Cours Biochimie 8-13 PDF

Leçon 8 Hémoglobine (et myoglobine) - Structure et fixation d’oxygène - Transport d'oxygène - Mécanismes moléculaires pour la régulation de hémoglobine - Mutations dans l'hémoglobine Anticorps - Fixation d’antigène - Structure - Régions variables  Transport de l'oxygène des poumons a...

Leçon 8 Hémoglobine (et myoglobine) - Structure et fixation d’oxygène - Transport d'oxygène - Mécanismes moléculaires pour la régulation de hémoglobine - Mutations dans l'hémoglobine Anticorps - Fixation d’antigène - Structure - Régions variables  Transport de l'oxygène des poumons aux tissues Poumons Tissues Comment est-ce que l'hémoglobine peut i) fixer l'oxygène dans les poumons et ii) libérer dans les tissues?  Transport de l'oxygène des poumons aux tissues Poumons 98% saturation 100 torr Tissues 20 torr  Courbe de fixation de l'oxygène Fonction de la saturation par rapport à la concentration d’oxygène  Courbe Courbede defixation fixationde del'oxygène oxygène Fonction de la saturation par rapport à la concentration d’oxygène Fraction d' hémoglobine liée à l'oxygène concentration en oxygène  Courbe Courbede defixation fixationde del'oxygène oxygène Fonction de la saturation par rapport à la concentration d’oxygène oxygène hémoglobine  Courbe Courbede defixation fixationde del'oxygène oxygène Fonction de la saturation par rapport à la concentration d’oxygène Fraction d' A quelle pression d’oxygène hémoglobine liée à l'oxygène est-ce que l'hémoglobine est demi-saturée? concentration en oxygène  Pression de demi-saturation (P50) Fonction de la saturation par rapport à la concentration d’oxygène Fraction d' hémoglobine liée à l'oxygène concentration en oxygène  Pression de demi-saturation (P50) Fonction de la saturation par rapport à la concentration d’oxygène Fraction d' hémoglobine liée à l'oxygène Demi-saturation: P50 = 26 torr concentration en oxygène  Pression de demi-saturation (P50) Fonction de la saturation par rapport à la concentration d’oxygène Est-ce que Fraction d' l'hémoglobine hémoglobine est saturée dans liée à l'oxygène les poumons? concentration en oxygène  Saturation de l’hémoglobine dans les poumons Concentration (ou pression) d’oxygène dans les poumons = 100 torr Fraction d' hémoglobine liée à l'oxygène concentration en oxygène  Saturation de l’hémoglobine dans les poumons Concentration (ou pression) d’oxygène dans les poumons = 100 torr 98% de saturation Fraction d' hémoglobine liée à l'oxygène concentration en oxygène  Transport d'oxygène des poumons au tissue Poumons 98% saturation 100 torr  Transport de l'oxygène des poumons aux tissues Poumons 98% saturation 100 torr Tissues 20 torr Est-ce que l'hémoglobine peut dissocier son oxygène dans les tissues?  Saturation de l’hémoglobine dans les poumons Concentration (ou pression) d’oxygène dans les tissues = 20 torr Combien de pourcent d' Fraction d' hémoglobine hémoglobine liée à l'oxygène est lié à l'oxygène à 20 torr? concentration en oxygène  Saturation de l’hémoglobine dans les poumons Concentration (ou pression) d'oxygène dans les tissues = 20 torr  L’oxygène peut Fraction d' hémoglobine être transporté liée à l'oxygène des poumons aux 32% saturation tissues! concentration en oxygène Saturation de l’hémoglobine dans les poumons tissue poumon 66% Saturation de l’hémoglobine dans les poumons tissue poumon Combien de molécule d'oxygène peut être transporté par 66% l'hémoglobine si la protéine circule une fois des poumons aux tissues? Saturation de l’hémoglobine dans les poumons tissue poumon 0.66 x 4 = 2.66 66% Plus d'oxygène est transporté pendant un exercice Courbe sigmoidale Pourquoi est-ce que la courbe est sigmoïdale et pas linéaire?  Le modèle concerté Absence d'oxygène Présence d'oxygène - La conformation T est - La conformation R est favorisée favorisée - Affinité basse pour - Affinité forte pour l'oxygène l'oxygène  Le modèle concerté Absence d'oxygène Présence d'oxygène - La conformation T est - La conformation R est favorisée favorisée - Affinité basse pour - Affinité forte pour l'oxygène l'oxygène  Le modèle concerté Pourquoi doit l'hémoglobine changer l'affinité pour O2? L’avantage de la fixation coopérative d’oxygène coopérative d’oxygène L’avantage de la fixation coopérative d’oxygène coopérative d’oxygène tissues poumons 15% L’avantage de la fixation coopérative d’oxygène coopérative d’oxygène tissues poumons 15% 20% L’avantage de la fixation coopérative d’oxygène coopérative d’oxygène tissues poumons 66%  Changement de conformation T  R Comment est-ce que l'hémoglobine peut changer sa conformation (T R)? Les mécanismes moléculaires Les mécanismes moléculaires 1. L’atome de fer tire l'histidine 2. Le groupe carboxyle terminal de l'hélice  est positionné à l’interface entre les sous-unités d’hémoglobine 3. Les changements de conformations sont transformés d’une sous-unité à l’autre L’hémoglobine est un assemblage de 4 sous-unités de type myoglobine Saturation de l'hémoglobine et de la myoglobine avec l'oxygène Saturation Saturationde del'hémoglobine hémoglobine et et myoglobine de la myoglobine avec avec oxygène l'oxygène Est-ce que la myoglobine pourait aussi transporter l’oxygène des poumons aux tissues? Saturation Saturationde del'hémoglobine hémoglobine et et myoglobine de la myoglobine avec avec oxygène l'oxygène tissues poumons myoglobine: 98% dans les poumons 91% dans les tissues Saturation Saturationde del'hémoglobine hémoglobine et et myoglobine de la myoglobine avec avec oxygène l'oxygène tissues poumons myoglobine: 98% dans les poumons 91% dans les tissues hémoglobine: 98% dans les poumons 32% dans les tissues  Leçon 8 Hémoglobine (et myoglobine) - Structure - Fixation d’oxygène et interactions coopératives - Mécanismes moléculaires pour la régulation de hémoglobine - Mutations dans l'hémoglobine Anticorps - Fixation d’antigène - Structure - Régions variables Mécanismes moléculaires pour la régulation de l'hémoglobine 4 mécanismes 2,3-bisphosphoglycerate pH (concentration de H+) Hémoglobine foetale CO2 2,3-bisphosphoglycérate Pourquoi est-ce qu’on trouve une grande différence? 2,3-bisphosphoglycérate Il y a du 2,3-bisphosphoglycérate dans les globules rouges Comment est-ce que le 2,3- BPG peut changer l’affinité avec l'oxygène?  Les mécanismes moléculaires interactions avec des aminoacides chargés positivement 2,3-BPG se place dans une poche au milieu du tetramère de l'hémoglobine (en état T) Le 2,3-BPG stabilise l’état T (qui a une affinité basse pour l’oxygène) Mécanismes moléculaires pour la régulation de l'hémoglobine 4 mécanismes 2,3-bisphosphoglycerate pH (concentration de H+) Hémoglobine foetale CO2 pH  L’effet du pH sur l’affinité avec l'hémoglobine L'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène est différente à différent pH  L’effet du pH sur l’affinité avec l'hémoglobine L'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène est différente à différent pH pH dans les poumons: 7.4 pH dans les tissues: 7.2  L’effet du pH sur l’affinité avec l'hémoglobine L'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène est différente à différent pH pH dans les poumons: 7.4 pH dans les tissues: 7.2 Est-ce que l’effet du pH est utile pour le transport d’oxygène?  