Trasformazione Genetica Negli Eucarioti PDF

TRASFORMAZIONE GENET ICA NEGLI EUCARIOT I La trasformazione genetica consente il trasferimento di un frammento di DNA da una cellula di un organismo alla cellula di un altro organismo. Il frammento di DNA può essere un gene (regione regolatrice e regione codificante), un promotore ma anche un framm...

TRASFORMAZIONE GENET ICA NEGLI EUCARIOT I La trasformazione genetica consente il trasferimento di un frammento di DNA da una cellula di un organismo alla cellula di un altro organismo. Il frammento di DNA può essere un gene (regione regolatrice e regione codificante), un promotore ma anche un frammento di DNA a funzione non nota. Abbiamo bisogno di: - Conoscere i geni - Tecnologie del DNA ricombinante: possibilità di clonare il frammento all’interno di un vettore per essere certi che il DNA ricombinante abbia tutto quello che serve per esprimere la proteina - Colture cellulari: diverse a seconda se trasformo procarioti (E. coli) o eucarioti - Coltura in vitro: Possono esserci colture vegetali in cui coltivo cellule senza parete (protoplasti) e il trasferimento del DNA avviene facilmente in quanto la parete è assente. Dopodiché si ha la riformazione della parete e divisione fino ad ottenere dei calli, ovvero insiemi di cellule indifferenziate. Inoltre in vitro si possono coltivare gli organi ma anche cellule umane e animali. - Coltura di tessuti: rimozione di cellule / tessuti / organi da un organismo. La cellula da un organismo viene trasferita in un ambiente artificiale per continuare la crescita, sottoposta a stress in quanto le comunicazioni cellulari con le altre cellule dell’organismo vengono interrotte. COLTURA PRIMARIA DI CELLULE ANIMALI 1. Prelievo delle cellule da un campione 2. Dissezione meccanica per mezzo di bisturi e coltura in vitro delle cellule —-> la tripsina va ad attacare proteine 3. Trattamento con tripsina per eliminare i contatti tra le cellule e separarle come caderine che legano tengono le cellule unite insieme. 4. Aggiunta di un inibitore per bloccare la digestione enzimatica —-> si aggiungono degli inibitori della tripsina per bloccare la sua azione digestiva es. FBS ( siero bovino), Ovomucina, STI ( soybean Trypsin Inhibitor ) 5. Controllo della vitalità cellulare con colorante trypan blue, che attraversa la membrana cellulare solo nel caso in cui sia rotta Marchia le cellule di blu. Il suo effetto è osservabile solo al microscopio. Si fa conta manuale. 6. Le colture cellulari vengono seminate su terreno solido in piastra Petri oppure in sospensione 14 COLTURE DI CELLULE ANIMALI Subcolture: dalla coltura primaria vengono fatte le subcolture per permettere la continua crescita. (COLTURA SECONDARL) Un surplus di cellule può essere trattato con crioprotettori (DMSO) o glicerolo e crioconservate a -130°C fino al momento dell’utilizzo. Un’alternativa alla preparazione di una coltura primaria è di acquistare linee cellulari già stabilizzate o chiederle ad altro laboratorio. Tipi di cellule: - Cellule di tipo epiteliali: forma poligonale, attaccate al substrato - Cellule di tipo fibroblasti: forma allungata e bipolari, attaccate al substrato - Cellule di tipo linfoblasti: forma sferica, non attaccate al substrato ma rimangono in sospensione Perché si usano le cellule in coltura? - Sistema modello per studiare la biologia e biochimica cellulare, effetto dei farmaci, invecchiamento… - Test di tossicità di nuovi composti, cosmetici, farmaceutici - Ricerca sul cancro e confronto con cellule normali - Virologia: replicazione dei virus nelle cellule per produzione di vaccini - Produzione di tessuti, anticorpi, possibilità di differenziare in diversi tipi di cellule. Nuovi approcci in diverse condizioni mediche - Consulenze genetiche come aberrazioni cromosomiche ecc. - La trasformazione genetica (introdurre DNA e geni, produrre nuove proteine) - Drug screening per l’industria farmaceutica - La possibilità di ingegnerizzare le cellule ha portato alla terapia genica: le cellule possono essere rimosse da un paziente se manca un gene funzionale, vengono studiate, modificate ecc. oppure il gene mancante può essere inserito in un vettore virale poi usato per infettare il paziente. 