UE 2 - Molécules du vivant - Cours 2021-2022 PDF

UE 2 Molécules du vivant Cours de l’année 2021-2022 STRASBOURG ACIDES AMINES - PROTEINES Dr. LAMOUR – LIVRET n°2 Mercredi 29 septembre 8h à 10h Spots vidéo associés : 3-UE2-SPOT-EXAM-Hémo...

UE 2 Molécules du vivant Cours de l’année 2021-2022 STRASBOURG ACIDES AMINES - PROTEINES Dr. LAMOUR – LIVRET n°2 Mercredi 29 septembre 8h à 10h Spots vidéo associés : 3-UE2-SPOT-EXAM-Hémoglobine 4-UE2-SPOT-EXAM-Enzyme-Coenzyme 1 TABLE DES MATIERES Structure quaternaire...................................................................................................................................................... 4 IV. FLEXIBILITE CONFORMATIONNELLE DES PROTEINES..............................................................................5 A. REGULATION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE : TRANSITION D’UN ETAT A UN AUTRE................................................................................... 5 B. L’ADN TOPOISOMERASES 2 : UNE ENZYME ALLOSTERIQUE................................................................................................................ 5 C. LES PROTEINES INTRINSEQUEMENT DESORDONNEES......................................................................................................................... 6 D. DENATURATION DES PROTEINES................................................................................................................................................... 6 V. DETECTION DES PROTEINES.............................................................................................................................7 A. DETECTION PAR SPECTROPHOTOMETRIE........................................................................................................................................ 7 B. DETECTION PAR COLORATION...................................................................................................................................................... 7 1) Les possibilités de coloration........................................................................................................................................... 7 2) Principe de la séparation sur gel d’électrophorèse : la SDS PAGE................................................................................... 8 A. DETECTION DES PROTEINES PAR DES ANTICORPS : LE WESTERN BLOT................................................................................................... 8 B. DETECTION DES PROTEINES DANS LES TISSUS : L’IMMUNOHISTOCHIMIE................................................................................................ 9 C. DETERMINATION DES STRUCTURES 3D DES PROTEINES (RESULTATS DANS LA PROTEIN DATA BANK)........................................................... 9 LES PROTEINES DE TRANSPORT ET DE STOCKAGE DE L’O2 : HEMOGLOBINE ET MYOGLOBINE..............10 I. MYOGLOBINE : PROTEINE DE STOCKAGE DE L’OXYGENE........................................................................10 A. STRUCTURE............................................................................................................................................................................ 10 B. STRUCTURE TERTIAIRE DE LA MYOGLOBINE ET FIXATION D’UNE MOLECULE D’O2.................................................................................. 10 C. HEMOGLOBINE : PROTEINE DE TRANSPORT DE L’OXYGENE............................................................................................................... 12 1. Composition................................................................................................................................................................... 12 2. Les différentes combinaisons hémoglobine-gaz............................................................................................................ 12 La structure quaternaire de l’hémoglobine................................................................................................................... 12 L’hémoglobine (Hb) est une protéine allostérique......................................................................................................... 13 C. SATURATION DE L’HEMOGLOBINE ET DE LA MYOGLOBINE EN FONCTION DE LA PRESSION PARTIELLE DU DIOXYGENE..................................... 