Colture Cellulari - Biochimica Applicata PDF

**BIOCHIMICA APPLICATA** 2° LEZIONE 01/10/2024 **COLTURE CELLULARI** Una coltura cellulare è un modello in vitro nel quale le cellule sono separate dal resto dell'organismo e nasce per minimizzare le variazioni sistemiche nell'animale e nell'uomo. Le cellule estratte dall'organismo di origine pos...

**BIOCHIMICA APPLICATA** 2° LEZIONE 01/10/2024 **COLTURE CELLULARI** Una coltura cellulare è un modello in vitro nel quale le cellule sono separate dal resto dell'organismo e nasce per minimizzare le variazioni sistemiche nell'animale e nell'uomo. Le cellule estratte dall'organismo di origine possono essere cresciute e propagate in vitro: in adesione, in sospensione (di solito le cellule risultano tondeggianti come quelle del midollo osseo e si utilizzano delle flasc), in matrice (cellule particolari che per crescere devono attaccarsi a una matrice), libere o organizzate. Le colture cellulari possono essere utilizzate in campo: - Farmacologico: vengono utilizzate per "provare" i farmaci, quindi per screening di sostanze, per valutare l'attività proliferativa e per studiare il meccanismo d'azione dei farmaci - Tossicologico: per la valutazione della tossicità cellulare dei farmaci (deve agire su determinate cellule e non su altre) - Meccanismi molecolari - Cosmetico: per "provare" trucchi - Ricerca biomedica: per lo studio delle basi molecolari (genetiche, biochimiche) di patologie infettive, genetiche..., per l'identificazione di marcatori diagnostici/prognostici, per l'identificazione di target terapeutici e per la progettazione di test e vaccini, strategie terapeutiche e farmaci - Diagnostica - Terapia: per lo sviluppo di nuovi farmaci, terapia cellulare e tissutale in medicina rigenerativa (trapianto di pelle, cartilagine, midollo osseo), terapia genica (per curare malattie genetiche come la SMA "curata" con la spinraza), terapia per la riproduzione assistita - Biotecnologie industriali: per la sintesi di prodotti ad uso farmaceutico (insulina), alimentare (con la carne coltivata derivante da miociti messi in piastra e coltivati) ALLESTIMENTO ============ Le cellule utilizzate nelle culture cellulari possono essere prese da tessuti: - Con elevata proliferazione - Normali con elevato contenuto di cellule staminali/progenitrici: ematopoietico - Tumorali - Con scarsa attività proliferativa: connettivali, ghiandole, pancreas (molto difficile fare colture) CELLULE UTILIZZATE ================== - Fibroblasti (derivanti da tessuto connettivo): sono cellule isolate con una forma allungata e crescono in adesione - HeLa (cellule epiteliali): sono cellule confluenti che crescono in adesione. Le cellule HeLa sono la prima linea cellulare in coltura continua (la cui propagazione è indefinita) ottenuta da un ricercatore nel 1951. È una coltura cellulare di origine tumorale derivante da Henrietta Lacks, paziente affetta da carcinoma cervicale uterino da cui sono state isolate. Il ricercatore, coltivando queste cellule, nota che proliferavano in modo indefinito e le invia a tutti i laboratori del mondo - Ematopoietiche: sono cellule tondeggianti che crescono in sospensione TIPI ==== COLTURA CELLULARE PRIMARIA -------------------------- Colture composte da cellule che derivano da un espianto di tessuto o organo e possono duplicarsi solo per un numero limitati di passaggi (numero finito di divisioni), poi vanno incontro a degenerazione e morte. Le cellule vengono ottenute da frammenti di tessuti espiantati (da adulti o embrioni) o da organi freschi provenienti da organismi morti, alcune di queste sopravvivono per pochi giorni senza mai moltiplicarsi (globuli rossi), altre per settimane senza mai dividersi (cellule nervose), mentre altre crescono e si moltiplicano (fibroblasti). Quando una coltura primaria