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## Enzimas ### Universidad de Oriente - Núcleo de Anzoátegui - Departamento de Básico Ciencias - Laboratorio de Biología II (003-1721) ### Complemento de las Guías de Prácticas #### 4) Enzimas - Diseñar una curva de calibración para pruebas colorimétricas, basada en la reacción del lugol con...

## Enzimas ### Universidad de Oriente - Núcleo de Anzoátegui - Departamento de Básico Ciencias - Laboratorio de Biología II (003-1721) ### Complemento de las Guías de Prácticas #### 4) Enzimas - Diseñar una curva de calibración para pruebas colorimétricas, basada en la reacción del lugol con el almidón. - Medir la cantidad de almidón presente en una solución dada utilizando la curva de calibración. - Establecer el efecto del tiempo de incubación de la enzima amilasa salival sobre la formación del producto en la reacción de desdoblamiento del almidón. - Establecer el efecto de la concentración de la enzima amilasa salival sobre la velocidad de reacción en el desdoblamiento del almidón. - Establecer el efecto de la concentración del sustrato sobre la acción de la enzima amilasa salival. - Representar gráficamente los efectos del tiempo de incubación, concentración de la enzima y concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción enzimática. - Discutir los resultados experimentales obtenidos con base al mecanismo de acción enzimática y formular conclusiones. #### 5) Estudio del efecto de las variaciones de pH y la temperatura sobre la actividad enzimática - Establecer el efecto del pH sobre la actividad de la enzima amilasa salival. - Determinar el pH óptimo de acción de una enzima. - Establecer el efecto de la temperatura sobre actividad de la enzima amilasa salival. - Establecer el efecto de la temperatura y el pH sobre la acción de una enzima. - Representar gráficamente los efectos de la temperatura y el pH sobre la velocidad de reacción enzimática. - Discutir los resultados experimentales obtenidos con base al mecanismo de acción enzimática y formular conclusiones. ### Enzimas Recuerde que las macromoléculas se pueden dividir en cuatro categorías principales: carbohidratos, proteínas, ácidos nucleicos, y lípidos. Los primeros tres polímeros, compuestos por un gran número de elementos de bajo peso molecular o monómeros. Estas macromoléculas se construyen a partir de monómeros mediante un proceso de polimerización. - Monómero monosacárido (Glucosa) - Monómero aminoácido - Monómero nucleótidos <start_of_image> diagrams: - Carbohidrato: Almidón - Proteína: Hemoglobina - Lípido: Ácido graso - Ácido nucleico: ADN ### Enzimas Las proteínas representan más del 50% de la masa seca de la mayoría de las células e intervienen en casi todo lo que los organismos efectúan. Algunas proteínas aceleran reacciones químicas, mientras que otras desempeñan un papel en el sostén estructural, el almacenamiento, el transporte, las comunicaciones celulares, el movimiento y la defensa contra sustancias extrañas, entre otras funciones. <start_of_image> diagrams: - Motora - Estructural - Receptoras - Señalización - Funciones de las Proteínas - Transporte - Almacenamiento - Reguladoras - Enzimas ### Enzimas Las enzimas son probablemente el tipo de proteínas más importante, porque regulan el metabolismo al actuar como catalizadores, agentes químicos que aceleran en forma selectiva las reacciones químicas en la célula sin ser consumidas por la reacción. Debido a que una enzima puede realizar su función una y otra vez, estas moléculas pueden considerarse como caballos de trabajo que mantienen a las células en funcionamiento llevando a cabo los procesos de la vida. diagrams: - Encima (sacarasa) - Sustrato (sacarosa) - Complejo Enzima-sustrato (ES) - Complejo Enzima-producto (EP) - Producto ### Enzimas La vida aprovecha hábilmente el hecho de que la mayoría de las reacciones deban ser catalizadas. diagrams: - Enzima Sustrato: E+S - Complejo Enzima-Sustrato: ES - Complejo Enzima-Producto: EP - Producto: E+P - Gráfico de la variación de la concentración de sustrato y producto con el tiempo - La velocidad de una reacción se puede expresar como moles de sustrato consumido, o como moles de producto formado por unidad de tiempo: $V = \Delta[S]/\Delta T = \Delta[P]/\Delta T$ - La formación del producto o desaparición del complejo de partida puede monitorizarse espectrofotométricamente midiendo cambios en la absorción óptica de la solución que contiene los sustratos y la enzima. ### Enzimas Existen dos métodos generales mediante los cuales puede acelerarse la velocidad de una reacción química. Uno