13 II. LES ENZYMES.....................................................................................................................................................15 A. DEFINITIONS.......................................................................................................................................................................... 15 1) Enzyme – Substrat – Produit.......................................................................................................................................... 15 2) Notion d’énergie d’activation........................................................................................................................................ 16 3) Les 6 catégories d’enzymes............................................................................................................................................ 16 B. REGULATION DE L’ACTIVITE ENZYMATIQUE................................................................................................................................... 17 1) Régulation de l’activité : Mécanismes réversibles......................................................................................................... 17 2) Régulation de l’activité : mécanismes irréversibles....................................................................................................... 18 A. NOTION DE SITE ACTIF.............................................................................................................................................................. 19 B. COFACTEURS ET COENZYMES..................................................................................................................................................... 20 Utilisez le forum pour poser vos questions 3  Structure quaternaire - La structure quaternaire désigne l’association de plusieurs sous-unités protéiques associées par des liaisons faibles. La structure quaternaire présentée est formée par la répétition d’une même chaîne en 3 fois : c’est un trimère. - Les structures quaternaires sont aussi appelées oligomères : ce sont des complexes parfois symétriques composées d’assemblages non-covalents entre 2 (ou plus) sous unités monomériques. Il est possible que ces sous-unités soient reliées par des ponts disulfures. - L’organisation des sous-unités dans une structure quaternaire est caractéristique d’une organisation macromoléculaire fonctionnelle comme celle des enzymes : Si les sous-unités sont identiques ce sont des homo-oligomères Si les sous-unités sont différentes ce sont des hétéro-oligomères Alcool - La structure quaternaire contient 2 sous-unités identiques (dimère) qui comportent déshydrogénase du chacune 2 domaines foie - Chaque domaine contient un feuillet parallèle à 6 brins entourés de 2 hélices α ® Hémoglobine - La structure quaternaire contient 4 sous-unités (tétramère) : 2 α et 2 β humaine α2β2 - Chaque sous-unité comporte 8 hélices α ® - La structure quaternaire est composée de 2 chaînes lourdes et de 2 chaines légères légères ® - La structure quaternaire est stabilisée par des liaisons hydrogène et des ponts disulfures inter et intra caténaires ® - Les immunoglobulines G composent 75 à 80% des anticorps circulants : Produites en réaction à un antigène (corps étranger non reconnu par l’organisme) Elles protègent l’organisme contre les bactéries, les virus et certaines toxines. - Des glycosylations sont présentes - Il existe 12 domaines sur 4 chaînes : 4 domaines sur la chaîne lourde : H1 à H4 2 domaines sur la chaîne légère : L1 à L2 Immunoglobuline G Utilisez le forum pour poser vos questions 4 IV. FLEXIBILITE CONFORMATIONNELLE DES PROTEINES Les protéines sont flexibles et adoptent certaines conformations selon l’environnement. Ces fluctuations jouent un rôle important dans les propriétés fonctionnelles des protéines, ainsi que dans leur capacité à s’adapter à un changement de milieu ou de fixer des ligands de manière optimale. A. Régulation de l’activité enzymatique : transition d’un état à un autre Les conformations possèdent aussi un rôle très important pour les enzymes allostériques : la régulation de l’activité enzymatique dans ce cas-là se fait par transition d’un état à un autre : Passage