subisce la prima subcoltivazione si parla di linea cellulare che può subire un processo di invecchiamento e perdere le proprie capacità replicative e le proprie caratteristiche, oppure essere stabilizzata quindi perde le proprie caratteristiche (come inibizione da contatto) ed essere coltivabile all'infinito [PROCESSO] 1. Lavaggio della cute con acqua sterile 2. Disinfezione con etanolo 3. Prelievo del frammento 4. Separazione del derma dagli altri tessuti 5. Disgregazione tessuto: - Meccanica: con forbici da dissezione - Enzimatica: con enzimi proteolitici (per il fegato la collagenasi) - Chimica: agenti chelanti 6. I frammenti vengono posti nella petri o nella flasks 7. Viene aggiunto il terreno di coltura appropriato 8. Controllo al microscopio ottico o eventuali analisi biochimiche: ogni 2 giorni deve essere fatto il passaggio di cellule e la conta. La conta cellule viene fatta con la camera di Burker che è un reticolo che viene visto al microscopio e aiuta la conta LINEA CELLULARE --------------- Sono composte da cellule derivanti da un tumore o da una cultura primaria e immortalizzate con agenti chimici o virali, in grado di crescere in modo infinito PASSAGGIO CELLULE ================= Il passaggio di cellule (adese) consiste in una serie di passaggi per poter dividere le cellule e viene fatto a intervalli regolari. Avviene nel seguente modo: 1. Aspirare il terreno (medium) 2. Lavare la petri con il tampone sterile (PBS): viene fatto questo passaggio perché il terreno in cui sono presenti le cellule contiene un inibitore della tripsina. Non viene mai utilizzata la fisiologica ma si usa la PBS tamponata con fosfato 3. Aggiungere la tripsina: enzima che digerisce la matrice extracellulare e quindi separa le cellule 4. Incubazione a 37 °C: perché la tripsina è un enzima che agisce a questa temperatura 5. Aggiungere agenti chelanti (EDTA): eliminano gli ioni (Ca e Mg) utilizzati per attaccare le cellule a una rete di proteine che permettono l'adesione alla petri. L'**adesione** è un requisito fondamentale per permettere la proliferazione delle cellule che crescono in monostrato ed è mediata da recettori cellulari di superficie. Le piastre adatte a questo fenomeno sono in polistirene trattato con radiazioni ad alta energia ionizzante o scariche elettriche per renderle idrofile e cariche negativamente. In questo modo il polistirene lega stabilmente la fibronectina e la vitronectina presenti nel siero che permettono l'adesione di diversi tipi di cellule 6. Diluire il terreno fresco: per inibire l'effetto della tripsina 7. Centrifugo: ottengo un pellet di cellule 8. Aspiro il surnatante 9. Riprendere il pellet di cellule con il terreno fresco 10. Semino nelle piastre utilizzando la pipetta e la fiasca inclinate a 45°: le cellule non devono essere troppo diluite perché non crescono, ma neanche troppo concentrate perché non riescono a crescere visto che si verifica un'inibizione da contatto per mancanza di nutrienti e problemi di scambi gassosi 11. Conta delle cellule: tramite la camera di burker che è un reticolo in cui, tramite il microscopio, si contano le cellule per un certo numero di quadrati e si moltiplicano per i restanti CRESCITA CELLULARE ================== Monostrato: tipo di coltura in cui le cellule aderiscono alla superficie della petri Confluenza: quando le cellule hanno occupato l'intera superficie del contenitore Queste cellule possono essere adese e in questo caso vengono passate con tripsina e EDTA Sospensione: le cellule crescono sospese nel terreno di coltura. Si trovano principalmente nelle Flask e vengono prelevate con una pipetta, trasferite in una eppendorf e pellettate Possono essere utilizzati degli agenti per permettere il differenziamento delle cellule. Ad esempio i monociti crescono in sospensione, mentre