Diagnostic Virologique PDF

Diagnostic virologique Rappels CM1 : Types de capside : 2 Types de génomes : 6 Classes de Baltimore : 7 Critères de classification des virus : 4 La transcriptase inverse est une ADN polymérase ARN dépendante Les ARN + ont un génome infectieux et le cycle commence par la traduction de l\'ARN v...

Diagnostic virologique Rappels CM1 : Types de capside : 2 Types de génomes : 6 Classes de Baltimore : 7 Critères de classification des virus : 4 La transcriptase inverse est une ADN polymérase ARN dépendante Les ARN + ont un génome infectieux et le cycle commence par la traduction de l\'ARN virale. Les ARN- incorporent leur polymérase dans la particule virale. Le cycle intracellulaire commence par la transcription d\'un ARNm Les rétrovirus incorporent leurs polymérase dans la particule virale. Et ils ont une phase ADN dans leur cycle viral. Direct : détection du virus ou de ses composants - Virus - Protéines virales - Génome viral Indirect : effet sur l\'hôte - Activité enzymatique - Effet cytopathogène - Réponse de l\'hôte : anticorps Échantillons utilisés : - Sang - Prélèvements par écouvillons : nasopharyngé, buccale - Tissus - Urines, liquide amniotique - Selles Détection directe des virus en microscopie : Microscopie électronique : - Nécessite une forte concentration de virus - Chronophage - Coûts élevés Isolement des virus : culture cellulaire Les virus ne peuvent se multiplier que dans les cellules vivantes : - Cellules en culture - Animaux de laboratoire - Œufs de poule embryonnés Choix des cellules dépend du virus recherché : animales, végétales, bactéries Les cellules choisies doivent être susceptibles et permissives au virus Propagation des virus Découverte de nouveaux virus Développement de vaccins (poliomyélite, rubéole) Base du diagnostic virologique Titration de virus : on cherche à déterminer une quantité de particules dans un volume donné. Cellule sensible ou susceptible : possède le récepteur Cellule permissive : permet l\'adsorption du virus Cellules primaires : cellules issues de tissus normaux, les cellules en suspension ou adhérentes, elles possèdent un arrêt de la division par « inhibition de contact ». Confluences : pourcentage de la surface couverte par les cellules. Lignées cellulaires : - Cellules immortalisées/transformées : empêche la prolifération indéfinie - Transformation « naturelle » → ex : cellules HeLa : issues d\'un carcinome du col de l\'utérus. - Transformation induite : - oncogènes viraux : protéines LT du SV40, E6-E7 du HPV ( papillomavirus - activation de l'activité télomérase de la cellule : hTERT → Cellules Vero : cellules de rein de singe transformées - Cellules modifiées pour l'expression de gènes d'intérêt - Expression de récepteur pour un virus → cellule devient sensible C - Expression d'un système permettant la détection du virus : gène sous contrôle d'un promoteur viral Promoteur viral : gène qui nécessite le virus pour pouvoir transcrire le gène. Détection du virus par Elisa : ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Identification du virus grâce à des anticorps spécifiques de protéines virales de surface. Elisa en sandwich : - Anticorps de capture spécifique du virus - Anticorps de détection spécifique du virus conjugué à une enzyme - Ajout du substrat réaction enzymatique colorée Elisa direct : Anticorps de détection conjugué à une enzyme reconnaît la Fc de l'anticorps spécifique du virus Détection du virus : Détection des protéines virales : immunofluorescence IF, utilisation d\'anticorps fluorescents Pour détecter la protéine virale l\'anticorps primaires reconnaît la partie virale et pour produire un anticorps secondaire on injecte la partie constante de l\'anticorps dans un autre animal et on obtiendra des anticorps secondaire spécifique de la partie constante de l\'anticorps primaire. Détection du génome viral : hybridation in situ avec sonde nucléotidique marquée qui s'apparie de manière séquence spécifique à son complémentaire Détection du génome viral sur un gène spécifique : PCR, RT-PCR - Amorces spécifiques d'une séquence virale - Polymérisation par complémentarité Technique qui vise à amplifier la zone amorce qui nous intéresse. Pour voir quel ADN est présente on fait migrer les produits PCR sur gèle d\'agarose. RT = reverse transcriptase : ARN → ADN On utilise un témoin négatif lors de la migration pour vérifier qu\'il y a seulement l\'échantillon qui est fluorescent et non autre chose. Le témoin positif permet de montrer