Cours de Biochimie 1-4 PDF

Cours Biochimie Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Campus: Leçons: PO 01 Exercices: PO 01  Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Professeur en chimie bioorganique Laboratoire de Protéines et Peptide Théra...

Cours Biochimie Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Campus: Leçons: PO 01 Exercices: PO 01  Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Professeur en chimie bioorganique Laboratoire de Protéines et Peptide Thérapeutiques Recherche:  Cours Biochimie Contenu: - Discuter les classes majeures de biomolécules - Analyser les fonctions des biomolécules - Comprendre la relation entre structure et fonction Protéines Acides nucléiques Glucides Acides aminés, DNA, RNA, Lipides structures, fonctions les nucléosides Molécules du métabolisme  Comment s'organise le cours? Heure Lundi Mardi Mercredi Jeudi Vendredi 10:15-11:00 Cours magistral 11:15-12:00 Cours magistral 12:15-13:00 Exercices 13:15-14:00  Exercices Un exercice per semaine (une feuille, 5-7 questions) Contenu du cours accessible sur Moodle (http://moodle.epfl.ch) Mot de passe: chim10 Livre: « Biochimie » Berg, Tymoczko, Stryer (7e édition) Livre: « Biochimie » Berg, Tymoczko, Stryer (6e édition) Livre: « Biochemistry » Berg, Tymoczko, Stryer (9th edition)  Les leçons Pages indiquées pour la 6e édition de Stryer  Leçon 1 Introduction en biochimie - Les classes de biomolécules Interactions moléculaires - Forces des interactions - Etat de ionisation (pH et pKa) Aminoacides - Chimie et structure des aminoacides - Les qualités des aminoacides Les classes de biomolécules Quels sont les composants des plantes ou des animaux? Les classes de biomolécules Quels sont les composants des plantes ou des animaux? Avec quelles méthodes peut-on analyser les composants?  Quels sont les composants des cellules? Avec quelles méthodes peut-on analyser les composants? sédiment  cellules, nucleus, cytoskeleton, membrane proteines mitochondrie, lysosome, peroxysomes microsomes ribosomes, macromolecules paroi cellulaire La biochimie s'occupe surtout des molécules des niveaux 1 et 2 Quelle part du pois d’une cellule est de H2O, protéine, DNA, lipide ? Vue d’ensemble des composants dans une cellule de bactérie (E.coli) La part du poids d’une cellule (en %)  Introduction en biochimie - Les classes de biomolécules Interactions moléculaires - Forces des interactions - Etat de ionisation (pH et pKa) Aminoacides - Chimie et structure des aminoacides - Les qualités des aminoacides  Interactions moléculaires Les interactions moléculaires sont nécessaires pour… …former des structures tridimensionnelles …les fonctions des biomolécules  Interactions moléculaires Les interactions moléculaires sont nécessaires pour… …former des structures tridimensionnelles …les fonctions des biomolécules Quels types d'interactions est-ce qu’il y a entre les atomes des biomolécules?  Interactions covalente et non-covalente Interactions covalente: Les atomes ~ 100 kcal/mol partagent un électron Interactions non-covalentes:  Interactions covalente et non-covalente Interactions covalente: Les atomes ~ 100 kcal/mol partagent un électron Interactions non-covalentes: Quels types d'interactions non-covalents existent? Quatre interactions non-covalentes Interactions électrostatiques Interactions Van der Waals Liaisons hydrogènes Effets hydrophobe  1. Interactions électrostatiques attraction Loi de Coulomb: E = kq1q2/Dr D = constante diélectrique, r = distance, k = constante de proportionnalité Interaction entre deux charges séparées dans l’eau par 3 Å = ~ 3 kcal/mol  2. Interactions de Van der Waals répulsion attraction Résultat d’une asymétrie temporaire de la distribution électronique autour d’un atome/ molécule ~ 0.5 - 1 kcal/mol 3. Liaisons hydrogènes Une liaison hydrogène est formée entre un « hydrogen acceptor » et un « hydrogen donor » Interactions électrostatiques, conséquence de la polarisation d’une liaison X-H 1-5 kcal/mol Liaisons hydrogènes dans la glace En général 1-5 kcal/mol, entre 1.5 et 2.6 Å, souvent linéaire.  4. L’effet hydrophobe (the hydrophobic effect) Une cage de molécules d'eau Important pour le « protein folding », membranes, DNA double-helix…  Vue d’ensemble des forces des interactions 3 kcal/mol ~ 100 kcal/mol ~ 0.5 - 1 kcal/mol 1-5 kcal/mol  Introduction en biochimie - Les classes de biomolécules Interactions moléculaires - Forces des interactions - Etat de ionisation (pH et pKa) Aminoacides - Chimie et structure des aminoacides - Les qualités des aminoacides  pH Quel est la signification du pH?  pH Quel est la signification du pH? pH = - log10 [H+] Exemple: Concentration de H+ = 10-6 M pH = 6 Dans l’eau, le H+ est toujours lié au H2O (H3O +)  pKA Quel est la signification du pKA? KA (comme le pKA) decrit l’état d’ionisation des molécules  KA (comme le pKA) decrit l’état d’ionisation des molécules Définition de [H+][Ac-] l’équilibre: Ka = ------------- [HAc] (Équation 1)  KA (comme le pKA) decrit l’état d’ionisation des molécules Définition de [H+][Ac-] l’équilibre: Ka = ------------- pKa = - log10(Ka) [HAc] (Équation 1) (Équation 2) pKA decrit l’état d’ionisation des molécules [H+][Ac-] Ka = ------------- [HAc] pKA decrit l’état d’ionisation des molécules [H+][Ac-] Ka = ------------- [HAc] Ka [Ac-] ------- = ------------- [H+] [HAc] Le rapport de [Ac-] au [HAc]  pKA decrit l’état d’ionisation des molécules [H+][Ac-] Ka = ------------- [HAc] constante de Ka [Ac-] dissociation ------- = ------------- (fixe) [H+] [HAc] concentration de protons Le rapport de [Ac-] au [HAc]  pKA decrit l’état d’ionisation des molécules [H+][Ac-] Ka = ------------- [HAc] constante de Ka [Ac-] dissociation ------- = ------------- Pourquoi est-ce que c’est (fixe) [H+] [HAc] intéressant de savoir le rapport de [Ac] au [HAc]? concentration de protons Le rapport de [Ac-] au [HAc] Quel est le rapport de [Ac-] avec [HAc] à pH 7? pKa (acide acétique) = 4.75 pKa = - log10(Ka) Ka [Ac-] ------- = ------------- [H+] [HAc] pKA decrit l’état d’ionisation des molécules Ka [Ac-] ------- = ------------- [H+] [HAc] pKa = - log10(Ka)  Ka = 10-4.75 = 0.0000178 pH = - log10 [H+]  [H+] = 10-7 = 0.0000001 [Ac-] 0.0000178 ----------- = ------------------- = 178 [HAc] 0.0000001  Une connaissance du pKA d’un groupe fonctionnel est indispensable pour comprendre et prédire ses interactions avec d'autres molécules!!! acide acétique acide carbonique acide aminé phosphate inorganique  Exemple: Ka [G-] ------- = ------------- pKa (guanine) = 9.7 [H+] [GH] Quel est le rapport de [G-] au [GH] au cellules (pH 7.4)?  Exemple: pKa = - log10(Ka)  Ka = 10-9.7 = 0.0000000002 pH = - log10 [H+]  [H+] = 10-7.4 = 0.00000004 [G-] 0.0000000002 ----------- = ------------------------- = 0.005 [GH] 0.00000004 double hélice de DNA liaison hydrogène  Introduction en biochimie - les classes de biomolécules Interactions moléculaires - forces des interactions - etat de ionisation (pH et pKa) Aminoacides - chimie et structure des aminoacides - les qualités des aminoacides  Aminoacides Les 20 aminoacides sont les constituants principaux des protéines.  Aminoacides chaîne d'aminoacides Les 20 aminoacides ont des groupes chimiques en commun. Lesquels?  