Cours_Acides nucléiques_20_21.pdf

Université Mohammed Premier Faculté de Médecine et de Pharmacie Oujda Biochimie Structurale Acides Nucléiques Cours de Première Année de médecine Année Universitaire : 2019 - 2020 Pr. A. HAKKOU Enseignant - ch...

Université Mohammed Premier Faculté de Médecine et de Pharmacie Oujda Biochimie Structurale Acides Nucléiques Cours de Première Année de médecine Année Universitaire : 2019 - 2020 Pr. A. HAKKOU Enseignant - chercheur à la Faculté de Médecine et de Pharmacie Oujda LES ACIDES NUCLEIQUES La cellule animale La cellule végétale La cellule bactérienne La cellule bactérienne A. LES BASES NUCLEIQUES LES BASES PYRIMIDIQUES  LES BASES PYRIMIDIQUES Le noyau pyrimidine est basique, les azotes fixent réversiblement les protons. Les radicaux OH de la forme lactime sont légèrement acides. Les substituants des bases pyrimidiques sont fixés à un atome de carbone échangeant une double liaison avec un atome d'azote, cela permet une isomérie appelée tautomérie.. LES BASES PYRIMIDIQUES  LES BASES PYRIMIDIQUES La fonction amine est supprimée par désamination enzymatique avec fixation des radicaux d'une molécule d'eau (H et OH) sur les valences libérées. Ces bases participent dans la structure des acides nucléiques et l'élaboration des signaux génétiques : – ARN contient la cytosine et l'uracile. – ADN contient la cytosine et la thymine. Elles ont un spectre UV (Ultra-violet) caractéristique.. LES BASES PYRIMIDIQUES LES BASES PURIQUES  LES BASES PURIQUES Le noyau purine est légèrement basique : l'adénine et la guanine sont des bases faibles. Quand le noyau purique porte trois hydroxyles ou plus, il devient un acide faible La guanine présente une tautomérie et l’adénine peut subir une désamination pour donner l’hypoxanthine :  LES BASES PURIQUES NH2 OH O OH N N N N N NH3 N HN N N N N N N N NH2 N NH2 N H H H H Adénine Hypoxanthine Forme lactame Forme lactime DESAMINATION DE L'ADENINE TAUTOMERIE DE LA GUANINE  LES BASES PURIQUES Interviennent dans la structure des acides nucléiques ARN et ADN, des coenzymes (NAD, NADP, FAD....) et dans l'ATP et GTP. L'adénine à l'état libre est rencontrée dans les matières fécales, le lait de vache, le thé, le café, le tabac et dans le sang humain (100 mg/l de sang).. La guanine à l'état libre est rencontrée dans les excréments humains, des oiseaux et de l'araignée, dans les écailles des poissons et dans la peau de certains reptiles. Elles ont des caractères basiques et résistent bien à l'oxydation. Elles ont un spectre UV caractéristique qui varie avec le pH du milieu : LES BASES PURIQUES  B) NUCLEOSIDES Les nucléosides sont des substances qui libèrent un pentose et une base purique ou pyrimidique après hydrolyse totale Le pentose de l’ARN est le D-ribose et celui de l’ADN est le D- désoxyribose..  B) NUCLEOSIDES La liaison entre l'ose et la base se fait par l'intermédiaire du C1' (hémiacétalique) du pentose et d'un sommet azoté du noyau de la base (Azote 1 pyrimidique et Azote 9 purique). Cette liaison a une configuration b par rapport au carbone hémiacétalique. Les carbones du pentose sont numérotés avec des chiffres prime : 1', 2'..... La liaison entre la base et le sucre est appelée b-N-glycosidique. Les nucléosides dérivés des bases puriques se terminent en – osine. Exemple : adénosine ou désoxy-adénosine. Les nucléosides dérivés des bases pyrimidiques se terminent en – ine. Exemple : uridine, désoxy-thymidine..  