de ellos es la elevación de la temperatura (ya que provoca un incremento en la velocidad de las moléculas); el otro consiste en utilizar un catalizador. El catalizador se combina con los reactantes de modo transitorio activándolos, produciendo un estado de transición de menor energía que en la reacción no catalizada. Una vez formados los productos el catalizador queda libre, y puede ser de nuevo utilizado. Las enzimas disminuyen la energía de activación, de tal forma que aumentan la velocidad de la reacción catalizada, sin afectar a las funciones termodinámicas ni a las constantes de equilibrio. diagrams: - Gráfico de energía libre vs progreso de la reacción con y sin enzima - Efecto de las enzimas en la velocidad de reacción. Sin afectar la variación de energía libre (ΔG) de una reacción, una enzima la acelera al reducir su energía de activación (EA). ### Enzimas El universo equivale a el sistema más el entorno. La energía libre de Gibbs (G) de un sistema (sin considerar el entorno), mide la porción de energía de un sistema que puede realizar trabajo cuando la temperatura y la presión son uniformes en todo el sistema, como ocurre en una célula viva. La variación de energía libre, ΔG, puede calcularse para cualquier reacción química específica con está fórmula: $ΔG = ΔH-TΔS$ Donde: - ΔH = simboliza la variación en la entalpía del sistema (en los sistemas biológicos, es el equivalente a la energía total), - ΔS = es la variación en la entropía del sistema, - T = es la temperatura absoluta en unidades Kelvin (K) (K = °C + 273) El valor de ΔG de un proceso, permite predecir si éste será espontáneo (es decir, si procederá sin una entrada de energía externa). Los procesos con una ΔG negativa son espontáneos. Por lo tanto, para que un proceso ocurra de forma espontánea, el sistema debe o bien entregar entalpía (H debe disminuir), ceder orden (TS debe aumentar), o ambos. Cuando los cambios en H y TS se computan, G debe tener valor negativo (ΔG < 0). Esto implica que cada proceso espontáneo disminuye la energía libre del sistema. Los procesos que tienen una ΔG positiva o igual a cero, nunca son espontáneos. ### Enzimas Una enzima cataliza una reacción disminuyendo la barrera de energía de activación (Eд), lo que permite que las moléculas de reactivo absorban suficiente energía para alcanzar el estado de transición aún a temperaturas moderadas. Una enzima no puede cambiar la energía libre (ΔG) de una reacción, no puede transformar una reacción endergónica en exergónica. Las enzimas sólo pueden acelerar las reacciones que de cualquier modo ocurrirían finalmente, pero esta posibilita que la célula tenga un metabolismo dinámico para dirigir el tráfico químico de la célula de forma ligera a través de ella. Dado que las enzimas son muy selectivas en las reacciones que catalizan, determinan qué procesos químicos ocurrirán en la célula, en cualquier momento en particular. diagrams: - Gráfico de energía libre vs progreso de la reacción con y sin enzima - Efecto de las enzimas en la velocidad de reacción. Sin afectar la variación de energía libre (ΔG) de una reacción, una enzima la acelera al reducir su energía de activación (EA). ### Enzimas Recuerde que, una reacción exergónica ocurre cuando hay una liberación neta de energía libre. Dado que la mezcla química pierde energía libre (Gdisminuye), la ΔG es negativa para una reacción exergónica (es decir, ocurre de modo espontáneo). Sin embargo, espontáneo no implica que una reacción ocurrirá de forma instantánea o con rapidez. La magnitud de la ΔG para una reacción exergónica representa la cantidad máxima de trabajo que la reacción puede realizar. Cuanto mayor es la disminución de energía libre, mayor será la cantidad de trabajo que puede llevarse a cabo. diagrams: - Gráfico de energía libre vs progreso de la reacción con y sin enzima - Efecto de las enzimas en la velocidad de reacción. Sin afectar la variación de energía libre (ΔG) de una reacción, una enzima la acelera al reducir su energía de activación (EA). ### Enzimas En síntesis, las enzimas son proteínas que se comportan como catalizadores, es decir, aceleran la velocidad con la que las reacciones se llevan a cabo sin alterar el equilibrio y son responsables de las transformaciones metabólicas en los seres vivos. Debido a las características estructurales propias de la enzima, solamente sustratos muy específicos pueden unirse a la enzima. diagrams: - Enzima - Sustrato - Complejo Enzima-sustrato ### Enzimas Los organismos vivos contienen un número incontable de enzimas, que gobiernan casi todos los procesos metabólicos. Una