Diaporama TP Biologie Cellulaire 2022-23 USTHB PDF

USTHB - SNV – L 1 Biologie Cellulaire TP n°1 de Biologie Cellulaire 2022-23 Le microscope Photonique. est il l’instrument indiqué pour l’étude de la cellule ? Equipe de préparation : Aouameur R. Bouzid S, Hannache K. & Trabsi S. 1- Accueil. 1- La présence aux...

USTHB - SNV – L 1 Biologie Cellulaire TP n°1 de Biologie Cellulaire 2022-23 Le microscope Photonique. est il l’instrument indiqué pour l’étude de la cellule ? Equipe de préparation : Aouameur R. Bouzid S, Hannache K. & Trabsi S. 1- Accueil. 1- La présence aux TP est obligatoire. 2- Au cours de chaque TP, un compte rendu est réalisé. 3- Matériel à avoir : a. 1 cahier pour la prise de notes. b. Blouse blanche. c. Papier extra blanc format 21 x 27 cm. d. Crayon HB2 e. Gomme blanche f. Règle 4- Système de notation en TP: Assiduité = 1 pts. Participation = 1 pts. Interrogations (2 ou 3) = 8 pts. Examen final = 10 pts Moyenne TP = 20 pts 5- Le polycopié de Cytologie est un outil de travail important. Polycopier de Cytologie en vente à l’OPU Points de vente de l’OPU: - au village de l’USTHB - à Alger centre place Audin - à Alger centre rue Didouche Mourad (en face cinéma l’Algéria) 2- Le Microscope Photonique. 2.1. But et principe. 2.1.1. Le But : Obtenir une image agrandie d’un échantillon traversé par un faisceau de photons condensé et dirigé. 2.1.2. Le Principe : Basé sur l’utilisation de lentilles en verre condensatrices (pour le faisceau de photons) et grossissantes (pour l’image réelle) 2.2. Description du Microscope Photonique.  Parties essentielles du Microscope Photonique A- Parties B- Parties Optiques Mécaniques Lentille de l’oculaire Bras ou potence Révolver (support des objectifs) Lentille de valet (maintien de la préparation) l’objectif Platine (support porte objet) Lentille du Vis Macroscopique condenseur (déplacement rapide) Vis Microscopique (déplacement lent) Lampe (source de photons) diaphragme (diamètre du faisceau) Rhéostat (quantité de lumière) socle Planche n°1 Votre microscope: le MOTIC 1820 2.3. Formation de l’image agrandie. L’image finale formée dans l’œil subit deux grossissements successifs: - Un premier grossissement par la lentille de l’objectif d’une valeur variable selon la lentille choisie (x4, x10 et x 40) (NB: l’objectif x 100 sera utiliser en L2 et plus). - Un deuxième grossissement par la lentille de l’oculaire d’une valeur fixe (x10). Le grossissement final du MP = grossissement de l’objectif X le grossissement de l’oculaire. Quel est le grossissement maximal de ce microscope ? Lentille de l’oculaire Lentille de l’objectif 2.4. Le pouvoir séparateur (ou pouvoir de résolution) du microscope photonique. C’est la distance minimale entre deux points en dessous de laquelle ils se seront plus distincts. Œil 200 μm Microscope photonique 0,2 μm ou 200 nm 3. Types d’observations au Microscope Photonique Il existe deux types d’observations: 3.1. Observation Vitale. 3.2. Observation Fixée. Dans ce cas, l’échantillon est Dans ce cas, l’échantillon observé dans son état vivant. Il observé est mort. est prélevé directement de son Une fois prélevé, il est mis environnement est mis instantanément dans un fixateur instantanément sur une lame pour subir par la suite une série porte objet recouverte d’une de manipulations qui constituent lamelle et observé au MP sans la technique histologique aucune préparation particulière. 3.1. Observation Vitale. Exemple 1: observation vitale du plancton marin. Prélèvement d’eau de mer Dépôt d’une goutte d’eau de mer sur lame porte-objet. Observation au MP. P hy t o p l a n c t o n. Zooplancton. Résultat…….  