que si il n\'y a pas de signal c\'est pas parce que la manipulation n\'a pas marché mais parce que la protéine n\'est pas présente. Provirus : Le génome du virus est intégré au génome de la cellule. Quantification du génome viral par qPCR ou RT-qPCR : - qPCR = PCR quantitative, pour les génomes ADN - RT-qPCR = PCR quantitative avec étape de transcription inverse, pour les génomes ARN - 2 méthodes de quantification possible : - intercalant de l'ADN double brin : SybrGreen - Utilisation d'une sonde qui s'hybride sur la séquence d'intérêt - Initiation - Dénaturation : séparation des deux brins - Primer annealing (60°c) la sonde peut se fixer par complémentarité - Extension (72°c) dégradation de la sonde et séparation du fluorochrome et du quencher qui permettent la fluorescence. SybrGreen fluoresce seulement lorsqu\'il s\'intercale ce qui nous indique la quantité d\'ADN double brin. Suivi de la fluorescence en temps réel lors de la PCR : mesure de la fluorescence à chaque cycle. Plus il y a de copies du génome cible, plus vite on va avoir une fluorescence détectable. Détermination du nombre de cycles à partir duquel on peut détecter la fluorescence : Ct ou Cq Réalisation d'une gamme avec des quantité connues et test des échantillons. Identification des virus isolés : effets cytopathogène ECP : - Modifications morphologiques des cellules infectées - Modifications typiques d'un virus ou d'une famille de virus Modification morphologiques : - Cellules saines : confluentes - VZV : « trous » - Adénovirus « dentelle » - HSV « grappes » - Entérovirus « cellules étoilées - VRS « syncitiums » Titrage du virus : Plages de lyse : - Titres en PFU/mL (PFU : Plaque Forming Unit) - Pour les virus avec ECP lytique - Titrage des **particules infectieuses** Cellules infectées avec des dilutions en série de virus puis recouvertes d'un milieu semi-solide pour limiter la diffusion des virions produits après quelques jours coloration des cellules au crystal violet Pour choisir le puits on prend le premier sur lequel on arrive à compter. 4/0,4 \* 10\^7 = 1\*10\^8 Titrage du virus : foyers fluorescents - Foyers fluorescents : titre en FFU/mL (FFU = Fluorescent focus Forming Unit) - Titrage des particules infectieuses - Cellules infectées avec des dilutions en série de virus - Perméabilisation et incubation avec un anticorps primaire contre une protéine virale - Détection avec un anticorps secondaire couplé à un fluorophore Titrage du virus : hémagglutination des globules rouges : - Dilutions en série de virus incubées en présence d'une suspension de globules rouges à 0,5% → hémagglutination ou sédimentation - Titrage des particules physiques - Titre HA = dernier facteur de dilution de virus hémagglutinant les hématies Ici le virus n\'a pas besoin de rentrer et de faire un cycle virale on reconnaît son enveloppe. Puits contenant de l\'acide sialique reconnu par l\'hémagglutinine. Le titre est la dernière fois où j\'ai suffisamment de virus pour avoir une hémagglutination. Le ratio nombre de particules physiques / nombre de particules infectieuses est élevé pour la plupart des virus. /!\\ Toutes les particules ne sont pas infectieuses !!! particules défectives, présences de mutations (s)\... Les particules qui ne sont pas infectieuses sont appelées défectives. Titrage des virus : dose infectieuse 50% Dose pour laquelle on a un Effet cytopathologique (ECP) dans 50% des cas On inocule les cellules qui on un effet dans 50% des cas puis on calcul. 10\^-4/0,2 = 10\^5/2 = 5\*10\^4 Diagnostic indirect : détection des anticorps sériques Identifier le type ou sous-type de virus grâce à la présence d'anticorps dans le sérum \- Anticorps anti-Fc couplé à une enzyme \- Anticorps spécifique du virus dans le sérum du patient \- Liquide allantoïque Ou culture cellulaire Titre en anticorps neutralisant : Titre PRNT50 = inverse de la dernière dilution de sérum permettant de réduire de 50% le nombre de plages de lyse. PRNT : Plaque Réduction Neutralization Test On prend les différentes dilutions ainsi qu\'un témoin dans lesquels on ajoute du virus on sait qu\'en absence d\'anticorps on a 8 plages de lyse. On cherche la dilution pour laquelle on en a moitié moins. **/!\\** ex : si dilution à 1/40 le titre n\'est pas 1/40 mais 40 Étapes du titre en anticorps neutralisant : - Dilution du sérum - Dilution ajout de virus à concentration constante - Incubation du mélange de virus + dilution de sérum - Inoculation des cellules - Incubation - Révélation au crystal violet