acumuladas en las paredes son las que favorecen el desarrollo del flujo electro-osmótico. De esta forma, la derivatización del capilar mediante el bloqueo de los grupos silanol con grupo -Si(CH3)3, , evita la formación de cargas reduciendo significativamente la componente de flujo electro- osmótico. 9.5.3 Sistemas de introducción de muestras. La introducción de muestras en el capilar electroforético puede realizarse mediante 3 posibilidades: por presión hidrodinámica (introducción de presión en el compartimento de la muestra, forzando su desplazamiento por el capilar), por presión electrocinética (movimiento de la muestra a través del capilar por aplicación de un potencial eléctrico) y por 120 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez presión hidrostática (empleo de la diferencia de niveles para forzar el desplazamiento de la muestra por acción gravitatoria). La inyección por presión (hidrodinámica / hidrostática) genera perfiles de flujo parabólicos (b) en el capilar, lo cual fomenta la dispersión en los picos del electroferograma. Por el contrario la introducción mediante presión electrostática genera un perfil de avance plano en el capilar (a). 9.5.4 Modalidades de la electroforesis. La electroforesis puede emplearse para la separación de muestras cargadas, aunque generalmente se emplea DNA o proteínas, también puede emplearse para resolver aminoácidos (a un pH sobre o bajo su PI que permita que presenten residuos cargados) o incluso polisacáridos y/o monosacáridos, tras una derivatización mediada por boro. Existen cinco modalidades de electroforesis capilar (EC): EC de zona, EC en gel, Enfoque isoeléctrico capilar, isotacoforesis capilar y la cromatografía micelar de zona (MEKC; cromatografía electrocinética micelar). Electroforesis capilar de zona. La composición de la disolución reguladora es constante en toda la zona de la separación. Se utiliza para iones pequeños, moléculas pequeñas como herbicidas sintéticos, plaguicidas y fármacos siempre de naturaleza iónica. También se ha utilizado para separar proteínas, aminoácidos e hidratos de carbono. 121  TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Electroforesis capilar en gel. Se utiliza una matriz polimérica que contiene una mezcla de disoluciones reguladoras que rellenan los poros. Se utiliza para macromoléculas como proteínas, fragmentos de ADN y oligonucleótidos que presentan la misma carga pero distinto tamaño. Esta técnica permite por tanto separar las especies conforme a su capacidad de migración a través de una matriz, definidas por su tamaño y geometría molecular. Isotacoforesis capilar. Consiste en la inyección de la muestra a analizar entre dos disoluciones reguladoras muy distintas. Existe una primera disolución reguladora con una velocidad de movilidad electroforética por encima de la de todo analito, así mismo la segunda disolución reguladora posee una movilidad electroforética mucho menor que la de cualquiera de los analitos. Enfoque isoeléctrico capilar. Consiste en la separación se basa en la diferencia entre puntos isoeléctricos y se aplica a la separación de especies anfóteras, aminoácidos y proteínas. Generalmente se establece en el capilar un gradiente de pH mediado por el uso de dos tampones distintos entre ánodo y cátodo. Los analitos cargados migrarán a través del capilar modificando su carga conforme al pH encontrado en cada región. Cuando el pH alcance su PI (punto isoeléctrico), se neutralizará la carga del analito, deteniéndose su migración en el sistema. Cromatografía electrocinética micelar (MEKC). Consiste en el empleo de un agente tensioactivo capaz de interactuar en mayor o menor medida con los analitos cargados, formando micelas. Estas micelas formadas recubrirán el capilar, actuando como una fase pseudo-estacionaria capaz de desplazarse a lo largo del capilar. La separación se da por dos mecanismos. Movilidad electroforética de la solución reguladora a lo largo del capilar y reparto cromatográfico mediado por las micelas. Las micelas que rellenan el capilar se comportan como si fuesen una fase estacionaria con movimiento. Solo las sustancias con afinidad por esta fase estacionaria se retendrán. Los cationes se asociarán con la parte externa de la micela (cargada negativamente normalmente). Las sustancias apolares se quedarán dentro de la micela, mientras las sustancias negativas son rechazadas. Las primeras que llegan al detector son las cargadas negativamente, luego aquellas apolares incluidas dentro de la micela y finalmente la micela unida con diferentes cargas positivas. 