Exemple 2: observation de cellules de l’épithélium buccal. Prélèvement des cellules épithéliales. Étalement sur lame. Résultat Coloration VITALE.!!! Observation au MP. Bleu de Méthylène  Exemple 3 (la manipulation n°1) : observation de cellules de l’épiderme d’écailles de bulbe d’oignon. 1. É t a p e s d e l a p r é p a r a t i o n d e l ’é c h a n t i l l o n. Prélèvement d’un fragment Mettre une goutte d’eau au centre Déposer le fragment d’épiderme d’épiderme à l’aide d’une pince d’une lame porte objet propre dans la goutte d’eau Déposer une lamelle en suivant un mouvement incliné et en évitant Chasser les bulles d’air. d’emprisonner des bulles d’air entre lame et lamelle. Préparation prête à l’observation. Ici l’échantillon , n’es pas coloré (contrasté!!!  2. O b s e r v a t i o n d e l ’é c h a n t i l l o n. L’échantillon est observé de manière graduelle à l’aide de trois objectifs: - l’objectif 4 X : permet d’agrandir l’image 4 fois, c’est le faible grossissement. - l’objectif 10 X :permet d’agrandir l’image 10 fois, c’est le grossissement moyen. - l’objectif 40X : :permet d’agrandir l’image 40 fois, c’est le fort grossissement. X 10 = Vue d’ensemble X10 = Vue intermédiaire X 40 = Vue de détail Re marque : Les microscopes de nos salles ne sont pas équipés des objectifs x 1 0 0.  Les conclusions des observations sont, en générale, faites au fort grossissement qui permet d’obtenir une vue de détail. Portion d’épiderme externe d’écaille de bulbe d’oignon (Allium cepa) dans une goutte d’eau salée (cellules plasmolysées) observée au microscope photonique Gr. x 400. Décrivez cette observation. ? Paroi pectocellulosique. Vacuole. Tonoplaste. Cytoplasme. Espace né du décollement entre Membrane Plasmique et paroi (effet de la plasmolyse).  Exemple de résultat obtenu avec le duodénum de lapin Epithélium de revêtement prismatique unistratifié, à plateau strié et à cellule caliciforme muqueuse Gr. x 400 ( vue de détail ). Dessin de l’observation Dessin de l’épithélium de revêtement prismatique unistratifié, à plateau strié et à cellule caliciforme muqueuse du duodénum de lapin, préparé par la téchnique histologique, vu au microscope photonique Gr. x 400. 4.concl usi on À l’issu des deux observations, pensez vous que Microscope Photonique est le bon instrument pour l’étude de la cellule ? Justifier vos réponses? La Technique Histologique  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e I. Le but C’est une technique destinée principalement à l’observation des tissus au microscope photonique*. Elle est basée sur l’obtention à partir d’un échantillon, parfaitement fixé, des coupes minces (de l’ordre du µm). *Cependant, elle permet également de donner une vue d’ensemble sur les cellules. II. Le principe Le principe est basé sur le durcissement de l’échantillon (par inclusion après fixation et déshydratation), pour confectionner des coupes minces (ordre du micron) transparentes aux photons et suffisamment contrasté.  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e I. Les étapes 1. Le prélèvement et fixation: A. Le prélèvement. Il doit être pratiqué le plus tôt possible après la mort de l’organisme vivant. Ce prélèvement peut être effectué sur un organisme maintenu en vie, notamment chez l’humain dans le cas des biopsie. L’échantillon prélevé peut être sectionné en plusieurs pièces qui seront sélectionnées selon les objectifs de l’étude  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e B. La fixation. Le but de la fixation est de conserver l'échantillon dans un état le plus proche possible de l'état in vivo Elle consiste à immobiliser les tissus in-situ tout en préservant l’aspect structural du tissu. Cette fixation se fait à l’aide de fixateurs physique ou chimique. FIXATEURS PHYSIQUES FIXATEURS CHIMIQUES Fixateurs chimiques simples. Fixateurs chimiques composés. La congélation - Ethanol ou alcool éthylique - À