L’effet L’effect du pH du sur pH àl’affinité l’affinitéavec d’hémoglobine l'hémoglobine L'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène est différente à différent pH tissues poumons pH dans les poumons: 7.4 pH dans les tissues: 7.2 La différence de fixation de l'oxygène dans les poumons et les tissues est encore plus grande!  L’effet L’effect du pH du sur pH àl’affinité l’affinitéavec d’hémoglobine l'hémoglobine L'affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène est différente à différent pH tissues poumons pH dans les poumons: 7.4 pH dans les tissues: 7.2 Quel est le mécanisme moléculaire? Un pH différent peut changer l’état d’ionisation pKa  Etat d’ionisation de l'histidine Ka [His] ------- = ------------- [H+] [HisH] HisH His pKa = - log10(Ka)  Ka = 10-6 = 0.000001 pH = - log10 [H+]  [H+] = 10-7.4 = 0.00000004 [H+] = 10-7.2 = 0.000000063 [His] ------------- = 25 (au pH 7.4) ou 16 (au pH 7.2) [HisH] poumon tissue  Mécanisme moléculaire: H+ provoque la libération d’oxygène Mécanismes moléculaires pour la régulation de l'hémoglobine 4 mécanismes 2,3-bisphosphoglycerate pH (concentration de H+) Hémoglobine foetale CO2 foetus Hémoglobine fœtale et maternelle L'hémoglobine fœtal a 2 unités  et 2 unités g g g hémoglobine hémoglobine adulte foetal Hémoglobine Hémoglobinefœtale foetaleetetmaternelle maternel L'hémoglobine fœtal a 2 unités  et 2 unités g g g hémoglobine hémoglobine adulte foetal  L’affinité de l'hémoglobine foetale pour l'oxygène est plus haute que celle de l'hémoglobine adulte Hémoglobine Hémoglobinefœtale foetaleetetmaternelle maternel L'hémoglobine fœtal a 2 unités  et 2 unités g g g hémoglobine hémoglobine adulte foetal Pourquoi est-ce que c’est utile que l’hémoglobine foetal a une affinité d’oxygène élevé? Hémoglobine Hémoglobinefœtale foetaleetetmaternelle maternel  L’oxygène est transporté de l'hémoglobine maternelle à l'hémoglobine foetale Hémoglobine fœtale et maternelle  L’oxygène est transporté de l'hémoglobine maternelle à l'hémoglobine foetale Quelles sont les différences entre les deux hémoglobines au niveau moléculaire? Hémoglobine Hémoglobinefœtale foetaleetetmaternelle maternel La sous-unité g a 72% d’aminoacides identiques avec la sous-unités  His 143 (sous-unités )  Ser 143 (sous-unités g) – 2 charges positives sont enlevées du site qui fixe le 2,3-BPG  L’affinité du HbF pour 2,3-BPG est diminuée  L’affinité du HbF pour l'oxygène est augmentée Mécanismes moléculaires pour la régulation de l'hémoglobine 4 mécanismes 2,3-bisphosphoglycerate pH (concentration de H+) Hémoglobine foeteaux CO2 L’effet du CO2 sur l’affinité de l'hémoglobine avec CO2  Leçon 8 Hémoglobine (et myoglobine) - Structure - Fixation d’oxygène et interactions coopératives - Mécanismes moléculaires pour la régulation de hémoglobine - Mutations dans l'hémoglobine Anticorps - Fixation d’antigène - Structure - Régions variables  Des mutations Sickledans les gènesDisease Cell codant pour les sous- unités de l’hémoglobine peuvent être responsables de maladies L’anémie falciforme (sickle cell disease) Thalassémie ( thalassemia)  L’anémie falciforme Les protéines d’hémoglobine forment des fibres Pourquoi?  L’anémie falciforme Les protéines d’hémoglobine forment des fibres Des mutations augmentent l' hydrophobicité de l'hémoglobine  L’anémie falciforme Maladie génétique Mutation des sous-unités  de hémoglobine: Glu 6  Val 6 HbS (sickled hemoglobin) Population avec la mutation dans un allèle  Population avec la mutation dans un allèle Les gens avec la mutation Glu 6  Val 6 sont protégés patiellement d’une infection avec la malaria  Leçon 8 Hémoglobine (et myoglobine) - Structure - Fixation d’oxygène et interactions coopératives - Mécanismes moléculaires pour la régulation de hémoglobine - Mutations dans l'hémoglobine Anticorps - Fixation d’antigène - Structure - Régions variables Structure et fonction des anticorps Quelle est la structure et la fonction des anticorps?  Structure et fonction des anticorps Structure de la forme ‚Y‘ Se fixent sur la surface des agents infectieux Composant du système immunitaire  Structure des anticorps chaîne chaîne légère 1 légère 2 chaîne chaîne lourde 1 lourde 2 Structure des anticorps Quelles sont les chaînes lourdes et légères?  Structure des anticorps chaîne légère 1 chaîne lourde 1  Structure des anticorps ponts disulfures chaîne légère 1 chaîne lourde 2  Structure des anticorps ponts disulfures chaîne légère 1 Quelles régions peuvent fixer les agents infectieux? chaîne lourde 2  Structure des anticorps chaîne légère 1 Quelles régions peuvent fixer les agents infectieux? chaîne lourde 2  Fonction des anticorps antigène (= protéine, agent glucide, etc.) infectieux anticorps Les anticorps peuvent se fixer sur des antigènes spécifiques présents sur les agents infectieux.  Fonction des anticorps Les anticorps fixés sont reconnus par le système immunitaire qui élimine les agents infectieux.  Plusieurs agents infectieux Comment le système immunitaire peut générer des anticorps contre tous les agents infectieux différents?  Leçon 8 Hémoglobine (et myoglobine) - Structure - Fixation d’oxygène et interactions coopératives - Mécanismes moléculaires pour la régulation de hémoglobine - Mutations dans l'hémoglobine Anticorps - Fixation d’antigène - Structure - Régions variables Anticorps avec plusieurs specificités régions variables Anticorps avec plusieurs specificités Combien d’anticorps différent est-ce qu’il y a dans un humain? < 1000 ? 1000-1‘000‘000 ? > 1‘000‘000 ? Anticorps avec plusieurs specificités Environ 10 milliards (1010 !) d‘anticorps différents sont générés dans un humain.  Régions variables et constantes des anticorps régions variables régions variables Chaque anticorps a une région variable et une région constante  Régions variables et constantes des anticorps régions variables régions variables régions variables Chaque anticorps a une région variable et une région constante  Régions variables et constantes des anticorps régions variables régions variables régions variables Chaque anticorps a une région variable et une région constante Chaque région variable a 3 boucles de peptides variables Régions variables des anticorps (vue d'en-haut)  Régions variables des anticorps (vue d'en-haut) environ 20 positions d‘aminoacides sont variables  Régions variables des anticorps (vue d'en-haut) Combien d’anticorps peuvent être formés? environ 20 positions d‘aminoacides sont variables Régions variables des anticorps (vue d'en-haut) 2040 anticorps différents = 1052 !  Interaction complémentaire Exemple 1: antigène anticorps (seule une région variable est montrée)  Interaction complémentaire Exemple 1: Exemple 2: antigène antigéne anticorps (seule une anticorps région variable (seule la partie supérieure est montrée) des deux régions variables est montrée) Production d'anticorps dans les animaux Comment peut-on produire des anticorps?  