Aminoacides Quelles groupes chimiques sons commun dans les acides aminés? Aminoacides  Les a-aminoacides sont chiraux Les isomères sont les images de l’un et l’autre dans un miroir Deux nomenclatures: D/L R/S  D / L nomenclature Les 20 aminoacides naturels sont tous des isomères L  R / S nomenclature S (sinister = gauche) S- isomère R- isomère N > CO > C > H Les 20 aminoacides (avec une exception) naturels sont tous des isomères S  Etat d’ionisation des a-aminoacides + 3 pKa = 8 pKa = 3.1  Etat d’ionisation des a-aminoacides + 3 pKa = 8 pKa = 3.1 Quel est l’état d’ionisation au pH 7.4?  Etat d’ionisation d’un acide aminé: le group acide carboxylique Ka [COO-] ------- = ------------- pKa = 3.1 [H+] [COOH] Quel est le rapport de [COO-] avec [COOH] dans les cellules (pH 7.4)?  Etat d’ionisation d’un acide aminé: le group acide carboxylique pKa = - log10(Ka)  Ka = 10-3.1 = 0.0008 pH = - log10 [H+]  [H+] = 10-7.4 = 0.00000004 [COO-] 0.0008 ----------- = ------------------------- = 20000 [COOH] 0.00000004 Etat d’ionisation d’un acide aminé: le group amine Ka [NH2] ------- = ------------- pKa = 8 [H+] [NH3+] Quel est le rapport de [NH2] avec [NH3+] dans les cellules (pH 7.4)? Etat d’ionisation d’un acide aminé: le group amine pKa = - log10(Ka)  Ka = 10-8 = 0.00000001 pH = - log10 [H+]  [H+] = 10-7.4 = 0.00000004 [NH2] 0.00000001 ----------- = ------------------------- = 0.25 [NH3+] 0.00000004 A pH neutre, les a-aminoacides se trouvent sous forme d’ions dipolaires Les chaînes latérales  Les chaînes latérales Pourquoi est-ce les acides aminés ont des chaînes latérales variables?  Fonctions des chaînes latérales 1. Les chaînes latérales influencent la structure tridimensionnelle d’une protéine 2. Les chaînes latérales influencent les interactions d’une protéine avec des autres molécules 3. Dans les protéines, quelques chaînes latérales ont des fonctions particulières (par exemples elles aident à catalyser des réactions chimiques) La glycine et l'alanine sont les aminoacides les plus petits La glycine et l'alanine sont les aminoacides les plus petits  La glycine et l'alanine sont les aminoacides les plus petits Quelle est la chaîne latérale de glycine? Chaînes latérales hydrocarbonée plus long  La proline Quelle est la chaîne latérale de proline? La proline a aussi une chaîne latérale aliphatique mais est aussi le seul aminoacide cyclique La proline joue souvent un rôle structurel important.  Prolin Village en Valais Chaînes latérales aromatiques Tyr et Trp déterminent les spectres UV des protéines pKa = 10.9 Chaînes latérales aromatiques Quel est l’état de ionisation dans la chaîne latérale de tyrosine? pKa = 10.9 Chaînes latérales avec des groupes hydroxyles Chaînes latérales avec des groupes thiols pKa = 8.3 Un pont disulfure (= lien covalent) peut être formé par oxidation (réversible) Chaînes latérales avec des groupes basiques pKa = 10.8 pKa = 12.5 pKa = 6 Chaînes latérales avec des groupes carboxylates pKa = 4.1 Chaînes latérales avec des groupes carboxamides Liste des groupes fonctionnels ionisables des 20 aminoacides Liste des groupes fonctionnels ionisables des 20 aminoacides  Chaîne d’aminoacides Comment est-ce que les acides aminés peuvent être connectés? Les chaînes latérales Chaîne d’aminoacides amino-terminus (N-terminus) carboxy-terminus (C-terminus)  Cours Biochimie I Leçon 2 : Composition et Structure des Protéines Christian Heinis [email protected], BCH 5305  Leçon 2 Liaisons peptidiques Organisation des protéines - structure primaire - structure secondaire - structure tertiaire - structure quaternaire 20 acides aminés  Liaison peptidique La biosynthèse des liaisons peptidiques nécessite de l'énergie Les liaisons peptidiques sont très stables (duré de vie = 1000 ans!)  Une chaîne polypeptidique a une polarité amino-terminus carboxy-terminus N-terminus C-terminus N→C Exemple: NSGYALC  Peptide et protéine Peptide: < 50 aminoacides Protéine: 50 – 2000 aminoacides  Structure de résonance → La liaison peptidique a un caractère de double liaison Quelle est la conséquence de la double liaison pour la structure de la chaîne polypeptidique? La liaison amide empêche la rotation → Une liaison peptidique est rigide et planaire En générale, une liaison peptidique est dans une conformation trans Choc stérique Les chaîne polypeptidiques sont flexibles bien que limitées dans leur conformation → La liberté de rotation permets aux protéines de se replier de nombreuses manières différentes Les chaîne polypeptidiques sont flexibles bien que limitées dans leur conformation → La liberté de rotation permets aux protéines de se replier de nombreuses manières différentes  Les angles de torsion phi () et psi () décrivent la conformation du squelette (« backbone ») peptidique () () Phi () = angle autour de la liaison azote – carbon a Psi () = angle autour de la liaison carbon a – carbon du carbonyle  Définition des angles de torsion Exemple: angle de torsion psi () () Comment est-ce qu’on peut définir l’angle de torsion psi?  Définition des angles de torsion Exemple: angle de torsion psi () n n+1 () Observer les 4 atomes dans la direction Nn → Ca → CO → Nn+1 Exemple: angle de torsion psi () Nn COn Nn+1 Can 95  Définition des angles de torsion Exemple: angle de torsion phi () Nn Can COn COn-1 () Observer les 4 atomes dans la direction COn-1 → Nn → Can → COn Exemple: angle de torsion phi () COn-1 COn Nn Can ? Exemple: angle de torsion phi () COn-1 COn Nn Can - 80°  Exemple: angle de torsion phi () COn-1 COn Nn Can - 80° Est-ce que toutes les combinaisons de  et  sont possibles? Seulement quelques angles  et  sont trouvés Valeurs trouvées dans les peptides et protéines   Diagramme de Ramachandran G.N. Ramachandran Seulement quelques angles  et  sont trouvés Valeurs trouvées dans les peptides et protéines   Diagramme de Ramachandran G.N. Ramachandran Pourquoi est-ce qu’on trouve pas toutes les combinaisons de  et ? Seulement quelques angles  et  sont trouvés Deux atomes ne peuvent pas être à la même place  Empêchements stériques   La conformation du squelette d’une protéine est limitée Deux atomes ne peuvent pas être à la même place Liaisons peptidiques Empêchements stériques planaires (trans) (chocs stériques) Organisation de la structure des protéines Combien de conformations existent pour une protéine?  Organisation de la structure des protéines N C C N N C  Organisation de la structure des protéines N C C N N C Est-ce qu’il y a dans les protéines des sous-unités (structures) régulières ? Organisation de la structure des protéines En 1951, Linus Pauling et Robert Corey ont proposés les deux structures périodiques hélice a et feuillet plissé b: Structures secondaires Organisation de la structure des protéines Structure primaire: Structures secondaires: hélice a feuillet plissé b boucles Structures secondaires: L’hélice a La chaîne polypeptidique principale forme une hélice Les chaînes latérales se disposent à l’extérieur L'hélice alpha est stabilisée par des liaisons hydrogène entre les groupes NH et CO (-----) Liaisons hydrogène entre les résidus i et i + 4 1 2 3 4 5 6 Les aminoacides distant de 3 ou 4 résidus dans la séquence linéaire sont spatialement très proches! Quel est le sens d’enroulement d’une hélice a? Quel est le sens d’enroulement d’une hélice a? Amino-terminus Carboxy-terminus Le sens d’enroulement d’une a hélice est "droite" Le diagramme Ramachandran montre que les hélices "droites" et "gauches" existent. Mais les hélices "droites" sont énergétiquement plus favorables est elles sont trouvées beaucoup plus souvent. Quelques paramètres de l’hélice a 3.6 aminoacides par tour d’hélice La longueur d'un résidu, mesurée le long de l'axe de l'hélice, est de 1.5 Å Pas de l'hélice 5.4 Å Quelle est la longueur d'une hélice a qui est composée de 36 aminoacides?  