15 Trasformazione di cellule animali: TRANSFEZIONE Con il termine trasfezione si intende l’introduzione del DNA nel nucleo di una cellula eucariotica e può essere di 2 tipi: - Transfezione stabile: il DNA deve passare la membrana cellulare e l’envelope del nucleo, il DNA si integra all’interno del genoma nucleare. Segue l’espressione e nel citoplasma ci sarà la proteina→ stabile. - Transfezione transiente: inserisco al DNA all’interno della cellula attraverso la membrana e l’envelope del nucleo fino ad arrivare al suo interno MA non si inserisce all’interno del genoma quindi non si integra, è riconosciuto dai meccanismi di trascrizione e traduzione quindi i geni saranno espressi per un tempo limitato→ instabile. Primo metodo di trasformazione: elettroporazione Le cellule si trovano in un apposito buffer, segue l’aggiunta degli acidi nucleici e la trasfezione delle cellule che vengono piastrate in terreni e per vedere l’espressione genica poi le analizzo con ≠ metodi: - western - ! attività Gene reporter (GFP) - microscopio - Real time-PCR - citometria 16 Secondo sistema di trasformazione: particle gun Si utilizzano delle particelle metalliche (oro / tungsteno) con carica + e il DNA essendo carico - si attacca ad esse. Le particelle vengono inserite all’interno di una sorta di provetta (pallottola) a sua volta inserita all'interno della pistola. Successivamente spariamo. Devono passare solo le particelle di metallo con il DNA legato quindi esiste uno stopping screen che le seleziona. Il DNA viene sparato in qualsiasi parte della cellula, ciò che finisce nel citoplasma viene degradato mentre ciò che arriva nel nucleo potrà integrarsi e avviene una trasformazione stabile altrimenti non si integra. Terzo metodo: microiniezione Strumento che permette di tenere ferma la cellula che voglio trasformare e con l’altra mano si utilizza uno strumento che permette di mettere il transgene all’interno della cellula. Quarto metodo: vettore virale Sono vettori di espressione in cellule di mammifero. Inserisco il DNA nel vettore virale che mi permette poi di arrivare nella cellula. È utilizzata per la terapia in vivo che consiste nell’inserire il vettore direttamente negli organi interni del paziente, e per la terapia ex vivo dove prelevo le cellule da un paziente che coltivo e le trasformo con il DNA che voglio reinserire nel paziente. Quinto metodo: sostanze lipofiliche liposomi Consiste nell’utilizzo dei liposomi, piccole vescicole con struttura simile alla membrana plasmatica. 17 Il liposoma è formato da strati esterni fosfolipidici che delimitano all’interno una parte idrofila in cui si trova il materiale in fase acquosa. Il DNA viene incorporato nel liposoma che viene successivamente inserito nella cellula. Parte del DNA verrà degradato ma una parte arriva al nucleo e si integra nel genoma (trasformazione stabile) o funziona per un tot di ore (trasformazione transiente). Tutto ciò che rimane nel citoplasma e non arriva al nucleo viene degradato da nucleasi. 18 COLTURE DI CELLULE VEGETALI Tipi di colture: - Coltura di protoplasti (cellule vegetali senza parete) - Cellule in sospensione mantenute in soluzione liquida in costante agitazione per permettere l’ossigenazione delle cellule - Coltura di calli (cellule che crescono in maniera indifferenziata) - Coltura di organi - Coltura di embrioni somatici: sono facilmente rigenerabili e trasformabili. Prendiamo un embrione immaturo dopo la fecondazione, lo estraggo dal seme e lo metto in coltura con particolari condizioni ormonali. Si formano tanti embrioni somatici sulla parete di quell’embrione zigotico iniziale. L’inserimento di materiale genetico anche in questo caso deve arrivare al nucleo e può dare origine alla