TEST ESAME LABORATORIO BIOLOGIA CELLULARE 2024 PDF

Esercitazioni pratiche Laboratorio di Biologia Cellulare 2024 c/o Polo Biotech Prof.ssa Chiara Gentili Prof.ssa Sara Tavella Programma Giorno 1 Organizzazione e preparazione de...

Esercitazioni pratiche Laboratorio di Biologia Cellulare 2024 c/o Polo Biotech Prof.ssa Chiara Gentili Prof.ssa Sara Tavella Programma Giorno 1 Organizzazione e preparazione del banco di lavoro Preparazione terreno di coltura Visione al microscopio delle cellule Tripsinizzazione di colture cellulari: Conta cellulare: Semina 10.000 cel. x MTT in 6 pozzetti da 24 Semina 100.000 cel. x colorazione DAPI in 2 petri da 3cm Semina cellule in 2 petri da 6 cm x conta e congelamento e cellulare (T1 e T3) Giorno 2 Test di MTT (primo tempo sperimentale) Conta cellulare per proliferazione (primo tempo sperimentale) Congelamento cellulare- Crioconservazione Giorno 3 Preparazione coltura cellulare da primaria da tessuto Colorazione DAPI su piastre da 3cm del giorno 1 Giorno 4 Test di MTT (secondo tempo sperimentale) Conta cellulare per proliferazione (secondo tempo sperimentale) e calcolo duplicazioni cellulari Scongelamento cellulare delle cellule congelate giorno 2 PRATICHE IGIENICHE E’ ASSOLUTAMENTE VIETATO MANGIARE, BERE, FUMARE, E TOCCARSI IL VISO CON I GUANTI E’ BUONA NORMA LAVARSI LE MANI CON IL SAPONE PRIMA E DOPO AVER USATO LA STANZA DELLE COLTURE CONSIDERARE SEMPRE IL MATERIALE BIOLOGICO POTENZIALMENTE INFETTO. INDOSSARE I DPI OPPORTUNI: CAMICE, GUANTI NON UTILIZZARE CELLULARE Protocolli 1) PREPARAZIONE TERRENI PER COLTURE Materiale necessario: - terreno di base - pen/strep: penicillina 10.000 U/ml + streptomicina 10.000U/ml - glutammina - siero fetale bovino “NOTA” La preparazione del terreno deve essere rigorosamente eseguita utilizzando cappe sterili. Procedura Per la preparazione di 50 mL di terreno completo: - X mL di terreno base - 1% di pen/strep - 1% di L-glutammina (stabilità 30 gg) - 10% di siero fetale bovino “NOTA” Il terreno completo è conservato a 4°C, può essere utilizzato nello spazio di 2-3 mesi. La glutammina tende a degradarsi più in fretta rispetto agli altri fattori, e va aggiunta nuovamente nelle corrette proporzioni dopo un mese dalla preparazione del terreno. 2) TRIPSINIZZAZIONE & CONTA CELLULARE Materiale necessario - PBS (Phosphate-Buffered Saline), utilizzato come soluzione di lavaggio. Il PBS serve a mantenere il pH e il bilancio osmotico corretti e a rimuovere gli inibitori delle proteasi, presenti nel siero. - Soluzione 0.05% Tripsina/EDTA (0.05%), utilizzata per staccare le cellule dal substrato. Le soluzioni di tripsina sono spesso integrate con altri enzimi (collagenasi) o con agenti chelanti (EDTA) per migliorare la sua attività. - Terreno completo, contenente il siero fetale bovino, necessario a bloccare l’attività della tripsina, grazie alle proteine del siero. Procedura 1. Aspirare (sterilmente) il terreno dal fondo della piastra; 2. Lavare il monostrato cellulare 2 volte con PBS, al fine di rimuovere tutte le tracce di siero (contenente possibili inibitori di proteasi); 3. Aggiungere la soluzione di tripsina/EDTA, incubare 5-10 min a 37°C in incubatore; 4. Controllare al microscopio il distacco cellulare; 5. Recuperare le cellule con 5 ml di terreno completo per inattivare l’attività enzimatica e trasferire il tutto in tubi da centrifuga da 15 ml; 6. Centrifugare le cellule 10 min a 1500 rpm; 7. Rimuovere il surnatante mediante aspirazione; 8. Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di terreno completo; 9. Contare le cellule mediante l’utilizzo della camera di Burker. Si contano le cellule presenti all’interno di almeno tre quadranti della camera (quadrati rossi). 10. Calcolare il numero totale di cellule presenti nella sospensione mediante la seguente formula: N° cells = (media di almeno 2 quadrati) x (10.000) x (volume di sospensione) 11. Piastare le cellule in ragione di: - 100.000/in piastre da 3 cmm - 10.000/pozzetto di una multiwell da 24 pozzetti - Il restante numero di cellule da dividere esattamente in due piastre da 6 cm 12. Aggiungere terreno completo 3) TEST DI MTT (saggio di attività metabolica-vitalità cellulare) Materiale necessario - soluzione madre di MTT - terreno liscio, ossia senza siero,L- glutammina e en/strep, necessario a diluire la soluzione madre di MTT (working solution) - PBS (Phosphate-Buffered Saline), utilizzato come soluzione di lavaggio Procedura 1. Preparare al buio (spegnere la luce della cappa) la soluzione MTT aggiungendo 25 ul di MTT (soluzione madre) a 250 ul di terreno liscio; 2. Eliminare il terreno di coltura dal pozzetto; 3. Eseguire 1 lavaggio del pozzetto con 1 mL di PBS; 4. Aggiungere 275 ul della soluzione diluita di MTT nel pozzetto; 5. Incubare 2/3 h a 37°C; 6. Rimuovere la soluzione diluita di MTT; 7. Aggiungere 0,5 ml di etanolo assoluto nel pozzetto, raccogliere e trasferire in una cuvetta per la lettura allo spettrofotometro; 8. Eseguire 2 letture allo spettrofotometro: lettura impostando la lunghezza d’onda a 570 nm MTT (test di vitalità cellulare e attività metabolica) Il test MTT (3,(4,5-dimethylthiazol-2)2,5 difeniltetrazolium bromide) è un saggio di laboratorio colorimetrico standard per misurare l'attività di enzimi mitocondriali che riducono l’MTT a formazano, facendo virare il composto da un colore giallo ad un colore blu-violetto intenso. Il formazano rimane localizzato all’interno dei mitocondri, quindi deve essere solubilizzato ed estratto dalle cellule. A tale scopo, scaduto il tempo di incubazione, la piastra viene sciacquata dalla soluzione di MTT ed incubata per un minimo di 2/3 ore con isopropanolo (solvente di estrazione) a temperatura ambiente e al buio perché è un composto fotosensibile. L'intensità della colorazione della soluzione ottenuta è direttamente proporzionale alla concentrazione di formazano ed è quindi espressione della vitalità