Représentation des hélices a rubans enroulés bâtonnet Les hélices alpha sont généralement moins de 45 Å de long Les hélices alpha sont importantes dans des protéines fibreuses Exemples: a-kératine, collagène Deux hélices enroulées l’une autour de l’autre Structure ‘coiled coil’ Structures très stables rubans enroulés Fonctions: cytosquelette, myosine (muscle), cheveux, etc. Organisation de la structure des protéines Structure primaire: Structures secondaires: hélice a feuillet plissé b boucles  Les feuillets plissés b ‘b’ parce que c’était la deuxième structure secondaire qui était proposé par Pauling et Corey (après ‘a’). Composé de deux ou plusieurs chaînes polypeptides (= chaînes b) Les chaînes b sont tenues ensemble par des liaisons Les feuillets plissés b hydrogène (comme les hélices a) formés par des chaînes b  Feuillets plissés b parallèles et anti-parallèles feuillets plissés b anti- parallèles feuillets plissés b parallèles  Un feuillets b anti-parallèles Chaque aminoacide a son partenaire et forme 2 liaisons hydrogène C-term. N-term. 10 9 8 7 6 O3/NH8 NH3/O8 1 2 3 4 5 N-term. C-term. ------- liaisons hydrogène Quels groupes chimiques des aminoacides forment des liaisons hydrogène?  Vue du côté latéral Le feuillet n’est pas complètement plat Les chaînes latérales des acides aminés adjacents pointent dans des directions opposées.  Un feuillets b parallèles Chaque aminoacide a deux partenaires et forme 2 liaisons hydrogène N-term. C-term. 10 9 8 7 6 NH2/O10 O2/NH8 NH4/O8 O4/NH6 2 4 5 1 3 N-term. C-term. ------- liaisons hydrogène  Le feuillet n’est pas complètement plat Les chaînes latérales des acides aminés adjacents pointent dans des directions opposées. Quels sont les angles  et  des feuillets plissés b ? chaînes b 3 2 1 Quels sont les angles  et  des feuillets plissés b ? chaînes b 3 2 1   Quels sont les angles  et  des feuillets plissés b =? CO CO N Ca  Quels sont les angles  et  des feuillets plissés b =? CO CO N Ca  CO  = -100° N Ca CO Quels sont les angles  et  des feuillets plissés b =? CO N Ca N  N CO Ca  = 150° N Quels sont les angles  et  des feuillets plissés b  Protéines avec des feuillet plissé b Un baril Les feuillets plissés b sont un peu tordus Organisation de la structure des protéines Formation des structures secondaires: hélice a feuillet plissé b boucles Les coudes d’inversion et les boucles (loops) Les coudes d’inversion et les boucles sont nécessaire pour changer la direction de la chaîne polypeptide dans une protéine Coudes d’inversion Le groupe CO d’un résidu i est lié à un groupe NH d’un résidu i+3 par une liaison hydrogène Les boucles n’ont pas des structures régulières comme les hélices a et les feuillets b  Hiérarchie des structures Structure primaire Structure secondaire - hélice a - feuillet plissé b - boucle e.g. coude d’inversion Structure tertiaire?  La structure tertiaire La structure d’ensemble de la chaîne polypeptidique d’une protéine = structure tertiaire Les structures secondaires sont tenues ensemble par des liaisons non-covalentes Myoglobin La première structure tertiaire d’une protéine: la myoglobine John Kendrew Cambridge Prix Nobel en 1962 Aujourd’hui (2020) plus de 150’000 structures; les « coordinates » pour chaque structure peuvent être retrouvées sur le site http://www.rcsb.org/pdb La structure de la myoglobine 153 aminoacides 70% des aminoacides de la myoglobine forment des hélices a Peut fixer un molécule d’oxygène Groupe hème La structure de la myoglobine 153 aminoacides 70% des aminoacides de la myoglobine forment des hélices a Peut fixer un molécule d’oxygène Groupe hème Quels sont les dimensions d’une protéine comme la myoglobine? 1mm? 1mm? 1nm? 1Å?  Dimensions d’une protéine 153 aminoacides Peut fixer on molecule d’oxygène Pas de Groupe hème l'hélice = 70% des aminoacides du 5.4 Å myoglobine forment des hélices a Quels sont les dimensions d’un protéine comme le myoglobin?  Dimensions d’une protéine 153 aminoacides Peut fixer on molecule d’oxygène Pas de Groupe hème l'hélice = 70% des aminoacides du 5.4 Å myoglobine forment des hélices a Quels sont les dimensions d’un protéine comme le myoglobin? Dimensions: 45 x 35 x 25 Å  Dimensions d’une protéine 153 aminoacides Peut fixer on molecule d’oxygène Pas de Groupe hème l'hélice = 70% des aminoacides du 5.4 Å myoglobine forment des hélices a Quels sont les dimensions d’un protéine comme le myoglobin? Dimensions: 45 x 35 x 25 Å Est-ce qu’on peut voir la protéine avec un microscope photonique (résolution = 400 nm)?  La structure de l'hémoglobine Max Perutz, Cambridge Prix Nobel en 1962 Structure de l'hémoglobine  Distribution des aminoacides dans une protéine « Cross-section » Bleu: aminoacides chargés Pourquoi est-ce qu’on Jaune: aminoacides hydrophobes trouve cette distribution Blanc: tous les autres des aminoacides?  Distribution des aminoacides dans une protéine « Cross-section » Bleu: aminoacides chargés Pourquoi est-ce qu’on Jaune: aminoacides hydrophobes trouve cette distribution Blanc: tous les autres des aminoacides?  Distribution des aminoacides dans une protéine « Cross-section » Bleu: aminoacides chargés Pourquoi est-ce qu’on Jaune: aminoacides hydrophobes trouve cette distribution Blanc: tous les autres des aminoacides? Aminoacides chargé Aminoacides hydrophobes  Hiérarchie des structures Structure primaire Structure secondaire - hélice a - feuillet plissé b - coude d’inversion - boucle Structure tertiaire Structure quaternaire? La structure quaternaire des protéines Le tétramère a2b2 de l’hémoglobine humaine La structure quaternaire des protéines Cre endonuclease (homodimer) Structure quaternaire de protéines: capsides des virus Poliovirus (derived from PDB ID 2PLV) Tobacco mosaic virus (derived from PDB ID 1VTM) Est-ce que la séquence d’une protéine (structure primaire) détermine sa structure tridimensionnelle? ?  Expérience de Christian Anfinsen (1950) Christian Anfinsen NIH Prix Nobel en 1972 Séquence de la ribonucléase bovine (124 aminoacides, 4 liaisons disulfures)  Structure de la ribonucléase bovine Comment est-ce qu’on peut détruire la structure tridimensionnelle d’une protéine?  Une protéine peut être transformée en une forme dénaturée par certains réactifs Interactions covalentes (liaisons disulfures): b-mercaptoethanol Interactions non-covalentes: Une protéine peut être transformée en une forme dénaturée par certains réactifs → Christian Anfinsen avait enlevé les réactives urée et b-mercaptoethanol La dénaturation de la ribonucléase est réversible Après la dénaturation, la ribonucléase a retrouvé la même activité qu'avant L’information pour la structure tridimensionnelle est complètement contenue dans la séquence primaire!  