Généralités et Techniques en Virologie (PDF)

Pr Jacques Izopet Virologie - n°1 Estelle Touriol 08/01/2025 - 8h-10h Ronéo n°1 Marine Rodde GÉNÉRALITÉS ET TECHNIQUES I. La naissance de...

Pr Jacques Izopet Virologie - n°1 Estelle Touriol 08/01/2025 - 8h-10h Ronéo n°1 Marine Rodde GÉNÉRALITÉS ET TECHNIQUES I. La naissance de la virologie 1) Histoire de la virologie La virologie a vu le jour grâce à la vaccination. Les premières vaccinations ont eu lieu au XVIIIe siècle, notamment avec la vaccination contre la variole. En 1796, Jenner mena des travaux qui consistaient à prélever du matériel chez les bovins pour protéger les humains de la variole. Cette pratique était très contestée et suscitait de nombreux débats sur l'intérêt de cette méthode. En 1885, Pasteur proposa une stratégie de vaccination contre la rage. Il utilisa du matériel biologique cultivé en laboratoire par le passage sur des lapins. L’utilisation de ce matériel biologique permettait de protéger contre la rage. Mais là encore, tout le monde n’était pas convaincu. La notion de virus a été découverte par Ivanovsky en 1892, en opposition aux micro-organismes connus à cette époque. C’est l’expérience d’Ivanovsky qui a mis en évidence le caractère transmissible de la maladie de la mosaïque du tabac (voir image). C’était une maladie végétale, liée à des marbrures sur les feuilles de tabac. Il s’est rendu compte qu’il était possible de transmettre cette maladie à d'autres plants de tabac sains. Cette maladie était transmise par un agent transmissible invisible à la microscopie optique, contrairement aux bactéries et champignons qui, eux, étaient retenus par des filtres en porcelaine (filtres de Chamberland). De plus, cet agent n’était pas cultivable sur un milieu inerte ou gélosé, qui permet habituellement la croissance des bactéries et champignons. La notion de virus est donc née de cette expérience. La description des premières maladies humaines et animales a découlé rapidement avec : - la fièvre aphteuse des bovins (1897) - le myxome du lapin (1898) - la fièvre jaune (1901) : première maladie humaine liée à un arbovirus. - la rage (1903) - le sarcome de Rous découvert chez le poulet (1911) : premier rétrovirus. De nombreux virus d’avancée médicale ont été découverts grâce aux avancées technologiques : - microscopie électronique en 1935 : découverte de maladies virales grâce à la visualisation d’agents infectieux tout petits. - Culture cellulaires dans les années 50 (très important) : les virus, contrairement aux autres micro-organismes, sont des parasites intracellulaires obligatoires. Sans cellule, on ne peut pas cultiver des virus. Page 1 sur 20  - Biologie moléculaire dans les années 1980 qui a permis la découverte de nombreux virus non visibles en microscopie optique. Par exemple : l'herpès 8 ou le virus de l’hépatite C. 2) Impact de la virologie Le SIDA et la découverte du VIH ont permis l’essor de la discipline et ont eu un impact significatif sur la médecine. Mais au-delà de cela, le concept d’émergence virale, qui reste toujours d’actualité, est essentiel. En effet, le SIDA, les hépatites virales, les encéphalites, les fièvres hémorragiques (comme Ebola) et le SARS-CoV-2 sont des menaces toujours présentes. Le SARS-CoV-1 (apparu en 2003), Mpox (variole du singe) ou la grippe aviaire sont des menaces qui existent depuis une vingtaine d'années. Le virus de la grippe aviaire infecte principalement les oiseaux, mais peut se transmettre à l’homme. Cependant, pour l'instant, l'adaptation du virus n'est pas suffisante pour qu'il puisse se transmettre d’homme à homme (la transmission ne se fait que des oiseaux infectés vers l’homme). Le virus s’est néanmoins déjà adapté aux bovins, et si son évolution se poursuit, il pourrait représenter une menace épidémique. Malheureusement, les virus peuvent également être utilisés à des fins malveillantes, ce qui relève du bioterrorisme. Le virus de la variole est le seul virus qui ait été éradiqué, mais des stocks de varioles existent encore dans certains laboratoires, ce qui fait planer une menace potentielle. Cependant, les virus présentent également un aspect positif, car ils peuvent être utilisés comme outils ou stratégies dans des approches thérapeutiques innovantes, telles que la thérapie génique, la vaccinologie, ou encore en tant qu’agents oncolytiques pour cibler et détruire les tumeurs. II. Qu'est-ce qu’un virus ? Sur le plan fonctionnel, le virus est une entité caractérisée par un unique type d’acide nucléique, qu’il soit sous forme d’ADN ou d’ARN, constituant son patrimoine génétique. Il présente un parasitisme intracellulaire strict, ce qui signifie qu’il doit obligatoirement infecter une cellule hôte pour se répliquer. Contrairement aux organismes vivants, les virus ne se divisent pas par un processus de division binaire, mais se multiplient par réplication à partir de leur propre matériel génétique. Sur le plan structural, le virus est une entité simple composée d’un génome et d’une capside protéique, cette dernière ayant pour fonction de protéger le matériel génétique. Ces deux éléments, génome et capside, sont