i macrofagi in adesione (i macrofagi derivano dal differenziamento dei monociti) MANTENIMENTO ============ INCUBATORE ---------- Le colture vengono messe nell'incubatore per mantenere la temperatura e per creare un ambiente in cui il livello di umidità sia alla giusta percentuale per evitare che l'acqua nel terreno evapori provocando un aumento della pressione osmotica. Le condizioni in cui si trova l'incubatore sono: temperatura di 37 °C, un'umidità del 90% (per limitare l'evaporazione dell'acqua nei terreni per evitare un aumento della pressione osmotica) e una % di CO~2~ nell'aria del 5%. TERRENO DI COLTURA (MEDIUM) --------------------------- Il terreno di coltura è il veicolo per le sostanze nutritive e per i metaboliti tossici e può essere naturale (non esistono più) o sintetico (può essere completo o non completo). Il medium non completo è quello che si compra e viene utilizzato per fare il medium completo attraverso l'aggiunta di siero fetale bovino (5-10%), antibiotici (penicillina), glutammina e altre sostanze (come il glucosio), una volta pronto viene conservato a 4 °C. I più utilizzati sono il DMEM, l'RPMI e l'F12. Il terreno di coltura è costituito da: - Sali: danno una certa pressione osmotica, che non deve essere ne ipertonica per impedire che l'acqua fuoriesca e la cellula si disidrati, ne ipotonica per impedire che la cellula si gonfi d'acqua e provochi la lisi cellulare) - Ioni organici: molte reazioni hanno bisogno di ioni per avvenire - Metaboliti essenziali: come aminoacidi (nella forma L e in concentrazione tra 0,1 e 0,2 mM), vitamine (in concentrazione 1µM), glucosio (in concentrazione tra 5 e 10 mM) - pH fisiologico tra 7,2 e 7,4 - Siero (dei feti bovini): è un materiale la cui composizione è parzialmente indefinita e contiene fattori che stimolano la crescita e l'adesione cellulare. Prima dell'utilizzo deve essere disattivato in stufa a 56 °C per 30 minuti per eliminare delle proteine del completamento che potrebbe interferire con la crescita delle cellule. Se non è presente, sono necessari ormoni e fattori di crescita - Antibiotici: vanno aggiunti sempre (in alcuni casi no) e servono per sopprimere la crescita batterica - Rosso fenolo: è un indicatore di pH perché il pH deve essere circa 7,4. Il terreno può assumere una colorazione: - Gialla: le cellule stanno proliferando quindi producono CO~2~ che acidifica il terreno (pH=6,5) - Rosa: il pH è tra 7,0 e 7,4 - Viola: le cellule non sono metabolicamente attive o la regolazione della CO~2~ è errata CONSERVAZIONE ============= Le cellule vengono conservate per anni in azoto a -196 °C (crioconservazione) e per congelarle e non danneggiarle viene messo il DMSO (come crioconservante per proteggere le cellule dai danni di congelamento) e un'alta concentrazione di siero. Quando devono essere usate, si scongelano rapidamente immergendole in un bagno a 37 °C e si elimina subito il DMSO diluendo il terreno. CONTAMINAZIONI ============== Le colture cellulari possono essere contaminate da: - Lieviti: sono visibili solo al microscopio - Muffe: sono visibili a occhio nudo e possono essere causate dall'incubatore - Batteri: sono visibili solo al microscopio e rendono il terreno torbido - Micoplasmi: possono essere rilevabili solo con un test specifico FONTI DI CONTAMINAZIONE ----------------------- 1. Terreno di coltura 2. Materiale 3. Operatore 4. Incubatore 5. Tessuto di partenza 6. Cappa a flusso laminare: Non è una cappa chimica (non si usano ne agenti chimici ne composti infiammabile o fiamme libere) ma è una cappa che viene utilizzata in ambito biologico per proteggere l'operatore e l'ambiente circostante da agenti biologici eliminando le contaminazioni e lavorando in condizioni di sterilità. L'aria passa attraverso dei filtri HEPA (efficienza tra 99,97% e 