L’importance des liaisons disulfures removal of urea removal of mercaptoethanol removal of mercaptoethanol removal of urea La ribonucléase a 100% de l’activité La ribonucléase a seulement 1% de de l’enzyme native l’activité de l’enzyme native Pourquoi?  L’importance des liaisons disulfures Il y a 105 façons différentes de connecter 8 cystéines pour former 4 liaisons disulfures removal of urea La ribonucléase a seulement 1% de l’activité de l’enzyme native Est-ce qu’on peut prévoir la structure tridimensionnelle d’une protéine si on connaît la séquence? ?  Calculation de la structure d’une protéine The folding pathway of a 36-residue segment of the protein villin (an actin-binding protein found principally in the microvilli lining the intestine) was simulated by computer. The process started with the randomly coiled peptide and 3,000 surrounding water molecules in a virtual “water box.” The molecular motions of the peptide and the effects of the water molecules were taken into account in mapping the most likely paths to the final structure among the countless alternatives. The simulated folding took place in a theoretical time span of 1 ms. Est-ce qu’on peut prévoir des structures secondaires si on connaît la séquence d’une protéine? La probabilité de trouver un certain aminoacide dans une certaine structure secondaire alanine glutamate hélice a leucine valine feuillet b isoleucine glycine coude arginine proline  Est-ce que la séquence VDLLKN a une structure hélice a ou feuillet b? alanine glutamate hélice a leucine valine feuillet b isoleucine glycine coude arginine proline Une même séquence peut avoir des conformations différentes dans des protéines différentes Séquence: VDLLKN (en rouge) → Importance des interactions tertiaires  Est-ce qu’on peut prévoir des structures secondaires si on connaît la séquence d’une protéine? → Non, mais on peut calculer des probabilités pour trouver des hélices a ou feuillets b Pourquoi est-ce que quelques aminoacides sont trouvé rarement dans des hélices a? valine threonine isoleucine serine aspartate asparagine proline Pourquoi est-ce que quelques aminoacides sont trouvé rarement dans des hélices a? valine threonine isoleucine serine aspartate asparagine proline  Quelques aminoacides sont trouvés rarement dans les hélices a valine threonine = carbon b Déstabilisation des hélices a en isoleucine raison de conflits stériques Pourquoi est-ce que quelques aminoacides sont trouvé rarement dans des hélices a? valine threonine isoleucine serine aspartate asparagine proline  Quelques aminoacides sont trouvés rarement dans les hélices a serine = liaison hydrogène aspartate Chaînes latérales contiennent des doneurs asparagine ou accepteurs de liaisons hydrogène → déstabilisation des hélices a Pourquoi est-ce que quelques aminoacides sont trouvé rarement dans des hélices a? valine threonine isoleucine serine aspartate asparagine proline  Quelques aminoacides sont trouvés rarement dans les hélices a proline La structure cyclique de la proline tend à rompre les hélices a (valeur phi = 60°) Valeurs phi et psi d’une hélice a sont -80° et - 60° ! Comment est-ce que les protéines se reploient? Deux propositions: 1. Tester toutes les conformations de façon aléatoire 2. Une stratégie de reploiement ‘intelligente’  Comment est-ce que les protéines se reploient? 1. Tester toutes les conformations de façon aléatoire Un exemple: - Protéine de 100 aminoacides - Chaque aminoacide peut assumer trois positions différentes - 3100 strucuture = 1047 - On a besoin 10-13 second pour tester une structure → 1.6 x 1027 années → Paradoxe de Cyrus Levinthal « Une protéine n’a pas assez de temps pour tester toutes les conformations différentes imaginables pour trouver la bonne… » Une stratégie de reploiement ‘intelligente’ Stabilisation progressive d’intermédiaires! Reploiement des protéines Résumé: hiérarchie des structures  Leçon 3 Purification des protéines L’analyse des protéines Questions? Série 1 Question 1 Série 1 Question 2 Série 1 Question 3 Série 1 Question 4 Série 1 Question 5 Série 1 Question 6 Série 1 Question 7  Cours Biochimie I Leçon 3 : Exploration des protéines et des protéomes Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Structure des protéines Structure des protéines Structure des protéines Structure des protéines  Leçon 3 Purification des protéines L’analyse des protéines - Mesurer la concentration - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - Séquencer des protéines - Détection avec des anticorps - Spetrométrie de masse - Structure tridimensionnelle  Leçon 3 Purification des protéines L’analyse des protéines - Mesurer la concentration - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - Séquencer des protéines - Détection avec des anticorps - Spetrométrie de masse - Structure tridimensionnelle  Purification des protéines Ver rond Mouche des fruits (Caenorhabditis elegans) (Drosophila melanogaster) Combien de protéines différentes est-ce qu'il y a dans un organisme? < 1’000 1’000-10’000 10’000-100’000 > 100’000  Diversité des protéines Organisme: Nombre de gènes Ver rond 19'000 (Caenorhabditis elegans) Mouche des fruits 14'000 (Drosophila melanogaster) Humain 25'000 (Homo sapiens)  Diversité des protéines Organisme: Nombre de gènes Ver rond 19'000 (Caenorhabditis elegans) Mouche des fruits 14'000 (Drosophila melanogaster) Humain 25'000 (Homo sapiens) Comment est-ce qu’on peut extraire les protéines d'un organisme?  Première étape: extraction de la protéine de la cellule des cellules sont culot rompues avec un nucleus, membrane homogénéiseur surnageant culot petites organelles (e.g. mitrochondrie) surnageant très petites structures culot (e.g. microsomes) surnageant  Première étape: extraction de la protéine de la cellule des cellules sont culot rompues avec un nucleus, membrane homogénéiseur surnageant culot petites organelles (e.g. mitrochondrie) surnageant très petites structures culot (e.g. microsomes) surnageant Comment est-ce qu’on peut séparer une protéine spécifique dans un mélange de protéines?  Méthodes pour la purification des protéines Méthode: Principe de séparation: Chromatographie par gel-filtration Taille Chromatographie par échange d'ions Charge Chromatographie d'affinité Affinité spécifique  Méthodes pour la purification des protéines Méthode: Principe de séparation: Chromatographie par gel-filtration Taille Chromatographie par échange d'ions Charge Chromatographie d'affinité Affinité spécifique Exemple: lysozyme myoglobin alcohol dehydrogenase  Méthodes pour la purification des protéines Méthode: Principe de séparation: Chromatographie par gel-filtration Taille Chromatographie par échange d'ions Charge Chromatographie d'affinité Affinité spécifique Exemple: lysozyme myoglobin alcohol dehydrogenase  Séparation des protéines basé sur la taille  Chromatographie par gel-filtration: séparations fondée sur la taille des protéines colonne de chromatographie  Chromatographie par gel-filtration: séparations fondée sur la taille des protéines Billes poreuses (polymère) Les petites molécules colonne de peuvent pénétrer les chromatographie billes, mais pas les grosses Les grosses molécules s'écoulent plus vite Chromatographie par gel-filtration: séparations fondée sur la taille des protéines Chromatographie par gel-filtration: séparations fondée sur la taille des protéines  Chromatographie par gel-filtration: séparations fondée sur la taille des protéines 3 myoglobin 1 lysozyme 5 4 DNA polymerase 2 Alcohol dehydrogenase HIV protease Quelle protéine migre la plus vite?  