característica común de las enzimas es que su alto poder catalítico se debe en parte a su alta especificidad por los sustratos, la cuál puede ser absoluta para un único sustrato o relativa, cuando permite la reacción de compuestos diferentes pero con una estructura similar. diagrams: - Enzima - Sustrato - Complejo Enzima-sustrato ### Enzimas Las enzimas son altamente específicas diagrams: - Enzima (sacarasa) - Sustrato (sacarosa) - Complejo Enzima-sustrato (ES) - Complejo Enzima-producto (EP) - Producto ### Enzimas Además de la especificidad y la alta eficiencia, otras dos características que diferencian a las enzimas de los catalizadores químicos, son que las enzimas pueden saturarse por sustrato y tienen capacidad para regular su actividad. En este sentido, los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos. No obstante, éstas muestran (además del fenómeno de la especificidad) un rasgo característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la saturación por el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros activos de todas las moléculas de enzima. diagrams: - Gráfico de la Velocidad de la reacción vs Concentración de sustrato ### Enzimas La cinética enzimática es el estudio de la tasa o velocidad de cambio de reactantes a productos bajo diferentes condiciones experimentales. La velocidad de una reacción se define como el número de moléculas de sustrato que se convierten en producto por unidad de tiempo en condiciones experimentales constantes. La actividad de una enzima y su cinética pueden ser afectadas por diversos factores como la temperatura, pH y la concentración del sustrato. diagrams: - Gráfico de la variación de la concentración de sustrato y producto con el tiempo - Gráfico de Velocidad vs Concentración de sustrato - La actividad de una enzima se grafica ubicando en el eje de las ordenadas (y) la concentración (molar) del sustrato y en eje de las abscisas (x) el producto obtenido por unidad de tiempo (velocidad de la reacción). De acuerdo a la cinética, las enzimas pueden dividirse en dos grandes grupos: - Enzimas no alostéricas - Enzimas alostéricas - **Cinética enzimática de Michaelis-Menten** ### Enzimas Cinética enzimática de Michaelis-Menten. La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten, se trata de una hipérbola rectangular cuya asíntota es Vmax, como la curva representada en la figura de abajo. Esta relación nos da la velocidad inicial obtenida para cualquier concentración del sustrato [s] siempre que conozcamos las dos constantes Km y Vmax. diagrams: - Gráfico de Velocidad vs Concentración de sustrato - Ecuación: V= Vmax [S]/(Km + [S]) - La velocidad tiende a una asíntota Vmax - La Km es aquella concentración de sustrato para la que V = V máx/2 - Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción ### Enzimas Cinética enzimática de Michaelis-Menten - La Km es la constante de equilibrio de la disociación del complejo ES: $Km = \frac{[E][S]}{[ES]}$ - La Vmax representa la velocidad que se consigue cuando la concentración de sustrato tiende a infinito, es decir, es la asíntota superior de la ecuación de Michaelis-Menten; o bien, la velocidad conseguida cuando toda la enzima presente está en forma de complejo enzima-sustrato. Esta constante tiene dimensiones de velocidad, y por tanto, en cinética enzimática se expresa en Ul o en kat. - Un Km alto significa que la afinidad de la enzima por el sustrato es baja, mientras que un Km bajo supone una alta afinidad de la enzima por el sustrato. La Km es independiente de la concentración de enzima. - En la grafica se puede deducirse fácilmente que cuando la concentración de substrato es igual a su Km, la velocidad de la reacción será igual a Vmax/2. Otra forma, de definir la Km es aquella concentración de substrato para la cual la velocidad es igual a la mitad de la máxima. ### Enzimas Cinética enzimática de Michaelis-Menten - Entonces, la unidad de actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg) o por mililitro de disolución (U/ml). Sin embargo, el Sistema Internacional de unidades (SI) definió la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat), dado que son 106 µmoles en 60 segundos, 1 katal equivale a 60 x 106 U. Debido a que es una unidad muy grande, se utilizan frecuentemente sus submúltiplos, el microkatal (ukat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat). diagrams: - Gráfico de Velocidad vs Concentración de sustrato - Gráfico de la variación de la concentración de sustrato y producto con el tiempo ### Enzimas - La actividad enzimática está determinada entre otros