cellulare. La densità ottica (OD) è misurata spettrofotometricamente ad una lunghezza d’onda pari a 570 nm. 4) SCONGELAMENTO DI CELLULE CRIOCONSERVATE & TEST DI VITALITA’ CELLULARE Materiale necessario - terreno completo, utilizzato per lavare le cellule dal terreno di congelamento e per la loro successiva coltivazione in piastra - colorante trypan blue, utilizzato per il test di vitalità cellulare in quanto permette di discriminare le cellule vive e da quelle morte a seguito del congelamento (le prime appaiono traslucide al microscopio, mentre le seconde sono colorate di blu) Procedura 1. Aggiungere 10 ml di terreno completo ad un tubo Falcon e scaldarlo a 37°C nel bagnetto; 2. Prendere dall’azoto liquido la vial contenente le cellule crioconservate e tenerla in ghiaccio; 3. Scongelarla rapidamente nel bagnetto a 37°C; 4. Prelevare il contenuto della vial e trasferirlo nel tubo Falcon, e poi addizionare goccia a goccia di terreno completo. 5. Centrifugare a 2000 rpm per 5 min; 6. Eliminare il surnatante (liquido sopra il pellet presente sul fondo); 7. Risospendere il pellet in 1 ml di terreno completo; 8. Prelevare 100 ul di sospensione cellulare e aggiungerla a 100 ul di trypan blue per il test di vitalità cellulare 9. Eseguire la conta delle cellule vive (traslucide) mediante l’utilizzo di camera di Burker (come descritto nel protocollo numero 2); 10. Eseguire la conta delle cellule morte (blu) mediante l’utilizzo di camera di Burker; 1. Calcolare il numero totale di cellule vive e morte presenti nella sospensione mediante la seguente formula: N°cells = (media almeno di 2 quadrati) x (10.000) x (volume di sospensione) X eventuale fattore di diluzione 13. Calcolare la percentuale di vitalità facendo il rapporto percentuale tra numero di cellule vive e numero di cellule in totale (vive + morte): vitalità (%) = 100 x (N° cells vive) / (N° cells totali) 13. Piastrare le cellule in piastre Petri ad una opportuna concentrazione 14. Indicare sul coperchio della piastra il nome dell’operatore, il nome delle cellule, la data di scongelamento ed il passaggio di coltura. 5) CONGELAMENTO DELLE CELLULE Materiale necessario - PBS (Phosphate-Buffered Saline), utilizzato come soluzione di lavaggio - soluzione 0.05% Tripsina/EDTA (0.05%), utilizzata per staccare le cellule dal substrato - terreno completo, contenente il siero fetale bovino, necessario a bloccare l’attività della tripsina - terreno di congelamento, contenente terreno completo 90% e il dimetilsulfossido (DMSO) per il restante 10% Procedura 1. Preparare le etichette delle criovials scrivendo il nome delle cellule, il numero di cellule da congelare (100.000 cells), la data ed il passaggio di coltura; 2. Preparare il terreno di congelamento 9 ml di siero fetale bovino/ terreno di coltura e 1 ml di DMSO; 3. Lavare le cellule con PBS per 1 volta; 4. Tripsinizzare le cellule per staccarle dal substrato; 5. Recuperare le cellule con terreno completo per inattivare l’attività enzimatica e trasferire il tutto in tubi da centrifuga da 15 ml; 6. Centrifugare le cellule a 1200 rpm per 5 mim; 7. Rimuovere il surnatante mediante aspirazione; 8. Risospendere il pellet cellulare con terreno completo; 9. Contare le cellule mediante l’utilizzo di camera di Burker (mostrata in foto) 10. Centrifugare le cellule a 1200 rpm per 5 min; 11. Rimuovere il surnatante mediante aspirazione; 12. Aggiungere un volume di terreno di congelamento tale da poter avere al massimo 3.000.000 cells per ml di terreno; 13. Dispensare 1 mL di sospensione cellulare per criovial; 14. Mettere le vials in un contenitore con isopropanolo e tenerle a –80°C per 1-2 gg; 15. Trasferire le criovial in azoto liquido. 6) Primaria di cartilagine Procedimento: 1. Pulire il tessuto cartilagineo 2. Lavare in PBS 3. Sminuzzare il tessuto cartilagineo in frammenti e lavare in PBS Digerire con: 4. 2,5% tripsina in PBS. Incubare 30’ a 37°C, centrifugare o decantare per gravità ed eliminare il sovranatante 5. MIX di collagenasi I4000U/ml) e Tripsina (2,5%) in PBS, incubare 1h a 37°C. 6. Recuperare il sovranatante, centrifugare a 1800 RPM x 10’ e piastrare il pellet in una petri. 7. Le cellule si coltivano in terreno completo con 10% FCS+ L-Glutammina+ Pen/Strep 7) Colorazione DAPI 1. Rimuoveo il terreno. 2. Aggiungere ad una petri da 3cm Triton 0,5% in modo da coprire la superficie e lasciare per 10 min a TA. La seconda petri non viene trattata 3. Preparo DAPI 1:10000 in PBS coperto dalla luce. 4. Rimuovo Triton delicatamente, senza fare bolle, e aggiungo la soluzione di DAPI per 5 min coperto dalla luce. 5. Rimuovo la soluzione di DAPI, lavo con PBS. 6. Posizionare vetrino copri oggetto con una goccia di PBS+ 10% glicerolo 7. Visiono al microscopio: i nuclei delle cellule appariranno colorati di blu.  COLTURA CELLULARE Insieme di cellule mantenute “in vitro” derivanti dalla disgregazione di tessuti o isolate da fluidi biologici come il sangue. Le cellule vengono poste a contatto di tutti i fattori e metaboliti necessari alla loro crescita. SPERIMENTAZIONE PRECLINICA IN VITRO: VANTAGGI: sistemi semplificati e altamente riproducibili, consentono l’analisi di meccanismi cellulari e molecolari. Controllo ambientale, economicità e rapidità di risposta, disponibilità. SVANTAGGI: sistemi semplificati rispetto ad un organo integrato, condizioni di esposizione alle sostanze diverse da quelle in vivo, difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo, le sostanze somministrate possono interagire con il terreno di coltura. TECNICHE STERILI O ASETTICHE: Per impedire la contaminazione accidentale dovuta a microbi provenienti da fonti esterne. Per impedire la contaminazione di sé stessi o di terzi. METODI DI STERILIZZAZIONE: - Sterilizzazione al calore rosso su fiamma - Sterilizzazione al calore secco mediante l’utilizzo di un forno ad una temperatura di circa 160 C per almeno 2 h. Particolarmente indicata per la vetreria di laboratorio - Sterilizzazione al calore umido mediante l’utilizzo dell’autoclave a 121 C per almeno 15 min. Particolarmente indicata per mezzi liquidi non sensibili al calore e per la vetreria di laboratorio dopo l’uso LABORATORIO DI COLTURA CELLULARE: - Spazio o area di lavoro - Abbigliamento da laboratorio - Reagenti colturali - Vetreria e Plastica di laboratorio - Cappa a flusso laminare CAPPA A FLUSSO LAMINARE - Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec. I f iletti di aria sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici. - Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%.  - Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell’operatore e dell’ambiente CAPPE BIOLOGICHE DI CLASSE II maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologica CAPPE BIOLOGICHE DI CLASSE III caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all’interno della camera sono consentite da due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa. I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull’aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull’aria in uscita - Protezione totale dell’operatore e dell’ambiente. - Manipolazioni ad alto rischio biologico LE COLTURE CELLULARI VENGONO VISUALIZZATE CON MICROSCOPIO OTTICO INVERTITO: - La luce proviene dall’alto e l’obiettivo è posizionato in basso - Consente di osservare cellule poste in una piastra, cosa impossibile con un normale microscopio ottico a causa dello spessore del contenitore. CONDIZIONI FISICO-CHIMICHE All’interno dell’organismo, le funzioni vitali (nutrizione, controllo di pH, protezione, mantenimento della temperatura…) sono regolate nei tessuti da differenti sistemi di controllo. Una volta che le cellule sono nel terreno di cultura, queste funzioni, oltre all’ambiente di cultura, devono essere sostituite dallo strumento. - PH 7.2-7.4 - Sistema tampone (NaHCO3) - Temperatura 35-37° per le normali cellule animali e cellule umane Le cellule coltivate richiedono un controllo di temperatura rigoroso almeno quanto quello dell’organismo vivente. Anche se normalmente le cellule di mammifero si coltivano a 37° C, per certi tipi di cellule l’incubatore deve poter essere regolato in modo preciso anche a 30° C o 34° C. Molte culture cellulare sono tamponante con bicarbonato per mantenere costante il pH. Il pH del terreno dipende generalmente dalla % CO2 nell’incubatore. La concentrazione di CO2 richiesta può andare da 0,5% a 8,5% in funzione del contenuto di NaHCO3 nel terreno utilizzato e del pH desiderato. In alcuni casi si può incorporare nel medium di crescita un colorante sensibile al pH per avere un controllo visivo dello stato del pH durante la crescita. ROSSO FENOLO - Rosso-arancio a pH 7.3 - Rosso-viola a pH alcalino - Giallo-arancio a pH acido La pressione parziale (pCO2) di CO2 (5%) usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 cellulare misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg, equivalgono al 4.6- 5.9% di CO2). Così l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule. ISOLAMENTO DI CELLULE 1) Triturazione tessuto 2) I frammenti vengono sottoposti all’azione di agenti chelanti (EDTA,) o enzimi proteolitici (tripsina o collagenasi) che degradano la matrice del tessuto MEZZO DI CULTURA: Terreno di cultura liquido per dare nutrimento alle cellule SOSPENSIONE CELLULARE MISTA APPROCCI PER SEPARARE I DIVERSI TIPI CELLULARI: proprietà fisiche, capacità di adesione, proprietà di legame con anticorpi specifici, uso di terreni o condizioni di coltura selettivi. Tipi di coltura di cellule “in vitro” -> coltura primaria e coltura secondaria CULTURA PRIMARIA CULTURA PREPARATA DIRETTAMENTE DA UN TESSUTO: le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro dopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita). Vantaggi: le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo. Svantaggi: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo termine. LINEA CELLULARE CONTINUA ISOLAMENTO DI CEPPI CLONALI: il programma genetico dalla senescenza è stato annullato attraverso mutazioni spontanee o indotte. DERIVAZIONE: da colture primarie di tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie non tumorali. Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose. Vantaggi: cellule (clonali) più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie. Svantaggi: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico cellulare. Capacità di crescere indipendentemente dall’organismo da cui è derivata. Crescita ininterrotta per oltre un anno. Immortale. LINEA CELLULARE CONTINUA: - Capacità di crescere indipendentemente dall’organismo da cui è derivata. - Crescita interrotta per oltre un anno. - Immortale. CICLO VITALE DI CELLULE PRIMARIE: Le prime Linee cellulari continue: HELA e RAJI HELA Le cellule HeLa (chiamate anche Hela o hela) sono cellule tumorali immortalizzate altamente stabilizzate, molto utilizzate nella ricerca scientifica. Questa linea cellulare è stata isolata da un cancro della cervice uterina di Henrietta Lacks (dal cui nome deriva quello delle cellule), che morì di questo cancro nel 1952. COLTURE CELLULARI NORME DI SICUREZZA NEL LABORATORIO DI COLTURE CELLULARI: Definizione di agente biologico: qualsiasi microrganismo, anche geneticamente modificato, una coltura cellulare o un endoparassita umano che potrebbero provocare infezioni, allergie o anche intossicazioni. Per microrganismo si intende un'entità microbiologica, cellulare o meno, in grado di riprodursi e trasferire materiale genetico. Coltura cellulare: il risultato di una crescita in vitro di cellule derivate da organismi pluricellulari. VALUTAZIONE DELLA PERICOLOSITA’ DI UN AGENTE BIOLOGICO: - Infettività: ovvero la capacità di resistere alle difese dell'ospite per replicarsi nell'organismo stesso. - Patogenicità: capacità di produrre malattia. - Trasmissibilità: ovvero la capacità di essere trasmesso da un soggetto infetto ad un soggetto sano. - Neutralizzabilità: disponibilità di misure per contrastare la proliferazione dei microrganismi e quindi misure profilattiche per prevenire o curare un'infezione. CULTURE CELLULARI: MODALITA’ DI COMPORTAMENTO 1) Il laboratorio di colture cellulari deve essere ad uso esclusivo delle culture cellulari 2) Usare cappe a flusso laminare sterile, verticale. 