essentiels à la structure virale. Dans certains cas, le virus possède également une enveloppe de nature glucido-lipido-protidique. Cette enveloppe, qui enveloppe la capside, permet de différencier les virus enveloppés des virus nus. Les virus nus, dépourvus d’enveloppe, sont généralement plus fragiles dans l’environnement que les virus enveloppés, qui bénéficient d’une protection supplémentaire. Page 2 sur 20  1) Le génome Le génome du virus est : ADN ou ARN a 1 seul brin ou 2 brins (éléments importants pour la classification) monocaténaire ou bicaténaire linéaire ou circulaire segmenté ou non (le virus de la grippe a un génome segmenté ce qui est source de variabilité virale) taille du virus variable : 3 à 280 kilobases (kb) protéines structurales sont en nombre plus ou moins importants (4 - 400) variabilité génétique du virus : impact sur l’environnement, résistance aux médicaments, adaptation du virus. Il est important de retenir que la variabilité génétique des virus à ARN est plus importante que celle des virus à ADN. Ces variables génétiques peuvent être des mutations, des délétions, des insertions, des recombinaisons. 2) La capside Ce sont des unités protéiques polymérisées qui s’associent pour former des capsomères qui s’agencent de manière symétrique. Il existe plusieurs types de symétries : - la symétrie cubique ou icosaédrique (agencement de capsomères de manière géométrique) : beaucoup de virus répondent à cette symétrie qui permet de consommer le moins d’énergie possible. - la symétrie hélicoïdale : en hélice - symétrie complexe : ne répondent ni à la symétrie cubique ni à la symétrie hélicoïdale. a) Les capsides cubiques Capsides icosaédriques : constituées de sous unités appelées protomères qui peuvent être des pentamères (5 protomères sur les sommets) ou hexamères (6 protomères sur les faces). Cet agencement permet de donner des icosaèdres. On peut définir le nombre de capsomères : c’est toujours un multiple de 60 (important à retenir), c’est-à-dire 60xT. Souvent c’est 60 fois 3, il s’agit du nombre de triangulation (T (triangulation) = h2 + hk + k2 => non dit par le prof mais présent dans la diapo) et cela représente un intérêt dans la classification des virus. Adénovirus est un exemple de virus à symétrie cubique. Il est Page 3 sur 20 responsable de gastro-entérites, de manifestations respiratoires ou d’infections oculaires et il répond à cette capside avec cet agencement géométrique. Ci-contre, une photo en microscopie électronique montrant des adénovirus avec cette symétrie icosaédrique. Il y a aussi l’exemple du poliovirus (voir l’image ci-contre. Le prof le mentionne sans en dire plus). b) Les capsides hélicoïdales L'agencement des capsomères dans certains virus présente une structure distincte, avec les capsomères s'assemblant en hélices autour d'un axe central creux. Un exemple de cette organisation est le virus Ebola, un virus particulièrement redoutable responsable de fièvres hémorragiques. En microscopie électronique, ce virus apparaît avec une structure filamenteuse et allongée, mais en réalité, il s'agit bien d'une hélice enroulée autour de l'ARN tout au long de l'organisme. Cette organisation hélicoïdale permet de protéger l'acide nucléique et est un trait caractéristique de ce type de virus. Lorsque l'acide nucléique (ARN) et la capside s'assemblent, ils forment une ribonucléoprotéine. Les capsides virales sont souvent caractérisées par des dimensions spécifiques, telles que la longueur et le diamètre de l'hélice, ainsi que le nombre de capsomères présents par tour d'hélice. Un autre exemple pertinent est celui du virus de la rage. Comme pour Ebola, l'agencement des capsomères autour de l'acide nucléique du virus de la rage est également hélicoïdal. Cependant, ce virus présente une formation plus compacte à l'intérieur de la particule virale, donnant une forme de balle de pistolet observable en microscopie électronique. Ce type de structure a été d'une grande utilité pour la reconnaissance des virus dans les premiers temps de la microscopie électronique. Bien que la microscopie électronique soit aujourd’hui beaucoup moins utilisée dans les laboratoires pour l'identification des virus, elle reste une méthode précieuse pour caractériser de nouveaux virus, comme ce fut le cas pour le SARS-COV 2, notamment lors de l'épidémie de COVID-19. Cette technique continue de jouer un rôle crucial dans la détection de virus émergents. Page 4 sur 20  3) L’enveloppe Cette structure n'est pas systématique chez tous les virus. L'enveloppe virale est une structure glucido-lipido-protéique, ce qui signifie qu'elle possède une composition similaire à celle des membranes cellulaires, qu'elles soient plasmatiques ou internes. L'enveloppe virale dérive généralement de membranes cellulaires telles que la membrane nucléaire, le réticulum endoplasmique, ou encore la membrane cytoplasmique, selon le type de virus. Cette origine membranaire explique pourquoi certains virus enveloppés présentent une certaine similitude avec les membranes cellulaires hôtes. Il est important de noter que les virus enveloppés sont souvent plus fragiles