Production d'anticorps dans les animaux Un antigène est injecté dans un animal (souris, lapin, etc.) Le système immunitaire développe des cellules B qui produisent des anticorps  Applications des anticorps Recherche: détection de protéines (discuté en leçon 3): Médicaments: ligands très spécifiques et puissants  Leçon 8 Hémoglobine (et myoglobine) - Structure - Fixation d’oxygène et interactions coopératives - Mécanismes moléculaires pour la régulation de hémoglobine - Mutations dans l'hémoglobine Anticorps - Fixation d’antigène - Structure - Régions variables Série 7 Question 1 Série 7 Question 2 Série 7 Question 3 Série 7 Question 4 Série 7 Question 5  Cours Biochimie I Leçon 9: Enzymes: concepts de base et cinétique Christian Heinis [email protected], BCH 5305  Leçon 9 Enzymes - Catalyse enzymatique - Energie libre - Etat de transition et complexe enzyme-substrat - Modèle de Michaelis-Menten  Catalyse d’enzyme cétone alcool Exemple 1 Réaction: Isomérisation du dihydroxyacétone phosphate en glyceraldéhyde 3- alcool phosphate. Enzyme cétone Enzyme: Triose phosphate isomerase (TIM) (utilisé dans la glycolyse)  Catalyse d’enzyme cetone alcool Exemple 1 Réaction: Isomérisation du dihydroxyacétone phosphate en glyceraldéhyde 3- alcool phosphate. Enzyme cetone Enzyme: Triose phosphate isomerase (TIM) Pourquoi la catalyse des réactions chimiques dans la biologie (utilisé dans la glycolyse) est-elle si importante? L’isomérisation du dihydroacétone phosphate Réactions par seconde: L’isomérisation non-catalysée est simplement trop lente!  Exemple 2: Hydratation du CO2 Formation d'acide carbonique à partir de CO2 et de H2O. anhydrase carbonique  Hydratation du CO2 par l’anhydrase carbonique Réactions per seconde: Chaque molécule d’enzyme peut hydrater 106 molécules de CO2 par seconde! Example 3: Activité protéolytique protéase  Example 3: Activité protéolytique protéase Dans quelle direction est-ce que la réaction se passe?  Leçon 9 Enzymes - Catalyse enzymatique - Energie libre - Etat de transition et complexe enzyme-substrat - Modèle de Michaelis-Menten  Energie libre Réaction: réactifs ou produits ? énergie libre (G) ? ?  Différence d'énergie libre énergie libre (G) différence d'énergie libre (DG)  Différence d'énergie libre DG = négatif énergie libre (G) différence d'énergie libre (DG) réaction exergonique  Différence d'énergie libre DG = positif énergie libre (G) différence d'énergie libre (DG) réaction endergonique  Vitesse d'une réaction A énergie DG petit libre (G) B DG grand Quelle réaction entre les deux est la plus rapide?  Vitesse d'une réaction énergie DG petit libre (G) DG grand  La vitesse d'une réaction ne dépend pas de la différence d'énergie libre  Energie libre des réactifs et des produits énergie libre (G) ? ? Où peut-on trouver les valeurs de l'énergie libre des réactifs et des produits?  Energie libre (G) énergie libre (G) ? ?  Il n'existe pas de valeurs générales pour l'énergie libre (G)  Mais il y a des valeurs générales pour l'énergie libre standard (G°)  Energie libre standard (G°) énergie libre 1M 1M standard 1M 1M G° DG°: Energie libre standard G°: Si tous les réactifs et produits ont une concentration de 1 molaire (1 M)  Energie libre standard (G°) énergie libre 1M 1M standard 1M 1M G° DG°: Energie libre standard G°: Si tous les réactifs et produits ont une concentration de 1 molaire (1 M) Energie libre standard G°': Concentration de 1 molaire (1 M); (pour les réactions biochimiques) pH = 7  Energie libre standard (G°) énergie libre 1M 1M standard 1M 1M G° DG°: Energie libre standard G°: Si tous les réactifs et produits ont une concentration de 1 molaire (1 M) Energie libre standard G°': Concentration de 1 molaire (1 M); (pour les réactions biochimiques) pH = 7 Quelle est la différence entre DG et DG°?  Changer les concentrations change l’énergie libre réactifs produits 1M 1M énergie DG = DG° libre 1M 1M (G) DG 0.1 M 0.03 M La différence d'énergie libre (DG) dépend des concentrations des réactifs et des produits!  Changer les concentrations change l’énergie libre réactifs produits 1M 1M énergie DG = DG° libre 1M 1M (G) DG 0.1 M 0.03 M La différence d'énergie libre (DG) dépend des concentrations des réactifs et des produits! Comment peut-on calculer DG? Changer les concentrations change l’énergie libre For A the reaction: B A + B C +CD D T = 298 K, [A] = [B] = [C] = [D] = 1 M  DG = DGo' [C] [D] DG = DGo' + RT ln ---------- [A] [B] T = température; R = constante des gaz  La différence d'énergie libre peut être calculée si on connaît les concentrations des réactifs et des produits ainsi que la différence d'énergie libre standard réactifs produits 1M 1M énergie DG = DG° libre 1M 1M (G) DG [C] [D] 0.1 M 0.03 M DG = DGo' + RT ln ---------- [A] [B] Calculer les concentrations de réactifs/produits en equilibre réactifs produits DG = 0 ?M ?M ?M ?M énergie libre (G) La différence d'énergie libre (DG) à l'équilibre = 0 La différence d'énergie libre (DG) à l'équilibre = 0 [C] [D] DG = DGo' + RT ln ---------- [A] [B] A l'équilibre: DG = 0 [Ceq] [Deq] 0 = DGo' + RT ln --------------- [Aeq] [Beq] La différence d'énergie libre (DG) à l'équilibre = 0 [Ceq] [Deq] DGo' = - RT ln --------------- [Aeq] [Beq] La différence d'énergie libre (DG) à l'équilibre = 0 [Ceq] [Deq] DGo' = - RT ln --------------- [Aeq] [Beq] Keq' For A the reaction: B A + B C +CD D La différence d'énergie libre (DG) à l'équilibre = 0 [Ceq] [Deq] DGo' = - RT ln --------------- [Aeq] [Beq] Keq' DGo' = - RT ln Keq' Calculer les concentrations des réactifs et des produits à l'équilibre DGo' = - RT ln Keq' DGo' = - 2.303 RT log10 Keq‘ T = 298 K, R = 8.315 x 10-3 kJmol-1 DGo' = - 5.69 log10 Keq‘ Keq‘ = 10 -DG°' / 5.69 Exemple 1: calculer la constante d'équilibre d'une réaction d’isomérisation Isomérisation du dihydroacetone phosphate en glyceraldehyde 3-phosphate DGo' = 1.8 kcal/mol Quel est le rapport entre GAP et DHAP dans cette réaction en equilibre? Exemple 1: calculer la constante d'équilibre d'une réaction d’isomérisation Isomérisation du dihydroacetone phosphate en glyceraldehyde 3-phosphate DGo' = 1.8 kcal/mol DGo' = 1.8 kcal/mol = 7.53 kJ/mol Exemple 1: calculer la constante d'équilibre d'une réaction d’isomérisation Isomérisation du dihydroacetone phosphate en glyceraldehyde 3-phosphate DGo' = 1.8 kcal/mol DGo' = 1.8 kcal/mol = 7.53 kJ/mol Keq‘ = 10 -DG°' / 5.69  Exemple 1: calculer la constante d'équilibre d'une réaction d’isomérisation Isomérisation du dihydroacetone phosphate en glyceraldehyde 20 3-phosphate Keq‘ = 0.0475 1  Exemple 2: Calculer l'énergie libre Concentrations: 0.0002 M Est-ce que la réaction peut se produire aux ? concentrations indiquées? 0.000003 M  Exemple 2: Calculer l'énergie libre Concentrations: [GAP] 0.0002 M DG = DGo' + 2.3 RT log ---------- [DHAP] ? 0.000003 M  Exemple 2: Calculer l'énergie libre Concentrations: [GAP] 0.0002 M DG = DGo' + 2.3 RT log ---------- [DHAP] ? 7.53 kJ/mol 0.000003 0.000003 M 8.315 x 10-3 -------------- 298 0.0002  Exemple 2: Calculer l'énergie libre Concentrations: [GAP] 0.0002 M DG = DGo' + 2.3 RT log ---------- [DHAP] ? 7.53 kJ/mol 0.000003 0.000003 M 8.315 x 10-3 -------------- 298 0.0002 DG = 7.53 + 2.3 x 8.315 x 10-3 x 298 log10 (0.000003/0.0002)  Exemple 2: Calculer l'énergie libre Concentrations: DG = - 2.86 kJ/mol 0.0002 M Est-ce que la réaction peut ? se produire aux concentrations indiquées? 