122 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 9.6 Acoplamiento de técnicas cromatográficas / electroforéticas a MS. 9.6.1 Motivaciones para el acoplamiento y retos tecnológicos. El acople entre técnicas permite incrementar la capacidad de separación obtenida en una primera dimensión, ampliando la información disponible sobre cada respuesta del primer sistema. Esto es posible debido a la gran especificidad de los sistemas MS y las interfases compartidas entre las técnicas cromatográficas y las de MS. Cada pico de un cromatograma / electroferograma podrá ser resuelto posteriormente en un sistema de MS, generando iones de compuestos tanto orgánicos como inorgánicos, detectándolos posteriormente tanto cualitativamente (relación m/z), como cuantitativamente (abundancia en la muestra). Todo esto permite obtener información sobre la estructura de las moléculas orgánicas, inorgánicas y biológicas (incluso a nivel de isomería posicional), composición elemental de las muestras estructura y composición de superficies sólidas, caracterización de las elaciones isotópicas de los átomos además de la composición cualitativa y cuantitativa de mezclas complejas. Para un acoplamiento adecuado, debe garantizarse la compatibilidad e independencia entre métodos. El principal reto de los sistemas Cromatógrafo – MS, consiste en el mantenimiento del vacío requerido por los sistemas de MS, además de las condiciones de T. También, deberán emplearse analizadores capaces de tolerar alta presión y efectuar barridos a gran velocidad. Las características de los espectrómetros de masas en términos de poder de resolución, sensibilidad y exactitud en la medida de la masa dependen del tipo de instrumento, del método de ionización y de su capacidad para separar los iones formados 9.6.2 Acople GC-MS. El acople GC-MS se emplea para la separación de compuestos volátiles, donde la utilización de isótopos marcados como patrones junto al acople permite la detección inequívoca de compuestos no resueltos. Debido a que la muestra saliente del sistema GC se encuentra volatilizada en fase gaseosa, la interfaz GC-MS es sencilla. La adecuada selección del gas portador y el empleo de columnas de bajo sangrado resultan suficientes para conectar la salida de un GC a la fuente de ionización de un MS. 123  TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Interfases. Sistemas de ionización. Analizadores de masas. Acoplamiento directo. Más Impacto electrónico. Permite habitual, se ajusta el caudal obtener resultados altamente Sªs de doble enfoque. de salida del GC al de reproducibles, incluso Consiste el empleo de entrada del MS. empleando distintos GC. un sector magnético para la resolución. Sistemas tipo Open-Split. Ionización química. Consiste Menos utilizados en la introducción e ionización Cuadrupolos. Permiten generalmente, debido a la previa de un gas reactivo, el cual una detección rápida. menor reproducibilidad. ioniza la muestra posteriormente. Reduce la Trampas iónicas. fragmentación del analito pero puede originar aductos del gas- analito. Cabe destacar que cada pico cromatográfico, deberá analizarse por MS al menos en 10 ocasiones, desde el comienzo hasta el final del pico. Esto permite comparar los distintos espectros de masas obtenidos en cada pico. En caso de ser distintos podría indicar la existencia de co-elución de diferentes analitos. Existirán además, otros sistemas de medición que aceptan mayores rangos m/z, lo cual se requiere especialmente en el caso de proteínas ionizadas con metodologías suaves. En todo caso, el resultado analítico obtenido del acople cromatografía-MS es un conjunto bidimensional de datos, donde cada pico cromatográfico vendrá asociado a un espectro de masas. (Imagen para el caso de iones totales). 124 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez El cromatograma se estructura conforme a la suma total de las intensidades recogidas en el detector del M/S para cada ión analizado durante la elución del pico. Así mismo, asociado a cada “ventana temporal” del pico, se resolverá un conjunto de espectros de masas que permitirán la caracterización cualitativa del analito correspondiente a dicho pico. Modos de operación del acople GC-MS. Los sistemas de cromatografía acoplada a MS pueden operarse en dos modalidades: modo de iones totales (Total Ion Monitoring o TIC) y en modo de iones seleccionados (SIM). El primer modo analizará todos los iones formados en cada pico, precisando de una corta ventana temporal para la resolución de los iones y ofreciendo por tanto menores sensibilidades. Al analizar la totalidad de iones