factores, por la adaptación de la estructura de la enzima (estructura nativa), que permite en forma extremadamente selectiva la unión al sustrato. Una vez que el sustrato se una al sitio activo, la enzima esta lista para convertir el sustrato en el producto adecuado. $E + S \rightleftharpoons ES \rightarrow E + P$ - La actividad de la enzima puede ser afectada por factores experimentales tales como: la concentración de enzima y de sustrato, el pH de la solución de reacción y la temperatura. Los factores ambientales pueden afectar la actividad de la enzima, puesto que los aminoácidos que conforman la molécula se afectan con estos factores, la actividad enzimática también es afectada (recuerde el efecto de estos factores en la estructura de una proteína). Además de los factores mencionados anteriormente, las enzimas pueden alterar su actividad con la presencia de cofactores o grupos prostéticos, inhibidores o efectores alostéricos. diagrams: - Enzima - Sustrato - Complejo Enzima-sustrato - Gráfico de Velocidad vs Concentración de sustrato ### Enzimas - Las enzimas no alostéricas están formadas por unas sola subunidad o cadena polipeptídica. - Las enzimas alostéricas están son proteínas poliméricas, es decir, está formada por dos o más cadenas o subunidades polipeptídicas. Se caracterizan porque cada subunidad tiene dos sitios topológicamente y funcionalmente distintos: el sitio activo y el sitio alostérico (alos = otro y steric = espacio), que corresponde al sitio regulador. - Estas enzimas se denominan heterótropas debido a que el sitio activo y el regulador son diferentes, en las enzimas homótropas el sitio activo es a su vez el sitio regulador, por lo que el sustrato es simultáneamente el sitio regulador (enzimas no alostéricas). - El sitio alostérico carece de actividad catalítica, pero se une a una molécula efectora o moduladora que puede inhibir (modulador o efector negativo o inhibidor) o estimular (modulador o efector positivo activador) la actividad enzimática, mediante modificaciones en la conformación del sitio activo haciéndolo menos o más afín al sustrato. diagrams: - Diagrama de una enzima alostérica mostrando el sitio activo y el sitio alostérico ### Enzimas - La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína, mientras que otras necesitan, además, uno o más componentes no proteicos, llamados cofactores. El cofactor puede ser un ión metálico o bien una molécula orgánica, llamada coenzima, aunque algunas enzimas necesitan de ambos. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente a la enzima se llaman grupos prostéticos. - La forma catalíticamente activa de la enzima se llama holoenzima y esta constituida por la enzima unida a su grupo prostético (apoenzima + grupo prostético = holoenzima). La parte proteica de una holoenzima se llama apoenzima, que por sí misma es inactiva catalíticamente. diagrams: - Diagrama que muestra los componentes de una holoenzima (apoenzima, cofactor, grupo prostético) ### Enzimas - Muchas enzimas han sido designadas añadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, la molécula sobre la cuál ejerce su actividad catalítica. Por ejemplo la sacarasa cataliza la hidrólisis de la sacarosa, y la arginasa cataliza la hidrólisis de la arginina. - Otras enzimas han recibido su nombre en función del tipo de reacción que catalizan; así la Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa cataliza la deshidrogenación (oxidación) del Gliceraldehído-3-fosfato a 3-fosfoglicerato. Incluso algunas se conocen desde hace mucho tiempo y mantienen su nombre, sin dar información alguna del sustrato o la reacción que catalizan (tripsina). - No obstante, existe una **clasificación sistemática de las enzimas** que las divide en 6 grandes grupos, cada uno de los cuales se divide a su vez en subclases: - Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reducción) - Transferasas (transfieren grupos funcionales) - Hidrolasas (reacciones de hidrólisis), - Liasas (reacciones de adición a los dobles enlaces) - Isomerasas (reacciones de isomerización) - Ligasas (formación de enlaces con consumo de ATP). ### Enzimas - En el complejo medio de la célula, hay innumerables reacciones posibles entre las moléculas. La célula se aprovecha de la catálisis específica para catalizar las sustancias hacia rutas que sean útiles en vez de hacia reacciones colaterales despilfarradoras. diagrams: - Ciclo de Krebs con las enzimas que participan ### Enzimas - Recuerde que el espectrofotómetro permite determinar la concentración de una sustancia en una solución. diagrams: - Esquema de un