d’un état inactif à un état actif ; Passage d’un état de faible affinité à un état de forte affinité pour le substrat. - Suite aux interactions avec des substrats, des produits ou à la fixation d’effecteurs, l’activité des enzymes allostériques est donc contrôlée par des mouvements globaux. - Il y a un équilibre entre la forme T et la forme R : B. L’ADN topoisomérases 2 : une enzyme allostérique - La machinerie cellulaire, lors de mécanismes comme la réplication de l’ADN, la transcription, la ségrégation des chromosomes, introduit des torsions dans la Contexte double hélice d’ADN. - L’ADN ne peut pas tourner librement dans la cellule - Les topoisomérases interviennent dans la réplication, la transcription de l’ADN et lors de la ségrégation des chromosomes - Les ADN topoisomérases coupent et religuent l’ADN : L’hydrolyse de 2 molécules d’ATP entraîne des réarrangements spatiaux des domaines Le transport d’un segment d’ADN se fait à travers la coupure double brin d’un premier ADN à l’interface dimérique Activité - Enzymes essentielles conservées de la bactérie à l’Homme : cibles pour les antibiotiques (fluoroquinolones) et les composés anti-cancereux. Utilisez le forum pour poser vos questions 5  C. Les protéines intrinsèquement désordonnées - Les protéines intrinsèquement désordonnées n’ont pas de structure secondaire : protéines entières boucles domaines de protéines. - Elles peuvent se structurer et assurer des signalisations ou des régulations transcriptionnelles. Le changement de structure secondaire au sein d’une même chaîne : A la suite de modifications post traductionnelles (phosphorylation, acétylation …) Au contact d’autres protéines pour former des complexes - Certaines protéines intrinsèquement désordonnées sont impliquées dans les maladies neurodégénératives : Alzheimer, Parkinson, Huntington, Sclérose en plaques, Encéphalite bovine spongiforme. - Les transitions entre protéine de structure flexible en hélice et formation d’agrégats protéiques en feuillets β anti-parallèles induisent des plaques d’agrégats. D. Dénaturation des protéines - Protéines adoptant une structure tertiaire native peuvent être dénaturées et prendre une structure primaire à nouveau, ce qui neutralise totalement leur action. Utilisez le forum pour poser vos questions 6  - Il existe plusieurs agents capables de dénaturer les protéines : Dénaturation irréversible Dénaturation réversible Chaleur - Urée 8M : rupture des liaisons hydrogène, des liaisons de van der Walls et des interactions hydrophobes UV - Chlorure de guanidium : rupture des liaisons Acides et bases hydrogène, des liaisons de van der Walls et des Solvants organiques interactions hydrophobes Forte agitation - β-mercaptoéthanol (βSH) : rupture des ponts Grande dilution disulfures. Détergents anioniques (comme le SDS = Sodium DodécylSulfate) V. DETECTION DES PROTEINES - Il existe plusieurs techniques pour les mettre en évidence : Spectrophotomètre UV Colorants Anticorps spécifiques de la protéine Dosage de substrats ou de produits des réactions catalysées par les enzymes ® A. Détection par spectrophotométrie - Les acides aminés aromatiques (tryptophane, tyrosine, phénylalanine) absorbent la lumière ultraviolette (260-280 nm). - Cette absorption permet de détecter la présence d’une protéine dans une solution et de quantifier la concentration d’une protéine. B. Détection par coloration 1) Les possibilités de coloration - Deux possibilités : Mettre le colorant directement dans une solution : on détecte alors l’ensemble des protéines présentes. Mettre le colorant après une séparation des protéines en fonction de leur taille sur un gel d’électrophorèse. - Colorant utilisé bleu de Coomassie : Il se fixe sur les acides aminés basiques ® (arginine R, lysine K, histidine H) et donne une coloration bleue Utilisez le forum pour poser vos questions 7  2) Principe de la séparation sur gel d’électrophorèse : la SDS PAGE. - Un détergent, le SDS (sodium dodecyl sulfate), est appliqué pour dénaturer les protéines. Il charge négativement le polypeptide et expose la structure primaire - Les protéines déposées en haut du gel d’acrylamide migrent à travers les mailles du gel dans un champ électrique vers le pôle positif La migration à l’intérieur d’un gel de polyacrylamide se