Méthodes pour la purification des protéines Méthode: Principe de séparation: Chromatographie par gel-filtration Taille Chromatographie par échange d'ions Charge Chromatographie d'affinité Affinité spécifique Chromatographie par échange d’ions Billes avec des groupes chargés Les protéines sont séparées sur la base de leur charge globale  Chromatographie par échange d’ions 2 1 Aminoacides chargés positivement: bleu Aminoacides chargés négativement: rouge 3 Quelle protéine migre la plus vite?  Méthodes pour la purification des protéines Méthode: Principe de séparation: Chromatographie par gel-filtration Taille Chromatographie par échange d'ions Charge Chromatographie d'affinité Affinité spécifique Chromatographie d’affinité Billes avec des groupes chimiques (par exemple glucose) Une protéine qui a une affinité pour le glucose se fixe sur la colonne Comment peut-on dissocier la protéine fixée? Chromatographie d’affinité Billes avec des groupes chimiques (par exemple glucose) Une protéine qui a une affinité pour le glucose se fixe sur la colonne Comment peut-on dissocier la protéine fixée?  Purification des protéines - Chromatographie par gel filtration - Chromatrographie par échange d'ions - Chromatographie d'affinité L’analyse des protéines - Mesurer la concentration - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - Séquencer des protéines - Détection avec des anticorps - Spetrométrie de masse - Structure tridimensionnelle  Mesurer la concentration solutions avec protéine Comment peut-on mesurer la concentration d'une protéine?  Mesurer la concentration longueur d'onde spécifique  La loi de Beer-Lambert intensité de la lumière sortante coefficient diamètre de absorption d'extinction l‘éprouvette concentration intensité de la lumière incidente  La loi de Beer-Lambert intensité de la lumière sortante coefficient diamètre de absorption d'extinction l‘éprouvette ? concentration intensité de la peut être lumière incidente 1 cm mesuré valeur spécifique pour chaque protéine  Un spectre d'absorption Quels sont les aminoacides qui absorbent le plus fort la lumière à une longueur d'onde de 280 nm? Coefficient d'extinction des aminoacides Coefficient d'extinction des aminoacides Coefficient Aminoacide: d’extinction (e): Tryptophane 5500 M-1cm-1 Tyrosine 1490 M-1cm-1  Calcul d’un coefficient d’extinction MKALIILGFLFLSVAVQGKVFERCELARTL KKLGLDGYKGVSLANWLCLTKWESSYNT KATNYNPSSESTDYGIFQINSKWWCNDG KTPNAVDGCHVSCSELMENDIAKAVACA KHIVSEQGITAWVWKSHCRDHDVSSYVQ GCTL structure de la lysozyme séquence primaire de la lysozyme Comment est-ce qu'on peut calculer le coefficient d’extinction de la lysozyme?  Calcul d’un coefficient d’extinction MKALIILGFLFLSVAVQGKVFERCELARTL KKLGLDGYKGVSLANWLCLTKWESSYNT KATNYNPSSESTDYGIFQINSKWWCNDG KTPNAVDGCHVSCSELMENDIAKAVACA KHIVSEQGITAWVWKSHCRDHDVSSYVQ GCTL structure de la lysozyme séquence primaire de la lysozyme e(lysozyme) = 6 x e(tryptophane) + 5 x e(tyrosine) = 6 x 5500 + 5 x 1490 = 40450 M-1cm-1  Mesurer la concentration de la lysozyme Dans une solution aqueuse avec la protéine lysozyme on a mesuré une absorption de 0.65. Quelle est la concentration de la protéine? ? E Diamètre de la cuvette = 1cm structure de la lysozyme e(lysozyme)= 40450 M-1cm-1  Mesurer la concentration de la lysozyme ? E 0.65 1cm e(lysozyme)= 40450 M-1cm-1 structure de la lysozyme E 0.65 c = ---------- = ------------ = 1.6.10-5 M = 16 mM el. d 40450. 1  Analyser plusieurs protéines dans un échantillon { Comment peut-on voir si on a une ou plusieurs protéines dans une éprouvette?  Purification des protéines L’analyse des protéines - Mesurer la concentration - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - Séquencer des protéines - Détection avec des anticorps - Spetrométrie de masse - Structure tridimensionnelle  Électrophorèse sur gel charge négative (-) charge négative (-) champ électrique gel poreuse charge positive (+) charge positive (+) Méthode la plus importante pour déterminer la composition d’un échantillon de protéine  Gel de polyacrylamide (‘filet de pêche’) Fine plaque de polyacrylamide acrylamide bisacrylamide réaction de initiée par polymerisation un radical Un gel de polyacrylamide est Liaison croisée chimiquement inerte et peut être préparé par polymérisation d'acrylamide  Électrophorèse sur gel puits pour placer les solutions de protéines charge négative (-) Appareil d'électophorèse charge positive (+) Électrophorèse sur gel (PAGE = polyacrylamide gel electorphoresis) charge négative (-) charge positive (+) v = Ez/f v: vitesse de migration E: force électrique z: charge nette de la protéine f: coefficient de friction (taille de la protéine, gel) SDS-PAGE: SDS polyacrylamide gel electorphoresis Les molécules de SDS se lient aux protéines (interaction non- covalente) sodium dodecyl sulfate (SDS) Environ 1 molécule SDS par 2 aminoacides Les protéines sont dénaturées Toutes les protéines sont chargées négativement  La mobilité dans le SDS-PAGE est proportionnelle au logarithme de leur masse marker  La mobilité dans le SDS-PAGE est proportionnelle au logarithme de leur masse marker Sur un SDS-PAGE les protéines sont séparées uniquement en fonction de leur taille une échelle logarithmique  La mobilité dans le SDS-PAGE est proportionnelle au logarithme de leur masse marker Sur un SDS-PAGE les protéines sont séparées uniquement en fonction de leur taille Comment peut-on visualiser une protéine? Coloration des protéines après électrophorèse en utilisant du bleu de Coomassie Une quantité de 0.1 mg de protéine peut être détectée Des protéines avec une différence de masse de 2% peuvent être séparées (e.g. 50 et 51 kDa; 10 aminoacides) Electrophorèse avec beaucoup de protéines différentes Comment pourrait-on améliorer la résolution des protéines sur un gel SDS-PAGE?  Électrophorèse en deux dimensions d’un échantillon de bactérie Escherichia coli (E. coli) 1ère séparation 2ème séparation  1ère séparation Avec quelle propriété 2ème séparation physique pourrait-on séparer les protéines dans la deuxième dimension?  1ère séparation Séparé sur la base du point isoélectrique Quel est le point isoélectrique? Séparé sur la base 2ème séparation de la taille  Focalisation isoélectrique Le point isoélectrique (pI) est le pH auquel la charge globale d'une protéine est égal à 0 Un gel avec un gradient de pH est préparé Les protéines migrent dans un champ électrique et s'arrêtent dans la région où leur charge globale est égale à 0.  