Cours Méthode Biochimie 1 PDF

Biologie Cours méthode 1 27/09 Techniques de biologie moléculaire : Micro-arrays, séquençage, northern blot Méthode de séquençage de l’ADN Méthode de Maxam and Gilbert (on ne l’uDlise plus)...

Biologie Cours méthode 1 27/09 Techniques de biologie moléculaire : Micro-arrays, séquençage, northern blot Méthode de séquençage de l’ADN Méthode de Maxam and Gilbert (on ne l’uDlise plus) Méthode de Sanger (prix nobel) (on ne l’uDlise plus) Next generaDon sequencing (NGS) § Illumina sequencing § Pacbio sequencing § Nanopore sequencing Analyses de transcrits ARNs par Northern Blot Analyses de transcrits ARNs par Micro-arrays Séquençage d’ARN Séquençage de l’ADN Le séquençage de l’ADN = la lecture de la séquence des bases qui consDtuent le génome d’un organisme Il y a de nombreuses applicaDons comme : - Le séquençage de novo (découverte du génome d’une espèce) - L’annotaDon du génome (aspects foncDonnels du génome) - La compréhension de l’expression des gènes (annotaDons, RNA-seq, CHIP- seq…) - L’idenDficaDon de mutaDons héréditaires - Le diagnosDc clinique, prénatal - La médecine personnalisée (staDsDques risques maladies) - L’étude de la spéciaDon et l’évoluDon des espèces et des populaDons - La criminologie - La sélecDon et le développement d’espèces végétales Avec le développement de nouvelles technologies, les coûts de séquençage par génome ont diminué très fortement (100 000 000/génome humain en 2001 VS 1 000 dollars en 2022) Le développement de techniques et de machines a conduit à des capacités de séquençage à très haut débit Sanger sequencing = méthodes très basiques et manuelles Massively parallel sequencing = révoluDon, on peut lire plein de brins d’ADN ensemble 1958 : Sanger = prix nobel de chimie = structure des protéines (insuline) 1980 : Sanger et Gilbert = prix obel chimie pour leurs contribuDons à la technique de séquençage de l’ADN Quelques définiDons 1 Biologie Cours méthode 1 27/09 L’autoradiographie : méthode photographique uDlisée pour détecter des matériaux radioacDfs, notamment des protéines ou des acides nucléiques radiomarqués. L’énergie de l’autoradiographe est capable de pénétrer à travers un gel et sur un film photographique. -> on uDlise de moins en moins ce`e méthode = radioacDf Gel d’acrylamide : gel réDculé fabriqué en mélangeant de l’acrylamide qui polymérise, ce qui donne un réseau de mail plus ou moins denses en foncDon des proporDons d’acrylamide et de bis-acrylamide uDlisées. Le gel obtenu se comporte donc comme un tapis moléculaire. La séparaDon se fait en foncDon du poids moléculaire. Les UV de ce`e méthode sont aussi dangereux. Technique de Maxam-Gilbert (1977)- Méthode chimique Un fragment d’ADN simple brin à séquencer est marqué radioacDvement à l’extrémité 5’ par un *32P Ce fragment *32P est devisé en 4 échanDllons soumis à 4 réacDons chimiques différentes qui induisent un clivage après G, G+A, T+C ou C Le mélange des fragments clivés aux différentes bases de façon aléatoire est soumis à électrophorèse sur un gel polyacrylamide qui séparer les fragments selon leur taille avec une résoluDon d’une base. La séquence est lue après autoradiographie du gel Technique de Sanger – Dideoxy ou Chain-terminaDon sequencing Séquençage Sanger manuel Mélange de réacDon : § Template/matrice ADN simple brin § Primer/amorce (radioacDf *32P) § DNA polymérase + dNTPs + ddNTPs (1/100) On va uDliser la réplicaDon L’idée est de faire des fragments Méthode basée sur l’hybridaDon de l’ADN à séquencer (matrice simple brin) avec une amorce (primer marqué radioacDvement), ensuite on ajoute un ADN polymérase et des nucléoDdes pour synthéDser un brin complémentaire à la matrice Ce que la méthode a de parDculier = elle inclut réacDon de synthèse dans les 4 déoxynucléoDdes qui forment l’ADN normalement mais aussi 4 didéoxynucléo8des ou ddNTP) Une fois qu’un ddNTP incorporé dans chaîne nouvellement synthéDsée = elle bloque complètement l’extension de la séquence/ les ddNTP empêchent l’élongaDon du brin d’ADN par la polymérase Séquençage Sanger automaDsé (sans radioacDvité) Mélange de réacDon : § Template/Matrice ADN simple brin § Primer/amorce (non radioacDf) § DNA polymérase + dNTPs + ddNTPs fluorescents (1/100) 2 Biologie Cours méthode 1 27/09 Séquences d’ADN Notées dans le sens 5’-3’ (sens du codage de l’informaDon généDque sur les gènes) Analysées bio-informaDquement à l’ide d’applicaDons locales ou web Sont souvent comparées à une séquence de référence Il existe de nombreuses bases de données où les séquences sont stockées Next GeneraDon sequencing (NGS) Shotgun sequencing Séquençage Shotgun = technique de labo perme`ant de déterminer la séquence d’ADN du génome d’un organisme. La méthode consiste à diviser le génome de manière aléatoire en peDts fragments d’ADN qui sont séquencés individuellement Nouvelle technique de séquençage selon Sanger à haut débit et assemblage bio- informaDque par alignement des séquences