3) Sostituire periodicamente prefiltri e filtri della cappa. 4) Il piano di lavoro deve essere pulito prima di iniziare a lavorare e dopo aver finito di lavorare con alcool denaturato 5) Quanto gli operatori SONO ASSENTI accendere gli UV germicidi nel piano di lavoro e nella stanza. 6) Tutto il materiale utilizzato, vetro o plastica, soluzioni, deve essere rigorosamente sterili  7) Indossare i guanti 8) Usare un pipettatore elettrico 9) Colture inquinate vanno isolate, incubate con un disinfettante e quindi autoclavate 10) Sterilizzazione del materiale delle soluzioni: a. A secco (2h, 180°C) b. In autoclave (120°C, 30’) c. Per filtrazione (con eventuale sistema di aspirazione) COLTURA PRIMARIA COLTURA PREPARATA DIRETTAMENTE DA TESSUTO: le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro dopo le quali vanno incontro a senescenza (fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti appropriati per la crescita). VANTAGGI: le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo SVANTAGGI: vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo termine LINEA CELLULARE CONTINUA - Capacità di crescere indipendentemente dall’organismo da cui è derivata - Crescita ininterrotta per oltre un anno - Immortale MEDIUM DI CULTURA I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule. I più comuni terreni base di coltura: - MEM: Minimum Essential Medium - DMEM: Dulbecco smodification of MEM - RPMI: Roswell Park Memorial Instit Differiscono per la concentrazione in amminoacidi e Sali e per la concentrazione di glucosio. MEDIUM DI COLTURA SALI INORGANICI Essenziali per la crescita e il mantenimento delle funzioni cellulari e agiscono anche come tampone per le fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali o ai prodotti del catabolismo. - Cloruro di calcio anidro - Solfato di magnesio anidro - Cloruro di potassio - Nitrato di potassio - Cloruro di sodio - Fosfato di sodio bibasico - Bicarbonato di sodio VITAMINE Agiscono come catalizzatori o come substrati per facilitare o controllare alcune funzioni metaboliche. - Biotina - Pantotenato - Acido folico - Inositolo - Nicotinamide - Piridossina - Riboflavina - Tiamina - Vitamina B12 AMMINOACIDI-ISOMERI L Necessari per la sintesi delle proteine. ZUCCHERI Glucosio: rappresentano la principale fonte di energia o di carbonio per le biosintesi. Glucosio: più o meno di ad alti livelli. La dose di glucosio modifica molto il comportamento cellulare perché va a modificare il metabolismo. Conservato a 4° C il nutrimento in bottiglia e deve essere addizionato di glutammina, antibiotici, siero fetale di mucca. Terreno completo. MEDIUM DI COLTURA Il terreno base viene conservato a 4 C e, prima di essere utilizzato, viene complementato con: - Glutammina (aa essenziale molto labile) - Antibiotici (penicillina/streptomicina) - Siero (supplemento più comune delle colture cellulari) SIERO: miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule. - Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF - Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina - Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS) L’uso del siero è controverso: - effetti positivi: protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità, introduce fattori di crescita ed ormoni, veicola lipidi, ferro e molecole organiche, favorisce interazione fra cellule e substrato, contiene inibitori della tripsina. - Effetti negativi: possibile tossicità degli anticorpi, variabilità da lotto a lotto, inibitori metabolici, fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari. COME SI FA A CAPIRE IL PH DEL TERRENO: - Quanto il pH è intorno a 7.3: valore fisiologico, il colore del terreno è rosso-arancio - A pH acido (6.8-7.0) il colore vira al giallo: con il proliferare delle cellule il pH del terreno si acidifica per la produzione di CO2 da parte del metabolismo cellulare: il terreno va cambiato. - A PH basico (>7.5-7.6) il colore vira al rosso-viola: tale colorazione indica che le cellule non sono metabolicamente attive. PREPARAZIONE TERRENI PER COLTURE Materiale necessario: - terreno di base - pen/step: penicillina 10.000 U/ml + streptomicina 10.000U/ml - glutammina - siero fetale bovino “NOTA ” La preparazione del terreno deve essere rigorosamente eseguita utilizzando cappe sterili PREPARAZIONE TERRENO DI COLTURA - 500 ml Terreno - 50 ml FBS - 5ml Pen/Strep - 5ml Glutammina PROCEDURA Per la preparazione di 500 mL di terreno completo: “NOTA ?ml ” Il terreno completo è conservato a 4°C, può essere utilizzato nello spazio di 2-3 mesi. La glutammina tende a degradarsi più in fretta rispetto agli altri fattori, e va aggiunta nuovamente nelle corrette proporzioni dopo un mese dalla preparazione del terreno. SISTEMI DI CRESCITA DIPENDENZA DALL’ANCORAGGIO: attacco indispensabile per la proliferazione - MONOSTRATO: le cellule aderiscono ad un substrato e crescono fino a confluenza. - La crescita cessa in risposta a segnali inibitori dell’ambiente: o Esaurimento fattori di crescita o Contatto con cellule circostanti INIBIZIONE DELLA CRESCITA ESURIMENTO FATTORI DI CRESCITA INIBIZIONE DA CONTATTO SUPPORTO DI COLTURA La plastica per coltura è generalmente in polistirene, trasparente al microscopio. Viene trattata per essere sterile e atossica nei confronti delle cellule. La superficie è idrofila e carica negativamente, in modo da favorire il legame dei fattori di adesione presenti nel siero o aggiunte dall’operatore in un secondo momento. Nel caso di colture cellulari