0.000003 M  Exemple 3: Calculer l'énergie libre Concentrations: 0.0002 M Est-ce que la réaction peut se produire aux ? concentrations indiquées? 0.5 M  Exemple 3: Calculer l'énergie libre Concentrations: [GAP] 0.0002 M DG = DGo' + 2.3 RT log ---------- [DHAP] ? 7.53 kJ/mol 0.5 0.5 M 8.315 x 10-3 -------------- 298 0.0002 DG = 7.53 + 2.3 x 8.315 x 10-3 x 298 log10 (0.5/0.0002)  Exemple 3: Calculer l'énergie libre Concentrations: DG = 26.9 kJ/mol 0.0002 M Est-ce que la reaction peut ? se produire aux concentrations indiquées? 0.5 M  Une réaction peut se produire si la différence d'énergie libre DG est négative réactifs énergie produits libre (G) différence d'énergie libre (DG) La différence d'énergie libre dépend des concentrations des réactifs et des produits!  Leçon 9 Enzymes - Catalyse enzymatique - Energie libre - Etat de transition et complexe enzyme-substrat - Modèle de Michaelis-Menten Etat de transition et complexe enzyme-substrat En général, les enzymes ont un site actif Emil Fischer qui peut lier le substrat et catalyser la Prix Nobel en 1902 réaction correspondante. Analogie « clef et serrure » La structure d’une enzyme possède souvent une certaine flexibilité: adaptation induite (« induced fit ») La structure d’une enzyme possède souvent une certaine flexibilité: adaptation induite (« induced fit ») Que fait l'enzyme avec le réactif?  Stabilisation de l'état de transition énergie d'activation Exemple d'un état de transition  Stabilisation de l'état de transition énergie d'activation Par définition, la catalyse est la stabilisation de l’état de transition par rapport au réactif et au produit réactif produit énergie libre Par définition, la catalyse est la stabilisation de l’état de transition par rapport au réactif et au produit énergie d'activation réactif énergie libre produit Par définition, la catalyse est la stabilisation de l’état de transition par rapport au réactif et au produit réactif énergie d'activation énergie libre produit  Par définition, la catalyse est la stabilisation de l’état de transition par rapport au réactif et au produit réactif énergie d'activation L'enzyme change-t-elle énergie libre l'équilibre entre le substrat et le produit? produit Les enzymes changent la vitesse des réactions Réactions per seconde: Etat de transition: non-stabilisé par une enzyme substrat tordu = état de transition Etat de transition: stabilisé par une enzyme Comment l'état de transition est-il stabilisé? Exemple de la stabilisation d'un état de transition  Le site actif est en général formé par des parties différentes de la séquence Structure de la lysozyme Séquence de la lysozyme Les chaînes latérales aident souvent à stabiliser l'état de transition  Leçon 9 Enzymes - Catalyse enzymatique - Energie libre - Etat de transition et complexe enzyme-substrat - Modèle de Michaelis-Menten Modèle de Michaelis-Menten  Réaction chimique (sans enzyme) Réaction SP substrat 2SP produit S1 + S2  P  Réaction chimique (sans enzyme) Réaction Vitesse SP 2SP S1 + S2  P D [produit] Vitesse = ---------------- D [temps]  Réaction chimique (sans enzyme) Réaction Vitesse constante de vitesse SP V = k[S] premier ordre vitesse 2SP V = k[S]2 deuxième ordre S1 + S2  P V = k[S1][S2] deuxième ordre  Réaction chimique catalysée par une enzyme Observation de Michaelis et Menten D [produit] Vitesse = ---------------- D [temps]  Réaction chimique catalysée par une enzyme Observation de Michaelis et Menten D [produit] Vitesse = ---------------- D [temps] Réaction chimique catalysée par une enzyme Observation de Michaelis et Menten  Réaction chimique catalysée par une enzyme Observation de Michaelis et Menten A quel type de courbe s'attend-on pour une réaction non-catalysée? par exemple pour une réaction de premier ordre: V = k [S]  Réaction chimique catalysée par une enzyme Observation de Michaelis et Menten A quel type de courbe s'attend-on pour une réaction non-catalysée? par exemple pour une réaction de premier ordre: V = k [S] Deux constantes décrivent la réaction catalysée Vitesse maximale (Vmax) Constante Michaelies Menten (KM) Réaction chimique catalysée par une enzyme Modèle proposé par Michaelis et Menten Réaction catalysée k1 k2 S+E ES E+P k-1 k-2 substrat enzyme complex produit substrat-enzyme Réaction chimique catalysée par une enzyme Modèle proposé par Michaelis et Menten Réaction catalysée k1 k2 S+E ES E+P k-1 k-2 substrat enzyme complex produit substrat-enzyme Quelle est l'équation de la vitesse de réaction catalysée? Réaction chimique catalysée par une enzyme Modèle proposé par Michaelis et Menten Réaction catalysée k1 k2 S+E ES E+P k-1 k-2 Vitesse V = k2[ES] - k-2[E][P]  Réaction chimique catalysée par une enzyme Modèle proposé par Michaelis et Menten Réaction catalysée k1 k2 S+E ES E+P k-1 k-2 Vitesse V = k2[ES] - k-2[E][P] Vitesse (V0) Au temps 0: [P] = 0  V0 = k2 [ES] Réaction chimique catalysée par une enzyme Modèle proposé par Michaelis et Menten Réaction catalysée k1 k2 S+E ES E+P k-1 k-2 Vitesse (V0) V0 = k2 [ES] ? Réaction chimique catalysée par une enzyme Etat stationnaire proposé par George Briggs et John Haldane k1 k2 S+E ES E+P V0 = k2 [ES] k-1 k-2 Vitesse de formation de ES = k1 [E][S] Vitesse de destruction de ES = (k-1 + k2 ) [ES] Réaction chimique catalysée par une enzyme Etat stationnaire proposé par George Briggs et John Haldane k1 k2 S+E ES E+P V0 = k2 [ES] k-1 k-2 Vitesse de formation de ES = k1 [E][S] Vitesse de destruction de ES = (k-1 + k2 ) [ES] k1 [E][S] = (k-1 + k2 )[ES] Réaction chimique catalysée par une enzyme Etat stationnaire proposé par George Briggs et John Haldane k1 k2 S+E ES E+P V0 = k2 [ES] k-1 k-2 Vitesse de formation de ES = k1 [E][S] Vitesse de destruction de ES = (k-1 + k2 ) [ES] k1 [E][S] = (k-1 + k2 )[ES] Réaction chimique catalysée par une enzyme Etat stationnaire proposé par George Briggs et John Haldane k1 k2 S+E ES E+P k-1 k-2 k1 [E][S] V0 = k2 ---------------- (k-1 + k2 )  Réaction chimique catalysée par une enzyme k1 [E][S] V0 = k2 ---------------- (k-1 + k2 ) L'équation est modifiée en 3 étapes: Substitution 1 k-1 + k2 KM = ---------------- k1  Réaction chimique catalysée par une enzyme k1 [E][S] V0 = k2 ---------------- (k-1 + k2 ) L'équation est modifiée en 3 étapes: Substitution 1 Substitution 2 k-1 + k2 KM = ---------------- [E]T = [E] + [ES] k1 enzyme total  Réaction chimique catalysée par une enzyme k1 [E][S] V0 = k2 ---------------- (k-1 + k2 ) L'équation est modifiée en 3 étapes: Substitution 1 Substitution 2 Substitution 3 k-1 + k2 KM = ---------------- [E]T = [E] + [ES] Vmax = k2 [E]T k1 enzyme total Vitesse maximale  Réaction chimique catalysée par une enzyme vitesse t = 0 [S] V0 = Vmax ---------------- [S] + KM vitesse maximale Constante de Michaelis Menten KM  Réaction chimique catalysée par une enzyme vitesse t = 0 [S] V0 = Vmax ---------------- [S] + KM vitesse maximale Constante de Michaelis Menten KM Quelle est la signification de Vmax? Signification de Vmax Nombre de molécule de produit générée par unité de temps si l'enzyme est saturée complètement par le substrat Vmax est proportionnel à la constante k2 qui est aussi appelée kcat: Vmax = k2 [E]T  Vmax = kcat [E]T  Réaction chimique catalysée par une enzyme vitesse t = 0 [S] V0 = Vmax ---------------- [S] + KM vitesse maximale Constante de Michaelis Menten KM Quelle est la signification de KM? Signification de KM "L'affinité pour le substrat" Un KM très bas (p.ex. 0.1 mM)  l'enzyme a une forte affinité pour le substrat Un KM très haut (p.ex. 1 mM)  l'enzyme a une faible affinité pour le substrat KM = la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de réaction est égale à la moitié de Vmax  Exemple 1: Détermination de Vmax La vitesse de réaction pour l'hydrolyse d'un peptide a été mesurée aux concentrations de substrat suivantes: 10, 20, 40 et 80 mM. Quel est le Vmax? [S1] = 80 mM [S2] = 40 mM [S3] = 20 mM [S4] = 10 mM  Exemple 1: Détermination de Vmax La vitesse de réaction pour l'hydrolyse d'un peptide a été mesurée aux concentrations de substrat suivantes: 10, 20, 40 et 80 mM. Quel est le Vmax? Velocité: v1 [S1] = 80 mM [V1] = 90s-1 v2 [S2] = 40 mM [V2] = 70s-1 v3 [S3] = 20 mM [V3] = 50s-1 v4 [S4] = 10 mM [V4] = 25s-1  Exemple 1: Détermination de Vmax La vitesse de réaction pour l'hydrolyse d'un peptide a été mesurée aux concentrations de substrat suivantes: 10, 20, 40 et 80 mM. Concentration: Velocité: [S1] = 80 mM [V1] = 90s-1 [S2] = 40 mM [V2] = 70s-1 [S3] = 20 mM [V3] = 50s-1 [S4] = 10 mM [V4] = 25s-1 Quel est le Vmax? 0 mM 50 mM 100 mM  Exemple 1: Détermination de Vmax La vitesse de réaction pour l'hydrolyse d'un peptide a été mesurée aux concentrations de substrat suivantes: 10, 20, 40 et 80 mM. Concentration: Velocité: Vmax [S1] = 80 mM [V1] = 90s-1 [S2] = 40 mM [V2] = 70s-1 [S3] = 20 mM [V3] = 50s-1 [S4] = 10 mM [V4] = 25s-1 Vmax = 95 s-1 0 mM 50 mM 100 mM  Exemple 2: Détermination de KM La vitesse de réaction pour l'hydrolyse d'un peptide a été mesurée aux concentrations de substrat suivantes: 10, 20, 40 et 80 mM. Concentration: Velocité: [S1] = 80 mM [V1] = 90s-1 [S2] = 40 mM [V2] = 70s-1 [S3] = 20 mM [V3] = 50s-1 [S4] = 10 mM [V4] = 25s-1 Quel est le KM? 0 mM 50 mM 100 mM  Exemple 2: Détermination de KM La vitesse de réaction pour l'hydrolyse d'un peptide a été mesurée aux concentrations de substrat suivantes: 10, 20, 40 et 80 mM. Concentration: Velocité: [S1] = 80 mM [V1] = 90s-1 [S2] = 40 mM [V2] = 70s-1 [S3] = 20 mM [V3] = 50s-1 V1/2 [S4] = 10 mM [V4] = 25s-1 KM = 20 mM KM 0 mM 50 mM 100 mM  Leçon 9 Enzymes - Catalyse enzymatique - Energie libre - Etat de transition et complexe enzyme-substrat - Modèle de Michaelis-Menten  Leçon 10 Stratégies catalytiques - Protéases - Anhydrase carbonique - Enzyme de restriction Inhibition enzymatique Série 8 Question 1 Saturation de l’hémoglobine au poumons et tissue Saturation de l’hémoglobine au poumons et tissue tissue poumon Saturation de l’hémoglobine au poumons et tissue tissue poumon 95% 32% Série 8 Question 2  Hémoglobine et myoglobine Hémoglobine Myoglobine L’hémoglobine est un assemblage de 4 sous-unités de type myoglobine Série 8 Question 3 Série 8 Question 4  Transport d'oxygène des poumons au tissue Poumons Tissue  Transport d'oxygène des poumons au tissue Poumons 80 torr Tissue 20 torr Saturation de l’hémoglobine au poumons tissue poumon 66% L’effect de CO2 à l’affinité d’hémoglobine avec CO2 L’effect de CO2 à l’affinité d’hémoglobine avec CO2 Série 8 Question 5 Anticorps avec plusieurs specificités Environ 10 milliards (1010 !) d‘anticorps différents sont générés dans un humain.  Régions variables et constantes des anticorps régions variables régions variables Chaque anticorps a une région variable et une région constante  Régions variables et constantes des anticorps régions variables régions variables régions variables Chaque anticorps a une région variable et une région constante  Régions variables et constantes des anticorps régions variables régions variables régions variables Chaque anticorps a une région variable et une région constante Chaque région variable a 3 boucles de peptides variables Régions variables des anticorps (vue d'en-haut)  Régions variables des anticorps (vue d'en-haut) environ 20 positions d‘aminoacides sont variables Série 9  Cours Biochimie I Leçon 10: Enzymes: stratégies catalytiques 7 Exploration de l'Évolution 8 Portrait de haemoglobin / des anticorps 9 Enzymes: concepts de base et cinétique après aujourd’hui: 10 Enzymes: stratégies catalytiques 10/12 = 83% 11 Lipides et membranes cellulaires / Les glucides 12 Métabolisme Christian Heinis [email protected], BCH 5305  Leçon 10 Stratégies catalytiques - Protéases - Anhydrase carbonique - Enzyme de restriction Inhibition enzymatique  Exemple 1: Protéases Réaction: clivage (hydrolyse) des liaisons peptidiques  Exemple 1: Protéases Réaction: clivage (hydrolyse) des liaisons peptidiques Quel est le mécanisme de la réaction?  Exemple 1: Protéases Réaction: clivage (hydrolyse) des liaisons peptidiques + H - OH  Exemple 1: Protéases Réaction: clivage (hydrolyse) des liaisons peptidiques + H - chymotrypsine OH Comment une enzyme peut-elle catalyser cette réaction?  Exemple 1: Protéases chymotrypsine Stabilisation de l’état de transition  Stabilisation de l'état de transition énergie réactif d'activation énergie libre produit Mécanisme de la catalyse: catalyse covalente substrat R HN R NH2  Catalyse covalente R HN R groupe hydroxyle de la sérine 195  Catalyse covalente R - HN R groupe hydroxyle déprotoné  Catalyse covalente R - HN R  Catalyse covalente R - HN R  Catalyse covalente R - HN R NH2  Catalyse covalente + H R HN R NH2 - OH  Catalyse covalente R HN R NH2  Catalyse covalente R HN R NH2  Catalyse covalente Liaison peptidique R HN R NH2 Liaison peptidique  Catalyse covalente Liaison peptidique R HN R NH2 Fragment 1 Fragment 1 Liaison peptidique  Catalyse covalente Fragment 2 Liaison peptidique R HN R NH2 Fragment 1 Fragment 2 Fragment 1 Liaison peptidique  Catalyse covalente R HN R groupe hydroxyle de la sérine 195  Catalyse covalente [serine O-] Quel est le rapport ---------------- ? R [serine OH] - HN R groupe hydroxyle déprotoné  Catalyse covalente [serine O-] Quel est le rapport ---------------- ? R [serine OH] - HN R Quel est le pKa de serine? groupe hydroxyle déprotoné  Catalyse covalente [serine O-] Quel est le rapport ---------------- ? R [serine OH] - HN R Quel est le pKa de serine? groupe hydroxyle déprotoné pKa = 13  Catalyse covalente [serine O-] Quel est le rapport ---------------- ? R [serine OH] - HN R Quel est le pKa de serine? groupe hydroxyle déprotoné pKa = 13 [serine O-] Ka ---------------- = ---------- [serine OH] [H+]  Catalyse covalente [serine O-] Quel est le rapport ---------------- ? R [serine OH] - HN R Quel est le pKa de serine? groupe hydroxyle déprotoné pKa = 13 [serine O-] Ka 10-13 1 ---------------- = ---------- = --------- = --------- [serine OH] [H+] 10-7.4 400’000  Catalyse covalente Comment est-ce que l’enzyme peut R - changer le pKa de serine 195? HN R groupe hydroxyle déprotoné Triade catalytique  Catalyse covalente R HN R NH2 Mécanismes catalytiques des sérine protéases chymotrypsine Stabilisation de l’état de transition  Stabilisation de l'état de transition énergie réactif d'activation énergie libre produit  Stabilisation de l'état de transition énergie réactif d'activation énergie libre produit Quel état de transition doit-il être stabilisé?  