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COLTURE CELLULARI TBL 22/10/2024 Oggi facciamo una carrellata di tutte quelle tecniche che vengono utilizzate nella sperimentazione preclinica, cioè ciò che avviene prima di somministrare un farmaco. Vediamo in primis quelli che sono gli strumenti della tecnologia e quindi tutto quello che è la BIO...

COLTURE CELLULARI TBL 22/10/2024 Oggi facciamo una carrellata di tutte quelle tecniche che vengono utilizzate nella sperimentazione preclinica, cioè ciò che avviene prima di somministrare un farmaco. Vediamo in primis quelli che sono gli strumenti della tecnologia e quindi tutto quello che è la BIOLOGIA IN SILICO (il computer presenta silicio al suo interno).Le applicazioni che si possono mettere in atto grazie ai computer sono diversissime tra loro: per esempio ultimamente si cerca di fare quello che è il repurposing: un farmaco, con un certo scopo, viene “riprogrammato” per uno scopo alternativo, così da non dover rifare tutti gli step da capo. Il silicio in questo aiuta perché è in grado di screenare diversi database con le strutture di molecole, e data una struttura target (una proteina, un recettore) riesce a indicare quali tra le milioni di molecole, potrebbero essere dei candidati, che si legano al recettore. Si possono andare a creare delle strutture 3d delle proteine. Uno dei primi nobel è stato assegnato a dei ragazzi che hanno inventato il software alpha fold: inserire la struttura amminoacidica di una proteina e ottenere la struttura 3d e quindi predire la sua funzione usando un computer, senza produrre la proteina tramite batteri, cristallizarla e vedere come si dispongono i vari amminoacidi nello spazio. In laboratorio è la BIOLOGIA IN VITRO→COLTURE IN VITRO e consiste nel coltivare cellule esternamente all'organismo a cui appartenevano in condizioni riproducibili e controllate in laboratorio. Esiste, poi, la RICERCA IN VIVO, in seguito ad aver ottenuto dei risultati in vitro, e prevede l'utilizzo di animali che possono essere dalla piccola drosophila ai primati. Dall'intersezione tra questi due tipi di colture si ha la EX VIVO. Quindi la cellula più traslazionale: la possibilità di andare a recuperare cellule e tessuti da organismi viventi e poterli coltivare in laboratorio in vitro e vedere se il trattamento voluto è possibile →si vuole vedere se il risultato ottenuto in vitro e possibile in vivo facendo una traslazione da vitro a vivo. Il vivo ha dei vantaggi: permette di studiare l'organismo nella sua interezza, perché alcune cose non si possono studiare in vitro, tipo la pressione. Si ha quindi un livello di complessità e completezza elevato utilizzando i modelli in vivo. Ma in seguito venne istituito il principio delle 3R che stanno per: 1) REPLACEMENT/SOSTITUZIONE: ogni volta che l'animale è possibile sostituirlo da modello in vitro, ex vivo o in silico è meglio e preferibile; 2) REFINEMENT/AFFINAMENTO: far sì che la ricerca sia controllata secondo il benessere dell'animale; 3) REDUCTION/RIDUZIONE: cercare di coinvolgere il minor numero possibile di animali di grandi o piccoli dimensioni, anche perché nella ricerca si diventa responsabili di tutta la vita degli animali. STORIA DELLE COLTURE CELLULARI 1° ESEMPIO DI COLTURA CELLULARE: raggiunto dal DOTTOR HARRISON nel 1907: isolò delle cellule nervose del midollo spinale di un anfibio e le mise in coltura. Questa è conosciuta come COLTURA PRIMARIA, perché deriva direttamente dall'organismo vivente. Si disgrega meccanicamente (con azione meccanica o proteolitica) il tessuto, si isolano le cellule e si mettono in coltura. Le cellule possono essere inserite direttamente nella petri, o prima si può trattare il fondo della petri, così da far aderire le cellule alla superficie della petri. Harrison vide le cellule nella petri crescere. Una volta che le cellule, cresciute, riempiono l'intera superficie della petri, la