in sospensione è necessario usare plastica trattata appositamente allo scopo di inibire l’adesione delle cellule alla superficie. I supporti di coltura maggiormente usati sono le piastre multiwell, le piastre Petri e le fiasche. PLASTICA PER COLTURA Sono generalmente in polistrirene; - materiale rigido con superficie lucida - buona resistenza chimica a soluzioni acquose - limitata resistenza a solventi-totale assenza di tossicità per le cellule in coltura-trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio - la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero) TIPI DI PIASTRE TRIPSINIZZAZIONE E CONTA CELLULARE: MATERIALE NECESSARIO: - PBS (Phosphate-Buffered Saline), utilizzato come soluzione di lavaggio. Il PBS serve a mantenere il pH e il bilancio osmotico corretti e a rimuovere gli inibitori delle proteasi, presenti nel siero. - Soluzione 0.05% Tripsina/EDTA (0.05%), utilizzata per staccare le cellule dal substrato. Le soluzioni di tripsina sono spesso integrate con altri enzimi (collagenasi) o con agenti chelanti (EDTA) per migliorare la sua attività. - Terreno completo, contenente il siero fetale bovino, necessario a bloccare l’attività della tripsina, grazie alle proteine del siero. Soluzione di EDTA e tripsina - EDTA: chela il Ca2+ e il Mg 2+, indispensabili per l’adesione - Tripsina: enzima proteolitico, derivato da pancreas porcino. Degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti al substrato PROTOCOLLO DI TRIPSINIZZAZIONE MANCANO I PRIMI 5 PASSAGGI - Centrifugare le cellule 10 min a 1500 rpm; - Rimuovere il surnatante mediante aspirazione; - Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di terreno completo; - Trasferire la sospensione in una provetta e centrifugare 5 min per 900-1000 giri al min  - Aspirare il solvatante - Aggiungere il terreno fresco e separare le cellule - Distribuire nelle nuove piastre Tutte le operazioni dovrebbero essere svolte con rapidità in modo da tenere le cellule fuori dall’incubatore il minor tempo possibile EFFICIENZA DI SEMINA - Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densità non crescono in modo efficiente - Regola generale: densità > 104 cellule/cm2 TEMPO DI DUPLICAZIONE - La popolazione cellulare cresce in modo esponenziale: il numero di cellule raddoppia ad ogni duplicazione - Il tempo impiegato per ogni duplicazione è caratteristico di ogni linea cellulare: circa 20-24 ore per le cellule animali e 24-30 ore per le cellule umane CONTA CELLULARE Diversi metodi: un metodo semplice ed economico è l’uso dell’emocitometro o camera di Burker La camera è costituita da un vetro in cui è ricavata una camera capillare; la parte superiore della camera è costituita da un vetrino bloccato lateralmente. Procedura: - Preparare la sospensione cellulare - Trasferire una piccola quantità di sospensione cellulare nella camera del vetrino, permettendo il riempimento per capillarità - Contare le cellule nel quadrato centrale e nei quattro quadrati agli angoli - Ciascun quadrato ha un volume di 0.1mm3 Risospeso il pellet cellulare in 1-3 ml di terreno completo. Si contano le cellule presenti all’interno di almeno 2 quadranti della camera (quadrati rossi); Calcolare il numero totale di cellule presenti nella sospensione mediante la seguente formula: N°cells = (media di 3 quadrati) x (10.000) x (volume di sospensione) Piastare le cellule in ragione di: - 100.000/pozzetto di una multiwell da 6 pozzetti - 50.000/pozzetto di una multiwell da 24 pozzetto Aggiungere 2,5 mL di terreno completo per ogni pozzetto di una multiwell Numero di cellule: - La sospensione cellulare viene risospesa in egual volume di Trypan blue - La sospensione viene fatta scorrere per capillarità all’interno della cameretta - Si contano le cellule non colorate e quelle colorate N.B. colorante trypan blue, utilizzato per il test di vitalità cellulare in quanto permette di discriminare le cellule vive e da quelle morte (le prime appaiono traslucide al microscopio, mentre le seconde sono colorate di blu) COLORANTI VITALI CONTA CELLULARE E CALCOLO DELLE DUPLICAZIONI CELLULARI CONTAMINAZIONE - AMBIENTALE: stanze per colture cellulari a norma, pulizia delle superfici, non portare materiale fuori dalla stanza culture. - OPERATORE: le colture cellulari possono essere contaminate (virus) o trasformarsi durante l’uso. Procedure e tecniche che riducono il rischio per l’operatore (cappe e flusso laminare, dispositivi di protezione individuale). Le culture cellulari di derivazione umana devono sempre essere considerate pericolose. - COLTURE: più frequenti da lieviti, funghi e micoplasmi; possono uccidere le colture (lieviti, funghi e batteri) o alterare le caratteristiche delle cellule (micoplasmi) È necessario lavorare in condizioni di sterilità. LA STERILITA’ È UN PREREQUISITO IN TUTTE LE FASI DI UNA COLTURA E PER OGNI TIPO DI COLTURA I terreni che si utilizzano quando si lavora con le colture cellulari costituiscono un substrato ottimale non solo per le cellule ma anche per i microrganismi che contaminano le colture cellulari. Bisogna quindi prevenire le contaminazioni o, nel caso in cui si verificano, cercare di eliminarle. I rischi di contaminazione per le colture cellulari li troviamo a vari livelli. Nelle colture primarie i campioni che derivano da soggetti umani o animali sono di per sé a rischio di contaminazione proprio perché derivano da un organismo intero e quindi possono portare con sé eventuali agenti patogeni o infettanti già presenti nei campioni di partenza. Altre fonti di contaminazione sono le modalità con cui allestiamo una coltura cellulare: in tutte la fasi bisogna stare attenti ad evitare di portarsi dietro agenti contaminanti. Molti reagenti che si usano per lavorare con le colture sono di origine animale e quindi possono essere veicolo di contaminazioni (es. il siero). I laboratori spesso non sono idonei per la coltivazione delle colture