que les virus nus. L'enveloppe étant constituée de lipides et de protéines, elle peut être facilement altérée ou détruite par des substances comme l'alcool ou les détergents classiques. Cette vulnérabilité compromet leur viabilité, en particulier en dehors de l'hôte, où ils sont moins résistants aux conditions environnementales. En revanche, les virus nus, tels que l'adénovirus ou le poliovirus, possèdent une coque protéique robuste et sont bien plus résistants dans l'environnement. Leur infectiosité peut être maintenue pendant de longues périodes et, dans certains cas, la transmission de ces virus peut se produire par voie hydrique, ce qui témoigne de leur résistance à des conditions extérieures hostiles. Cette durabilité dans l'environnement fait des virus nus des agents pathogènes particulièrement difficiles à éradiquer et potentiellement plus contagieux. III. Classification et origine des virus 1) Critères de classification Ils ont été proposés par 3 chercheurs de l’institut Pasteur : Lwoff, Horne, Tournier en 1962. 4 critères essentiels pour la classification qui restent toujours utilisés aujourd’hui (même si y en a d’autres). 1. Nature de l’acide nucléique : ADN ou ARN 2. Symétrie de la capside protéique 3. Présence ou absence d’une enveloppe lipidique 4. Taille du virion et de la capside Mais les scientifiques qui classent les virus (taxonomistes) utilisent différents critères plus complets : - type et organisation génomique - stratégie de réplication - structure (capside et + ou - environnement) - propriétés physicochimiques - protéines, lipides et glucides - propriétés antigéniques - propriétés biologiques : spectre d’hôte, tropisme, transmission, pathogénèse Page 5 sur 20 Tout cela conduit à classer ces virus selon différents niveaux de classification. Et il est important (nous devons le connaître !!) de savoir la terminologie pour comprendre la classe mentionnée : - Si l’ordre est évoqué, le nom comportera toujours la terminaison ‘’-virales” - Si une famille est évoquée, la terminaison sera ‘’-viridae” (exemple : Herpesviridae ou Retroviridae). C’est le niveau le plus important à connaître en pratique médicale. - Si une sous-famille est évoquée, la terminaison sera ‘’-virinae”. - Si le genre est évoqué, la terminaison sera “-virus” (herpes virus par exemple). (Il existe 6 ordres, 87 familles, 349 genres, 2284 espèces). Classification de Baltimore de 1971 (à connaître !!) : il existe 7 groupes de virus selon la nature du génome : I : ADN double brin II : ADN simple brin III : ARN double brin IV : ARN simple brin de polarité positive : la séquence des nucléotides qui constituent l’ARN est directement traduisible en protéines. V : ARN simple brin de polarité négative : la séquence nucléotidique n’est pas directement traduite en protéines, celle-ci nécessite la synthèse d’un brin complémentaire au préalable. VI : ARN associé à une activité transcriptase inverse (rétrovirus) VII : ADN associé à une activité transcriptase inverse (virus de l’hépatite B) Il s’agit de la stratégie de réplication des virus et de leur multiplication dans la cellule. Cette classification est intéressante à connaître puisqu’il existe des antiviraux qui sont actifs à la fois sur le VIH et aussi sur le virus de l’hépatite B puisque ces molécules ciblent la transcriptase inverse. Le prof nous a ensuite présenté rapidement les tables de virus sans les détailler : Table des virus à ADN : Page 6 sur 20 Tables des virus à ARN : Page 7 sur 20 Page 8 sur 20  2) Origine des virus - Théorie réductive : parasite intracellulaire n’ayant conservé que des gènes essentiels à sa réplication - Théorie cellulaire : organite subcellulaire ayant acquis une autonomie de réplication - Théorie fondée sur une co-évolution virus-cellule depuis l’origine de la vie Le mimivirus est un virus géant qui a suscité un débat important dans le domaine de la virologie. Découvert en 2003, ce virus infecte une amibe, Acanthamoeba polyphaga, et se distingue par sa taille exceptionnelle, bien plus grande que celle des virus classiques. En raison de sa taille et de son patrimoine génétique, qui présente des similarités avec des microorganismes comme les bactéries et les cellules eucaryotes, le mimivirus remet en question la définition traditionnelle des virus. Le mimivirus possède un génome suffisamment large pour inclure des gènes qui étaient auparavant associés aux organismes vivants, ce qui a alimenté des discussions sur la classification des virus dans le monde du vivant. Certains chercheurs ont proposé que les virus, comme le mimivirus, pourraient être considérés comme une forme distincte de vie, en plus des trois grands domaines biologiques traditionnels : les bactéries, les archaea et les eucaryotes. Cela a conduit à la suggestion que les virus géants, et en particulier le mimivirus, pourraient constituer un "quatrième domaine" de la vie. Cependant, cette idée reste controversée, car les virus ne remplissent pas toutes les caractéristiques essentielles des organismes vivants, notamment en termes de reproduction autonome et de métabolisme. Page 9 sur 20 Malgré tout, le mimivirus