trasformazione transiente quando non si integra nel genoma, o stabile quando si integra. La trasformazione genetica è un processo che avviene anche in natura. Nel terreno alla base del colletto della pianta (congiunzione tra la parte ipogea=radice e la parte epigea=stelo/foglie), esiste Agrobacterium tumefaciens che riconosce una ferita che si può formare nel punto di congiunzione, in quanto ci sono sostanze come acetosiringone e idrossiacetosiringone rilasciate dalle cellule ferite. Si attiva così una risposta per cui l’agrobatterio infetta le cellule inserendo un tratto di DNA→ trasformazione delle cellule. In vivo accade che il trasferimento di DNA conferisce alla cellula vegetale la possibilità di moltiplicarsi continuamente, formando tessuti indifferenziati, si ha una specie di ingrossamento che corrisponde a formazioni tumorali che ostruiscono i vasi (non c’è più passaggio di acqua e sali minerali) e la pianta è destinata a morire. In una cellula non tumorale per mantenere la divisione e la proliferazione cellulare sono necessari ormoni vegetali quali auxine e citochinine. Il tessuto tumorale invece non richiede gli ormoni. 19 Le cellule tumorali producono composti azotati chiamati opine che servono per il nutrimento dell’Agrobacterium, il quale infetta la cellula vegetale, la stimola a moltiplicarsi e le cellule prodotte producono le opine. Ci sono ≠ tipi di opine in base al ceppo dell’agrobatterio. All’interno del patogeno A. tumefaciens esiste un plasmide Ti (tumor inducing), DNA circolare di ~200kb, in grado di trasferire parte del DNA dal plasmide alla cellula vegetale, dove produce e sintetizza proteine che causano il tumore del colletto con conseguente morte. Plasmide Ti Il frammento trasferito prende il nome di T-DNA, che viene trasferito alla cellula vegetale, e in esso sono contenuti i geni per la sintesi di auxine / citochinine / opine. - Il T-DNA trasferito è colineare al T-DNA del plasmide, ovvero viene mantenuto l’orientamento e la sequenza nucleotidica. - L’inserimento del T-DNA è casuale. - I bordi del T-DNA sono delimitati a dx (RB: right border) e sx (LB) da sequenze ripetute (" ). ! Jeff Schell è stato uno dei primi a studiare il tumor inducing principle dell’A. tumefaciens. All’inizio si pensava che il trasferimento di materiale genetico dal batterio alla pianta potesse avvenire grazie ad un batteriofago ma nessuna prova potè essere ottenuta a conferma di questa ipotesi. Un giorno, mentre stavano comparando del DNA isolato da un ceppo virulento (dunque con plasmide all’interno) di Agrobatterio, con quello di un ceppo avirulento, si accorsero che una banda di DNA era presente nel gradiente di saccarosio su cui era stato caricato il DNA del ceppo virulento, mentre era assente nel gradiente contenente il DNA del ceppo avirulento→ scoperto il plasmide Ti. 20 I geni contenuti sul T-DNA possono essere sostituiti con altri geni, non si interferisce con il trasferimento purché vengono mantenute le sequenze fiancheggianti LB e RB. Meccanismo di trasferimento del T-DNA: Il T-DNA è a doppio filamento, si stacca il T-strand a singolo filamento protetto da una serie di proteine SSB ed entra nella cellula vegetale attraversando la parete cellulare, il citoplasma e l’envelope fino ad arrivare al nucleo. Sul plasmide rimane il singolo filamento, copiato da meccanismi di replicazione e si ricostituisce lo strand complementare; stessa cosa avviene nel genoma della pianta in cui si crea il filamento complementare al T-strand. Si ha una risposta chimica: la cellula vegetale ferita rilascia degli ACETOSIRINGONE essudati (fenoli e derivati) che inducono i geni vir (responsabili della virulenza) presenti in 8 operoni e sono policistronici. I geni vir A e G codificano per proteine a 2 componenti (all’interno ed esterno della cellula batterica) e sono sempre espressi. Vir A e Vir G sono responsabili di percepire segnali chimici della pianta come es. acetosiringone per attivare virulenza. Vir