Catalyse covalente R - HN R NH2 Quel état de transition doit-il être stabilisé?  Catalyse covalente R - HN R NH2 R - O charge négative HN C Enzyme O R  Catalyse covalente R - HN R NH2 R - O charge négative Comment peut-on stabiliser HN C cet état de transition? Enzyme O R Etat de transition: groupe carbonyle chargé négativement L'état de transition est stabilisé par des liaisons hydrogène  Catalyse covalente R - HN R NH2 R - - O O HN C HO C Enzyme O R Enzyme O R  Spécificité de la chymotrypsine La chymotrypsine peut-elle cliver toutes les liaisons peptidiques? NH2  Spécificité de la chymotrypsine La chymotrypsine clive au niveau des liaisons peptidiques situées après des résidus avec de longues chaînes latérales hydrophobes Scissile bond  Spécificité de la chymotrypsine La chymotrypsine clive au niveau des liaisons peptidiques situées après des résidus avec de longues chaînes latérales hydrophobes Scissile bond Quelle partie de la chymotrypsine détermine la spécificité?  Spécificité de la chymotrypsine chymotrypsine Liaison à cliver Poche formant des interactions avec les chaînes latérales hydrophobes  Spécificité de la chymotrypsine Liaison à cliver Poche formant des interactions avec les chaînes latérales hydrophobes =  Spécificité de la chymotrypsine chymotrypsine Liaison à cliver Poche formant des interactions avec Quels sont les aminoacides avec de les chaînes latérales hydrophobes longues chaînes hydrophobiques? Spécificités des sérine protéases phenylalanine tyrosine tryptophane methionine leucine Ala, Ser, Gly, V  Spécificité de la chymotrypsine La chymotrypsine chymotrypsine ne peut pas cliver cette liaison peptidique Liaison à cliver Poche formant des interactions avec les chaînes latérales hydrophobes  Spécificités de la sérine protéase 'trypsine' Structures de la trypsine et de la chymotrypsin Specificités: Chymotrypsin: Tyr, Phe, Met, Trp, Leu Trypsin: Lys, Arg  Spécificités de la sérine protéase 'trypsine' Structures de la trypsine et de la chymotrypsin Specificités: Chymotrypsin: Tyr, Phe, Met, Trp, Leu Trypsin: Lys, Arg Pourquoi les spécificités de la trypsine et de la chymotrypsine sont-elles différentes?  Spécificités des sérine protéases tyrosine methionine lysine phenylalanine leucine arginine tryptophane Ala, Ser, Gly, Val  Spécificités des sérine protéases tyrosine alanine glycine methionine lysine phenylalanine serine valine leucine arginine tryptophane  Résumé des mécanismes catalytiques Activité: Stabilisation de l’état de transition Catalyse covalente (avec triade catalytique) Spécificité: Complémentarité Triade catalytiques dans des autres protéases Carboxypeptidase II Subtilisine Triade catalytiques dans des autres protéases Carboxypeptidase II L'évolution divergente? Subtilisine Carboxypeptidase II et subtilisine Chymotrypsine Carboxypeptidase II Subtilisine  Carboxypeptidase II et subtilisine La triade catalytique s'est Carboxypeptidase II développée indépendamment trois fois dans l’évolution! Evolution convergente Subtilisine  Carboxypeptidase II et subtilisine La triade catalytique s'est Carboxypeptidase II développée indépendamment trois fois dans l’évolution! Evolution convergente Y a-t-il d'autres exemples Subtilisine d’évolution convergente?  Evolution convergente une chauve-souris un oiseau Quelques espèces Les pattes de ont développé devant se sont des qualités transformées en ailes. (p.ex. une aile) indépendantes  Autres stratégies catalytique pour l'hydrolyse de peptides D'autres acides aminés peuvent-ils catalyser l'hydrolyse de peptides? Autres classes de protéases aspartate Autres classes de protéases aspartate Autres classes de protéases histidine cysteine ‘diade’  Leçon 10 Stratégies catalytiques - Protéases - Anhydrase carbonique - Enzyme de restriction Inhibition enzymatique  Exemple II: Anhydrase carbonique Le dioxyde de carbone réagit avec une molécule d'eau  Exemple II: Anhydrase carbonique Le dioxyde de carbone réagit avec une molécule d'eau Pourquoi cette réaction est-elle importante dans l’humain?  Exemple II: Anhydrase carbonique Transport du dioxyde de carbone des tissues aux poumons acide carbonique Réaction non-catalysée k1=0.15 s-1 k2=50 s-1 Réaction catalysée par l'anhydrase carbonique kcat=1’000’000 s-1 Une enzyme d’anhydrase carbonique peut catalyser un million de réactions par seconde! Réaction catalysée par l'anhydrase carbonique kcat=1’000’000 s-1 Une enzyme d’anhydrase carbonique peut catalyser un million de réactions par seconde! Quel est le mécanisme catalytique? Mécanisme réactionel (non-catalysé) ? Mécanisme réactionel (non-catalysé) + H H - O  Mécanisme réactionel catalysé + H H - O Quel est le mécanisme catalytique? Un ion de zinc est nécessaire pour la catalyse! ion zinc  L’anhydrase carbonique contient un ion de zinc lié Le zinc est fixé par trois chaînes latérales d'histidine  L’anhydrase carbonique contient un ion de zinc lié Le zinc est fixé par trois chaînes latérales d'histidine Comment le zinc peut-il faciliter l'hydratation du CO2?  Le zinc fixe une molécule d’eau Le zinc fixe une molécule d’eau Quel est l’effet du zinc sur la molécule d’eau? Le zinc change le pKA de la molécule d’eau Le zinc change le pKA de la molécule d’eau Quel est le pKA de l'eau normalement? Le zinc change le pKA de la molécule d’eau Quel est le pKA de l'eau normalement? pKA = 15.7  L’anhydrase carbonique contient un ion zinc lié Comment le groupe - hydroxyle peut-il réagir avec le CO2? Mécanisme réactionel catalysé Mécanisme réactionel catalysé Mécanisme réactionel catalysé Mécanisme réactionel catalysé La catalyse dépend du pH La catalyse dépend du pH Pourquoi?  La catalyse dépend du pH pH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Vérification du mécanisme catalytique  Vérification du mécanisme catalytique pKA = 8.7 Vitesse de réaction: 100-fois augmentée Il est trés probable que l’ion de zinc dans l’anhydrase carbonique catalyse la catalyseur synthétique: réaction  Vérification du mécanisme catalytique pKA = 8.7 Vitesse de réaction: 100-fois augmentée Il est trés probable que l’ion de zinc dans l’anhydrase carbonique catalyse la catalyseur synthétique: réaction Pourquoi l’anhydrase carbonique peut-elle augmenter la vitesse de réaction de 1’000’000 fois?  