représente une curiosité scientifique majeure, car il repousse les frontières de notre compréhension des virus et des organismes microscopiques. On distingue des virus spécifiques : - pour les archaea - pour les virus des bactéries : ce sont les bactériophages qui détruisent les bactéries, notamment celles qui sont très résistantes - pour les virus des eucaryotes (tous les virus d’importance médicale). Il est important de ne pas hésiter à se reporter aux tableaux face à certains virus ou syndromes viraux. IV. Diagnostic virologique et suivi thérapeutique Différents types de circonstances : Les circonstances cliniques et épidémiologiques jouent un rôle clé dans l’identification et la gestion des infections virales. En ce qui concerne les circonstances cliniques, l'absence de symptômes cliniques peut conduire à un dépistage systématique, où l'on cherche des infections virales chez des individus qui ne présentent pas de manifestations visibles mais pour lesquels la détection d’un virus est cruciale. Par exemple, lors de dons de sang, il est essentiel de vérifier la présence de virus, même en l'absence de symptômes, pour garantir la sécurité du receveur. En revanche, la présence de manifestations cliniques indique des infections virales, bactériennes ou fongiques, et nécessite une attention particulière. Certaines populations, notamment les personnes immunodéprimées, comme les receveurs de cellules souches hématopoïétiques ou d’organes, sont particulièrement vulnérables aux infections. De plus, les femmes enceintes et les nouveau-nés Page 10 sur 20 représentent des groupes à risque, où des mesures spécifiques doivent être prises pour éviter des risques de transmission verticale du virus à l’enfant. Le système immunitaire du nouveau-né étant immature, il est aussi plus susceptible aux infections. Du point de vue épidémiologique, les contextes saisonniers ou non doivent être pris en compte. Par exemple, les bronchiolites sont courantes chez les enfants durant les mois d'octobre-novembre, la grippe touche particulièrement la population en décembre-janvier, et bien que le SARS-COV 2 soit un virus émergent, il n’a pas montré de caractère saisonnier jusqu’à présent. La survenue de cas groupés est une autre situation épidémiologique importante. Lorsqu'un nombre significatif de cas d'une même infection, comme l’hépatite C, se présente dans une même zone ou groupe de personnes, il faut enquêter sur la raison de cette transmission. Puisque l’hépatite C est transmissible par le sang, il est primordial de se demander si des transmissions nosocomiales sont en jeu, notamment dans le cadre de soins médicaux. La génétique virale, à travers des techniques comme le séquençage, permet de démontrer que les virus présents chez les personnes infectées sont très proches génétiquement, ce qui peut aider à confirmer un lien entre les cas. Enfin, la suspicion de transmission nosocomiale, c’est-à-dire la transmission du virus dans un environnement hospitalier ou de soins, doit toujours être envisagée et investiguée afin d'identifier la source et de prévenir de futures contaminations. Moyens mis en oeuvre pour le diagnostic virologique Il existe deux grands types de stratégies : le diagnostic indirect et le diagnostic direct. Le diagnostic indirect ne permet pas de mettre en évidence directement le virus, mais détecte plutôt la réponse de l’organisme à l’infection, notamment en recherchant des anticorps spécifiques (IgG ou IgM) dans le sérum des patients. Cette approche est la plus couramment utilisée en virologie. Les anticorps, en particulier les IgM (indicateurs d'une primo-infection) et les IgG (indiquant une infection passée ou une réponse immunitaire établie), sont détectés pour confirmer l'infection virale. Le diagnostic direct, quant à lui, vise à détecter directement le virus ou ses constituants dans un échantillon biologique. Cela peut se faire soit par un prélèvement direct sur l'échantillon, soit après culture cellulaire. Cette méthode est de plus en plus privilégiée grâce aux avancées technologiques, en particulier dans le domaine de la biologie moléculaire, qui permet de détecter le génome viral (ADN ou ARN) de manière plus sensible et plus rapide que les techniques traditionnelles. La microscopie électronique, bien que jadis utilisée pour détecter des particules virales, n’est plus couramment employée en raison de sa faible sensibilité. En effet, elle nécessite la présence d’au moins un million de copies de particules virales dans un millilitre d’échantillon (par exemple, dans les selles ou les sécrétions respiratoires), ce qui est peu probable dans de nombreux cas cliniques. En revanche, les techniques de biologie moléculaire peuvent détecter un nombre beaucoup plus faible de copies, permettant ainsi une identification plus précoce et précise du virus, même avec des échantillons plus faibles. Page 11 sur 20 Enfin, la culture cellulaire reste une méthode classique et précieuse en virologie. Bien que plus lente et relativement complexe, elle permet de cultiver le virus en laboratoire et d’en observer les caractéristiques. Cette approche est