cultura dev’essere divisa, bisogna quindi trasferire una parte delle cellule in un’altra petri (tecnica dello SPLITTING). Per disgregare il tessuto si va a inserire la TRIPSINA (enzima proteolitico che taglia le proteine di giunzione tra le cellule) e la EDTA che è un chiodante dei metalli, non è proteolitico, e funziona in modo diverso. Le molecole di adesione per funzionare hanno bisogno di alcuni ioni. L'EDTA va a chelare/sottrarre quegli ioni e quindi facendo ciò le proteine di adesione non funzionano più e le cellule si staccano. Si semina (SEEDING) una coltura su un supporto di plastica, che a un certo punto occuperà tutto lo spazio e quindi si dividerà e si sposterà in un altro supporto. A un certo punto queste cellule, replicandosi vanno incontro al processo di SENESCENZA (cellulare): si vanno ad accumulare diverse mutazioni a livello genetico che portano la cellula a morire. Questo ci dice che la linea cellulare che deriva dalla coltura primaria è finita. PROS AND CONS: PROS: dato che abbiamo preso le cellule direttamente dal tessuto dell'animale di interesse, (o dall'uomo addirittura) non c'è di meglio perché si vanno a trattare cellule provenienti direttamente dall'organismo. CONTRO: le cellule hanno una vita limitata, inoltre nella petri oltre alle cellule crescono batteri, muffe, altre cellule eucariote etc..eliminare queste condizioni è difficile, una coltura che presenta batteri o altro è da buttare e rifare da capo. Il colorante DAPI colora gli acidi nucleici e quindi i nuclei che contengono gli acidi nucleici. I coloranti si legano intercalandosi. Alcuni ricercatori (tra cui il Dottor Carrel, che prese il nobel) hanno provato a trovare una soluzione alle contaminazioni nelle colture cellulari: prima si usa la sterilizzazione usando fuoco cosicché i batteri muoiano; inoltre si iniziano ad aggiungere nutrienti. HENRIETTA LACKS Henrietta Lacks: si presenta all'ospedale 4 mesi dopo il parto del quinto figlio e scopre di avere un tumore alla cervice. Il dottore/ricercatore prende un campione del tumore e lo mette in vitro: si accorge che le cellule sono praticamente immortali e continuano a replicarsi e scopre che il tumore andava a mutare l'enzima telomerasi all'interno di queste cellule→le cellule così non vanno mai incontro all'accorciamento dei telomeri. Tutti gli altri meccanismi fisiologici di queste cellule tumorali sono uguali a quelle delle cellule normali (tranne la questione delle telomerasi), quindi pensa di poterle utilizzare come modello in vitro e quindi nasce la prima linea cellulare immortalizzata (HeLa, dal nome della donna). È possibile congelare le cellule immortalizzate e creare una BIOBANCA. Per immortalizzare le cellule si può provare ad aggiungere degli oncogeni, dei geni di origine virale che vanno a sopprimere quei meccanismi cellulari che fanno sì che una cellula dopo un certo punto smetta di replicarsi. Un secondo metodo è quello di inserire all'interno del patrimonio genetico della cellula di interesse un gene che codifica per una proteina che è un enzima e si chiama HUMAN TELOMERASE che allunga i telomeri. Questi metodi fanno parte dei metodi di trasformazione cellulare. STARTER PACK DEL BIOLOGO CELLULARE: cappa a flusso laminare, centrifuga, incubatore, microscopio invertito, bagnetto a 37°C, frigoriferi e freezer, azoto liquido che arriva fino a -150°C (importante per mantenere le cellule congelate), camerette di conta per contare le cellule, pipette, plasticheria varia per coltivare le cellule e una serie di materiale plastico chiamato CONSUMABILI. È necessario adottare dei LIVELLI DI BIOSICUREZZA perché come vogliamo conservare le colture, conserviamo noi stessi. Esistono diversi livelli di biosicurezza: 4 livelli di sicurezza che vengono applicati in base all’agente con cui si entra in contatto. Nei livelli più alti c'è una CAMERA FLUSSO LAMINARE, per evitare di portare dentro patogeni