espectrofotómetro - La palabra espectrofotómetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa imagen, y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotómetro es uno de los principales instrumentos diagnósticos y de investigación utilizados por el ser humano. Utiliza las propiedades de la luz y su interacción con las sustancias, para determinar la naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de características especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende de factores como la concentración de la sustancia. diagrams: - Esquema de un espectrofotómetro ### Enzimas - El espectrofotómetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentración de una sustancia en una solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos. La espectrofotometría de luz visible y luz ultravioleta se fundamenta en Ley de Lambert-Beer, según la cual la capacidad de una sustancia de absorber la luz a una determinada longitud de onda es directamente proporcional a la concentración de la sustancia. diagrams: - Esquema de un espectrofotómetro - Gráfico de Absorbancia vs Transmitancia ### Enzimas - Una curva de calibración es la representación gráfica de la relación entre la absorbancia y la concentración de una sustancia cualquiera. La calibración incluye la selección de un modelo para estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva. Las curvas de calibración se construye graficando diferentes concentraciones de la sustancia patrón versus la absorbancia de cada una de ellas. - La calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que consiste en encontrar la recta de calibrado que muestre el mejor ajuste a una serie de "n" puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable "x" (variable independiente, generalmente concentración de la sustancia de interés) y una variable "y" (variable dependiente, generalmente respuesta instrumental). La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (a) y una pendiente (b), mediante la ecuación y = a + bx. diagrams: - Gráfico de Absorbancia vs Concentración ### Enzimas diagrams: - Gráfico de Absorbancia vs Concentración ### Enzimas - Por otra parte, el almidón es una mezcla de dos polisacáridos, amilosa (10-20%) y amilopectina (80-90%), ambos formados por unidades de glucosa. La amilosa posee una estructura lineal, mientras que la amilopectina es ramificada. El almidón está presente en el trigo, la papa, la yuca, el arroz, el maíz, etc., constituyendo la reserva de energía de la mayoría de vegetales, y es la principal fuente de energía de los alimentos que consumimos. Para que el cuerpo humano pueda aprovechar la glucosa del almidón es preciso degradarlo previamente. La saliva humana contiene entre 0 y 3 mg/ml de la enzima llamada amilasa, capaz de romper los enlaces que unen las moléculas de maltosa en el almidón. diagrams: - Estructura de la molécula de almidón - Estructura de la molécula de maltosa ### Enzimas - La saliva, principalmente aquella producida por la parótida, contiene una enzima, la alfa amilasa salival (a-amilasa salival), llamada también ptialina. Esta es capaz de actuar sobre los almidones y sobre el glucógeno, rompiendo los enlaces a (1-4) de tal forma que se separan de dos en dos los fragmentos de la molécula polimérica. Las moléculas que resultan entonces, son del disacárido maltosa. diagrams: - Diagrama de la glándula salival - Estructura de la amilosa - Estructura de la amilopectina - Estructura de la maltosa - Estructura de un enlace glicosídico ### Enzimas - Recuerde la identificación de polisacárido mediante la prueba de yodo diagrams: - Esquema de la reacción del Lugol con el almidón - Estructura de la molécula de amilosa ### Enzimas - Entonces, la enzima a-amilasa salival actúa sobre el almidón, al hidrolizar (romper con ayuda de un medio acuoso) los enlaces a (14) glicosídicos de este polisacárido cuya estructura se basa en cadenas de a-D-glucosa, de tal forma que se separan de dos en dos los fragmentos de la molécula polimérica. Las moléculas resultantes son del disacárido maltosa. diagrams: - Esquema de la reacción de la amilasa salival con el almidón - Diagrama de la glándula salival - Estructura de la amilosa - Estructura de la amilopectina - Estructura de la maltosa - Estructura de un enlace glicosídico ### Enzimas - 1) Diseño de la curva de calibración diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para la curva de calibración - Gráfico de la curva de calibración - Esquema de un espectrofotómetro ### Enzimas - 2) Efecto del tiempo de incubación de la enzima Amilasa sobre la formación del producto. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento del tiempo de incubación - Gráfico de la Absorbancia (DO) vs Tiempo de incubación ### Enzimas - En cualquier reacción catalizada, el sustrato debe unirse primero con la enzima para formar el complejo enzima-sustrato. Para una concentración de sustrato particular, un aumento en la concentración enzimática aumenta la velocidad de la reacción catalizada. A concentraciones enzimáticas más altas, más moléculas están disponibles para unirse al sustrato y catalizar la reacción. Mientras la concentración de sustrato sea mayor que la concentración de la enzima, hay una relación directa entre la concentración de la enzima y la actividad enzimática. Cuando la concentración de enzima se mantiene constante, la adición de más sustrato aumentará la velocidad de la reacción. Si la concentración del sustrato es alta, puede saturar todas las moléculas de enzima. Entonces la velocidad de la reacción alcanza su máximo y la adición de más sustrato no aumenta más la velocidad de la reacción. diagrams: - Gráfico de Velocidad de la reacción vs Concentración de enzima - Gráfico de Velocidad de la reacción vs Concentración de sustrato ### Enzimas - 3) Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento de la concentración de la enzima - Gráfico de Absorbancia (DO) vs Concentración de la enzima - Esquema de un espectrofotómetro ### Enzimas - Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento de la concentración de la enzima - Gráfico de Absorbancia (DO) vs Concentración de la enzima - Esquema de un espectrofotómetro ### Enzimas - 4) Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento de la concentración del sustrato - Gráfico de Absorbancia (DO) vs Concentración del sustrato - Esquema de un espectrofotómetro ### Enzimas - Efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento de la concentración del sustrato - Gráfico de Absorbancia (DO) vs Concentración del sustrato ### Enzimas - Universidad de Oriente - Núcleo de Anzoátegui - Departamento de Básico Ciencias - Laboratorio de Biología II (003-1721) ### Estudio del efecto de las variaciones de pH y la temperatura sobre la actividad enzimática ### Enzimas - Recuerde que la cinética enzimática es el estudio de la tasa o velocidad de cambio de reactantes a productos bajo diferentes condiciones experimentales. Además, en la cinética enzimática de Michaelis-Menten, la curva expresa la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad inicial tiene la misma forma para la mayoría de las enzimas; se trata de una hipérbola rectangular cuya asíntota es Vmax. Esta relación nos da la velocidad inicial obtenida para cualquier concentración del sustrato [S] siempre que conozcamos las dos constantes Km y Vmax. diagrams: - Gráfico de Velocidad vs Concentración de sustrato ### Enzimas - La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando la velocidad de la reacción se hace independiente de la concentración de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad alcanza un valor máximo. Este valor depende de la cantidad de enzima disponible. - La constante de Michaelis (Km) indica la concentración de sustrato a la cuál la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km también indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato. diagrams: - Gráfico de Velocidad vs Concentración de sustrato ### Enzimas - Efecto de las variaciones de pH y la temperatura sobre la actividad enzimatica - Las conformaciones de las proteínas globulares son extremadamente sensibles a cambios en su entorno. La desorganización de la conformación nativa, o biológicamente activa, de una proteína, que tiene lugar cuando se cambia el entorno, se denomina desnaturalización. Se pueden emplear diversos métodos para desnaturalizar una proteína, como por ejemplo: - Los aumentos y las disminuciones del pH cambian el estado de ionización de las cadenas laterales de las proteínas, rompen los pares iónicos y los enlaces de hidrógeno y, consecuentemente, desnaturalizan las proteínas. - El calentamiento de una disolución de proteína aumenta las energías vibracional y rotacional de las moléculas de proteína disueltas. Estos incrementos térmicos de la motilidad van a romper el delicado equilibrio entre las débiles interacciones que estabilizan la conformación plegada. diagrams: - Esquema de una proteína normal y una proteína desnaturalizada ### Enzimas - Recuerde que el almidón es un polisacárido y la amilasa salival una enzima que se encuentra en las glándulas salivares. La amilasa romperá los enlaces a (1-4) de almidón y dará