99,999% per particelle di diametro di 0,3 µm) dall'alto verso il basso e per questo motivo non bisogna lasciare molto materiale sulla superficie perché si andrebbe a inibire il flusso. Come si lavora sotto cappa: - Prima di iniziare: si spruzza il materiale con etanolo e poi si inserisce sotto cappa - Durante: non toccare le pipette con le mani o con i guanti dopo averle tolte dall'involucro e non portare fuori dalla cappa bottiglie aperte - Termine: pulire la cappa con etanolo, spegnere il flusso laminare, chiudere la cappa e attivare il ciclo di UV per sterilizzare le superfici TEST DI VITALITÀ CELLULARE E CITOTOSSICITÀ ========================================== La citotossicità è la proprietà di una sostanza di produrre a livello cellulare effetti tossici che si manifestano sottoforma di modificazione dalla normale morfologia e funzionalità cellulare. I test di citotossicità rappresentano un "metodo di valutazione" dei danni biologici provocati dalle sostanze e i più diffusi sono: - Trypan blue: è un colorante utilizzato nella determinazione della vitalità cellulare in quanto viene internalizzato solo dalle cellule morte - MTT: è un saggio colorimetrico per valutare la citotossicità di farmaci o sostante chimicamente attive tramite l'utilizzo dello spettrofotometro. Consiste nella misurazione dell'attività dell'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi che riduce l'MTT (giallo) a formazano (azzurro) ed è un è attivo solo nelle cellule vive - LDH: è un saggio colorimetrico che serve a valutare la presenza dell'enzima lattato deidrogensi che è un enzima che normalmente si torva nel citoplasma delle cellule, ma in caso di danno alla parete cellulare viene riversato nel mezzo di coltura NON SONO DA SAPERE VANTAGGI ======== - Fonte continua di materiale omogeneo - Buone condizioni di crescita - Riduzione nell'utilizzo di animali - Riduzione di costi - Possibilità di conservazione per un lungo periodo - Controllo semplice e veloce della vitalità cellulare SVANTAGGI ========= - Sistemi semplificati rispetto a un organismo pluricellulare - Condizioni di esposizione diverse da quelle in vivo - Le sostanze possono interagire con i componenti del terreno (siero) BIOBANCHE ========= Raccolgono, conservano e distribuiscono il materiale biologico (linee cellulari) utile alla ricerca. Le più famose sono l'ATTC e l'european collection of cell culture che forniscono anche la scheda con tutte le informazioni per coltivare le cellule. ALTRI TIPI ========== Sono colture in 3D che costituiscono il punto di legame tra la coltura cellulare e i modelli in vivo. Le **colture d'organo** (o istotipiche) sono piccole porzioni di organo o di tessuto coltivate in vitro con vita breve in quanto i nutrienti contenuti nel terreno e l'ossigeno non riescono a raggiungere in maniera efficace le porzioni più interne. Queste porzioni vengono messe in "matrici" e, attraverso dei microfluidi che vengono fatti passare all'interno, viene analizzata la tossicità dei farmaci attraverso la produzione di determinati metaboliti. Le colture istotipiche vengono ottenute isolando le cellule e poi riaggregandole utilizzando scaffold artificiali in modo da creare una struttura simile al tessuto. Le **co-colture** sono sistemi che contengono due tipi cellulari diversi in modo da aumentare la complessità del modello in vitro. Gli **organoidi** derivano da cellule staminali (o da cellule tumorali in quanto sono cellule con proprietà rigenerative simili alle cellule staminali) coltivate in vitro che spontaneamente si autoorganizzano spazialmente in modo simile agli organi veri presentando delle caratteristiche comuni ad esso (senza la stessa vascolarizzazione o innervazione). La produzione di queste strutture segue procedure standardizzate ed è stata possibile grazie alla