cellulari perché anche se esistono delle regole generali frequentemente si hanno difficoltà di natura pratica. Si cerca quindi di mantenere le condizioni sine qua non maspesso bisogna scendere a compromessi dovuti dalla struttura e dal personale che ci lavora. Infine, abbiamo l'uso sistematico di antibiotici per le colture cellulari. Quando però si fa un uso troppo vasto di antibiotici si selezionano ceppi resistenti che, quando si verifica la contaminazione, non sono facili da radicare: quindi l'uso degli antibiotici deve essere limitato solo per colture cellulari delicate, importanti o difficilmente reperibili. Le contaminazioni possono essere: - Di tipo chimico, come residui di detergenti e disinfettanti o anche la presenza di impurità o tossine presenti nell'acqua che si usa nelle normali procedure di laboratorio. - Di tipo biologico, come contaminazioni derivanti da microrganismi che vanno a contaminare la coltura o anche contaminazioni derivata da altre cellule come nel caso delle cellule Hela che hanno una velocità di duplicazione molto elevata rispetto alle altre cellule. Quello che deve essere tenuto presente è che nessuna di queste due contaminazioni può essere eliminata al 100% ma si può tenere sotto controllo CONTAMINAZIONE DELLA COLTURA I microrganismi contaminanti possono essere: - batteri, che sono la contaminazione più diffusa - miceti (muffe o lieviti) - virus, anche se in questo caso la contaminazione è abbastanza rara infine, possiamo avere contaminazioni da micoplasma, una delle più frequenti contaminazioni che si hanno quando si lavora con le cellule. I rischi di contaminazione derivano quindi sia dal donatore (nel caso delle colture primarie) sia dall'operatore e dal laboratorio. Norme precauzionali per la riduzione ed eliminazione delle contaminazioni: Al momento del prelievo bisogna stare attenti a lavorare in condizioni di sterilità perché è il primo passo di possibili fonte di contaminazione; durante la preparazione delle cellule stesse; anche nella coltivazione bisogna sempre e comunque mantenere condizioni che tengano sotto controllo le contaminazioni. CONTAMINANTI I virus sono una contaminazione rara e sono contaminazioni difficilmente riconoscibili (tranne se determinano effetto citopatico, ovvero le cellule vanno incontro a lisi). I virus possono anche integrarsi nel genoma dell'ospite e possono quindi trasmettersi alle cellule figlie sempre senza dar segno di ciò. Virus di derivazione umana o animale, come i retrovirus ed il virus di SV40, non sono considerati dei contaminanti perché convivono all'interno delle cellule senza dare alcun problema, quindi senza alterare morfologia e metabolismo delle cellule. Talvolta possono essere usati per la trasformazione di cellule di colture primarie in colture stabilizzate. I batteri invece sono facilmente individuabili e visualizzabili in una coltura cellulare. Una contaminazione di tipo batterico alla fine porta alla morte delle cellule. I più comuni batteri che possiamo ritrovare come contaminanti delle colture cellulari sono soprattutto gram positivi come vari tipi di staphylococcus che sono naturalmente presenti nell'epidermide, nell'apparato digerente, nelle mucose. Anche gli streptococchi sono spesso presenti nelle colture soprattutto quelli di tipo B emolitici. Quando ci accorgiamo di una contaminazione batterica bisogna disfarsi della coltura e buttar via tutto ricominciando da capo. Anche i funghi sono facilmente visualizzabili e riconoscibili tramite osservazione al microscopio, possono essere unicellulari come i lieviti o pluricellulari come le muffe. La candida albicans è uno dei funghi che più spesso infetta le colture cellulari. I funghi possono essere eliminati dalle coltura utilizzando specifici farmaci antimicotici, ma se la coltura non è preziosa è meglio ricominciare da capo l'esperimento. Infine, abbiamo i micoplasmi che sono uno dei problemi più grandi. Effettuano una contaminazione insidiosa con effetti a lungo termine. Tutti i risultati che si ottengono con una coltura cellulare infettata dai micoplasmi vanificano ogni risultato sperimentale. Gli effetti che i micoplasmi provocano sulle cellule sono: - Le cellule cominciano a crescere meno, la loro capacità di proliferazione rallenta (primo segnale che qualcosa non va). - Alterazioni morfologiche nelle cellule. - Aberrazioni cromosomiche (come anche taglio del DNA in vari frammenti). - Alterazioni metaboliche sia a livello del metabolismo degli AA che degli acidi nucleici. Tutte modificazioni che falsificano la sperimentazione. CONTAMINAZIONI DA PARTE DI BATTERI E MICOPLASMI: La contaminazione da parte di batteri e micoplasmi è quella che causa più problemi ai biologi cellulari. È importante identificare l'origine ed il tipo di contaminazione con cui abbiamo a che fare per poter arginare una eventuale epidemia. I batteri effettuano una contaminazione visibile e, nell'arco di 24-48, subito uno se ne accorge. In presenza di moltissime contaminazioni di vari tipi di batteri si ha una variazione del pH dei terreni di coltura. Come abbiamo già visto, nel terreno di coltura si aggiunge una sostanza in grado di virare di colore a seconda del pH del mezzo. Nel caso di una infezione da batteri si ha un forte abbassamento del pH ed il colore del terreno di coltura diventa completamente giallo. Se la fiasca è completamente gialla qualcosa non è andata bene. Non appena abbiamo rilevato una eventuale contaminazione, possiamo osservare al microscopio la nostra cultura per avere una eventuale conferma di contaminazione. Al microscopio, nel caso dei batteri, si possono vedere forme a cocchi o bastoncelli mobili; i lieviti appaiono come particelle rotonde ed ovali mentre i funghi come filamenti che possono presentare anche spore. COME PREVENIRE LA CONTAMINAZIONE: - Evitare di aggiungere antibiotici di routine per evitare di selezionare ceppi resistenti. - Non pipettare