C) NUCLEOTIDES ØLes nucléotides sont des esters phosphoriques de nucléosides. ØL'acide phosphorique peut estérifier l'hydroxyle en 2', 3' ou en 5' du pentose. La position la plus fréquente est la 5'. ØIl existe également des diesters, l'acide phosphorique estérifie deux fonctions alcool. ØLes nucléotides sont des acides puisque l'acide phosphorique conserve deux fonctions acides libres.. LESC) NUCLEOTIDES ACIDES NUCLEIQUES  C) NUCLEOTIDES PROPRIETES DES NUCLEOTIDES Les désoxyribonucléotides sont des dérivés du catabolisme des ADN. Les ribonucléotides sont des dérivés du catabolisme des ARN. Ils existent à l'état libre dans la cellule : – AMP : le point de départ de la synthèse de l'ATP – GMP : même rôle dans la synthèse de GTP – UMP : dans la synthèse de l'UDP, un coenzyme d'activation des oses – CMP : même rôle dans l'activation des lipides – AMP cyclique et GMP cyclique : médiateur de l'action hormonale.  Les 4 désoxyribonucléotides triphosphate sont les précurseurs de la biosynthèse de l'ADN. Les 4 ribonucléotides triphosphates sont les précurseurs de divers types d'ARN. Ils jouent le rôle de coenzymes de plusieurs activités enzymatiques. ATP : molécule de réserve d'énergie chimique. GTP a aussi le rôle de donneur d'énergie et d'activateur dans certaines réactions métaboliques. UTP a un rôle d'activateur des oses pour former des osides ou des polyosides. CTP joue le même rôle pour l'activation de certains lipides comme la phophatidyl choline.  Le groupement phosphate du nucléotide est un acide fort, le pK est égal à 0,9. – à pH < 1 que seul la base est protonée et que les phosphates sont neutralisés. – Si le pH augmente, on observe les premières ionisations des phosphates. – A pH = 3,5, l’adénine est neutre, – à pH = 6,2, le phosphate est complètement déprotoné. – A pH = 12, il y a déprotonation du ribose ( ce qui provoque dans une molécule d’ARN la rupture de la liaison phosphodiester).. Les liaisons N-glycosidiques sont plus sensibles à l’hydrolyse acide que les liaisons phosphodiesters. Les liaisons ribose-purine (A,G) sont plus sensibles que les liaisons ribose-pyrimidine (U,C)..  La sensibilité particulière de l’ARN à l’hydrolyse alcaline O P-O-CH2 O B1 H H 3’ 2’ H H - P-O-CH2 O B1 O OH 3’ 2’ 1 OH H H 3 O=P-OH O 2 O-H O- 3’ 2’ 4 O=P-O - O O O 5 O-CH2 B2 2 P 2 H H O 3’ 2’ H H O 1 O- - HO O 3’ 2’ OH O=P-OH O OH O- L’ARN est donc sensible à l’hydrolyse alcaline et pas l’ADN.  C) NUCLEOTIDES Base Ribonucléoside Nucléoside Nucléoside Nucléoside monophosphate diphosphate triphosphate Adénine Adénosine AMP ADP ATP Adénosine Adénosine Adénosine Monophosphate ou diphosphate triphosphate Acide adénylique Guanine Guanosine GMP GDP GTP Guanosine Guanosine Guanosine monophosphate ou diphosphate triphosphate Acide guanylique Uracile Uridine UMP UDP UTP Uridine Uridine Uridine Monophosphate ou diphosphate triphosphate Acide uridylique Cytosine Cytidine CMP CDP CTP Cytidine Cytidine Cytidine Monophosphate ou diphosphate triphosphate Acide cytidylique  C) NUCLEOTIDES Base Désoxyribo- Désoxyribo- Désoxyribo- Désoxyribo- nucléoside nucléoside nucléoside nucléoside mono-phosphate diphosphate triphosphate Adénine Désoxyadénosine dAMP dADP dATP Désoxy-adénosine Désoxyadénosine Désoxyadénosine monophosphate diphosphate triphosphate Guanine Désoxy-guanosine dGMP dGDP dGTP Désoxy-guanosine Désoxyguanosine Désoxy-guanosine monophosphate diphosphate triphosphate Thymine Thymidine TMP TDP TTP Thymidine Thymidine Thymidine monophosphate diphosphate triphosphate Cytosine Désoxycytidine dCMP dCDP dCTP Désoxycytidine Désoxycytidine Désoxycytidine monophosphate diphosphate triphosphate  D) LES POLYNUCLEOTIDES Les polynucléotides sont des molécules qui contiennent cinq résidus nucléotidiques ou plus. Ces nucléotides sont unis par un pont