l’azote liquide - Liquide de Carnoy : alcool + chloroforme + acide acétique. - Le formaldéhyde ou formol - Liquide de Bouin : formol + acide picrique T = - 195 °  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e 2. La déshydratation: C’est une étape qui permet de préparer l’inclusion. En fait, le milieu intracellulaire contient beaucoup d’eau non miscible avec la paraffine de l’inclusion. Cette eau doit être remplacée par un solvant organique miscible avec la paraffine comme l’alcool ou le toluène. La déshydratation se déroule dans des bains successifs d’alcool à degrés croissants. le dernier bain étant constitué par un solvant parfaitement miscible avec la paraffine tell que le toluène. Cependant, il tend à être remplacé par de l’alcool 100 % en raison de sa haute toxicité (produit cancérigène) Bains de déshydratation alcool 50° 70° 80° 90° 100°  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e 3. L’inclusion à la paraffine Cette étape consiste à substituer le liquide intracellulaire, qui donne la consistance molle des tissus, par de la paraffine qui durcira l’échantillon et par conséquent facilitera son débitage en coupes. Le résultat de l’inclusion étant l’obtention d’un bloc de paraffine. Refroidissement de la paraffine Coulage de la paraffine liquide Orientation des prélèvements dans Bloc de paraffine  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e 4. Réalisation des coupes Cette étape sera réalisée à l’aide d’un instrument de coupes appelé Microtome. En raison du pouvoir pénétrant relativement élevé des photons (comparé à celui des électrons) , l’épaisseur des coupes sera de l’ordre de quelques microns ( 2 à 5 microns environ). Bloc de paraffine fixé au microtome Échantillon inclus dans le bloc Lame Ruban de coupes Microtome  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e 5. Etalement des coupes Une fois les coupes obtenues, elles seront étalées sous forme d’un ruban de quelques coupes sur une lame porte-objet en verre. Elles y seront fixées à la lame par des substances collantes telle que l’albumine ou de l’eau gélatinée. Ruban de coupes Étalement sur lame porte-objet. Collage des coupes à l’eau gélatinée  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e 6.Déparaffinage et réhydratation C’est une étape qui permet de préparer la coloration des coupes. la première partie de cette étape consiste à enlever la paraffine hydrophobe contenu dans les cellules en la faisant fondre sur une plaque chauffante. au cours de la seconde partie de cette étape, la paraffine hydrophobe est substituée par de l’eau compatible avec les colorants hydrosolubles. On procèdera de manière contraire de la déshydratation vu plus haut. Les lames sur lesquelles sont fixées les coupes des échantillons subiront des bains d’alcool à degrés décroissant Alcool 100° 90° 80° 70° 5 0° Réhydratation des lames Plaque chauffante pour déparaffinage (bains d’alcool à degrés décroissant)  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e 7. coloration les structures cellulaires sont difficiles à distinguer et des méthodes de coloration particulières s'avèrent le plus souvent indispensables pour pouvoir contraster les différentes parties d’un tissu Coloration Résultat Lames en cours de coloration A: échantillon dans le bloc de paraffine non coloré. B: Coupe de l’échantillon coloré.  L a T e c h n i q u e H i s t o l o g i q u e 8. Montage et Observation Les lames sélectionnées sont recouverte d’une lamelle qui sera collée à la lame grâce à de la résine type baume du Canada. Ces lames peuvent êtres conservées longtemps. Montage définitif : Collage des lamelles Les lames sont observées au microscope photonique qui donnera un aperçut sur l’organisation histologiques des coupes Exemples de résultats