formados ofrece una mayor capacidad de determinación cualitativa. El segundo modo emplea una trampa iónica (o el ajuste del analizador a iones de relación m/z concreta. De este modo se determinan solo iones concretos de un modo mucho más preciso. Esta metodología permite incrementar la capacidad de determinación cuantitativa. Interpretación de los espectros obtenidos en sistemas GC-MS. Tras la obtención de un cromatograma de iones y sus espectros asociados, existen múltiples estrategias que pueden llevarse a cabo para la extracción de información relevante. Permite determinar si los picos corresponden a compuestos aislados o existe coelución. Esto es observable cuando para un mismo pico los espectros de masas varían del comienzo del pico al final de su elución. (e.g. Macromoléculas diferenciadas en un único grupo metilo). Comparación de los espectros obtenidos con bases de datos. Debido a la reproducibilidad de la técnica, el patrón obtenido para un compuesto dado podrá ser obtenido en otros equipos y permitir la identificación de compuestos. Debe considerarse la derivatización efectuada sobre algunos analitos. Determinar si existen iones moleculares completos o se ha producido fragmentación de las moléculas. Evaluación del patrón de fragmentación y comparación con estándares. Evaluación de perfiles isotópicos. Algunos elementos como los halógenos, S, Si, P y otros, presentan una abundancia relativamente elevada para varias formas isotópicas. Esto origina que en el espectro de masas se observarán picos con intensidad relativa a la proporción entre la abundancia de los isótopos y con la relación m/z característica. 125 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Aplicaciones de los sistemas de tipo GC-MS. Análisis de alimentos y bebidas, especialmente especies volátiles responsables de aromas y sabores. Análisis de productos derivados del petróleo Hidrocarburos lineales, ramificados, cíclicos y aromáticos. Análisis de fármacos y drogas Fármacos y metabolitos en fluidos biológicos Control de calidad de productos farmacéuticos. Contaminantes en medio ambiente. Como los pesticidas, dioxinas, furanos, VOCs, bifenilos policlorados (PCBs), hidrocarburos poliaromáticos (PAHs), derivados del petróleo (BTEX) o compuestos organometálicos. 9.6.2 Acople LC-MS. Pese a las grandes ventajas de los sistemas GC-MS, únicamente moléculas volátiles y poco sensibles a la degradación térmica serán fácilmente analizables. Principalmente podrán analizarse compuestos moderadamente polares con M < 600 Da. Esto deja fuera un amplio rango de analitos (compuestos iónicos, macromoléculas, compuestos apolares no volátiles…). Los sistemas de LC-MS permiten analizar un rango de analitos mucho más amplio que los sistemas GC-MS, especialmente en lo relativo a polímeros y macromoléculas. No obstante, existen una serie de retos tecnológicos, principalmente asociados a la interfaz cromatógrafo-espectrómetro. 126  TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez La tecnología de HPLC es aplicable a muy diversos compuestos que presentan diversa volatilidad, estabilidad térmica y masas moleculares muy amplias. Se pueden separar incluso especies iónicas. Por otra parte los sistemas de MS son detectores universales que presentan en determinadas condiciones alta selectividad y sensibilidad. Además, la espectrometría de masas puede proporcionar identificación inequívoca de los analitos teniendo en cuenta la información estructural y el cálculo de masa exacta, especialmente cuando se emplean sistemas de MS-MS en tándem. La sensibilidad LC-MS es mayor que la obtenida con otros detectores (fg-pg) y el intervalo lineal suele ser amplio (pg-μg), además, las determinaciones cuantitativas con RSD90%) alcanza el estado polimérico en tiempos cercanos a los 30 minutos. Así mismo, la polimerización se detiene en contacto con el aire. Se tratan de geles inertes, transparentes y estables en amplios rangos de temperatura, pH y fuerza iónica, además de ser resistentes a agentes desnaturalizantes. De modo similar a los geles de agarosa empleados en electroforesis, estos geles están constituidos por un mallado de porosidad controlable (grado de entrecruzamiento entre cadenas). Estas características les dotan de un elevado poder de separación atendiendo al tamaño molecular, actuando como tamices moleculares. 