phosphodiester entre l'hydroxyle en position 3' du pentose et l'hydroxyle 5' de l'autre. Pour les polynucléotides irréguliers, la liaison entre les nucléotides se fait en 2' et 5'. Ces polynucléotides sont souvent artificiels et ont un poids moléculaire qui varie entre 30000 et 2000000.. D) LES POLYNUCLEOTIDES D) LES POLYNUCLEOTIDES  D) LES POLYNUCLEOTIDES NOMENCLATURE DES POLYNUCLEOTIDES La lecture se fait de l'extrémité 5' à l'extrémité 3'. On indique un radical phosphoryl par la lettre P. Un diphosphate par PP Un triphosphate par PPP. On indique ensuite la nature des nucléotides successifs dans l'ordre de la séquence de bases en utilisant une nomenclature résumée à une seule lettre par base (A, T, G, U ou C) avec le préfixe d pour les désoxyribonucléotides.  5'p-dG-pdC-pdT-pdA...3' pour un désoxyribonucléotide. 5'p-G-pA-pC-pU...3' pour un ribonucléotide. Cette nomenclature est utilisée également dans le cas des acides nucléiques mais souvent simplifiée en raison de la longueur de ces macromolécules en succession de bases sous forme de lettre 5'ATGCTCCAG......3'. L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Ce sont des polydésoxyribonucléotides unis les uns aux autres pour donner une chaîne de plusieurs dizaines de milliers d'unités. Les 4 principaux désoxyribonucléotides sont : - L'acide désoxyadénylique monophosphate (dAMP) - L'acide désoxyguanylique monophosphate (dGMP) - L'acide désoxycytidylique monophosphate (dCMP) - L'acide désoxythymidylique monophosphate (dTMP).. L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Les molécules d'ADN sont souvent à l'état de double brin. Les deux brins sont liés par des liaisons hydrogène échangées par les bases nucléiques situées au même niveau. Ces liaisons hydrogène s'établissent de façon spécifique par complémentarité entre les bases : – Adénine et thymine échangent deux liaisons hydrogène – Cytosine et guanine échangent trois liaisons hydrogène. On dit que ces bases sont appariées. On constate que la séquence d'un brin détermine obligatoirement la séquence de l'autre brin.. L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) D) LES POLYNUCLEOTIDES L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Rosalind Frankin Les données de diffraction de rayons X L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Double hélice de James Watson et Francis Crick L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) La structure de Watson et Crick : l’ADN-B Deux brins de polynucléotides tournant autour d’un même axe avec une torsion droite pour former une double hélice d’environ 20 Å de diamètre. Les deux brins sont antiparallèles et ne peuvent pas être séparés sans dérouler l’hélice. Les bases sont au centre et les sucres et phosphates sont en périphérie. Les plans des bases sont quasi perpendiculaires à l’axe de l’hélice. Chaque base est liée à une autre sur le brin opposé par ponts hydrogène. Ces interactions, appelées appariements de bases complémentaires, résultent dans l’association spécifique des deux chaînes 10 paires de bases (bp) par tour, 3.4 Å entre deux paires de bases (stacking), pitch de 34 Å Deux sillons de largeurs différentes (majeur et mineur).. -> structure 3D La publication de 1953 L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Forme B Forme A Forme Z L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Hélice Z : q L'axe de l'hélice n'est pas une droite mais il a une forme de ligne brisée. q Dans cette conformation, le grand sillon est transformé en une surface convexe et le petit sillon est une fente profonde. q Le pas d’hélice fait 4,56 nm par tour, le nombre de paires de bases par tour passe à 12 et le diamètre de l’hélice est de 1,84 nm. q Dans les conditions physiologiques, la majeure partie de l’ADN est de conformation B, des régions riches en paires GC peuvent adopter la conformation Z..  