chevauchantes A permis de finaliser le séquençage du génome humain en2003 Ce`e approche a conduit au développement de nouvelles techniques de séquençage massif en parallèle (deep sequencing) et de machines de plus en plus performantes. Séquençage Illumina (NGS) Approche similaire mais avec fluorescence Pas besoin d’apprendre Single molecule sequencing : Pacific Biosciences (Pacbio) SMRT : single molecule real Dme (AND ou ARN) À base de microchips Le séquen4age d’un fragment unique est fait grâce à un primer et une polymérase au fond d’u puit. Une puce de séquençage conDent plusieurs millions de puits L’addiDon d’un nouveau nucléoDde est détectée par un pulse de fluorescence spécifique Le fluorophore se détache après formaDon de la liaison. Pas de lavage après addiDon de chaque base Avantages : Ce système permet le séquençage de molécules uniques sur plusieurs kb (1000-3000bp). Aucune étape d’amplificaDon Single molecule sequencing : Nanopore sequencing Séquençage d’AND (ARN) avec un nanopore biologique ou synthéDque On détourne la protéine et la met dans nanopore La nanopore, inséré dans une membrane électrorésistante, est immergée dans un liquide conducteur 3 Biologie Cours méthode 1 27/09 Un courant électrique, issu de la conducDon des ions, traverse le nanopore. Le passage de l’ADN au travers du nanopore modifie le courant Chaque nucléoDde obstrue le nanopore différemment et génère un différenDel de courant spécifique qui peut être mesuré. Des séquences de 10-100 kb ou plus sont obtenues par nanopore (400 bases/sec) Env. 100'000 nanopores par puce Avantages : pas d’amplificaDon (moins d’erreurs), pas de problème avec les séquences répétées, assemblage bio-informaDque plus simple, idenDficaDon rapide de pathogènes Séquençage de l’ARN Southern Blot (DNA) VS Northern Blot (RNA) VS Western Blot (Protein) Northern Blot Visualiser des mRNAs ou d’autres transcrits Les étapes : 1. IsolaDon d’ARN total (on doit isoler, purifier les molécules, on va casser les cellules) 2. Électrophorèse (on va s’intéresser à l’ARN totale) 3. Transfert/buvardage sur membrane 4. HybridaDon (on fait un appariement de bases) 5. Lavage 6. VisualisaDon Hybrider la membrane avec une sonde radioacDve (32P) ou fluorescente complémentaire à l’ARN recherché La sonde peut être faite à parDr d’ADN ou ARN La sonde (simple brin ou double brin) est dénaturée avant hybridaDon avec la membrane L’idenDficaDon est basée sur la taille et la complémentarité entre l’ARN et la sonde L’idée est de mesurer la présence et la quanDté des molécules Différentes condiDons de culture font varier la quanDté d’ARNm Stromelysin-1 La quanDté d’ARN ribosomique reste stable et sert de contrôle interne de charge (une quanDté d’ARN total idenDque doit être chargé dans chaque puit) Puces à ADN ou Microarrays Puces à ADN perme`ent de mesurer le niveau d’expression des ARns et de comparer les profils d’expression dans différentes condiDons biologiques Les puces à ADN sont consDtuées de fragments d’ADN immobilisés sur un support solide selon un ordre précis Ces fragments d’ADN ont été amplifiés par *PCR et chaque spot correspond à une séquence d’ADN spécifique Ces spots d’ADN sont hybridés avec les **cDNAs des ARNs marqués avec des fluorophores (Cy3 ou Cy5) 4 Biologie Cours méthode 1 27/09 1995 : 1ere puce à ADN perme`ant de mesurer l’expression différenDelle de 45 gènes d’Arabidopsis grâce à l’hybridaDon d’ARNs marqués avec des fluorophores. Les cDNAs produits à parDr des ARns échanDllons 1 et 2 sont marqués avec les fluorophores Cy3 ou Cy5 puis hybridés simultanément avec les puces à ADN Le niveau de fluorescence verte et rouge mesurée sur chaque spot révèle le niveau d’expression de cet ARN dans l’échanDllon 1 et 2 Ce`e hybridaDon est compéDDve : + la concentraDon d’un cDNA (dont celle de l’ARN messager qui en est l’origine) est élevée, plus le cDNA s’hybridera sur le spot ADN Northern blot versus Microarrays ARNm = molécule intermédiaire qui transporte l’informaDon généDque du noyau cellulaire au cytoplasme pour la synthèse des protéines Lorsque certains gènes sont exprimés ou acDfs, de nombreuses copies de l’ARNm correspondant à ces gènes sont produites par un processus appelé transcripDon. Ces ARnm synthéDsent la protéine correspondante par traducDon. Ainsi, indirectement, en évaluant les différents ARNm, on peut évaluer l’informaDon généDque ou l’expression des gènes. Cela permet de comprendre les différents processus à l’origine de chaque modificaDon de l’expression généDque, L’ARNm agit donc comme un marqueur de subsDtuDon. Des techniques telles que le Northern Blot ne perme`ent de tester que quelques gènes par expérience. Mais, les puces à ADN ou le « profilage global de l’expression » perme`ent non seulement d’examiner un nombre de gènes bcp plus important que ce qui était possible avant, mais présentent également l’avantage que les gènes examinés ne sont pas influencés par une présélecDon de gènes. 5