como resultado la amilosa, amilopectina, dextrinas y maltosa. La prueba del yodo permite identificar la presencia de almidón pues tomará un color azul intenso o azul violeta. La coloración se debe a que el yodo entra a la estructura helicoidal del almidón provocando la fijación del yodo en las moléculas de amilosa. diagrams: - Diagrama de la glándula salival - Estructura de la amilosa - Estructura de la amilopectina - Estructura de la maltosa - Estructura de un enlace glicosídico ### Enzimas - 1) Efecto del pH sobre la actividad de la Amilasa. - La amilasa actúa de manera óptima a un pH 7,0 y presenta actividad entre pH 6,0 y 7,4 e inactivándose en un medio tanto ácido como alcalino. - En los tubos 1 (pH 4,0) y 3 (pH 10,0) se observa una tonalidad azul intensa, lo que indica que no hubo ninguna actividad de la enzima sobre el sustrato. Los cambios en el pH del medio afectan profundamente el carácter iónico de los grupos funcionales de la enzima y por lo tanto, alteran la conformación tridimensional de la enzima, y con ello el sitio catalítico. - En los tubos 2 (pH 7,0) y 4 (agua destilada) se evidencia una solución transparente, lo que indica que a este pH, la enzima presenta actividad óptima. La actividad enzimática guarda estrecha relación con el estado iónico de la molécula. - Con esta actividad evidenciamos como el pH influye sobre la velocidad de la reacción entre la enzima y el sustrato. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento del pH - Gráfico de Actividad enzimática vs pH ### Enzimas - Efecto del pH sobre la actividad de la Amilasa. - Por otra parte, la prueba de Benedict permite identificar azúcares reductores y es positivo cuando el color que toma es rojo ladrillo. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento del pH - Gráfico de Actividad enzimática vs pH - Esquema de la reacción de la prueba de Benedict ### Enzimas - Efecto del pH sobre la actividad de la Amilasa. - La amilasa efectivamente degrada el almidón a un pH óptimo, y las moléculas de maltosa reaccionaran con el reactivo de Benedict, produciendo una coloración rojo ladrillo. Si se desnaturalizó la amilasa (por modificaciones en el pH), el almidón no se hidroliza, por lo que efectivamente reaccionó con el yodo, tomando una coloración azul violeta. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento del pH - Gráfico de Actividad enzimática vs pH - Esquema de la reacción de la prueba de Benedict ### Enzimas - 2) Efecto de la temperatura sobre la actividad de la Amilasa. - La amilasa actúa de manera óptima a una temperatura de 37 °C y presenta actividad entre 3 2 °C y 42 °C. - En el tubo 1 (0 °C) la coloración es rojiza, lo cual indica la presencia de las dextrinas (productos de la hidrólisis incompleta del almidón que con yodo se tiñe de rojo. La amilasa hidroliza las uniones a (1-4), tanto de la amilosa como de la amilopectina. En este caso la amilasa puede revertir su inactividad debido a que a temperaturas bajas se mantiene en estado nativo pero sin ejercer su función, al elevar la temperatura sin exceder su punto óptimo, se activa nuevamente. - En el tubo 2 (temperatura ambiente) la coloración se torna café claro, esto se debe a que la temperatura no es óptima para la prueba. Recuerde que cada enzima tiene un rango de temperatura óptimo y en el caso de la amilasa es cercano a 37 °C y a temperatura ambiente no pierde su actividad. Pero disminuye, ya que los choques intermoleculares son menores. diagrams: - Esquema de los tubos de ensayo con las soluciones para el experimento de la temperatura - Gráfico de Actividad enzimática vs Temperatura ### Enzimas - Efecto de la temperatura sobre la actividad de la Amilasa. - En el tubo 3 (38°C) la coloración es amarilla muy clara, esto prueba que la enzima está activa en condiciones normales, ya que no se sometió a grandes variaciones de temperatura, preservándola en un rango de temperatura óptima para la acción de enzimas, que oscila entre 32 °C y 42 °C. - En el tubo 4 (100°C) presenta una coloración azul violeta, porque el yodo detecta la presencia del almidón (sustrato) sobre el cual actúa la enzima (amilasa). Debido a que la solución fue sometida a temperatura elevada pierde su actividad enzimática, ya que al ser hervida esta se desnaturaliza. Por lo cual, no puede actuar sobre el almidón para hidrolizarlo, lo que quiere decir que la enzima no degradó el almidón por lo tanto está inactiva, así esta ha perdido su estructura inicial y pierde sus propiedades como catalizador. Recuerde que esta prueba no es una reacción química, sino la formación de un compuesto el