L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Propriété ADN-A ADN-B ADN-Z Sens de l’hélice droite droite Gauche Unité répétitive 1 pb 1 pb 2 pb Rotation par pb 32,7° 34,6° 30° Paires de bases par tour 11 10,4 12 Inclinaison de pb sur l’axe 19° 1,2° 9° Distance entre 2 bases en nm 0,23 0,33 0,38 Pas de l’hélice en nm 2,46 3,40 4,56 Diamètre de l’hélice en nm 2,55 2,37 1,84 L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Superhélice : q la molécule d'ADN est circulaire et la double hélice constitue un anneau complet. q Ces conformations sont souvent rencontrées chez les bactéries, dans les mitochondries, les chloroplastes et chez certains virus..  L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) La stabilité de l’ADN est assurée par : q Les interactions hydrophobes, q Les forces de Van der Waals qui sont faibles entre bases empilées, mais s’additionnent et au sein d’une molécule faite de 10000 pb. q Les liaisons hydrogène contribuent à l’appariement des bases. La paire de base GC est plus stable que la paire AT, car elle contient une liaison hydrogène supplémentaire.. q Les forces électrostatiques stabilisent aussi la molécule d’ADN. La répulsion électrostatique élevée des groupes phosphodiester négatifs à pH physiologique est neutralisée par les cations cellulaires (Mg2+) qui se fixent solidement sur le squelette phosphodiester et stabilisent la double hélice..  L’ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE (ADN) Propriétés 1- la taille : La taille varie en fonction de l’origine de l’ADN, exemple : 2- Spectre d'absorption : lmax = 260 nm. L'intensité d'absorption est plus élevée quand l'ADN est sous forme simple brin.. 3- Dénaturation : La séparation des deux brins se fait par rupture des liaisons hydrogène sous des contraintes physico-chimiques, pH, force ionique, chaleur ou réactifs comme l’urée et formamide. Le chauffage est la méthode de choix pour obtenir la séparation des deux brins (fusion).. Effet hyperchrome 40% La variation de dénaturation en fonction de la température est suivie par mesure d'absorption de la lumière à 260 nm (hyperchromie et hypochromie).. La température de fusion se produit dans un domaine de température étroit, elle dépend de la composition de l'ADN. Cette température est plus élevée quand le nombre de C et G est supérieur à celui de A et T puisque G et C échangent trois liaisons alors que A et T échangent seulement 1- 0,01 M PO4 + 0,001 M EDTA deux.. 2- 0,15 M NaCl + 0,015 M Na-citrate L’ADN peut supporter des températures très élevées (jusqu’à 107°C) à condition d’être protégé contre les cassures par de fortes concentrations de sel (comme le sel de magnésium), et d’être maintenu dans une configuration qui empêche la libre rotation des deux brins l’un autour de l’autre, cas d’un ADN Variation de Tm en fonction de la concentration en KCl en M : 1) 0,01 ; 2) circulaire.. 0,02, 3) 0,035; 4) 0,05; 5) 0,075; 6) 0,1; 7) 0,195 ; 8) 0,6 ; et 9) 1 M. 4- Renaturation : La renaturation de la double hélice peut se faire par abaissement lent et progressif de la température. Quand le refroidissement est rapide, la dénaturation est irréversible.. 