A è in membrana che attiva Vir G intramembrana che port ad attivazione di altri geni vir. Qursti due geni sono sempre espressi in quanto sono gli attivatori degli altri. Gli altri geni vir sono coinvolti nella separazione del T-DNA del plasmide e nel trasferimento del T-strand e sono importanti perché inducono la sintesi di endonucleasi che permettono il taglio del RB e LB. All’interno della pianta deve trovarsi un NIC o una rottura del DNA della doppia elica che consente al T- strand di attaccarsi. L’integrazione completa del T-strand è dovuta dalla replicazione e riparazione del DNA. Dunque nel dettaglio la proteina al 5’ del T-strand interagisce con un punto aperto spezzato del genomico, l’attacco causa la torsione dell’altro filamento con conseguente secondo taglio. Avviene la ligazione del T-strand con il DNA genomico e copiato all’interno dai meccanismi di replicazione. La replicazione e la riparazione possono causare la formazione di sequenze ripetute agli estremi. In laboratorio: - I geni sul T-DNA non sono necessari per il trasferimento e l’integrazione del T-DNA - I geni vir possono funzionare in trans: funziona anche se non sono inseriti sul plasmide - Il T-DNA contenuto tra il LB e RB viene trasferito alla cellula vegetale - Il trasferimento è colineare - Il DNA integrato nel genoma viene ereditato Stabiliti questi 5 punti era necessario: - rigenerare da una singola cellula e tramite coltura in vitro rigenero la pianta - marcatori genetici (per selezionare le cellule trasformate) 21  le-re : CNEO BLARIO Casseta Cere - GENE MERESSE LEGETALE ↓ Hallatore Selezkne imping - NEL resto : - ON A TOM. Due Vettore binario - - OM E COLL. ITAErE SELEZIONE A TUIT SELEGE E Col. ⑪ SEC. ELPANDO A TUM che Va. heclio INFETrO Planta MALENE. D T ~ LESTMOIM - - Questo a differenza del plasmide Ti che aveva ~200kb è creato in laboratorio e ha ~10 kb. S L’ori di Agrobacterium viene mantenuta e si inserisce anche ori di - E.coli per il clonaggio perché è più facile moltiplicare e amplificare un plasmide in coli. C’è sempre un LB e RB. Il gene bersaglio è il nostro gene di interesse e per funzionare ha un promotore che permette l’espressione nel sistema eucariotico. All’interno del frammento che viene trasferito alla pianta c’è anche un gene marcatore vegetale con promotore eucariotico che permette di selezionare le cellule vegetali trasformate (resistenza antibiotico acquisita). È presente un altro gene marcatore per selezionare le cellule di E. coli e A. tumefaciens, dotato di promotore procariotico. Questo perché quando in lab trasformo E. coli o A. tumefaciens devo inserire antibiotici per selezionare le cellule trasformate, in quanto devo essere sicura di avere dentro un plasmide→ uso gene marcatore. Nella cellula batterica abbiamo il cromosoma, il vettore binario, e un plasmide più piccolo chiamato plasmide helper che contiene i geni vir, che funzionano anche se non sono nell’agrobatterio. Ricordando che i geni vir possono funzionare anche in trans possono essere rimossi e otteniamo una dimensione ridotta del plasmide. Più piccolo è il plasmide più facile è la trasformazione, replicazione ecc. Per facilitare la trasformazione, replicazione e generazione di un plasmide contenente gene di interesse. Si formano due tipi di plasmidi. Uno detto binario che contiene il T-dna con Lb e Rb. Questo dna è il gene di interesse. Inoltre nel plasmide binario abbiamo anche dei marcatori di selezione per assicurarsi della sua trasformazione in cellule come E:coli. Infatti qeusto plasmdie binario presenta ori di ecoli così che possiamo amplificarlo in maniera più semplice e veloce in ecoli per poi passarlo nelle piante. Il plasmide helper invece contiene i Geni Vir che possono essere espressi anche se separati da Tdna. !! Entrambi questi plasmidi vengono messi in agrobacterium cos’ che possa infettare la cellual vegetale!! Marcatori più usati: PANA - NPTII: resistenza alla kanamicina - HPT: resistenza all’igromicina - Gene bar: induce la resistenza alla phosphinotricina (erbicida) # Il tabacco si trasforma facilmente e lo usiamo in laboratorio. Tagliamo pezzi di foglie su piastra Petri, dopo settimane si formano foglie trasformate. Per confermare la trasformazione possiamo usare PCR sul gene inserito, sennò guardo l’espressione della GFP, oppure analisi del DNA con il Southern blot. Se nel mezzo di crescita la pianta forma la radice la probabilità con cui la pianta sia trasformata è altissima. CAPPA A FLUSSO ! -LAVONNE I ALBIENE STERICE # ↳ BIStel e PINE Sterilizzate con CALORE CSTENERE A 300) 22  Si fa per operere del S SECTI TRANSCEMCI Trasformazione di Arabidopsis thaliana con il metodo dipping (immersione) Le evita di dover USAME PretpaSt d & ischem di espam La pianta viene fatta crescere, si tagliano i fiori per stimolare la crescita di altri germogli, capovolgo la pianta all’interno di una soluzione di agrobatterio. Dopo 15’ la rigiro e la lascio in serra. La pianta fiorisce e produce semi al cui interno è probabile si abbia il transgene. - T-ona integrato EREDITABILE e Se questi semi li ricoltivo in un terreno selettivo (contenente ad es kanamicina) germinano tutti ma nel giro di 2-3 giorni i non trasformati muoiono. Le Perdite del Cere CHE MEMAstor A-relT SI Ha MARCATOME SELEZIONE PER EL KANAITIC WA. Questo sistema di trasformazione ha rivoluzionato la biologia molecolare vegetale consentendo di trasformare centinaia di piante in poco tempo. Il sistema viene utilizzato per inserire un tDNA all’interno del genoma di Arabidopsis. Questo determina naturalmente il silenziamento casuale di un gene. Infatti esiste un mutante per ciascuno dei geni della pianta, si ha a disposizione una collezioni di mutanti. Questo fu possibile grazie al suo piccolo genoma. Particle gun È la tecnica più comune dopo l’agrobatterio. Il procedimento è analogo a quello impiegato sulle cellule animali. Il vettore in cui è clonato il gene di interesse viene messo in una provetta insieme a particelle di oro o tungsteno. Il contenuto viene poi caricato nella della pistola e sparato ad alta velocità. La presenza dello stopping plate consente di far arrivare alle cellule solamente le particelle ricoperte. Si può verificare una trasformazione permanente/stabile se il DNA si integra nel genoma e la trasformazione viene ereditata dalla progenie oppure una trasformazione transiente nel caso in cui non si integri nel genoma (24-90h). È maggiore la quantità di DNA che non si integra. Con l’espressione transiente posso vedere l’espressione di un gene poche ore dopo la trasformazione senza dover aspettare mesi per dover rigenerare l’organismo intero. Ricorda: fare una pianta transgenica non significa solamente OGM ma anche una pianta editata ovvero manipolata con le recenti tecniche del CRISPR-CAS9. Processo di creazione di una pianta transgenica 1. Isolare un gene e caratterizzare la sua funzione 23  2. Preparare il vettore 3. Trasformazione della cellula 4. Rigenerazione della pianta intera: servono le colture in vitro in quanto trasformiamo una singola cellula Il gene che inseriamo deve essere stabile ovvero che oltre ad essersi integrato nel genoma, nelle generazioni successive viene ereditato. Dovrò quindi fare una auto-fecondazione e aspettare le generazioni successive affinché sia a livello omozigote (presente sui cromosomi omologhi). Trasformazione genetica dei cloroplasti I cloroplasti sono organelli che si trovano all’interno esclusivamente della cellula vegetale. Contengono un loro genoma e di conseguenza è possibile trasformare una cellula vegetale facendo in modo che il DNA sia indirizzato al genoma cloroplastico e non nel nucleo. In questo caso il DNA dovrà passare solamente la parete, il plasmalemma e il cloroplasto → passaggio più rapido. Caratteristiche dei cloroplasti - DNA circolare a doppio filamento di misura variabile a seconda della specie - Il numero di cloroplasti all’interno della cellula è specie-specifico così