o portarli fuori. L'incubatore è un mini fornetto (a 37 gradi→temperatura ottimale per la crescita, perché si trattano cellule umane) che consente di mantenere delle condizioni di coltura standard, tra cui la temperatura; il 95% di umidità altrimenti le cellule tendono ad asciugarsi, il 5% di 𝐶𝑂2, e il 5% di 𝑂2. Queste sono le condizioni standard di una coltura cellulare umana. Cosa si utilizza per coltivare le cellule? MEZZI DI COLTURA. Lei ha portato un terreno scaduto rosa/rosso: ognuno di questi terreni ha un determinato nome con codice (esistono numerosi terreni differenti perché ognuno è diverso e le linee cellulari hanno bisogno di nutrienti differenti), all'interno presenta delle vitamine, metaboliti, minerali che servono alla cultura delle matrici o colture cellulari (ricordarsi del dottor carrel che vinse il nobel per aver capito che serviva inserire dei nutrienti), inoltre c'è anche un indicatore di pH, possono esserci fonti di carbonio, cioè dei glucosi (alcune volte sul flacone c'è scritto high/low glucose dipende se la coltura ha bisogno di un'alta o bassa fonte di carbonio), ed è presente un sistema tampone che consente di mantenere la coltura a un pH fisiologico. Inoltre si addiziona la glutammina, un amminoacido essenziale per le colture. Non è direttamente presente nelle colture perché è instabile. Vengono aggiunti anche antibiotici (normalmente 1% sull'intero volume) e il siero di feti bovini (FBS→Fetal bovin serum) che fornisce dei fattori di crescita che servono alla cultura per prepararsi e duplicarsi. Il colore rosso è causato dal rosso fenolo (phenol red), molecola che è un indicatore di pH. Se è mantenuto a temperatura ambiente e senza CO2 presenta il colorino che significa terreno vuoto. Se mettiamo il terreno con cellule in coltura possono succedere due cose: le cellule crescono e metabolizzano i nutrienti presenti nel terreno di coltura, producono dei metaboliti acidi che quindi vanno ad acidificare il terreno (in coltura quindi quando si apre l'incubatore, nelle flasks si vedranno non terreni rosini ma arancioni, e questo è un segno che la coltura si sta acidificando e bisogna rimuovere il terreno esausto e aggiungerne altro nuovo, perché non ci sono più nutrienti dentro), un’altra cosa è che il terreno può diventare giallo e questo perché sia le cellule che i batteri sono cresciuti e quest'ultimi acidificano di più il terreno perché i batteri si duplicano in poco tempo; quindi si ha una iperacidificazione del terreno e si deve capire se è necessario buttare tutto→ per smaltire tutto con più sicurezza si aggiunge candeggina (che è basica) e tutto diventa violetto. FLUSSO DI LAVORO DELLA QUOTIDIANITÀ: si scongelano delle linee cellulari immortalizzate, si mettono in coltura, coltivano, espandono e fare lo splitting cioè il passaggio di cellule, la loro divisione, o senno si isolano le cellule da un tessuto. I punti di partenza sono due: se è da un tessuto è ex-vivo, se da una cellula immortalizzata è in vitro. Una volta raggiunta la quantità necessaria di cellule per l'esperimento, si prende la coltura si semina nelle piastre multipozzetto (in inglese le multiwell): c’è un coperchio per mantenere la sterilità e all'interno ci sono dei pozzettini/buchetti, e ci sono diversi modelli con numeri vari di pozzi. Questo permette di usare la stessa coltura, di dividerla in parti uguali in ogni pozzetto e poi andare a trattare ogni pozzetto indipendentemente dall'altro. Finito tutti gli esprimenti la coltura, dal multiwell, si recupera/si staccano le cellule, si mettono in fiale apposite e tornano a -150 quindi in azoto liquido, e poi se necessario si scongelano. COLTURE D'ADESIONE E DI SOSPENSIONE Quasi tutte le colture sono in adesione, quelle in sospensione sono quelle del sistema immunitario (perché il sangue è liquido). COLTURA A SOSPENSIONE: se metto del terreno, e metto nell'incubatore, a causa dela gravità