fait en fonction de leur taille en acides aminés = poids moléculaire ® Les petites migrent plus rapidement que les grandes vers le pôle +, elles se retrouvent plus vite en bas du gel - Il est aussi possible de faire migrer des protéines sans l’aide de détergent = gel natif, elles sont alors sous forme tertiaire ou quaternaire. Elles migrent en fonction de leur état oligomérique et en fonction des charges exposées en surface de la structure. a. Détection des protéines par des anticorps : le Western blot Quand les quantités de protéines sont très faibles, on peut utiliser une autre technique plus sensible pour les détecter grâce à des anticorps ® : le Western blot. Les protéines migrent dans un gel dénaturant (gel d’acrylamide : migration en fonction de la taille) ; Ce gel est ensuite transféré sur une membrane de nitrocellulose (grâce à un courant électrique) ; Cette membrane est incubée en présence d’un anticorps spécifique de la protéine que l’on cherche à détecter. Un anticorps primaire se fixe spécifiquement sur une petite région de la protéine appelée épitope. La révélation de la protéine d’intérêt peut se faire à l’aide d’un anticorps secondaire sui se fixe à l’anticorps primaire. Cet anticorps secondaire est détectable (colorant, groupe fluorescent ou de chimioluminescence). Utilisez le forum pour poser vos questions 8  Le test ELISA est une variation du Western blot : les protéines sont en solution et un colorant est utilisé pour visualiser les puits positifs par colorimétrie. b. Détection des protéines dans les tissus : l’immunohistochimie L’immunohistochimie permet : de détecter des protéines dans les tissus voir les cellules et de connaître leur position exacte grâce à des anticorps fluorescents dirigés contre ces dernières. de voir l’expression (surexpression ou sous-expression) de la protéine. c. Détermination des structures 3D des protéines (résultats dans la Protein Data Bank) Interaction rayons X et nuage électronique : Techniques 1) Obtention de cristaux de protéine biophysique de 2) Expérience de diffraction aux rayons X christallographie aux 3) Calcul de la densité électronique expérimentale des atomes de la protéine = rayons X modèle moléculaire Depuis 100 ans, plus de 23 prix Nobel ont été attribués dans ce domaine Interaction électrons et nuage électronique : Techniques de cryo- 1) Travaux directement en solution microscopie 2) Obtention d’une image 2D électronique 3) Reconstruction du modèle 3D de la protéine = modèle moléculaire Prix Nobel de chimie en 2017 Les structures obtenues par les techniques de biologie structurale notamment la cryo-microscopie électronique en 2020 permettent de comprendre comment le virus se fixe à nos cellules. Certains variants présentent des mutations ponctuelles de résidus de la protéine spike en contact avec le récepteur ACE2 Structure 3D des protéines du SARS- CoV2 Utilisez le forum pour poser vos questions 9  LES PROTEINES DE TRANSPORT ET DE STOCKAGE DE L’O2 : HEMOGLOBINE ET MYOGLOBINE I. MYOGLOBINE : PROTEINE DE STOCKAGE DE L’OXYGENE A. Structure - La myoglobine est composée de l’association d’une apoprotéine et d’un groupement prosthétique. - Une seule chaine polypeptidique de 153 AA : apomyoglobine de poids moléculaire 17 800 Da - Repliement : 8 hélices α ® numérotées de A à H (l’hélice F est en 2 parties) Partie protéique Les hélices sont connectées par des boucles et disposées de façon à délimiter une zone hydrophobe interne L’hème se loger dans la zone hydrophobe avec une teneur en histidine élevée. - Hème = site actif de la myoglobine - Un atome de fer héminique, inclus dans un cycle tétrapyrrolique (protoporphirine), enfoui dans la zone hydrophobe interne d’une globine, Groupement prosthétique : constitue le centre actif. hème - Le fer (élément essentiel) forme une combinaison réversible avec l’O2 moléculaire. - 4 cycles pyrroles peuvent s’unir par des ponts méthylènes pour former un cycle tétrapyrrolique (porphine). Après substitution par divers radicaux, il y a formation de porphyrines. Le cycle est plan avec des électrons π (dans des doubles liaisons conjuguées délocalisées) - Dans l’hème il y a : 4 liaisons entre le fer au centre et les 4 atomes d’azote des 4 pyrroles ; 2 autre liaisons sont libres, perpendiculaires au plan du cycle. - Les