mai a bocca (ormai ci sono i pipettatori automatici). - Non mangiare, bere, fumare in laboratorio e non parlare durante la manipolazione della coltura su cappa. - Accurata pulizia delle mani e delle superfici. - Tenere in quarantena qualsiasi materiale sospetto ed eliminare quello infetto per evitare di contaminare anche altre colture. - Utilizzare materiale monouso sterile e strumenti sterilizzati. - Utilizzo di soluzioni e terreni sterili. - Manipolare tutto nella cappe a flusso laminare. - Saggiare il funzionamento delle attrezzature come autoclavi, stufe e distillatori. - Monitorare i terreni di coltura, la tripsina ed i sieri. Quando si fa lo stoccaggio del siero, se non lo si fa in condizioni di assoluta sterilità, chiunque va ad utilizzare quella aliquota avrà una coltura contaminata. - Non fare entrare in laboratorio estranei e non addetti al lavoro. Le fonti di contaminazioni sono quindi: - Operatori - aria ambientale - recipienti - liquidi per colture - trasmissione della contaminazione per aerosol da una coltura ad un'altra. METODI PER STERILIZZARE: La sterilizzazione è in grado di uccidere la maggior parte dei germi, sia quelli patogeni che quelli non patogeni, anche agenti che possono fare spore resistenti.  - Abbiamo una sterilizzazione per filtrazione con vari filtri come quelli a siringhe, per sterilizzare volumi piccoli da 1 a 100 ml, o filtri a caffettiera per sterilizzare volumi che arrivano fino ad un litro. - La sterilizzazione si può fare anche con raggi UV efficaci per le superfici esposte agli UV dato che danneggiano il DNA. - Altra sterilizzazione è quella mediante calore che altera la struttura delle macromolecole inibendo le funzioni essenziali dei microrganismi. Alcune specie però non sono eliminabili da queste metodiche come quelli che producono spore. Il calore viene utilizzato in concomitanza ad un ambiente umido sotto forma di vapore saturo sotto pressione che è quello migliore. La sterilizzazione, inoltre, può essere effettuata tramite autoclavi per materiali che non sopportano temperature maggiori di 160 gradi (es. plastiche e terreni). La durata è generalmente di 15-20 minuti. Sopra il materiale da sterilizzare si mette del nastro adesivo che a temperature superiori ai 120 gradi cambia di colore permettendoci di avere una conferma della sterilizzazione. La sterilizzazione a secco si usa invece per la vetreria per temperature superiori di 160 gradi per 2 ore circa o più. Anche qui si usa un nastro specifico di rilevazione. Infine, abbiamo i detergenti e disinfettanti per le mani che hanno una attività germicida per lungo tempo e ad ampio spettro oltre a non essere tossici o irritanti per l'operatore. AEROSOL Una delle possibili fonti di contaminazione per le cellule e gli operatori è l'aerosol. Esso è un importante veicolo di infezione che si origina per via area per quei microrganismi che sono capaci di trasmettersi per via area e possono colonizzare l'apparato respiratorio sia come fonte di ingresso che come fonte di passaggio: ad esempio streptococchi, agenti eziologici della rabbia e della mononucleosi. Il materiale che si allontana dalle vie respiratorie forma delle goccioline di diametro variabile fino a mille micron sotto forma di aerosol che si disperde con l'aria; questo materiale può rimanere in sospensione anche per molto tempo. Queste goccioline vengono anche dette dropplet o nuclei. Il tempo di sopravvivenza dei microrganismi presenti nelle goccioline è importante soprattutto per quei microrganismi che hanno un meccanismo di trasmissione tramite aerosol. MICOPLASMA: INTRODUZIONE Luso di colture cellulari pone dei rischi di contaminazione sia da una linea cellulare all’altra sia, più frequentemente, con funghi e batteri. Tra le infezioni batteriche, quelle da micoplasma sono di particolare importanza perché, essendo parassiti intracellulari, non rendono torbido il terreno e possono essere rilevati solo con metodi specifici. Questi batteri hanno un diametro di 0.2-0.3 µm e poiché non hanno la parete cellulare sono resistenti agli antibiotici di uso comune. Le infezioni accumulate in tutto il mondo nel passato hanno portato ad un tasso di infezione medio del 25%. Esiste però un’alta variabilità tra diversi laboratori e capita spesso che un certo laboratorio sia infettato da una stessa specie di micoplasma o non lo sia. Questo indica che una coltura cellulare contaminata è probabile che rappresenti la principale sorgente di infezione. Comporta quindi un pericolo costante importare da altri laboratori cellule contaminate e coltivarle insieme a cellule mycoplasma-free. Evidenze assodate mostrano che le infezioni da micoplasma sono connesse con le tecniche di colture cellulari dei vari laboratori. Quindi non è solo importante testare le linee cellulari ed eradicare il micoplasma, ma anche la prevenzione delle infezioni all’interno delle colture cellulari di routine. MICOPLASMA: PREVALENZA DELLE CONTAMINAZIONI La prevalenza delle infezioni è molto più bassa per le colture primarie (1%) rispetto alle colture continue (15%- 35%). Questo indica che la contaminazione è introdotta durante la propagazione. Tra le venti specie di micoplasma isolate, sei (M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale, and Acholeplasma laidlawii) contano per il 95% delle infezioni. Lesatta sorgente di infezione non è ben capita perché le specie predominanti nelle colture cellulari sono associate con l’uomo, il bovino ed il suino. Le specie umane M. orale, M. fermentans, and M. hominis che danno metà delle infezioni si trovano fisiologicamente nel tratto orofaringeo. Questo indica che l’infezione deriva dal personale di laboratorio. Le specie di origine bovina (M. arginini and A. laidlawii) infettano le linee cellulari probabilmente attraverso il siero bovino non ben testato all’origine. La specie M. hyorhinis infetterebbe le colture cellulari attraverso l’uso