come il numero di genomi all’interno del singolo cloroplasto - Il sistema di traduzione e trascrizione è di tipo procariotico - Ci sono circa 100 cloroplasti e 100 copie di genoma per cloroplasto → stima di 10.000 copie di genoma per cellula ↳ Vantaggi: È possibile inserire più geni contemporaneamente e inoltre l’espressione è molto abbondante. Inoltre la trasformazione avviene per ricombinazione omologa. L’inserimento non è random ma conosciamo le sequenze del genoma del cloroplasto e preparo un vettore con le sequenze fiancheggianti corrispondenti a quelle del cloroplasto dove avverrà la ricombinazione omologa. ! ⚠ L’inserimento casuale nel nucleo fa si che un gene che si esprime in un certo punto del genoma nucleare ha una certa espressione. Lo stesso gene in un’altra pianta inserito in un punto diverso del genoma ha un livello di espressione differente. Questo è noto come EFFETTO DI POSIZIONE. Perciti Trasforitare CloroPAST ? · cope el dom cene ↑respressione creare Con sel del CCoroplso & Si evita la ricoltruazione casuale l quanto accere per ric. oltolosa quelli basta Sel Target. fanheschm Quechte a una Certa Sel Sul Genia. Si sail genolta omo) 24 Difficoltà: trasformo uno o due cloroplasti ma con il passaggio delle generazioni, lavorando su un terreno selettivo, devo selezionare la cellula che ha tutti i cloroplasti trasformati e ottenere un omoplastoma dove tutti i genomi di tutti i cloroplasti sono trasformati (se non il 100% almeno la maggior parte). Tale meccanismo di trasformazione è nato perché nel momento in cui porto in campo una pianta transgenica si può verificare l’incrocio con piante non transgeniche→ non posso controllare. Il polline però non contiene cloroplasti e di conseguenza la pianta transgenica con trasformazione dei cloroplasti non presenta il problema della fuga del transgenico. Metodi di trasformazione: - Particle gun - Trasformazione dei protoplasti con PEG: uso di polietilenglicole, un polimero, agente agglutinante. Determina un agglutinamento del DNA al protoplasto e il successivo ingresso di parte del DNA. Il protoplasto viene coltivato per qualche giorno affinché possa riformare la parete cellulare e inizia poi a dividersi e dopo 3-4 settimana si possono vedere a occhio nudo le colonie di cellule cresciute su terreno selettivo (muore tutto ciò che non è trasformato). - Utilizzo di micromanipolatore per fare microiniezioni I protoplasti sono cellule vegetali privi di parete cellulare. La possibilità di isolare i protoplasti e la loro trasformazione hanno permesso il veloce sviluppo di approcci di manipolazione genetica. (Fusione dei protoplasti: tecnica di difficile utilizzo e non in uso. Consiste nel prendere protoplasti di una pianta di due specie diverse e fonderli). Parete cellulare - Struttura che circonda il protoplasto esternamente alla membrana plasmatica - Composta da polisaccaridi, proteine e composti fenolici - Agisce da esoscheletro e mantiene e determina la forma e grandezza della cellula - Fornisce supporto e resistenza meccanica - Permette la creazione della pressione di turgore - Responsabile dell’architettura della pianta - Barriera importante per attacco di patogeni Preparazione dei protoplasti Si parte da foglie che vengono tagliuzzate e poste in soluzione con enzimi che sciolgono la parete cellulare. Sono enzimi estratti dai funghi come ad esempio le pectinasi o le cellulasi. La digestione avviene in circa 16 ore. È importante mantenere l’osmolarità del mezzo di coltura, ovvero la soluzione in cui sono contenuti i protoplasti deve essere pari all’osmolarità presente nella cellula, per evitare il raggrinzamento o lo scoppio del protoplasto. Per fare questo si aggiunge mannitolo o sorbitolo. Si fanno dei lavaggi per eliminare la soluzione e poterli trasferire in coltura affinché possano riformare la parete e dividersi dopo la trasformazione. In un gradiente si isola poi la striscia che contiene i cloroplasti. Trasformazione dei protoplasti 25