Vérification du mécanisme catalytique Un résidu histidine de l’enzyme peut extraire un ion hydrogène Stabilisation de l’état de transition  Résumé des mécanismes catalytiques Stabilisation de l’état de transition Fixation de H2O et changement du pKA Déprotonation de H2O par une histidine Evolution convergente des anhydrases carboniques L’anhydrase carbonique s'est développée au minimum trois fois Anhydrase α-carbonique (animaux) Anhydrase β-carbonique (plantes et bactéries) Anhydrase γ-carbonique (arachaea)  Leçon 10 Stratégies catalytiques - Protéases - Anhydrase carbonique - Enzyme de restriction Inhibition enzymatique  Exemple III: Enzymes de restriction Coupent les deux brins Réaction d'hydrolyse  Clivage du DNA à l’intérieur de la séquence (Type II) 5‘-GTGACCGAATTCAAAGGTGCCTTTTATCATCACTTTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTATA 3‘-CACTGGCTTAAGTTTCCACGGAAAATAGTAGTGAAATTTTTATTTTTTGTTAATGAGTCACGGACAATAT GCAATTAATTAGAATTCTGATTGATGCCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGTCTGCCTTA CGTTAATTAATCTTAAGACTAACTACGGATGTAGTGTTGTTTTTGACTAAATTGTTTACCAACCAGACGGAAT AAACCTTATCCCTATCCAAGAAGTGATG-3‘ TTTGGAATAGGGATAGGTTCTTCACTAC-5‘ EcoRI 5‘-GTGACCG-3‘ 3‘-CACTGGCTTAA-5‘ 5‘-AATTCAAAGGTGCCTTTTATCATCACTTTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTATAAGCAGCAATTAATTAG-3‘ 3‘-GTTTCCACGGAAAATAGTAGTGAAATTTTTATTTTTTGTTAATGAGTCACGGACAATATTCGTCGTTAATTAATCTTAA-5‘ 5‘- AATTCTGATTGATGCCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGTCTATATTTGAACATTATCTTGATTATATTA-3‘ 3‘- GACTAACTACGGATGTAGTGTTGTTTTTGACTAAATTGTTTACCAACCAGATATAAACTTGTAATAGAACTAATATAAT-5‘ Plus de 1000 enzymes de restriction ont été isolées des bactéries de Escherichia Coli de Haemophilius aegyptius  Mécanisme de protection contre les virus Infection d’une cellule de bactérie  Mécanisme de protection contre les virus Infection d’une cellule de bactérie Pourquoi le DNA des bactéries n’est-il pas clivé?  Methylation du DNA des bactéries Les bactéries ont des enzyme qui s’appellent ‘methylases’  Le DNA génomique des bactéries est methylé EcoRV  Methylation du DNA des bactéries Les bactéries ont des enzyme qui s’appellent ‘methylases’  Le DNA génomique des bactéries est methylé  Le DNA ne peut pas être clivé (p.ex. par EcoRV) EcoRV clivé non-clivé Mécanisme réactionel (non-catalysé) réactif produits  Mécanisme réactionel (non-catalysé) réactif produits Quel est le mécanisme de la réaction?  Mécanisme réactionel (non-catalysé) + H - O H  Mécanisme de la réaction catalysée Deux possibilités: 1. Hydrolyse directe + H - O H  Mécanisme de la réaction catalysée Deux possibilités: 2. Intermédiaire covalent + H O H  Mécanisme de la réaction catalysée Deux possibilités: 2. Intermédiaire covalent + H - O H Catalyse covalente d’une sérine protéase polypeptide NH2 R HN  Mécanisme de la réaction catalysée 1. Hydrolyse directe 2. Intermédiaire covalent Quel est le mécanisme de la réaction catalysée par l’enzyme de restriction? Inversion de la configuration stéréochimique  Mécanisme de la réaction catalysée 1. Hydrolyse directe 2. Intermédiaire covalent Mécanisme de la réaction catalysée O Mécanisme de la réaction catalysée Mécanisme de la réaction catalysée configuration configuration stéréochimique stéréochimique inversée non-inversée  Mécanisme de la réaction catalysée 1. Hydrolyse directe 2. Intermédiaire covalent  Hydrolyse directe + H - O H Un ion de magnésium est nécessaire pour la catalyse aspartates de l’enzyme de restriction ion de magnésium molécules d’eau Un ion de magnésium est nécessaire pour la catalyse aspartates de l’enzyme de restriction Les enzymes de restriction coupent toujours des séquences palindromiques Axe de symétrie Unités répétées et inversées Deux sous-unités sont nécessaires pour cliver le DNA  Les enzymes de restriction sont très spécifiques 5‘-GTGACCGAATTCAAAGGTGCCTTTTATCATCACTTTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTATA 3‘-CACTGGCTTAAGTTTCCACGGAAAATAGTAGTGAAATTTTTATTTTTTGTTAATGAGTCACGGACAATAT GCAATTAATTAGATATCTGATTGATGCCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGTCTGCCTTA CGTTAATTAATCTATAGACTAACTACGGATGTAGTGTTGTTTTTGACTAAATTGTTTACCAACCAGACGGAAT AAACCTTATCCCTATCCAAGAAGTGATG-3‘ TTTGGAATAGGGATAGGTTCTTCACTAC-5‘ GGGGGG CCCCCC AGGGGT TCCCCA TGGGGA ACCCCT CGGGGC GCCCCG EcoRV GAGGGG 4096 CCCCTC séquences............  Les enzymes de restriction sont très spécifiques 5‘-GTGACCGAATTCAAAGGTGCCTTTTATCATCACTTTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTATA 3‘-CACTGGCTTAAGTTTCCACGGAAAATAGTAGTGAAATTTTTATTTTTTGTTAATGAGTCACGGACAATAT GCAATTAATTAGATATCTGATTGATGCCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGTCTGCCTTA CGTTAATTAATCTATAGACTAACTACGGATGTAGTGTTGTTTTTGACTAAATTGTTTACCAACCAGACGGAAT AAACCTTATCCCTATCCAAGAAGTGATG-3‘ TTTGGAATAGGGATAGGTTCTTCACTAC-5‘ GGGGGG CCCCCC AGGGGT TCCCCA TGGGGA ACCCCT CGGGGC GCCCCG Pourquoi les EcoRV GAGGGG enzymes de restriction 4096 CCCCTC sont-elles si spécifiques? séquences............  Spécificité des enzymes de restriction Hypothèse: L’affinité pour un substrat spécifique est beaucoup plus forte que pour toutes les autres séquences  Les enzymes de restriction se fixent seulement aux séquences désirées  Spécificité des enzymes de restriction Hypothèse: L’affinité pour un substrat spécifique est beaucoup plus forte que pour toutes les autres séquences  Les enzymes de restriction se fixent seulement aux séquences désirées L’affinité pour des séquences différentes est similaire Spécificité des enzymes de restriction L’appareil catalytique de l’enzyme de restriction est assemblé uniquement avec une séquence spécifique! DNA spécifique DNA non-spécifique  Evolution divergente Les enzymes de restriction de type II se sont développées par évolution divergente (elles ont un ancêtre commun)  Leçon 10 Stratégies catalytiques - Protéases - Anhydrase carbonique - Enzyme de restriction Inhibition enzymatique Inhibition enzymatique substrat substrat Un inhibiteur est une substance qui diminue la vitesse d'une réaction catalysée par une enzyme  Inhibition enzymatique substrat substrat Inhibiteur: petite molécule peptide protéine  Réaction enzymatique (non-inhibée) D [produit] Vitesse = ---------------- D [temps]  Réaction enzymatique (non-inhibée) v0 = vitesse initiale D [produit] Vitesse = ---------------- D [temps]  Réaction enzymatique (non-inhibée) v0 = vitesse initiale D [produit] Vitesse = ---------------- D [temps] Quelle vitesse v0 attend-on pour une réaction inhibée?  Réaction enzymatique en présence d’un inhibiteur V0 = vitesse initiale D [produit] Vitesse = ---------------- pas D [temps] d'inhibiteur (I) [I] = 1 mM V0 [I] = 10 mM V0 V0 [I] = 100 mM Réaction enzymatique en présence d’un inhibiteur pas d'inhibiteur (I) V0 [I] = 1 mM V0 [I] = 10 mM V0 [I] = 100 mM vitesse de réaction v0 0 0.01 0.1 1 10 100 1000 concentration inhibiteur (mM) Réaction enzymatique en présence d’un inhibiteur 100% de la vitesse pas d'inhibiteur (I) V0 [I] = 1 mM V0 [I] = 10 mM 100% de la vitesse V0 [I] = 100 mM vitesse de réaction v0 0 0.01 0.1 1 10 100 1000 concentration inhibiteur (mM)  Réaction enzymatique en présence d’un inhibiteur 100% de la vitesse pas d'inhibiteur (I) V0 [I] = 1 mM V0 [I] = 10 mM 100% de la vitesse V0 [I] = 100 mM vitesse de réaction v0 Comment pourrait-on quantifier la force d'un inhibiteur? 