particulièrement utile pour découvrir de nouveaux virus ou étudier des aspects spécifiques des virus déjà connus. Cependant, elle est de plus en plus suppléée par des techniques de biologie moléculaire plus rapides et plus sensibles. Il est important de toujours citer le nom du prescripteur, la date/heure du prélèvement, et les renseignements cliniques (l'existence ou non d’un traitement antiviral, grossesse etc) sur une prescription destinée à un diagnostic virologique. Les méthodes utilisées par le laboratoire doivent être des méthodes validées. Tous les laboratoires sont soumis à une accréditation nommée COFRAC ISO 15189 et font l’objet d’audits annuels par le COFRAC en France. V. Diagnostic indirect : sérologies virales Le terme sérologie désigne l'analyse permettant de mettre en évidence la présence d'anticorps dans un organisme, en réponse à une infection virale ou bactérienne. Le plus souvent, ces anticorps sont recherchés dans le sang, qui est recueilli dans un tube sec pour permettre un bon prélèvement. Dans certains cas, le sang peut être prélevé sur un anticoagulant, auquel cas les anticorps sont alors recherchés dans le plasma. Bien que le sang soit le principal liquide biologique analysé, dans des situations particulières, la recherche d'anticorps peut également s'effectuer sur d'autres types de liquides corporels. Par exemple, dans le cadre d'une infection suspectée du système nerveux central, les anticorps peuvent être recherchés dans le liquide céphalo-rachidien. De même, dans le cas d'une suspicion d'infection fœtale, on peut analyser le liquide amniotique pour détecter la présence d'anticorps. Enfin, dans des situations plus rares et extrêmes, les anticorps peuvent être recherchés dans le liquide broncho-alvéolaire, par exemple lors d'infections respiratoires graves Les techniques utilisées pour faire le diagnostic indirect sont : - ELISA : colorimétrie (EIA) ou luminescence (LIA). Le principe de ces techniques est le même. Le marqueur de ces techniques est un fluorochrome. - Immunofluorescence via un microscope à fluorescence - Test de confirmation : Western Blot surtout utilisé pour confirmer une infection à VIH qui a été, en amont, dépisté par une technique ELISA. Ce schéma illustre la réponse humorale du système immunitaire en cas d’infection virale. Lors de la première rencontre avec un virus, le système immunitaire produit des anticorps, principalement de classe IgM. La présence d'IgM dans le sérum d'une personne est Page 12 sur 20 un indicateur de primo-infection, car ces anticorps sont produits rapidement après l'infection. En plus des IgM, on peut également détecter des IgG, mais leur concentration est relativement faible au début de l’infection. Les IgM persistent généralement de manière transitoire, durant environ 3 mois après la primo-infection. Ensuite, ces IgM disparaissent, tandis que les IgG restent présentes pendant plusieurs années, conférant une certaine immunité contre le virus. Si l'organisme rencontre à nouveau le virus, il peut y avoir une réinfection. Dans ce cas, la concentration d'anticorps augmente, mais la production d'IgM est généralement très faible et peut ne pas être détectée par les tests diagnostiques. En résumé, la présence d'IgM dans le sérum d'une personne indique généralement une infection récente (primo-infection) plutôt qu'une réinfection, à l'exception de certaines infections comme le VIH et l'hépatite B, où des phénomènes particuliers peuvent se produire. 1) Techniques immuno-enzymatiques Pour la technique ELISA simple : Le principe de cette méthode est que l’antigène spécifique du virus est fixé sur un support solide. Ensuite, un anticorps marqué (avec une enzyme, par exemple) est ajouté. Cet anticorps se lie spécifiquement à l’antigène. Le marquage de l’anticorps permet ensuite de détecter la réaction entre l’anticorps et l’antigène, généralement grâce à un changement de couleur ou d’intensité lumineuse, ce qui indique la présence de l’antigène. Pour la technique ELISA Sandwich : Dans cette méthode, l’antigène est également fixé sur un support solide. Un premier anticorps (spécifique à l'antigène) est fixé à cet antigène. Si l’antigène est présent dans l’échantillon du patient, l’antigène se lie à ce premier anticorps, formant une « capture ». Un autre anticorps, également spécifique à l’antigène, est ensuite ajouté et marqué. L'anticorps marqué va se lier à l’antigène, formant ainsi un "sandwich" entre les deux anticorps, d’où le nom de la technique. La présence de l’anticorps marqué permet de détecter la quantité d’antigène. Pour la technique ELISA Compétition : Dans cette technique, l’antigène est fixé sur un support solide. L'anticorps du patient se lie à cet antigène. Ensuite, un anticorps marqué est ajouté, qui peut également se lier à l’antigène. Ici, un phénomène de compétition se produit : l'anticorps du patient et l'anticorps marqué Page 13 sur 20 « se battent » pour se fixer sur l'antigène. Plus il y a d'anticorps du patient dans l'échantillon, moins l'anticorps marqué peut se fixer sur l’antigène, ce qui entraîne une réduction du signal. Si l’anticorps du patient est présent en grande quantité, le signal marqué sera faible, tandis que s’il est moins présent, le signal sera plus fort. Les trois techniques utilisent un principe similaire de détection basée sur l’interaction entre un antigène et un anticorps, mais chaque technique a un principe distinct qui modifie la manière dont cette interaction est mesurée. Ces tests sont réalisés soit de manière manuelle sur une microplaque soit de manière automatisée. 