della tripsina di origine suina usata per staccare le cellule dalle fiasche. Unaltra sorgente di contaminazione potrebbe essere l’azoto liquido, quindi si raccomanda di tenere le ampolle congelate nella fase gassosa dell’azoto per prevenire delle contaminazioni. MICOPLASMA: RILEVAMENTO DELLE CONTAMINAZIONI I metodi per rilevare le infezioni da micoplasma sono vari. Possono essere metodi: - microbiologici con crescita in terreni di coltura specifici o su agar; - di microscopia elettronica;  - biochimici con saggi enzimatici specifici o rilevando la produzione di ATP tramite luciferasi; - immunologici tramite immunofluorescenza o test ELISA; - di biologia molecolare tramite saggi di ibridazione o PCR con primer specifici delle regioni di DNA ribosomiale 16S; di microscopia a fluorescenza tramite colorazione diretta con DAPI o di ibridizzazione in situ fluorescente. Il metodo usato nel nostro laboratorio è basato sull’estrazione del DNA cellulare dopo coltura in assenza di antibiotici e successiva PCR con primer specifici del DNA ribosomiale 16S. BATTERI (BACILLI) INGRANDIMENTO 320X. I BATTERI APPAIONO COME PULVISCOLO NEGLI SPAZI TRA LE CELLULE. LIEVITI: LIEVITO (CANDIDA) INGRANDIMENTO 100X FUNGHI FUNGO (MUFFA) INGRANDIMENTO 100X Gli antibiotici il più comunemente usati sono: Questi antibiotici risultano efficaci sia contro i batteri gram-positivi che i batteri gram-negativi. È sconsigliato aggiungere a colture contaminate cocktail di molti antibiotici perché usati insieme possono provocare un effetto tossico cumulativo sulle cellule. MICOPLASMA MICOPLASMA: ERADICAZIONE DELLE CONTAMINAZIONI Il modo migliore per eradicare una contaminazione da micoplasma è buttare via la coltura e sostituirla con una non contaminata. Purtroppo, spesso per vari motivi è necessario eliminare la contaminazione senza alterare le cellule. Oltre ai metodi fisici, chimici e immunologici non molto efficaci, quello che viene usato è il trattamento con antibiotici specifici. Tre gruppi di molecole sono efficaci: i macrolidi e le tetracicline che inibiscono la sintesi proteica legandosi alle subunità ribosomiali e i quinoloni del DNA. che inibiscono l’enzima girasi fondamentale per la replicazione. Tra i quinoloni abbiamo la ciprofloxacina e la enrofloxacina mentre il macrolide tiamulina e la tetraciclina minociclina fanno parte del prodotto BM-ciclina fornito dalla Roche. L’efficienza di eradicazione varia tra il 66% e l 85% a seconda dell’antibiotico usato. Questi numeri riflettono però anche la perdita della coltura per inibizione della crescita dovuta a tossicità. Questo avviene quando la coltura è molto infetta e già in non buone condizioni. La Banca cellule San Martino è operativa dal 1994 per raccolta, controllo di qualità, espansione, conservazione e distribuzione di linee cellulari umane e animali, con l'obiettivo di fornire ai ricercatori dell’ospedale e alla comunità scientifica prodotti di qualità certificata e servizi di controllo di qualità e monitoraggio delle colture, a garanzia dell'affidabilità e riproducibilità dei risultati della ricerca. Produce linee cellulari per i ricercatori, fornisce un servizio di supporto scientifico e informazioni sulle normative e linee guida di riferimento, anche grazie ai legami con i principali Centri di Risorse Biologiche a livello europeo ed internazionale (ECACC, DSMZ). In qualità di Autorità Internazionale di Deposito, unica in Italia, permette ai ricercatori di depositare richieste di brevetto per linee cellulari e ibridomi, e di monitorare la qualit‡ dei loro prodotti. La Banca biologica e cell factory fa parte del Centro biologic di risorse he dell'IST (CRB-IST), con le funzioni di assicurazione qualità e referente nell'ambito del progetto europeo BBMRI, fase preparatoria della costruzione dell'infrastruttura europea delle biobanche. SmartBank dal 2005 in Italia è la Banca delle cellule staminali del cordone ombelicale per la tua famiglia. BiotechSol garantisce: la crio-conservazione per 20 anni delle cellule prelevate, nel miglior laboratorio della Repubblica di San Marino. il trasporto del campione con kit all'avanguardia consegnato gratuitamente a casa dei genitori CONGELAMENTO DELLE CELLULE Materiale necessario: - PBS (Phosphate-Buffered Saline), utilizzato come soluzione di lavaggio - soluzione 0.05% Tripsina/EDTA (0.05%), utilizzata per staccare le cellule dal substrato - terreno completo, contenente il siero fetale bovino, necessario a bloccare l’attività della tripsina - terreno di congelamento, contenente il siero fetale bovino per il 90% e il dimetilsolfossido (DMSO) per il restante 10% Procedura - Preparare le etichette delle criovials scrivendo il nome delle cellule, il numero di cellule da congelare (100.000 cells), la data ed il passaggio di coltura; - Preparare il terreno di congelamento in ragione di 9 ml di siero fetale bovino e 1 ml di DMSO; Lavare le cellule con PBS per 1 volta; - Tripsinizzare le cellule per staccarle dal substrato; - Recuperare le cellule con terreno completo per inattivare l’attività enzimatica e trasferire il tutto in tubi da centrifuga da 15 ml;  - Centrifugare le cellule a 2000 rpm per 5 mim; - Rimuovere il surnatante mediante aspirazione; - Risospendere il pellet cellulare con terreno completo; SCONGELAMENTO DI CELLULE CRIOCONSERVATE E TEST DI VITALITA’ CELLULARE: Materiale necessario - terreno completo, utilizzato per lavare le cellule dal terreno di congelamento e per la loro successiva coltivazione in piastra - colorante trypan blue, utilizzato per il test di vitalità cellulare in quanto permette di discriminare le cellule vive e da quelle morte a seguito del congelamento (le prime appaiono traslucide al microscopio, mentre le seconde sono colorate di blu) 3D – BIOPRINTING Il Bioprinting è il processo di realizzazione ed assemblaggio di layer cellulari finalizzati alla fabbricazione di tessuti e/o organi artificiali.