le cellule si vanno a depositare sul fondo (appena c'è un minuscolo movimento/agitazione dall’esterno le cellule tornano a nuotare) COLTURA AD ADESIONE: le cellule vanno a incollarsi al fondo del contenitore dove viene mantenuta la coltura. ALTRA DIFFERENZA TRA LE DUE COLTURE: seconda differenza: le colture possono essere distinte dal punto di vista morfologico--se prendo un microscopio e vado a ispezionare dal punto di vista microscopico le mie colture, posso ottenere diverse forme/morfologie, quindi se vedo che ho delle cellule squamose, collonari, cuboidali, sono cellule epiteliali; se invece ci sono delle cellule allungate però hanno i bordi lisci allora sono cellule endoteliali, se sono allungate ma con bordo non liscio, ma presentano delle protuberanze (un pò a stellina) allora sono fibroblasti, da non confondere con le cellule neuronali. Tutto ciò che è della linea linfoblasti, di fatto è in sospensione e quando sono in sospensione non hanno una forma, galleggiano. Se si vede una cellula tonda non attaccata alla plastica, è tipicamente una cellula del sangue/ della linea linfoide, mentre i neuroni hanno un supporto cellulare stellato e dei prolungamenti (molto lunghi). A un certo punto bisogna staccare le cellule, ma per x motivi (sono cresciute troppo non ci stanno più, devo fare uno splitting, le devo staccare (le colture in sospensione invece non si devono mai staccare perché sono in sospensione)). Perché stiano bene le cellule non devono mai né essere troppe, né troppo poche→se sono troppe non abbastanza nutrienti, e se sono poche c'è una filosofia di cellule che non si sentono tra di loro quindi pensano che l'ambiente sia sottile e non si replicano. Quindi bisogna mantenersi in un certo range che solitamente varia tra i 500 mila monociti ml e raggiungono duplicandosi 1 milione di monociti a ml. Sulle cellule in sospensione fare la subcoltura (quindi lo splitting) è molto facile. Se le cellule sono attaccate è già più complicato: staccarle si fa per diversi motivi--per lo splitting o per portarle dalla coltura alla semina, o quando oltre ad averle viste al microscopio non sono sicura di che epitelio è e devo fare un’analisi per vedere che cellula è, uso dei marcatori che costituiscono la carta d'identità della cellula: le cellule sulla loro superficie esprimono delle proteine che possono essere utilizzate. Se una cellula ha determinati marcatori (di solito 3 o 4) quella combinazione di marcatori definisce esattamente quella cellula li. In questo caso però i metodi per staccare le cellule dalla plastica cambiano. TRATTAMENTO A TRIPSINA: È il metodo più utilizzato per il distacco delle cellule aderenti. La tripsina è un enzima proteolitico che digerisce le proteine che tengono ancorate le cellule alla superficie della piastra. Si aggiunge una soluzione di tripsina (taglia le proteine) alle cellule e si lascia agire per pochi minuti. Le cellule vengono poi neutralizzate con un mezzo contenente siero (che inibisce la tripsina).Varianti: A volte si usa una combinazione di tripsina ed EDTA, dove l’EDTA chela il calcio, riducendo l’adesione cellulare. La tripsina comunque non sa che deve tagliare solo le proteine di adesione, infatti taglia tutto, quindi tutte le proteine che la cellula esprime sulla sua superficie, ma non è un problema perchè dopo lo splitting, le cellule in un’altra petri si espandono e ricreano le loro proteine superficiali. ALTRO METODO: EDTA ALTRO METODO: RASCHIAMENTO (SCRAPER in inglese): è un bastoncino con un piccolo segmento di plastica. Se le cellule non dovessero staccarsi (con la tripsina le cellule si staccano) si può usare lo scraper, è come se si andassero a staccare/raccogliere meccanicamente. Il problema è che nel farlo si potrebbero rompere delle cellule e quindi le analisi successive non si possono fare. Quindi alla fine dipende anche da qual è la loro applicazione finale. ALTRO METODO: Nel