porphyrines peuvent se complexer avec le fer Fe2+ (ferreux) ou Fe3+ (ferrique). - Lorsque le fer est sous forme Fe2+, le groupement est appelé hème, si le fer est sous forme Fe3+, le groupement est appelé hématine. B. Structure tertiaire de la myoglobine et fixation d’une molécule d’O2 - Les acides aminés polaires et hydrophiles sont exposés à la surface de la protéine. - L’hème est proche des hélices E et F. Au niveau de ces hélices il y a deux histidines : sur l’hélice F, dite histidine proximale, fait une liaison de coordination avec le fer sur l’hélice E dite histidine distale qui permet de fixer la molécule d’O2 de manière réversible Utilisez le forum pour poser vos questions 10  - L’espace entre l’histidine distale et le Fe2+ permet la fixation réversible de l’oxygène. En absence d’oxygène = - Fe s’écarte de l’hème, vers l’His proximale désoxymyoglobine En présence - Fe dans le plan de l’hème d’oxygène = - Seul le fer à l’état ferreux peut fixer l’O2 oxymyoglobine - Un des rôles essentiels de la globine est de prévenir l’oxydation du fer ferreux (Fe2+) en une ferrimyoglobine inactive Fe3+) Si l’atome de Fe est un ion Fe3+, la 6ème coordinance ne peut plus être occupée par un O2, mais à ce moment-là c’est un O d’un H2O qui occupe cet endroit. Formation de la Métmyoglobine, et l’O2 ne peut plus se fixer dans le site actif. - Rappel des différentes formes de la myoglobine : Utilisez le forum pour poser vos questions 11  C. Hémoglobine : protéine de transport de l’oxygène 1. Composition - L’hémoglobine humaine adulte est une métallo protéine contenant du fer et elle comporte 4 chaînes, 2 alpha et 2 bêta : Chaîne alpha plus courte que chaine bêta Les deux chaînes sont plus courtes que la chaîne de la myoglobine - Peux fixer 4 molécules d’O2. - Elle possède les mêmes structure désoxy et oxy que la myoglobine, ainsi le fer est aussi lié à l’azote N3 de l’histidine F8 proximale, et il y a présence d’une histidine distale : 2. Les différentes combinaisons hémoglobine-gaz - L’hémoglobine est une métalloprotéine qui permet le transport de l’O2 à l’intérieur des globules rouges dans le sang des mammifères. C’est un intermédiaire indispensable de la respiration chez les animaux à sang chaud. - Le complexe Hb-(O2)4 se forme à la pression partielle d’O2 du milieu extérieur (poumon) et se dissocie dans des pressions partielles plus basses du milieu intérieur (organes). Combinaison avec O2 - Hb + 4 O2  Hb[O2]4 Oxyhémoglobine - C’est une oxygénation et non une oxydation car le fer reste Fe2+ Combinaison avec CO - L’HB a 20 fois plus d’affinité pour le monoxyde de carbone que pour O2 Carboxyhémoglobine - Hb[CO]4 est très stable - La fixation se faire sur les groupements basiques de la globine (et d’autres Combinaison avec CO2 protéines du sang) et non pas à la place de l’oxygène Carbhémoglobine - La réaction produit un carbamate : R-NH2 + CO2  R-NH-COO- + H+ La structure quaternaire de l’hémoglobine - Chaque chaîne polypeptidique correspond à une sous-unité. Il existe une symétrie d’ordre 2 entre les sous- unités - Chaque sous-unité = protomère possède une structure tertiaire stabilisée par des liaisons ioniques, des liaisons hydrogène, des interactions hydrophobes. Il n’y a pas de liaisons covalentes dans l’hémoglobine. - Les 4 chaînes = oligomère sont associées par des liaisons faibles entre les sous-unités. Lorsque les sous- unités sont très nombreuses on parle de polymère. Utilisez le forum pour poser vos questions 12  L’hémoglobine (Hb) est une protéine allostérique - Deux conformations sont en équilibre : R T en équilibre - Dans les chaînes β : espace insuffisant pour O2 entre Fe2+ et His distale DésoxyHb = forme T - Dans les chaînes α : espace juste suffisant pour accepter O2 1. L’insertion de O2 sur une chaîne α entraîne un déplacement d’une hélice 2. Changement de conformation de l’autre chaine α et des chaines β Transition T → R 3. Possibilité de fixer l’O2 = phénomène coopératif. 4. De proche en proche, les sous-unités changent toutes de conformation. 