138 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez Todos los geles de poliacrilamida empleados en PAGE constan de dos regiones diferentes: una región concentradora inicial, y una región de resolución suelen prepararse en dos etapas de polimerización sucesivas, donde cada región del gel se prepara con una solución precursora tamponada a diferente pH y con una composición diferente. Zona de concentración. Esta región del gel de poliacrilamida con tamaño de poro grande (4%T). Este gel está preparado con un tampón de Tris/HCl con un pH de 6,8. Este gel se coloca sobre el gel de resolución. La altura de la zona correspondiente al gel de concentración debe ser superior al doble de la altura y el volumen de la muestra que va a ser aplicada. Estas condiciones proporcionan un ambiente para las reacciones de Kohlrausch dando como resultado, la concentración de las proteínas desnaturalizadas con SDS se concentran varias veces. De esta forma en pocos minutos se genera una zona de inicio de la electroforesis (del orden de 20 μm). Zona de resolución. Esta región del gel de poliacrilamida posee poros de un menor tamaño (3 - 30% de monómero de acrilamida) estando típicamente esta tamponada con Tris/HCl con un pH de 8,8. En el gel de resolución es donde las macromoléculas se separan de acuerdo con su tamaño. Los geles de resolución tienen un intervalo óptimo de separación dependiente del porcentaje de monómero utilizado para su preparación. Por ejemplo, se pueden utilizar eficazmente geles con contenidos de 8%, 10% y 12% para separar proteínas de 24 a 205 kDa, 14 a 205 kDa, y 14 a 66 kDa, respectivamente. Así mismo, el tampón de electroforesis PAGE consiste en una mezcla de buffer Tris/HCl ajustado al pH conveniente, un tensioactivo (SDS normalmente) y glicina. La composición de este buffer permite la focalización de las proteínas en una banda fina, debido a que a pH 6.8, la glicina se encuentra casi totalmente en forma Zwitteriónica, migrando por detrás de todas las proteínas, mientras que el anión Cl-, migrará con una mayor velocidad que cualquier proteína. Debido a ello, el frente de glicina y el de Cl- flanquean la banda de proteínas, favoreciendo su migración a través del buffer y concentrándolas en una banda de carga de unos 20 μm de anchura. 139 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez 10.1.2 Separación por electroforesis. La separación por electroforesis consiste en, tras la carga de las muestras en el gel, aplicar un potencial eléctrico entre sus extremos, permitiendo la migración de las especies cargadas a través de este. Debido su estructura, en su estado nativo cada proteína presentará una conformación y geometría propia, donde su carga vendrá definida por el pH del medio y el punto isoeléctrico de la misma, atendiendo a la cantidad de residuos cargados presentes en la estructura. En las separaciones electroforéticas sin agente desnaturalizante, las proteínas migraran en el gel atendiendo tanto a su geometría y tamaño molecular, como a la carga total definida en función del PI (punto isoeléctrico) de la proteína y el pH del medio. Esto generaría unos resultados complejos de analizar, recurriéndose por ello normalmente a la electroforesis con desnaturalización. En las metodologías donde se emplean agentes desnaturalizantes, la estructura de las proteínas es desplegada mediante el empleo de un tensioactivo, generalmente SDS. Tras la desnaturalización por acción combinada de altas temperaturas y el SDS en el buffer mencionado anteriormente, las proteínas adquieren una conformación lineal. Así mismo, el SDS interacciona con las proteínas asociándose a ellas de forma proporcional a su peso molecular. Debido a que el SDS es un tensioactivo aniónico, todas les proteínas presentarán una carga global negativa, proporcional a su tamaño molecular. La cantidad de SDS que interacciona con la proteína es constante y de unos 1.4 gramos de SDS por cada gramo de proteína. Esto nos garantiza una separación proporcional al peso molecular de la proteína. Como ésta se encuentra desnaturalizada, la interacción con el polímero de acrilamida será mayor cuanto mayor 140 TÉCNICAS DE ANÁLISIS Y TECNOLOGÍAS ÓMICAS Jorge Fernández Méndez sea el peso molecular. El resultado global es que la velocidad de desplazamiento de la proteína en el campo eléctrico es inversamente proporcional al peso molecular. Así mismo, las muestras deben ser cargadas en el gel, para ello se emplea un tampón de carga formulado con 4 compuestos principales; SDS (desnaturalizantre), mercaptoetanol (desnaturalización por ruptura de puentes disulfuro) , glicerol (densificante para facilitar la deposición en el pocillo) y azul de bromofenol (especie iónica que permite visualizar el frente de migración). Teoría de la movilidad electroforética. La velocidad a la que se mueve una proteína en el gel s