caso della marcatura con l’utilizzo di tripsina si vanno a togliere i marcatori superficiali delle proteine, o si vanno a rovinare con lo scraper. Quindi si deve usare una SOLUZIONE DI DISSOCIAZIONE ENZIMATICA MA NON TRIPSINICA. Questa soluzione (ha un nome diverso per ogni azienda) si chiama CELLS DISSOCIATIONS SOLUTION, e strappa le cellule in modo più delicato, ma richiede più tempo (si mettono in un incubatore): una volta staccate (possiamo anche agevolare il fatto che si stacchino dando un colpetto all’attrezzo di plastica usato) e possiamo portare le cellule alla marcatura. Le cellule in sospensione sono più facili da maneggiare, perché non è necessario staccarle dall'attrezzatura in plastica, ma è più difficile posizionare al microscopio perché si depositano sul fondo, ed è difficile individuare un unico piano focale col microscopio e individuare la morfologia. Mentre le colture di adesione sono più facili da ispezionare, e si riesce anche a capire ad occhio, non con il microscopio, se vanno divise oppure no perché si vedrà se la superficie è interamente coperta dalle cellule o se ci sono ancora degli spazi vuoti: nasce, quindi, il concetto di CONFLUENZA: cioè la superficie coperta dalle cellule (tutto coperto→100% confluenza e così via). DENSITÀ CELLULARE IN SOSPENSIONE: qui si sta tra il 50 e il 70%, quindi se vedo che le cellule arrivano al 70% le stacco e le divido, se arrivano al 100% non si staccano più, non si replicano più. Non si arriva mai al 100% di confluenza, ma si sta sempre tra il 50 al 70%. MONOCOLTURE E CO-COLTURE Se si ha una coltura di un unico tipo cellulare si ha una MONOCOLTURA. Se si vuole vedere come interagiscono due tipi cellulari diversi, si fanno delle CO-COLTURE che possono essere INDIRETTE: in due pozzetti diversi della multiwell io metto la coltura di tipo A e di tipo B. Queste colture crescendo rilasceranno del liquido/dei fattori e per farle comunicare, si raccoglie il liquido che contiene il fattore rilasciato dalla coltura A e metterlo nella coltura B, così entrano in comunicazione tra loro. CO-COLTURA DIRETTA: questa prevede che due linee in adesione, vengono piastrate in percentuali diverse, e si avrà una parte di colture ad adesione e una parte di coltura in sospensione. Questa è una coltura diretta perché loro si toccano. Con le colture 3D si introduce il concetto di TRANSWELL (piccoli cestelli in fondo al quale è presente una membrana porosa semipermeabile). Avendo a disposizione una membrana porosa si possono mettere in contatto delle cellule senza che loro si tocchino. Quindi i fattori solubili possono diffondersi attraverso la membrana, perché ha dei pori, ma le cellule no. Ci sono altre colture 3D→si parla degli SFEROIDI. Inoltre c'è il metodo della PETRI RIBALTATA: si mettono delle gocce e si ribalta la petri. ALTRO METODO: utilizzo di pozzetti dove il fondo è trattato per essere molto liscio così le cellule non si attaccano. Le cellule vanno a toccarsi tra di loro e a trasformare delle strutture tridimensionali. È necessario pensare che le cellule in vivo non sono in liquido ma in dei tessuti, in una matrice dei tessuti. Quindi lo stesso ricercatore che scoprì le HeLa, coltivò delle cellule umane, isolando il collagene dalle code dei ratti e usandolo come substrato gelificato, dove le cellule crescono mantenendo una struttura tridimensionale. DIFFERENZA TRA COLTURA 2D E 3D: nella coltura 2d le cellule sono forzate a espandersi sulla superficie della plastica e ad ottenere una forma diversa da quella che otterrebbero in natura o in vivo→le cellule sono obbligate a espandersi e a toccarsi tra di loro ottenendo quindi delle forme molto sottili, bidimensionali. Se nei pozzetti è presente una matrice di tipo gel, le cellule possono andare a creare delle strutture tridimensionali molto più vicine a quelle che sono le strutture in vivo. Dalla 48 slide gli appunti sono lì direttamente.