Focalisation isoélectrique protéines avec le même point isoélectrique, pI (p.ex. pI = 8) pH: 9 8 7 6 5 4 3  Électrophorèse en deux dimensions d’un échantillon de bactérie Escherichia coli (E. coli) 1ère séparation (point isoélectrique) 2ème séparation (taille)  Purification des protéines L’analyse des protéines - Mesurer la concentration  quantifier une protéine pure - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide  analyser des protéines dans un mélange - Séquencer des peptides et protéines - Détection avec des anticorps - Spetrométrie de masse - Structure tridimensionnelle  Séquençage des protéines Tyr-Ile-Ser-Cys-Thr Comment pourrait-on déterminer la composition en aminoacides d'un peptide ou d'une protéine?  Composition en aminoacides d'un peptide Tyr-Leu-Ser-Cys-Thr 1. Hydrolyse du peptide avec de l'acide chlorhydrique Ser (HCl, 6 M), 100°C, 24 h Leu 2. Séparation des Tyr Thr Cys aminoacides par chromatographie liquide à haute pression (HPLC)  Chromatographie liquide à haute pression (HPLC) Séparation des aminoacides avec une colonne L'identité d'un aminoacide est révélée par le temps d'élution Cys Ser Tyr Chromatographie liquide à haute pression (HPLC) temps d'élution Les aminoacides peuvent être identifiés par HPLC Les aminoacides peuvent être identifiés par HPLC Ser Thr Cys Tyr Ile  Séquence des protéines Tyr-Ile-Ser-Cys-Thr Tyr Leu Ile-Tyr-Ser-Cys-Thr Ser Ser-Ile-Tyr-Cys-Thr Thr Cys-Ile-Ser-Tyr-Thr Cys Thr-Ile-Ser-Cys-Tyr …… Comment pourrait-on déterminer la séquence d'aminoacides d'un peptide ou d'une protéine? Dégradation de Edman (Pehr Edman) Biochimiste de Suède En 1950, il avait développé une méthode pour déterminer les séquences des protéines Dégradation de Edman (Pehr Edman) Le résidu N-terminal est marqué Le résidu marqué est séparé L'identité du résidu est analysé par HPLC (chromatographie à haute pression) Dégradation de Edman isothiocyanate peptide amputé aminoacide d'un aminoacide libéré Les aminoacides libérés peuvent être identifiés par (chromatographie liquide à haute pression) HPLC Phenylalanine  Séquençage des protéines entières Peut-on séquencer des protéines entières par la méthode Edman? MKALIILGFLFLSVAVQGKVFERCELARTL KKLGLDGYKGVSLANWLCLTKWESSYNT KATNYNPSSESTDYGIFQINSKWWCNDG KTPNAVDGCHVSCSELMENDIAKAVACA KHIVSEQGITAWVWKSHCRDHDVSSYVQ GCTL structure de lysozyme séquence primaire de lysozyme  Séquençage des protéines entières Peut-on séquencer des protéines entières par la méthode Edman? Environ 50 aminoacides peuvent être séquencés Limitation: Dans chaque étape, seulement environ 98% des protéines libèrent le résidu N-terminal  La proportion des aminoacides libérés 'correctement' après 60 tours est de 0.3 (= seulement 30%) Cliver des protéines sur des aminoacides spécifiques MKALIILGFLFLSVAVQGKVFERCELARTLKKLGLDGYKGVSLANWL CLTKWESSYNTKATNYNPSSESTDYGIFQINSKWWCNDGKTPNAVD GCHVSCSELMENDIAKAVACAKHIVSEQGITAWVWKSHCRDHDVSS YVQGCTL ALIILGFLFLSVAVQGK VFERCELARLGLDGYK GVSLANWLCLTKWESSYNTK ATNYNPSSESTDYGIFQINSK WWCNDGK TPNAVDGCHVSCSELMENDIAK AVACAKHIVSEQGITAWVWK SHCRDHDVSSYVQGCTL  Cliver des protéines sur des aminoacides spécifiques Méthode chimique bromure de cyanogène Cliver des protéines sur des aminoacides spécifiques Méthode enzymatique en utilisant des protéases (p.ex. trypsin)  Exemple: Clivage de la protéine lysozyme avec de la trypsine MKALIILGFLFLSVAVQGKVFERCELARTLKKLGLDGYKGVSLANWL CLTKWESSYNTKATNYNPSSESTDYGIFQINSKWWCNDGKTPNAV DGCHVSCSELMENDIAKAVACAKHIVSEQGITAWVWKSHCRDHDV SSYVQGCTL MK ATNYNPSSESTDYGIFQINSK ALIILGFLFLSVAVQGK WWCNDGK VFERCELAR TPNAVDGCHVSCSELMENDIAK TLK AVACAK K HIVSEQGITAWVWK LGLDGYK SHCR GVSLANWLCLTK DHDVSSYVQGCTL WESSYNTK Comment est-ce qu'on pourrait établir l'ordre de ces segments?  Exemple de séquençage La protéine lysozyme est clivée en deux réactions séparées: - trypsine - chymotrypsine (clive les polypeptides après les aminoacides Phe, Trp, Tyr lysozyme lysozyme + + trypsin chymotrypsin Deux groupes de segments peptidiques sont obtenus  Exemple de séquençage Clivé avec trypsin: Clivé avec chymotrypsin: MK ALIILGFLFLSVAVQGK MKALIILGF VFERCELAR LFLSVAVQGKVF TLK ERCELARTLKKLGLDGY K KGVSLANW LGLDGYK LCLTKW GVSLANWLCLTK ESSY WESSYNTK NTKATNY ATNYNPSSESTDYGIFQI NPSSESTDY NSK GIF WWCNDGK QINSKW TPNAVDGCHVSCSELME W NDIAK CNDGKTPNAVDGCHVSCSELMENDIAK AVACAK AVACAKHIVSEQGITAW HIVSEQGITAWVWK VW SHCR KSHCRDHDVSSY DHDVSSYVQGCTL VQGCTL  Assemblage des segments peptidiques MK ALIILGFLFLSVAVQGK VFERCELAR TLK K LGLDGYK MKALIILGF LF LSVAVQGKVF ERCELARTLKKLGLDGY GVSLANWLCLTK WESSYNTK ATNYNPSSESTDYGIFQINSK KGVSLANW LCLTKW ESSY NTKATNY NPSSESTDY GIF WWCNDGK TPNAVDGCHVSCSELMENDIAK AVACAK QINSKW W CNDGKTPNAVDGCHVSCSELMENDIAKAVACAKHIVSEQGITAW HIVSEQGITAWVWK SHCR DHDVSSYVQGCTL VW KSHCRDHDVSSY VQGCTL  Purification des protéines L’analyse des protéines - Mesurer la concentration  quantifier une protéine pure - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide  analyser des protéines dans un mélange - Séquencer des protéines  analyser la séquence primaire - Détection avec des anticorps - Spetrométrie de masse - Structure tridimensionnelle Méthodes pour détecter des protéines basées sur des anticorps Anticorps = protéines synthétisées par un animal en réponse à l'introduction d'une substance étrangère anticorps anticorps (3D) (dessin schématique) Les anticorps ont une affinité spécifique pour des protéines (= antigens) Le site d’un antigène qui est reconnu par un anticorps est appelé épitope Génération d'anticorps  Exemple d'une application d'anticorps: Western blot Avec la méthode du ‘Western blot’ on peut identifier des protéines spécifiques sur un gel polyacrylamide anticorps radioactivité Application des anticorps exemple 1: Wester blot film transfère des protéines anticorps sur une feuille radioactivité  Purification des protéines L’analyse des protéines - Mesurer la concentration - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - Séquencer des protéines - Détection avec des anticorps - Spetrométrie de masse - Structure tridimensionnelle  Spetrométrie de masse Matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight; MALDI-TOF Exemple de MALDI-TOF Exemple de MALDI-TOF Koichi Tanaka Prix Nobel en 2002  Purification des protéines L’analyse des protéines - Mesurer la concentration - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - Séquencer des protéines - Détection avec des anticorps - Spétrométrie de masse - Structure tridimensionnelle Structure tridimensionnelle d’une protéine Cristallographie par rayons X Première étape: obtenir des cristaux Cristaux de myoglobine Deuxième étape: diffraction des rayons X par le cristal Troisième étape: calcul d’une carte de densité électronique Section de la carte de densité électronique de la myoglobine La structure de la myoglobine La structure d'une protéase avec un inhibiteur peptidique  L’analyse des protéines Mesurer la concentration  quantifier une protéine pure Electrophorèse sur gel  analyser des protéines dans un de polyacrylamide mélange Séquencer des protéines  analyser la séquence primaire Détection avec des anticorps  identifier des protéines spécifiques dans un mélange Spetrométrie de masse  déterminer la masse moléculaire d’une protéine Cristallographie par rayon X  Structure tridimensionnelle Questions? Questions qu’on ma demandé par e-mail / via Zoom: Est-ce qu’on doit apprendre pour l’examen…. Liste des groupes fonctionnels ionisables des 20 aminoacides Quelques paramètres de l’hélice a 