scoperta dei meccanismi molecolari di differenziamento dei tessuti stessi. Queste strutture non possono essere fatte per qualsiasi tessuto e sono molto utili perché possono essere trapianti nell'uomo, per la rilevazione di mutazioni genetiche che forniscono specifiche sensibilità per determinati farmaci e per la rigenerazione cellulare. Esempio: del fegato si può fare, una coltura primaria (si utilizzano degli enzimi che vanno a distruggere le interazioni cellula-cellula in modo tale da ottenere gli epatociti che poi verranno messi in piastra e coltivati, hanno una vita di circa 2 settimane), una coltura d'organo (è costituito da un piccolo pezzo di fegato, quindi, contiene diversi tipi cellulari oltre agli epatociti come cellule epiteliali, i macrofagi del fegato...). 3° LEZIONE 02/10/2024 ISOLAMENTO METABOLITI Per l'isolamento dei metaboliti: 1. Distruzione cellule/tessuti 2. Solubilizzazione proteine: viene fatto con un lysis buffer 3. Eliminazione dei contaminanti 4. Quantificazione: spettrofotometria DISTRUZIONE CELLULE E TESSUTI ============================= Può avvenire tramite metodi non meccanici o meccanici. NON MECCANICI ------------- - [Lysis buffer]: contiene - Sali: provocano uno shock osmotico attraverso l'utilizzo di soluzioni ipertoniche/ipotoniche su cellule prive di parete. Per l'isolamento di molti organelli bisogna utilizzare soluzioni iso-osmotiche per prevenire danni dovuti a stress osmotici - Detergenti: permettono la rottura della membrana e possono essere non ionici (NP-40 e Triton X-100 che sono più blandi), zwitterionici, anionici (SDS che denatura le proteine e viene utilizzato per solubilizzare le proteine da caricare nell'elettroforesi), cationici - Tamponi - Inibitori delle proteasi - Altri additivi: EDTA - [Freezing and thawing]: consiste in cicli di congelamento (in ghiaccio secco con formazione di cristalli di ghiaccio che portano alla disgregazione e alla rottura di parete e membrana) e scongelamento (a 37 °C) in modo tale da avere uno shock termico che provoca la lisi delle membrane. - [Enzimi litici]: possono essere utilizzati sia per distruggere i tessuti sia all'interno della cellula. In quest'ultimo caso abbiamo ad esempio la DNAasi che taglia il DNA in modo tale da ottenere solo le proteine. La lipasi e la proteasi vengono utilizzati per le cellule eucariote, mentre il lisozima per cellule batteriche LABORATORIO: 1. Aggiungere del lysis buffer: sul pellet cellulare viene messo un lysis buffer contenente acqua, detergenti e Sali (fino a 100 mM) in modo tale da rompere le membrane plasmatiche 2. Centrifugare: otteniamo un pellet di nuclei e il surnatante contenente l'estratto citoplasmatico 3. Aggiungere il secondo lysis buffer: contiene sempre acqua, detergenti e Sali (450 mM) MECCANICI --------- - [Sonicazione]: si basa sull'uso di onde meccaniche. Esistono diversi tipi di sonicatori, alcuni usano delle sonde, altri usano il movimento dell'acqua dovuto alle onde. Il Cobaris è l'ultima generazione che fornisce risultati più precisi - [French press]: viene utilizzata solo per cellule batteriche - [Pestello e mortaio]: vengono utilizzati per tessuti duri come le ossa in modo tale da rompere l'osso e ottenere il midollo osseo prelevabile con un pipettatore - [Omogenizzatori]: vengono utilizzati sia per tessuti molli e sono ad esempio il glass-bead, potter elvehjem e potter dounce (pipettatori di vetro con stantuffi che vengono girati e rompono il tessuto), sia per tessuti resistenti come il polytron. La loro efficienza dipende dal numero di colpi, velocità di rotazione, clearance e dalla quantità di materiale - [Centrifugazione]: è il metodo più semplice e consiste nella centrifugazione sequenziale dell'omogenato per ottenere serie di pellet che contengono materiale caratterizzato da velocità