2) Techniques sérologiques de confirmation Le Western Blot VIH est une technique très utilisée pour confirmer la présence d'anticorps spécifiques au VIH dans le sérum d'une personne. Cette méthode est souvent utilisée comme test de confirmation après un test de dépistage. Le test repose sur un support solide sur laquelle différents antigènes spécifiques du VIH (protéines virales) sont immobilisés. Ces antigènes représentent des parties du virus contre lesquelles le système immunitaire produit des anticorps lors de l'infection. Ensuite, un échantillon de sérum du patient est ajouté au support. Si la personne est infectée par le VIH, son sérum contiendra des anticorps spécifiques qui reconnaissent ces antigènes viraux. Les anticorps présents dans le sérum se lient spécifiquement aux antigènes VIH fixés sur le support. Après cette incubation, on ajoute un anticorps secondaire, appelé antiglobuline, qui est marqué par une enzyme ou un autre marqueur détectable. Cet anticorps secondaire est spécifique des anticorps humains (comme les IgG) et va se lier à l'anticorps primaire (le sérum du patient) déjà fixé sur les antigènes du VIH. Le marquage de l'antiglobuline permet de visualiser la présence des anticorps. En fonction du marquage utilisé, un changement de couleur, de fluorescence ou une émission de lumière va indiquer la présence de l’anticorps spécifique au VIH dans l’échantillon. Chaque bande visible correspond à une protéine du VIH à laquelle un anticorps spécifique a réagi. La première bande en partant de la gauche est la bande témoin positive. La seconde est la bande témoin négative. Les suivantes sont les profils de différents patients. Lorsqu’il y a des réactions colorées, cela témoigne de la présence des anticorps spécifiques des différentes protéines du VIH. Cela permet de confirmer une infection à VIH. Page 14 sur 20  3) Les indications du diagnostic indirect Le diagnostic indirect permet de mettre en évidence un contact récent avec un virus (IgM spécifiques selon les virus, séroconversion). Sur deux prélèvements effectués à une quinzaine de jours d'intervalle, Il n’y aura pas de présence d’anticorps sur le premier prélèvement à J1 tandis qu’il y aura une présence d’anticorps sur le prélèvement à J15 dû au développement de la réponse humorale. La séroconversion est donc le passage d’un statut négatif en anticorps à J1 à un statut positif en anticorps à J15. La recherche des IgM est plus intéressante que la séroconversion car elle donne une réponse plus rapide et permet d’éviter 2 prélèvements. La mise en évidence d’une immunisation est un deuxième objectif de la sérologie virale. Par exemple, dans le contexte de la transplantation d’organes il est important de savoir quel est le statut du donneur et receveur vis à vis du cytomégalovirus. Le cytomégalovirus est un virus particulièrement redoutable pour les personnes immunodéprimées. Si le receveur n’a pas d’anticorps dirigés contre le cytomégalovirus il peut recevoir cette infection transmise par le donneur. La sérologie virale va donc déterminer la présence d’IgG pour définir le statut immunitaire du donneur et du receveur. La mesure de l’avidité des anticorps est la troisième indication. Cette mesure est restreinte à deux cas : l’infection par le virus de la rubéole, l’infection par le virus du cytomégalovirus. Cette mesure est indiquée dans le cas de la grossesse pour être certain qu’il n’y a pas une primo infection. Dans certains cas, les IgM peuvent présenter une réactivité dite “douteuse”. On va donc regarder l’avidité des anticorps pour voir si l’infection est vraiment récente ou non. A retenir : Si l’infection est récente, l’avidité est faible. Si l’infection est plus ancienne, l’avidité est beaucoup plus élevée. 4) Avantages et limites du diagnostic indirect Ce sont des techniques très simples, automatisables, rapides. Toutefois, pour certaines personnes, la sérologie va présenter des faiblesses importantes, notamment les personnes immunodéprimées. Ces personnes-là vont avoir une réponse humorale souvent faible. Donc, même si on ne détecte pas la présence d'anticorps, on ne peut pas être sûr qu’il n’y a pas d’infection. L’interprétation est parfois délicate car pour certains virus il peut y avoir des réactivités croisées (c’est notamment le cas pour la famille des herpès virus). VI. Diagnostic direct 1) Diagnostic direct : prélèvements Le diagnostic direct va reposer sur des prélèvements. Les prélèvements vont dépendre du contexte et des manifestations cliniques présentées par le patient. Il y a plusieurs types de prélèvements : Page 15 sur 20  - Tube sec pour recueillir du liquide céphalo-rachidien, du liquide