5. Les chaînes de l’OxyHb sont donc sous forme R. OxyHb = Forme R - O2 fixé - Les poisons de l’hémoglobine : Le monoxyde de carbone (CO) : il concurrence l’O2 lors de l’oxygénation pulmonaire et peut entrainer des malaises, des céphalées et la mort par asphyxie. Le cyanure CN- et le sulfure d’hydrogène H2S : inhibiteurs de l’oxygénation C. Saturation de l’hémoglobine et de la myoglobine en fonction de la pression partielle du dioxygène - La pression partielle en O2 est plus grande dans les poumons que dans les tissus. Interprétation de la courbe de saturation de l’hémoglobine - On définit l’affinité d’une protéine par la quantité P50 : la P50 est la pression partielle à laquelle 50% La P50 des sites des protéines sont occupés par du dioxygène. Dans les poumons : la pression partielle en O2 est très forte. Les saturations de la myoglobine et de l’hémoglobine sont très fortes. Pour une saturation plus faible, comme 50%, la pression partielle correspondante pour la myoglobine et l’hémoglobine sont différentes. o P50 faible = forte affinité pour l’O2 o P50 élevée = faible affinité pour l’O2 o L’affinité est l’inverse de la P50. La P50 de la myoglobine est plus faible que celle de l’hémoglobine, l’O2 peut donc être relargué dans les tissus par l’hémoglobine. - La P50 de l’hémoglobine du fœtus (Hb F) est plus faible que celle de sa mère (Hb A), sinon le dioxygène serait incapable de quitter l’hémoglobine maternelle pour oxygéner le fœtus. Ceci peut s’expliquer par une conformation différente de l’hémoglobine fœtal qui est faite de deux chaînes gamma qui remplacent les deux chaînes beta qu’on trouve chez l’adulte. - La courbe de saturation de la myoglobine est une hyperbole Courbe de - La courbe de saturation de l’hémoglobine est une sigmoïde, caractéristique des protéines saturation allostériques Utilisez le forum pour poser vos questions 13  Interactions allostériques : R et T en équilibre Interactions - Effet de coopérativité positive entre les sites de fixation de l’O2 homotropiques - Effecteurs allostériques négatifs (ions H+, CO2, BPG (2,3 bisphosphoglycérate)) qui diminuent l’affinité de l’Hb pour l’O2. - Une augmentation des ions H+ par une baisse du pH ou par une augmentation de la pCO2 (formation de carbamates) entraînent l’effet Bohr = diminution de l’affinité de l’Hb pour l’O2 : Interactions o Le CO2 est transporté sous forme de carbamates : R-NH2 + CO2  R-NH-COO- + H+ hétérotropiques o Les ions H+ protonent certains acides aminés de l’hémoglobine ce qui change la conformation des chaînes (2 sites dans la chaîne ɑ (Nter et His122) et 1 dans la chaîne β (His 146)) o L’acidification dans les tissus permet une meilleure libération de l’O2. - La maladie génétique appelé drépanocytose (ou anémie falciforme=en forme de faucille) est caractérisée par : La formation de fibres par polymérisation du tétramère α2β2 de la désoxyhémoglobine S. Des hémoglobines mutées qui rendent la protéine hydrophobe. Les interactions ou bosse ou patch hydrophobes au sein de la même protéine rendent la protéine insoluble dans le sang. La mutation se situe au niveau de la chaine β de l’Hb, et notamment une mutation au niveau du 6ème acide aminé (GTG muté en CAG). Au niveau de l’Hb A un acide glutamique polaire est muté en une Valine apolaire dans Hb S, ceci entraîne des interactions hydrophobes (Val/Phe85 et Leu88 d’une autre chaîne β) et donc la formation de thromboses par obstruction des capillaires : o Soit les deux sous-unités β sont mutées : uniquement HbS o Soit une seule sous-unité est mutée : HbA + HbS Utilisez le forum pour poser vos questions 14 II. LES ENZYMES A. Définitions 1) Enzyme – Substrat – Produit - Les enzymes sont des catalyseurs biologiques avec un pouvoir catalytique important : Ils accélèrent la vitesse des réactions chimiques spécifiques et fonctionnent dans une gamme de pH et de température très douces. Ce sont des protéines synthétisées par des êtres vivants et leur synthèse et Définitions déterminée génétiquement. - Les enzymes possèdent une grande spécificité de substrat. Un substrat est la molécule qui entre dans une réaction pour y être transformé en produit grâce à l’action catalytique d’une enzyme. - Le produit est la molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par une enzyme - Si la réaction est réversible, le produit peut redevenir substrat - Le produit peut être transformé par une 2ème enzyme - Les enzymes : ne peuvent pas modifier l’équilibre de la réaction ® accélèrent la vitesse V1 (vitesse aller) ou V2 (vitesse retour) exactement d’un Réaction même facteur Constante d’équilibre Avec [P] la concentration en produit et [S] la concentration en substrat. 