di sedimentazione decrescenti che dipende dalle dimensioni e dalla densità delle particelle, dalla densità del medium, dalla viscosità del liquido e dalla forza centrifuga. Esistono diversi tipi di centrifuga come la supercentrifuga e l'ultracentrifuga ESEMPIO: - 1000 giri x 10 min: pellet (nuclei e mitocondri pesanti) e surnatante (proteine citoplasmatiche). Il surnatante viene poi ricentrifugato - 3000 giri x 10 min: pellet (mitocondri pesanti) e surnatante (proteine citoplasmatiche). Il surnatante viene poi ricentrifugato - 10.000 giri x 20 min: pellet (lisosomi e perossisomi) e surnatante. Il surnatante viene poi ricentrifugato - 100.000 giri x 40 minuti: pellet e surnatante (componenti solubili del citoplasma) L'efficacia della separazione deve essere confermata con metodi biochimici PROTEINE ======== 1. Distruzione del tessuto e lisi cellulare 2. Solubilizzazione proteine 3. Eliminazione interferenti 4. Quantificazione DISTRUZIONE TESSUTO E LISI CELLULARE ------------------------------------ Questa operazione viene fatta su ghiaccio (anche con azoto liquido) in modo tale da ridurre al minimo l'azione delle proteasi e vengono utilizzati i metodi meccanici e non meccanici descritti sopra. Il lysis buffer utilizzato dipende dalle proteine da isolare e dalle cellule da cui si estraggono, mentre la sua quantità dipende dal numero di cellule o dalla grandezza del tessuto. Esistono buffer più delicati come quelli contenenti l'NP-40 che è un detergente non ionico (per isolamento proteine citoplasmatiche solubili) o più aggressivi come il RIPA che contiene più detergenti. Ad esempio, i tessuti più piccoli vengono prima ghiacciati e poi omogenizzati con diversi metodi (sonicazione), mentre i tessuti più grandi vengono omogenizzati con frullatori utilizzando del PBS e successivamente viene aggiunto un lysis buffer e centrifugato. In caso di cellule: - In sospensione: centrifugare le cellule a 2000 g per pellettarle, aggiungere PBS e un lyisis buffer (lisa le membrane) come il RIPA che contiene anche EDTA utile per coordinare Ca e Mg. - In piastra: eliminare il terreno, lavare con PBS e aggiungere RIPA. SOLUBILIZZAZIONE PROTEINE ------------------------- La solubilizzazione delle proteine serve per rompere le interazioni tra le proteine e impedirne l'aggregazione e la precipitazione per una migliore elettroforesi e quantificazione. La solubilizzazione avviene direttamente con l'aggiunta del lysis buffer in quanto ha un determinato pH, Sali (influenzano la solubilizzazione) e: - Detergenti - Agenti riducenti (tiolici): rompono i legami disolfuro che si creano nella/tra proteina/e in modo tale da ottenere la forma più ridotta. Il β-mercapto-etanolo (TOSSICO) è volatile e viene utilizzato in eccesso per spostare verso destra l'equilibrio che si crea un equilibrio tra i tioli e i disolfuri liberi. Il DTT è meno volatile e viene utilizzato a basse concentrazioni perché durante la reazione di riduzione del disolfuro la sua struttura viene alterata per formare una struttura ad anello - Agenti caotropici: ad esempio l'urea viene utilizzata ad alte concentrazioni e rompe i legami a idrogeno e le interazioni idrofobiche nella/tra proteina/e (quindi la struttura secondaria) portando in soluzione le proteine ELIMINAZIONE INTERFERENTI ------------------------- Le sostanze che interferiscono con l'SDS-PAGE, ovvero un metodo di separazione delle proteine in base alle loro dimensioni, sono: - Sali: causano bande sfocate e restringimenti di corsie del gel verso il fondo. Per rimuoverli si può: - Diluire: attraverso l'aggiunta di acqua e si può fare solo se la concentrazione di proteine è elevata) - Dialisi: sono delle membrane che trattengono il campione e fanno passare i Sali - Precipitazione delle proteine (con TCA): questo metodo non viene utilizzato