broncho alvéolaire, des urines, des selles, ou du sang avec EDTA. - Ecouvillon stérile. Par exemple, toutes les infections respiratoires on effectue un écouvillonnage naso-pharyngé qui permet de recueillir des sécrétions et rechercher des virus. a) Technique par Immunofluorescence La technique par Immunofluorescence utilise des anticorps qui sont marqués avec un fluorochrome. Ces anticorps reconnaissent spécifiquement des antigènes présents dans un prélèvement. Si l'anticorps se lie à l'antigène cible (par exemple, un antigène viral), il émettra de la fluorescence lorsqu'il est observé sous microscope. Cette fluorescence indique que l'antigène du virus est présent dans le prélèvement. Cette technique permet d’objectiver par Immunofluorescence la présence d’antigène viral dans le prélèvement. b) Diagnostic par immunochromatographie Les tests antigéniques immunochromatographiques sont des tests rapides utilisés pour détecter la présence d'un antigène spécifique dans un prélèvement. Dans cette méthode, un anticorps marqué par une enzyme est utilisé pour reconnaître l'antigène cible. Lorsque l'antigène est présent dans l'échantillon, il se lie à l'anticorps, ce qui déclenche une réaction qui produit un changement de couleur. Ce changement est généralement visible en 10 à 20 minutes, ce qui permet une détection rapide et simple de la présence de l'antigène dans le prélèvement. Pour les infections respiratoires ( SARS COV 2, grippe, VRS etc.) ainsi que pour les infections virales associées à des gastroentérites, on peut rechercher par des antigènes de rotavirus, adénovirus et norovirus. c) Avantages et limites Ces tests sont très intéressants car ils peuvent être réalisés à proximité du malade, dans le temps du soin. Cela permet d’avoir un diagnostic rapide des manifestations cliniques présentées par un patient. Page 16 sur 20 Toutefois, ces tests manquent de sensibilité. La sensibilité de la mise en évidence des antigènes est plus faible par rapport à la biologie moléculaire par exemple. L'immunofluorescence nécessite un microscope et un observateur expérimenté par la difficulté de lecture du test. C’est une technique de moins en moins utilisée au profit des tests moléculaires. 2) Diagnostic direct : culture La culture de virus est une technique conventionnelle très utile en cas d'émergence virale a) Technique par culture La mise en culture d’un virus consiste à utiliser des lignées cellulaires, c’est-à-dire des cellules capables de se multiplier de manière autonome en laboratoire. Ces cellules sont mises en contact avec un prélèvement biologique prétraité, qui pourrait contenir un virus. Si le virus est présent, il infecte les cellules de la lignée. Après plusieurs jours de croissance cellulaire, on peut observer au microscope des modifications dans la morphologie des cellules. Ces changements sont visibles en microscopie optique et caractérisent les cellules infectées par le virus. Ces cellules présentent des morphologies distinctes qui permettent de mettre en évidence ce qu’on appelle l’effet cytopathogène. L’effet cytopathogène traduit l’utilisation de la machinerie cellulaire par le virus, ce qui entraîne des altérations morphologiques spécifiques. Ces altérations peuvent être identifiées par un observateur expérimenté. Pour la culture du cytomégalovirus, on utilise des fibroblastes, qui sont des cellules diploïdes. Lorsque ces fibroblastes sont infectés par le cytomégalovirus, leur morphologie présente un aspect caractéristique en "banc de poisson". Lorsqu’on utilise la culture cellulaire, des anticorps spécifiques peuvent être employés pour visualiser les antigènes directement dans les cellules cultivées. Cette méthode facilite l’observation par rapport à une simple analyse au microscope. La détection des antigènes peut se faire soit par immunofluorescence, soit par immuno-peroxydase. Page 17 sur 20  b) Indications La culture cellulaire permet de caractériser le phénotype d’un virus dans certains contextes spécifiques. Par exemple : - Pour le virus de l'herpès, la résistance aux antiviraux peut être évaluée en culture en exposant les cellules à différentes concentrations de médicaments. - Pour le VIH, la culture cellulaire est utilisée pour déterminer son tropisme, c’est-à-dire sa capacité à infecter certains types de cellules. Cependant, les indications pour recourir à la culture cellulaire restent relativement limitées. Elle devient particulièrement cruciale lors de l’émergence d’un nouveau virus, notamment pour les premières étapes de son étude et de sa caractérisation. c) Avantages et limites La culture cellulaire est le seul outil virologique capable de mesurer directement l'infectiosité d'un virus. Cette approche peut donc être intéressante dans certains contextes. Cependant, en pratique, les techniques de biologie moléculaire jouent un rôle bien plus central. Les limites de la culture cellulaire incluent : - Le délai souvent long pour obtenir des résultats, - La subjectivité de l’interprétation des observations, - L’impossibilité de cultiver certains virus, qui restent non cultivables en laboratoire comme le HCV ou le HBV. 