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Le Zn est nécessaire à l’activité de l’enzyme ®. Cette réaction est réversible. Utilisez le forum pour poser vos questions 16  Dans les tissus qui respirent, le CO2 produit par le catabolisme entre dans le globule rouge ® puis quitte le globule rouge au niveau des poumons. L’entrée (au niveau des poumons) et la sortie (au niveau des tissus) du bicarbonate dans le globule rouge se font grâce à la présence d’un échangeur chlorure-bicarbonate. o Le gaz carbonique produit par le catabolisme entre dans le globule rouge sous forme de CO2 et est transformé par l’anhydrase carbonique en ion bicarbonate. o Cet ion va pouvoir se dissoudre dans le plasma sanguin, en sortant du globule rouge avec un échange avec un Cl- = échangeur chlorure-bicarbonate Au niveau des poumons, les bicarbonates sont transformés en CO2, il quitte le globule rouge et est exhalé au niveau des poumons. Pour chaque entrée et sortie d’ion bicarbonate, il y a l’entrée ou la sortie correspondante d’un ion Cl- grâce à une protéine d’échange. Les anhydrases carboniques ont un grand pouvoir catalytique, chaque molécule d’anhydrase carbonique peut hydrater 105 molécules de CO2 par seconde. L’anhydrase carbonique présente une grande spécificité car elle n’hydrate que le CO2. B. Régulation de l’activité enzymatique La cellule peut contrôler les enzymes via leur synthèse (transcription et traduction) ou via leur activité (mécanisme réversible ou irréversible). 1) Régulation de l’activité : Mécanismes réversibles - Les produits de la réaction par leur formation peuvent inhiber l’activité des enzymes - Les enzymes allostériques peuvent subir des activations ou des inhibitions par différents effecteurs - Les modifications covalentes peuvent modifier la fonction enzymatique : phosphorylation sur sérine/thréonine/tyrosine, méthylation (Glu, Asp). Utilisez le forum pour poser vos questions 17  Exemple de la phosphorylation réversible par une kinase 2) Régulation de l’activité : mécanismes irréversibles - Glycosylation - Coupure hydrolytique de la chaîne peptidique a) Exemple de la chymotrypsine La chymotrypsine est produite sous forme d’un chymotrypsinogène inactif ®. Lors de coupures hydrolytiques par des protéases, la chymotrypsine devient active sous sa nouvelle forme. Cette réaction est irréversible. b) Régulation de la lactose synthétase - La synthèse du lactose est réalisée par la glande mammaire - La lactose synthétase catalyse de la formation de lactose à partir d’une molécule de d’UDP-galactose et une molécule de glucose : - Cette enzyme est constituée d’une sous unité catalytique et d’une sous unité modificatrice ® reliés par des liaisons non covalentes ® : La sous unité catalytique est capable de transférer une molécule de galactose à une protéine qui possède déjà des glucides = galactosyltransférase. ® La sous-unité modificatrice affecte la spécificité de la sous-unité catalytique ® de façon à ce qu’elle unisse le galactose au glucose par une liaison osidique β1-4 pour former le lactose. Le contrôle hormonal par la prolactine intervient sur la synthèse de la sous-unité modificatrice. Utilisez le forum pour poser vos questions 18  a. Notion de site actif - La plupart des enzymes sont des protéines globulaires. - Leur activité catalytique dépend de l’intégrité de la conformation de la protéine native (structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire). - Une réaction enzymatique a lieu à l’intérieur d’une poche fermée appelée site actif et la molécule liée au site actif est appelée substrat. - Le site actif est une région qui lie le substrat (et le ou les cofacteur(s) s’il y en a) et apporte les acides aminés des groupes catalytiques qui participent directement : Action A la formation de liaisons par les synthétases Au clivage de liaisons par une hydrolase - Il est créé par le repliement des protéines dans les structures tertiaires et quaternaires et occupe une part relativement réduite du volume total de l’enzyme. Structuration - Des acides aminés distants dans la structure primaire se retrouvent proches dans la structure tridimensionnelle (tertiaire