T.3 Cultivos Primarios y Líneas Celulares - Biología

**T.3 CULTIVOS PRIMARIOS Y LINEAS CELULARES** **BIOLOGÍA DE CÉLULAS ASOCIADAS** **Criterios de selección de células en un cultivo convencional** - Sólo formarán parte del cultivo aquellas células capaces de superar el proceso de disgregación, adhesión al sustrato y proliferación - Aument...

**T.3 CULTIVOS PRIMARIOS Y LINEAS CELULARES** **BIOLOGÍA DE CÉLULAS ASOCIADAS** **Criterios de selección de células en un cultivo convencional** - Sólo formarán parte del cultivo aquellas células capaces de superar el proceso de disgregación, adhesión al sustrato y proliferación - Aumentan en número aquellas células que tienen una mayor tasa de crecimiento (ciclo celular acelerado) - Presión selectiva a la que estén sometidas - Si se alcanza la confluencia 100%: - Las células detienen su crecimiento (inhibición por contacto) - Tipos celulares neoplásicos (sin inhibición) - Justo antes de alcanzar la confluencia, muchas líneas celulares expresan sus aspectos más característicos - Morfología y fisiología más parecidas a su estado original - Se detiene el crecimiento - Necesario replaquear, subcultivar, pasar o expandir las células - A partir del 3er replaqueo después del establecimiento de un cultivo primario, se suele homogeneizar - Establecer condiciones selectivas (medios, factores de crecimiento, sustratos específicos, etc) para evitar que las células más especializadas del cultivo se vean desplazadas por los fibroblastos o por otras células de rápido crecimiento **División y senescencia de células del cultivo** Límite de Hayflick - Número de duplicaciones que puede sufrir una célula eucariota antes de entrar en senescencia - 30-100 generaciones - Relacionado con el acortamiento de los telómeros con cada nueva división celular hasta que se acortan a una longitud crítica - Ocasionalmente puede mantenerse un cultivo durante más generaciones de las esperadas por la aparición de células inmortales - Tasa de multiplicación de líneas celulares primarias: depende del tipo celular y condiciones del cultivo - Por ejemplo: - Hepatocitos adultos: sólo se mantienen como cultivo primario (no se dividen) - Células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC): permanecen en cultivo de 3 a 9 pases - Fibroblastos dérmicos humanos: pueden superar los 20 pases - Finalmente, las células entran en una fase de senescencia: - Se acumulan numerosas anormalidades - Se pierden funciones especializadas - Muerte del cultivo - Telómero: extremo del cromosoma - Secuencia de ADN repetida que se replica de un modo diferente - Neutralizan la predisposición de acortamiento de los cromosomas en cada secuencia de replicación - Los telómeros protegen el extremo de nuestros cromosomas del deterioro por divisiones sucesivas/envejecimiento - Los telómeros se acortan un poquito cada vez que el cromosoma se replica. - El acortamiento se produce durante la replicación del ADN, debido a que el molde de la hebra retardada (3´-5´) se copia de forma discontinua (fragmentos de Okazaki) y el extremo no puede ser replicado en su totalidad. Esto daría como consecuencia un acortamiento progresivo de las hebras de los cromosomas cada ciclo de replicación. - Cuando el acortamiento de los telómeros sobrepasa un límite, las células entran en senescencia, es decir envejecimiento, con lo que no podrán dividirse más. **CULTIVOS 1^arios^: CONCEPTO Y TIPO. ETAPAS ESTABLECIMIENTO DE CULTIVO 1º** **Ventajas de los cultivos primarios:** - Células diferenciadas con gran semejanza biológica con el tejido originario - Se utilizan como modelos más fieles de las condiciones in vivo **Limitaciones de los cultivos primarios:** - Cultivos de corta viabilidad - Dificultad para crioconservarlos - Necesario utilizar un donante nuevo (animal o paciente) cada vez que se requiere la generación del cultivo: gran variabilidad entre unos cultivos primarios y otros - Distinta morfología celular - Producción de factores autocrinos y paracrinos celulares - Asociaciones entre células y sustrato - Valorar los resultados obtenidos entre distintos lotes de cultivos primarios **Principales pasos para asilamiento de células a partir de un tejido primario**  1. Extracción y transporte del tejido: por personal cualificado, en condiciones isoosmóticas, refrigerado 2. Disgregación: el tejido se somete a distintas fases de lavado, disección y disociación celular 3. Aislamiento de tipos celulares: hacer uniforme un cultivo primario heterogéneo - Separación y selección de células: gradientes de densidad, citometría - Condiciones selectivas: medios de cultivo suplementados con factores específicos de crecimiento, diferenciación o quimiotácticos - Para células adherentes: favorecer adhesión selectiva, proliferación de determinados tipos celulares - Superficies tratadas con proteínas de la matriz extracelular: laminina, gelatina, vitronectina, colágeno, fibronectina **Aislamiento tipo celular** - Eliminar las células muertas durante el proceso de establecimiento: pueden afectar negativamente a la viabilidad del cultivo - Enriquecimiento del cultivo primario con las células con mayor capacidad de división (precaución con los fibroblastos) - Una vez seleccionado el tipo celular mayoritario en el cultivo, mantener su viabilidad in vitro (elevados requerimientos nutricionales, suero, etc) durante un periodo limitado: varía según el tipo celular y las condiciones de cultivo (suele ser de unos días hasta 2 semanas aprox) - Las células primarias apenas se dividen y mantienen muchas de las características distintivas del tejido originario (células maduras diferenciadas). - Ejemplos de cultivos primarios: fibroblastos de embriones de pollo y de ratón, hepatocitos murinos, adipocitos murinos y humanos, cardiomiocitos murinos y humanos, neuronas de sistema nervioso central y de retina, linfocitos y monocitos de sangre periférica, células endoteliales, células musculares y células madre del cordón umbilical humano **CONCEPTO DE LÍNEA CEL. TRANSFORMACIÓN CEL. CARACTERIZACIÓN LÍNEAS CEL** - Hayflick y Moorhead 1960s: las células podían crecer mediante subcultivos durante ∼ 50 generaciones → células entran en senescencia, pierden la capacidad de dividirse y mueren - Las células primarias en cultivo tienen una capacidad finita de divisiones mitóticas (límite de Hayflick) - Número fijo de divisiones incluso si las células se criopreservan durante largo tiempo - 30 y 100 generaciones, dependiendo del origen de las células, antes de alcanzar la senescencia - Células derivadas de tejidos embrionarios tienen \> límite de crecimiento que las obtenidas de tejidos adultos - La senescencia está condicionada por los reguladores del ciclo celular (Rb, p53) y la influencia del acortamiento de los telómeros - Este tipo de cultivos celulares se denomina línea celular primaria o finita **Línea celular primaria** **Características** - Número diploide de cromosomas - Suelen depender del anclaje a un sustrato para su crecimiento: proliferación hasta confluencia en monocapa que ocupa todo el sustrato (inhibición por contacto) - Las células linfoides y hematopoyéticas crecen en suspensión hasta una densidad determinada - Vida finita (límite de Hayflick) - No son tumorales. **Obtención** - Superación de las fuerzas de la selección sobre un tipo celular determinado: - Supera los procesos de disgregación enzimática y/o mecánica - Capacidad de crecer adherido a un sustrato o de crecer en suspensión en un medio de cultivo - Responde a factores estimulantes o inhibitorios del crecimiento añadidos al medio - Elevada tasa de crecimiento **Diferenciación del cultivo** - Adición de estímulos, factores solubles celulares o medios condicionados para que las células de una línea finita puedan diferenciarse y adquirir características morfológicas y funcionales parecidas a las células de origen, especialmente cuando llegan a la fase estacionaria o de confluencia - Equilibrio entre diferenciación y proliferación (células madre-desdiferenciadas y células diferenciadas) **Línea celular continua o estable** **Obtención** - Evitan espontáneamente la fase de senescencia: superan el límite de Hayflick - Crecen indefinidamente: cultivos inmortalizados - Alteración genética de los factores controladores del ciclo celular - Obtención mediante generación de cambios genotípicos o transformación celular por: - Tumoración in vivo - Mutaciones por causas fisico-químicas: - Exposición a radiaciones ionizantes - Carcinógenos químicos - Mutagénesis dirigida: - Infección vírica - Transfección de ADN - Pej células de roedores, células tumorales, células madre - Capacidad de un cultivo celular para establecerse como línea estable o inmortal: relacionada directamente con su variabilidad genética - Las líneas celulares que nunca se vuelven inmortales se mantienen euploides (fibroblastos humanos, fibroblastos de pollo, glía humana) - Las líneas que se convierten en aneuploides son las que suelen transformarse en líneas celulares estables, como es el caso de las células epidérmicas - Una línea celular será tanto más fácil de establecer o cultivar cuanto más indiferenciada - Excepción: líneas tumorales de células diferenciadas **Características** - Inmortales: crecen indefinidamente. - Malignas: - Invaden tejidos (capacidad metastásica) y dan lugar al crecimiento de tumores. - Genéticamente inestables: - Desregulación de la mitosis: generación de aneuploidía y aberraciones cromosómicas - Las líneas continuas son más estables en los primeros pases - Crecimiento aberrante: - Pierden la inhibición por contacto - Pierden la dependencia del anclaje (pueden crecer en medios semisólidos) **Ventajas** - Alta tasa de división: se consiguen grandes cantidades de células en cultivo en poco tiempo (se reducen los costes) - Menos exigencias nutritivas o de medios de cultivo: muchas pueden crecer sin suero, lo que reduce la variabilidad del medio y los costes - Soportan bien el almacenamiento por crioconservación: se facilita el establecimiento de nuevos cultivos en el futuro **Células madre** - Células madre en subcultivo: caso especial de línea celular continua - No requiere transformación celular para mantenerse en divisiones aparentemente infinitas - Requieren medios de cultivo muy complejos - Elevada sensibilidad a los procesos de mantenimiento y conservación - La mayor parte de los cultivos de líneas continuas mantienen un nicho de células madre que repuebla las células diferenciadas **Caracterización líneas celulares** - Autentificación: confirmación genotípica y/o fenotípica. - Pureza: ausencia de contaminantes biológicos (m.o. y cont. cruzada). - Estabilidad y funcionalidad: capaz de responder adecuadamente en el tiempo de uso. 1. 2. 3. 4. - 5. - - -