3.6 aminoacides par tour d’hélice La longueur d'un résidu, mesurée le long de l'axe de l'hélice, est de 1.5 Å Pas de l'hélice 5.4 Å La probabilité de trouver un certain aminoacide dans une certaine structure secondaire alanine glutamate hélice a leucine valine feuillet b isoleucine glycine coude arginine proline Série 2 Question 1 Série 2 Question 2 Série 2 Question 3 Série 2 Question 4 Série 1 Question 5  Cours Biochimie I Leçon 4: Structure de la DNA et RNA Christian Heinis [email protected], BCH 5305  Leçon 4 Composition du DNA - Bases, sucres, phosphates Découverte du DNA - Histoire - Expériences importantes Structure du DNA DNA réplication, méthode de PCR Flux de l’information Composition du DNA Quel sont les composants du DNA? protéine aminoacides  Bases, sucres et phospates Long polymère linéaire Un squelette invariant: sucres reliés par des phosphates Bases variantes Un monomère = nucléotide Le squelette sucre-phosphate C3’  Le squelette sucre-phosphate ribose C3’ C5’ Sucre: déoxyribose → acide déoxyribonucléique (ADN)  Le squelette sucre-phosphate 1’ 2’ 3’ 4’ C3’ C5’ 5’ Sucre: déoxyribose → acide déoxyribonucléique (ADN) Nomenclature du ribose: carbone 1’, 2’, 3’, 4’, 5’  Le squelette sucre-phosphate 1’ 2’ 3’ 4’ C3’ C5’ 5’ Sucre: déoxyribose → acide déoxyribonucléique (ADN) Nomenclature du ribose: carbone 1’, 2’, 3’, 4’, 5’ On dessine le DNA dans la direction 5’ → 3’  Le squelette sucre-phosphate 1’ 2’ 3’ 4’ C3’ C5’ 5’ Quelles sont les bases? Les bases  L'adénine purine adénine  L'adénine purine adénine Dans quelle position est-ce que l'adénine est connecté au ribose?  L'adénine purine adénine adénosine ‘base’ ‘nucléoside’  La guanine purine guanine ‘base’  La guanine purine guanine guanosine ‘base’ ‘nucléoside’ Quelle est la différence entre les bases guanine et adénine?  Les purines guanine guanosine purine adénine adénosine  La thymine et la cystosine thymine thymidine pyrimidine cytosine cytidine ‘base’ ‘nucléoside’ Nomenclature: bases, nucléosides et nucléotides Nomenclature: bases, nucléosides et nucléotides base nucléoside guanine guanosine G purine adénine adénosine A thymine thymidine T pyrimidine cytosine cytidine C  5’ Nucléotides 5’ 5’ 4’ 1’ 3’ 3’ 2’ 5’ 3’ Les nucléotides sont liés par des liaisons phosphodiesters 3’ Les liaisons phosphodiesters sont formées par les 3’-hydroxyles et les 5’-hydroxyles Le polymère a une polarité; par convention une séquence de DNA est écrite dans la direction 5’ → 3’ (p.ex. 5’-ATGCT-3’)  Le DNA code l’information génétique Combien de nucléotides y-a-t-il dans le génome humain? Quelle est la longueur du DNA?  Le DNA code l’information génétique Les molécules de DNA ont des longueurs frappantes: - Bactérie (p.ex. E.coli): 4’600’000 nucléotides - Génome humain: 3’000’000’000 nucléotides organisés en 24 chromosomes Si une molécule de DNA pouvait être étirée, sa longueur serait de 30 cm!  Découverte du DNA Composition du DNA - Bases, sucres, phosphates Découverte du DNA - Histoire - Expériences importantes Structure du DNA DNA réplication, méthode de PCR Flux de l’information Découverte du DNA Découverte du DNA (‘nuclein’) 1869 Découverte du DNA (‘nuclein’) en 1869 par Friedrich Miescher à Tübingen (il avait mit les nucleus des cellules leucocytes dans une solution basic et ensuite les fait précipiter avec une solution acide) Friedrich Miescher Prix Friedrich Miescher (le prix le plus important en Suisse pour la recherche en biomédecine) Institut Friedrich Miescher (à Bale)  Structure chimique des nucléotides 1940s Lord Alexander Todd Découverte de la connectivité du DNA (5’- 3’). Prix Nobel en 1957  Composition des bases dans le DNA 1949 Erwin Chargaff  Composition des bases dans le DNA 1949 Erwin Chargaff  Composition des bases dans le DNA 1949 Erwin Chargaff  Composition des bases dans le DNA 1949 Erwin Chargaff Le ratio de A:T et G:C est toujours proche de 1; indépendamment de l’organisme  X-ray structure of DNA 1953 Maurice Wilkins At the time professor at Kings College Prix Nobel en 1962 Rosalind Franklin At the time researcher at Kings College Structure tridimensionnelle d’une protéine Cristallographie par rayons X X-ray structure of DNA Diffraction de rayons X par une fibre de DNA Structure hélicoïdale régulière Répétitive dans des unités de 3.4 Å Découverte de la structure du DNA par James Watson et Francis Crick (1953) Deux brins polynucléotidiques s’enroulent Les bases irrégulières sont à l'extérieur de l'hélice? Découverte de la structure du DNA par James Watson et Francis Crick (1953) Les squelettes sucre-phosphate sont à l’extérieur (→ pas de répulsions éléctrostatiques!) Les bases sont à l’intérieur ! Comment une structure aussi régulière est-elle capable de s’accommoder si les bases à l’intérieur sont si différentes? Structure du DNA par James Watson et Francis Crick guanine adénine thymine cytosine Structure du DNA par James Watson et Francis Crick guanine Hélice de DNA (vue latérale; 3 paires de bases) adénine thymine cytosine Structure du DNA par James Watson et Francis Crick pyrimidine Hélice de DNA (vue de haut) purine Structure du DNA par James Watson et Francis Crick La structure de DNA peut expliquer les résultats de Erwin Chargaff  Structure du DNA Composition du DNA - Bases, sucres, phosphates Découverte du DNA - Histoire - Expériences importantes Structure du DNA DNA réplication, méthode de PCR Flux de l’information  La double-hélice du DNA Les deux chaines sont assemblées par des liaisons hydrogène entre les pairs de bases; G-C, A-T, purine-pyrimidine Quelle est l’énergie d’une liaison hydrogène?  La double-hélice du DNA Les deux chaines sont assemblées par des liaisons hydrogène entre les pairs de bases; G-C, A-T, purine-pyrimidine L’énergie d’une liaison hydrogène: 1-5 kcal /mol  La double-hélice du DNA Deux brins hélicoïdales sont enroulés l’un autour de l’autre Sens d’enroulement: droite Les bases sont à l’intérieur, les phosphates et les deoxyriboses à l’extérieur La structure hélicoïdale se répète tous les 10 nucléotides (~ 34 Å) Le diamètre de l’hélice est ~ 20 Å Dimensions du DNA Liaison hydrogène: 2.8 – 3.0 Å Distance des C1’ (des sucres): 11.1 et 10.8 Å  Dimensions du DNA Quelle est la longueur d’une double hélice avec deux brins de 100 nucléotides? 34 Å  Dimensions du DNA Quelle est la longueur d’une double hélice avec deux brins de 100 nucléotides? 