ou quaternaire) - Le site actif de l’enzyme a par nature une forme complémentaire de celle du substrat : Analogie avec la clé et la serrure : modèle de Fisher Complémentarité enzyme/substrat Modèle de reconnaissance dynamique : le site actif a une forme complémentaire de celle du substrat seulement après que le substrat se soit lié : ajustement induit, modèle de Koschland - Au niveau du site actif, il existe des groupements possédant les caractéristiques d’un réactif nucléophile (riches en électron) : OH des sérines Mécanismes SH des cystéines moléculaires de l’acte catalytique Noyau imidazole des histidines - Pour connaître l’importance de certain acides aminés au sein d’une enzyme, il est possible : D’utiliser des techniques de mutation ® : génie génétique ou biotechnologies Utilisez le forum pour poser vos questions 19  Hiérarchisation fonctionnelle des AA : les acides aminés sont plus ou moins importants pour la fonction de l’enzyme selon leur localisation, leur position dans la structure primaire - Possibilité de faire des mutations ou des remplacements de ces AA sans Les AA « non collaborateurs » ou changer l’activité enzymatique, ; indifférents - En général situé sur les extrémités N ou C-terminal, à distance du site actif Les AA « collaborateurs » ou de - Interviennent dans le repliement de la chaine conformation - Interviennent dans l’ajustement induit, permettant de resserrer et former Les AA auxiliaires le complexe ES (ajustement induit) - Interviennent dans la catalyse Les AA de contact - Sont en liaison avec le substrat b. Cofacteurs et coenzymes - Certaines enzymes sont actives par elles-mêmes comme la RNase et d’autres nécessitent la présence d’un composé chimique supplémentaire appelé cofacteur qui peut être : Un ion inorganique = cofacteur minéral : Cu++, fe++, Mg++ ®, Mn++, Zn++, K+. o Retrouvés dans les métalloprotéines o Liaisons par des liaisons de coordination Une molécule complexe, organique ou métallo-organique = coenzyme. De nature non protéique, ce sont des molécules de petit poids moléculaire avec une mobilité électronique très grande comme des composés nucléotidiques, des systèmes organiques conjugués (double liaison) ou des coyaux cycliques ou hétérocycles. Les coenzymes sont des composés thermostables qui permettent une réaction de molécule à molécule sans être responsables de la spécificité enzymatique. o Un cosubstrat fait des liaisons faibles, hydrogène ou ioniques, avec l’apoenzyme ® o Un groupement prosthétique fait des liaisons de coordination ou covalente ® avec l’apoenzyme en plus des liaisons faibles - L’apoenzyme ou l’apoprotéine correspond à la partie protéique et une holoenzyme correspond à l’enzyme catalytiquement active ® (apoenzyme +/- cofacteur minéral +/- coenzyme +/- cofacteur) Utilisez le forum pour poser vos questions 20  - De nombreuses vitamines sont des précurseurs de coenzymes. Ce sont des éléments organiques indispensables en petite quantité dans le régime alimentaire. - Les coenzymes fonctionnent comme des transporteurs transitoires de groupements fonctionnels spécifiques. - Ils peuvent transporter différents groupements suivant le type de réaction catalysée. Réactions Coenzymes Espèces transportées NAD, NADP Co-substrats Oxydoréduction 2 H+, 2 e- FAD Groupements prosthétiques ® Transfert de Coenzyme A Groupement Acyl (R-CO) groupement Phosphate de pyridoxal CO2, NH2 Utilisez le forum pour poser vos questions 21  - Exemple : NAD+ : cosubstrat de déshydrogénases (LDH par exemple) Réaction 1 : le cosubstrat se réduit par action de l’apoenzyme 1 : Réaction 2 : le cosubstrat produit par action de l’enzyme 1 se régénère par action de l’apoenzyme 2 - Exemple : un le phosphate de pyridoxal est un groupement prosthétique dérivé de la vitamine B6 qui aide à la catalyse. Il se fixe dans le site actif d’aminotransférase ou d’aminoacides décarboxylases en formant des liaisons faibles, des liaisons de coordination avec un Cu++, une liaison covalente imine avec une lysine et quelques liaisons ioniques. La liaison imine peut se transférer et se faire avec le NH3 d’un acide aminé substrat. Le N+ du cycle du phosphate de pyridoxal attire les électrons et fragilise la liaison Cα-COOH pour induire la décarboxylation. Utilisez le forum pour poser vos questions 22