perché solitamente si hanno poche proteine e con questo metodo se ne perderebbero - Cromatografia ad esclusione - Detergenti - Denaturanti o solventi organici - DNA (maggiormente): per eliminarlo si possono usare enzimi (DNAasi), si può fare un'ultrafiltrazione (con spermidina, ma si perdono anche proteine) e un'interruzione meccanica (uso di sonde ultrasoniche e mulini a sfere) CONSERVAZIONE ------------- Una volta isolate, le proteine vanno o conservate in ghiaccio o storate a -80 °C perché si degradano facilmente ACIDI NUCLEICI ============== DNA --- È una molecola molto stabile, infatti, può essere estratta sia da organismi morti che da organismi vivi, dalla saliva, dai capelli, dalle ossa... **[ESTRAZIONE]** Mediante queste estrazioni si può ottenere solo il DNA genomico (il DNA plasmidico si estrae con una [[cromatografia a scambio ionico]](#cromatografia_a_scambio_ionico)) che si può trovare in fase: - Liquida: - [Estrazione organica con fenolo-cloroformio]: si basa sul fatto che il fenolo denatura le proteine del campione, mentre il cloroformio solubilizza i lipidi e rimuove l'eccesso di fenolo. - [Estrazione non organica con una proteinasi K e dei sali]: Possono essere aggiunti anche dei Sali per facilitare la precipitazione - Solida: - Colonnine: sono dei kit basati sul fatto che gli acidi nucleici si leghino per adsorbimento a una fase (colonna di silice) a seconda del pH e della concentrazione dei Sali presenti nel buffer 1. Lisi cellulare: aggiunta del lysis buffer che permette la rottura delle cellule e la liberazione del DNA, delle proteine e altri componenti in soluzione 2. Elevati livelli di Sali: aggiunta di un tampone contenente Sali caotropici che diminuiscono la solubilità del DNA rendendolo più affine alla silice 3. Legame alla silice: i gruppi fosfato del DNA cariche negativamente interagiscono con i gruppi OH della silice 4. Centrifuga: il DNA rimane nella colonnina, mentre sotto rimangono i contaminanti (proteine, lipidi, sali) che devono essere eliminati 5. Lavaggio: aggiunta di tamponi a base di etanolo o Sali per rimuovere i contaminanti 6. Eluizione: abbassando la concentrazione dei Sali o cambiando il pH (aggiungendo acqua), il DNA viene rilasciato dalla silice - Beads magnetiche: vengono utilizzate in genomica (sequenziamento di DNA) perché è un modo semplice e veloce per purificare il DNA in piccole tracce. Queste beats contengono o anticorpi per il DNA o silice 1. Aggiungere il lysis buffer al campione e la proteinasi K 2. Aggiungere le beats: le quali legano il DNA e in presenza di un campo magnetico si spostano verso un lato della provetta 3. Eliminare il liquido rimanente che conterrà i contaminanti 4. Lavaggi: con un buffer a base di etanolo per rimuovere le impurità 5. Eluizione: Aggiungere acqua o tampone acquoso: per permettere il rilascio del DNA dalle beats - Chelex: resina a scambio ionico **[CONSERVAZIONE]** Una volta isolato, il DNA deve essere conservato per evitare che si degradi chimicamente o che entri in contatto con nucleasi e il metodo di conservazione dipende dal tipo di DNA e dal suo uso. Può essere conservato a -20 °C, -80 °C, -196 °C, asciutto (si fa adsorbire su un pezzo di carta) o a temperatura ambiente, anche se il suo continuo congelamento e scongelamento lo può danneggiare. - Conservazione di media durata: a -20 °C o a -80 °C usando condizioni basiche (tris EDTA) oppure precipitato sotto etanolo che dovrà essere eliminato prima dell'uso del DNA. Le condizioni acide causano l'idrolisi del DNA - Conservazione a lunga durata (non la chiede): viene utilizzata per alcuni tipi di DNA e prevede una conservazione in azoto **[QUANTIFICAZIONE]** Esistono diversi metodi: - Nanodrop: è uno spettrofotometro - Elettroforesi - Fluorescenza - Bioanalyzer: è una elettroforesi capillare