0 0.01 0.1 1 10 100 1000 concentration inhibiteur (mM) Concentration inhibitrice à 50% (IC50) 100% de la vitesse pas d'inhibiteur (I) V0 [I] = 1 mM V0 [I] = 10 mM 100% de la vitesse V0 [I] = 100 mM vitesse de 50% réaction v0 de la vitesse 0 0.01 0.1 1 10 100 1000 concentration inhibiteur (mM) Concentration inhibitrice à 50% (IC50) 100% de la vitesse pas d'inhibiteur (I) V0 [I] = 1 mM V0 [I] = 10 mM 100% de la vitesse V0 [I] = 100 mM 50% IC50 = 8 mM vitesse de réaction v0 de la vitesse 0 0.01 0.1 1 10 100 1000 concentration inhibiteur (mM) Mécanismes d’inhibition Mécanismes d’inhibition Inhibiteur compétitif L’inhibiteur empêche la fixation du substrat Mécanismes d’inhibition Inhibiteur compétitif L’inhibiteur empêche la fixation du substrat Inhibiteur non compétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme et la rend inactive Mécanismes d’inhibition Inhibiteur compétitif L’inhibiteur empêche la fixation du substrat Inhibiteur non compétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme et la rend inactive Inhibiteur incompétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme une fois que le substrat est lié et la rend inactive Mécanismes d’inhibition Inhibiteur compétitif L’inhibiteur empêche la fixation du substrat Inhibiteur non compétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme et la rend inactive Inhibiteur incompétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme une fois que le substrat est lié et la rend inactive Cinétique d’un inhibiteur compétitif Cinétique d’un inhibiteur compétitif Cinétique d’un inhibiteur compétitif Un inhibiteur compétitif va-t- il changer le Vmax ou le KM? 1 mM  Cinétique d’un inhibiteur compétitif pas d’inhibiteur bas (p.ex. 0.1 mM) haut (p.ex. 10 mM) moyen (p.ex. 1 mM)  Cinétique d’un inhibiteur compétitif pas d’inhibiteur bas La vitesse haut maximale (Vmax) moyen reste-t-elle la même avec un inhibiteur compétitif?  Cinétique d’un inhibiteur compétitif pas d’inhibiteur bas haut moyen substrat  Cinétique d’un inhibiteur compétitif pas d’inhibiteur bas haut moyen Vmax ne change pas avec un inhibiteur compétitif Cinétique d’un inhibiteur compétitif pas d’inhibiteur bas haut moyen KM Le KM change avec un inhibiteur compétitif Mécanismes d’inhibition Vmax constant Inhibiteur compétitif KM varie L’inhibiteur empêche la fixation du substrat Inhibiteur non compétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme et la rend inactive Inhibiteur incompétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme une fois que le substrat est lié et la rend inactive Mécanismes d’inhibition Vmax constant Inhibiteur compétitif KM varie L’inhibiteur empêche la fixation du substrat Inhibiteur non compétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme et la rend inactive Inhibiteur incompétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme une fois que le substrat est lié et la rend inactive  Cinétique d’un inhibiteur non compétitif L’inhibiteur se fixe à l’enzyme ou au complexe enzyme-substrat  Cinétique d’un inhibiteur non compétitif L’inhibiteur se fixe à l’enzyme ou au complexe enzyme-substrat Cinétique d’un inhibiteur non compétitif Un inhibiteur non compétitif va-t-il changer le Vmax ou le KM? Cinétique d’un inhibiteur non compétitif bas haut moyen Le Vmax change avec un inhibiteur non compétitif  Cinétique d’un inhibiteur non compétitif bas La constante KM varie-t-elle avec un inhibiteur non haut moyen compétitif? KM  Cinétique d’un inhibiteur non compétitif Le KM reste le même avec un inhibiteur non compétitif bas haut moyen KM Mécanismes d’inhibition Vmax constant Inhibiteur compétitif KM varie L’inhibiteur empêche la fixation du substrat Vmax varie Inhibiteur non compétitif KM constant L’inhibiteur déforme l’enzyme et la rend inactive Inhibiteur incompétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme une fois que le substrat est lié et la rend inactive Mécanismes d’inhibition Vmax constant Inhibiteur compétitif KM varie L’inhibiteur empêche la fixation du substrat Vmax varie Inhibiteur non compétitif KM constant L’inhibiteur déforme l’enzyme et la rend inactive Inhibiteur incompétitif L’inhibiteur déforme l’enzyme une fois que le substrat est lié et la rend inactive  Cinétique d’un inhibiteur incompétitif L’inhibiteur se fixe uniquement au complexe enzyme-substrat  Cinétique d’un inhibiteur incompétitif L’inhibiteur se fixe uniquement au complexe enzyme-substrat  Leçon 10 Stratégies catalytiques - Protéases - Anhydrase carbonique - Enzyme de restriction Inhibition enzymatique Série 9 Question 1 AB Série 9 Question 2 Série 9 Question 2  Série 9 Question 2 velocité initial = D nombre molécules substrat / D temps e.g. nanomoles / minute velocité initial = D concentration substrat / D temps e.g. mM / min Série 9 Question 2 Série 9 Question 2  Cours Biochimie Leçon 11: Lipides et membranes cellulaires / Glucides 7 Exploration de l'Évolution 8 Portrait de haemoglobin / des anticorps 9 Enzymes: concepts de base et cinétique 10 Enzymes: stratégies catalytiques après aujourd’hui: 11 Lipides et membranes cellulaires / Les glucides 11/12 = 92% 12 Métabolisme 13 Examen teste 14 Correction examen teste Christian Heinis [email protected], BCH 5305  Leçon 11 Les lipides et les membranes - Fonction - Composants - Protéines membranaires Les glucides - Monosaccharides - Oligosaccharides - Glycoprotéines Fonction des membranes Micrographie électronique des membranes plasmiques de globules rouges  Fonction des membranes Micrographie électronique des membranes plasmiques de globules rouges Quelles sont les fonctions des membranes?  Quelles sont les fonctions des membranes? Les membranes sont des barrières qui définissent l’intérieur et l’extérieur d’une cellule Les membranes possèdent une perméabilité très sélective  Quelles sont les fonctions des membranes? Les membranes sont des barrières qui définissent l’intérieur et l’extérieur d’une cellule Les membranes possèdent une perméabilité très sélective Quels sont les composants des membranes?  Composants des membranes Les composants principaux des membranes sont des lipides et des protéines Rapport pondéral lipides:protéines entre 1:4 et 4:1 lipides protéines  Lipides Il y a beaucoup de lipides différents:  Lipides Les acides gras sont les constituants clefs des lipides Les acides gras peuvent être saturés ou non-saturés Les acides gras contiennent plusieurs atomes de carbone (typiquement entre 14-24). Ils peuvent être saturés ou insaturés Les acides gras peuvent être saturés ou non-saturés A B Quels sont les lipides saturés? Les acides gras contiennent plusieurs atomes de carbone (typiquement entre 12-24). Ils peuvent être saturés ou insaturés Les acides gras peuvent être saturés ou non-saturés A saturé B non-saturé Les acides gras contiennent plusieurs atomes de carbone (typiquement entre 12-24). Ils peuvent être saturés ou insaturés La nomenclature des acides gras third carbon: b groupe carboxyle last carbon: w second carbon: a La nomenclature des acides gras La nomenclature des acides gras La nomenclature des acides gras  La nomenclature des acides gras Entre 12 et 24 La nomenclature des acides gras saturé non-saturé  Lipides Les acides gras sont les constituants clefs des lipides  Classification des lipides (membranaires) lipides membranaires autres lipides réserve d’énergie molécules signales  Classification des lipides (membranaires) phospholipides lipides membranaires glycolipides autres lipides cholestérol réserve d’énergie molécules molecules signales signal  Classification des lipides (membranaires) phospholipides lipides membranaires glycolipides autres lipides cholestérol réserve d’énergie molécules molecules signales signal  Classification des lipides (membranaires) phospholipides phosphoglyceride lipides membranaires glycolipides sphingomyéline autres lipides cholestérol réserve d’énergie mol?