34 Å 100 pairs de bases Distance axial: 3.4 Å → 340 Å = 34 nm Il y a des formes différentes d'hélices du DNA A B Z Sillons dans la double hélice de DNA dessinée par un graphiste (structure fausse) Sillons dans la double hélice de DNA Minor Major groove groove Minor Major groove groove dessinée par un graphiste (structure fausse)  Sillons dans la double hélice de DNA Major groove Minor groove ribose Minor ribose groove  Sillons dans la double hélice de DNA Major groove Minor groove ribose Minor ribose groove  Sillons dans la double hélice de DNA Major groove Minor groove ribose Minor ribose groove  Sillons dans la double hélice de DNA Major groove Minor groove ribose Minor ribose groove  Sillons dans la double hélice de DNA Major groove Major groove Minor groove Minor groove Minor groove  Sillons dans la double hélice de DNA Major groove Major groove Minor groove Minor groove Minor groove  La structure du DNA a donné des informations sur la fonction J. D. Watson, F. H. C. Crick « Molecular structure of nucleic acids » Nature 171, 737-738 (1953) ….It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immedetiately suggests a possible copying mechanism for the genetic material…… De quelle ‘copying machanism’ est-ce que Watson et Crick parle? DNA réplication, méthode PCR Composition du DNA - Bases, sucres, phosphates Découverte du DNA - Histoire - Expériences importantes Structure du DNA DNA réplication, méthode de PCR Flux de l’information  DNA réplication La séquence d’un brin de la double hélice permet de déduire la séquence de l’autre brin! Exemple: 5’-ATGGGC-3’ → 5’-GCCCAT-3’ II I III 3’-TACCCG-5’  DNA réplication La séquence d’un brin de la double hélice permet de déduire la séquence de l’autre brin! Exemple: 5’-ATGGGC-3’ → 5’-GCCCAT-3’ II I III 3’-TACCCG-5’  DNA réplication La séquence d’un brin de la double hélice permet de déduire la séquence de l’autre brin! Exemple: 5’-ATGGGC-3’ → 5’-GCCCAT-3’ II I III 3’-TACCCG-5’  DNA réplication La séquence d’un brin de la double hélice permet de déduire la séquence de l’autre brin! Exemple: 5’-ATGGGC-3’ → 5’-GCCCAT-3’ La séparation des deux brins peut fournir deux matrices Deux nouvelles double hélices peuvent être synthétisées Comment est-ce qu’on pourrait vérifier si cette hypothèse est correcte? Réplication semi-conservative Expérience de Matthew Meselson et Franklin Stahl: 1. Marquer le DNA de bactérie parental avec l’isotope 15N (en cultivent E.coli dans un milieu avec 15NH Cl) 4 2. Transférer les bactéries brusquement dans un milieu avec 14N. 3. Analyser la distribution de 15N et 14N Sédimentation à l’équilibre en gradient de densité clorure de césium Sédimentation à l’équilibre en gradient de densité clorure de césium Sédimentation à l’équilibre en gradient de densité clorure de césium Meselson & Stahl PNAS 44, 671 (1956) Réplication semi-conservative Dissociation des brins de DNA Pour la réplication et les autres processus, les deux brins doivent être séparés Comment est-ce que les brins de la double hélice peuvent être séparés? Dissociation des brins de DNA Méthodes de séparation: - chaleur - acide (détruire les liaisons hydrogène) Dans les cellules, les brins sont dissociés par des enzymes en utilisant de l'énergie: hélicase Dissociation des brins de DNA Les bases forment des doubles hélices absorbant moins de lumière que les brins séparés L'absorption de la lumière est maximale à une longueur d'onde de 260 nm Dissociation des brins de DNA température de fusion Dissociation des brins de DNA température de fusion Est-ce que la dénaturation du DNA est réversible? Renaturation des brins: hybridation Des brins complémentaires séparés peuvent se lier = hybridation L'hybridation est utilisée dans plusieurs méthodes. Exemple: Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) A B C  DNA réplication Dans les cellules, les brins de DNA sont copiés (Meselson & Stahl) Les deux brins d'une double hélice peuvent être séparés Comment est-ce que le processus de duplication marche dans les cellules?  DNA réplication Le DNA est répliqué par une enzyme: DNA polymérase En 1958, Arthur Kornberg a isolé la DNA polymérase de E. coli Il a reçu le prix Nobel en 1959 Réplication du DNA par la DNA polymérase amorce de DNA 5’ 3’ matrice (un brin de DNA)  Réplication du DNA par la DNA polymérase amorce de DNA DNA polymérase 5’ 3’ matrice (un brin de DNA) Réplication du DNA par la DNA polymérase amorce de DNA 5’ 3’ matrice (un brin de DNA) Réplication du DNA par la DNA polymérase amorce de DNA 5’ 3’ dATP matrice (un brin de DNA) Réplication du DNA par la DNA polymérase amorce de DNA C3’-O-H 5’ 3’ dATP matrice (un brin de DNA) Réplication du DNA par la DNA polymérase PPi =  Réplication du DNA par la DNA polymérase DNA polymérase catalyse la ligation des nucleotides Élongation dans la direction 5’ → 3’  Réplication du DNA Arthur Kornberg Quels réactifs sont nécessaire pour la réplication du DNA?  Réplication du DNA Réactifs: - matrice Arthur (brin de DNA) Kornberg - amorce de DNA (‘primer’) - déoxinucléotides 5'-triphosphate (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) - DNA polymérase Réplication du DNA: ligation des nucléotides Réplication du DNA: ligation des nucléotides Combien d'erreurs est-ce que la DNA polymérase fait? Réplication du DNA: ligation des nucléotides La DNA polymérase a aussi une fonction « proof-reading » 1 erreur par 108 étapes d’élongation!! Copier des séquence de DNA au laboratoire avec la DNA polymérase 2. polymerase, 3. dénaturation nucleotides (T = 94°C) cycles 1. Hybridisation de l’amorce (T = 50°C) p.ex. 30 cycles donnent 30 copies de DNA  Copier des séquence de DNA au laboratoire avec la DNA polymérase 2. polymerase, 3. dénaturation nucleotides (T = 94°C) cycles 1. Hybridisation de l’amorce (T = 50°C) p.ex. 30 cycles donnent Comment pourrait-on produire 30 copies de DNA de plus grandes quantités de DNA? Amplification des séquences de DNA par la « polymerase chain reaction » (PCR) Kary Mullis Prix Nobel in 1993 Amplification des séquences de DNA par la « polymerase chain reaction » (PCR) Amplification des séquences de DNA par la « polymerase chain reaction » (PCR) Amplification des séquences de DNA par la « polymerase chain reaction » (PCR) PCR vs réplication normale Copies de DNA: Cycles PCR Réplication normale 0 1 1 1 2 2 2 4 3 3 8 4 4 16 5 5 32 6 6 64 7 7 128 8 8 256 9 9 512 10 10 1024 11............  Flux de l’information Composition du DNA - Bases, sucres, phosphates Découverte du DNA - Histoire - Expériences importantes Structure du DNA DNA réplication, méthode de PCR Flux de l’information  Flux de l’information Comment est-ce que l’information contenue dans le DNA peut être transformée en protéines?  Flux de l’information Les aminoacides sont codés par des groupes de trois bases Le code n’a pas de ponctuation: ABCDEFGHI et pas ABC,DEF,GHI, Combien de triplets de base différentes sont possible? p.ex. AAA, AAC, AAG, AAT, ACA, ACC, …. Flux de l’information 43 = 64 Le code génétique p.ex. serine: TCT TCC TCA TCG AGT AGC Le code génétique est presque universel Le code génétique p.ex. serine: TCT TCC TCA TCG AGT AGC Le code génétique est presque universel Comment est-ce que les codes de bases sont transformés en aminoacides?  DNA → RNA → protéine RNA polymérase Le RNA est la matrice pour la synthèse des protéines DNA → RNA → protéine Quelle est la différence entre DNA et RNA? Les différences entre DNA et RNA Structure: Le sucre: DNA: deoxribose RNA: ribose Les bases: DNA: thymine RNA: uracil Le squelette sucre-phosphate du DNA et du RNA C3’ C5’  Les bases de DNA et de RNA DNA thymine thymidine RNA uracile uridine DNA → RNA → protéine Est-ce que le RNA peut aussi stocker de l'information?  Virus de RNA p.ex. VIH  DNA Composition du DNA - Bases, sucres, phosphates Découverte du DNA - Histoire - Expériences importantes Structure du DNA DNA réplication, méthode de PCR Flux de l’information Série 3 Question 1 Série 3 Question 1 Série 3 Question 2 Série 3 Question 3 Série 3 Question 4 Série 3 Question 5