5- Hydrolyse : Elle se fait par des acides minéraux à chaud : tous les constituants de l'ADN sont libérés : bases, désoxyribose et phosphate. Dans des conditions particulières, l'hydrolyse acide entraîne préférentiellement l'élimination des bases puriques alors que les désoxyribonucléotides à pyrimidine gardent leurs places initiales. Le produit ainsi obtenu porte le nom d'acide apurinique. L’hydrolyse alcaline n’a pas d’effet sur l’ADN, par contre, elle entraîne l’hydrolyse de la liaison phosphodiester de l’ARN. 6- Hybridation Une chaîne monocaténaire d'un ADN peut s'apparier avec une chaîne monocaténaire d'ARN ayant une séquence de bases strictement complémentaire de la séquence de base de l'ADN, on obtient ainsi une molécule hybride ADN-ARN.. STRUCTURE DES CHROMOSOMES STRUCTURE DES CHROMOSOMES NUCLEOSOMES NUCLEOSOMES NUCLEOSOMES NUCLEOSOMES  LES ACIDES RIBONUCLEIQUES (ARN) Les ARN ont une organisation analogue à celle de l'ADN, mais de petite taille. Il existe plusieurs types : différents par leur taille, leur rôle dans la cellule et leur localisation cellulaire. Ils sont impliqués dans la transmission de l'information entre l'ADN et les protéines à l'exception des ARN des rétrovirus. Les ARN sont des monocaténaires mais le même brin peut s'associer à lui même sur une certaine distance pour former des boucles par appariement des bases C-G et U-A : épingle à cheveux. Si l'épingle à cheveux est assez longue , elle adopte une configuration en hélice. Il existe plusieurs types d'ARN : ARN messager (ARNm); ARN de transfert (ARNt) et ARN ribosomal (ARNr) : LES ACIDES RIBONUCLEIQUES (ARN) LES ACIDES RIBONUCLEIQUES (ARN) LES ACIDES RIBONUCLEIQUES (ARN) LES ACIDES RIBONUCLEIQUES (ARN) Propriétés Leurs poids moléculaires sont compris entre 25000 et plusieurs millions. Ils sont peu solubles dans l'eau, très solubles dans une solution de NaCl 10 mM mais insolubles dans des solvants organiques. Sous forme de ribonucléate d'ammonium quaternaire, ils sont solubles dans les solvants organiques. lmax d'absorption est 260 nm. Cette absorption augmente après une dégradation partielle ou complète de l'ARN c'est l'effet hyperchrome. Inversement, la formation d'un copolymère bicaténaire artificiel à partir de deux chaînes polynucléotidiques entraîne une diminution d'environ 34% de la densité optique à 260 nm de la solution initiale avant l'appariement de ces deux chaînes. L’ARN est un polymère beaucoup plus fragile que l’ADN, en raison d’un atome d’oxygène qui n’est présent que dans l’ARN (Hydroxyle 2’), et dont la forte réactivité peut provoquer la cassure de la molécule d’ARN. A l’inverse de l’ADN, l’addition des concentrations du sel de magnésium accélèrent l’apparition de cassures dans l’ARN. La vitesse de dégradation de l’ARN augmente d’un facteur de 3, chaque fois que la température croît de 10°C. Le groupe hydroxyle en 2’ empêche la molécule d’ARN d’adopter la conformation B, lui confère une plus grande liberté d’interactions spatiales et lui permet de catalyser des réactions chimiques. En solution alcaline 0,1 M à 25°C, l’ARN est dégradé, après quelques heures, en nucléosides 2’- et 3’-monophosphates. LES ACIDES NUCLEIQUES LES ACIDES NUCLEIQUES  LES ACIDES NUCLEIQUES PURIFICATION DES ACIDES NUCLEIQUES § Extraction des acides nucléiques Cellules ou tissu broyé Cellules et débris Surnageant Acides nucléiques et protéines solubles Attaque par une Attaque par une désoxyribonucléase ribonucléase Extraction phénolique ADN dans la douce Élémination phase aqueuse des protéines Culot ARNt, ARNm, (Ribosomes) Protéines solubles  Nucléoprotéines Hydrolyse alcaline NaOH 40% à température entre 0° et +3°C pendant 90 mn ou Phénol et/ou SDS Sel de sodium des acides nucléiques solubles et protéines insolubles Neutralisation par l'acide acétique à froid Culot à éliminer Surnageant Acidification 3