3) Diagnostic direct : moléculaire Le diagnostic moléculaire repose sur trois approches fondamentales : l’hybridation moléculaire, l’amplification génique (PCR) et le séquençage. a) Hybridation moléculaire L’hybridation moléculaire utilise des sondes marquées pour détecter directement les acides nucléiques présents dans un échantillon biologique. Les sondes, qui sont des fragments d’ADN ou d’ARN complémentaires à la cible, se lient spécifiquement aux acides nucléiques correspondants. Dans certaines variantes techniques, les sondes peuvent être équipées de multiples marquages pour amplifier le signal, rendant la détection plus sensible. Cette méthode est particulièrement utile pour mettre en évidence la présence d’acides nucléiques dans un échantillon, même en faible quantité. b) Amplification génétique La PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d’amplifier in vitro les acides nucléiques en trois étapes successives : Page 18 sur 20  - Dénaturation : séparation des brins d’ADN, - Hybridation : fixation des amorces sur les brins cibles, - Extension : synthèse des nouveaux brins complémentaires. Cette amplification rend détectables des quantités infimes d’acides nucléiques présentes dans l’échantillon initial. En outre, la PCR peut être utilisée pour quantifier les virus dans un échantillon biologique. Une alternative à la PCR est la TMA (Transcription-Mediated Amplification), qui repose sur l’amplification de l’ARN au lieu de l’ADN. Cette technique est particulièrement utile pour détecter des virus à ARN. c) Méthode du séquençage Le séquençage est une technique essentielle et de plus en plus utilisée en virologie. La méthode classique de Sanger, également appelée méthode des didésoxynucléotides, permet de déterminer précisément l’ordre des nucléotides dans un fragment d’ADN. Des techniques modernes de séquençage automatique permettent d’analyser rapidement et efficacement les séquences d’acides nucléiques, notamment pour : - Classer les génomes viraux et identifier les différents types de virus, - Repérer des mutations dans le génome, ce qui est particulièrement crucial pour identifier des mutations associées à la résistance à certains antiviraux. d) Analyse phylogénétique Les analyses phylogénétiques reposent sur les séquences génétiques. Une fois qu’une séquence virale est obtenue, elle est comparée à des séquences déjà connues pour évaluer la proximité génétique entre différentes souches de virus. Cette approche est particulièrement utile pour retracer l’origine d’une infection. Par exemple, en cas de suspicion d’une infection nosocomiale dans une unité de soins, les analyses phylogénétiques permettent de déterminer si les souches impliquées partagent une origine commune, ce qui peut aider à identifier la source et à prendre des mesures de contrôle adaptées. e) Séquençage de 2eme et 3eme génération Les technologies de deuxième génération permettent de séquencer de courts fragments d’acides nucléiques. L’un des principaux avantages des techniques NGS par rapport à la méthode de Sanger est leur capacité à détecter des variants minoritaires, c’est-à-dire des mutations présentes à des fréquences inférieures à 20 % dans une population virale. Cette sensibilité accrue est particulièrement utile pour identifier des mutations associées à des résistances aux traitements antiviraux, même si ces mutations sont présentes en faible quantité. Les technologies de troisième génération, quant à elles, permettent le séquençage de longs fragments génomiques. Elles offrent plusieurs avantages : Page 19 sur 20  - Une meilleure détection des virus minoritaires, - La possibilité de réaliser un haplotypage, c’est-à-dire d’identifier plusieurs mutations sur un même brin génomique, ce qui est essentiel pour comprendre la dynamique des mutations au sein d’un génome viral. f) Indications Les techniques qualitatives sont utilisées pour détecter les génomes viraux, soit de manière ciblée pour un virus spécifique, soit de manière groupée pour plusieurs virus. Ces techniques, de plus en plus miniaturisées, peuvent désormais être réalisées directement au lit du patient. Ces approches offrent l’avantage de fournir rapidement une preuve d’infection, ce qui est particulièrement efficace pour un diagnostic immédiat et une prise en charge rapide, au plus près du patient. Les techniques quantitatives, utilisées exclusivement en laboratoire, permettent de : - Déterminer la charge virale, c’est-à-dire la quantité de virus présent dans un échantillon biologique, - Évaluer l’efficacité d’un traitement antiviral en suivant l’évolution de cette charge virale au cours du temps. Le séquençage permet de caractériser les génomes viraux, de détecter des mutations associées à la résistance antivirale, de déterminer le tropisme du VIH, et de réaliser des analyses phylogénétiques pour retracer l’origine et la propagation d’une infection. Cette technique est essentielle pour mieux comprendre la diversité génétique des virus et adapter les stratégies de traitement et de prévention. g) Avantages et limites Les tests disponibles présentent plusieurs avantages. Ils offrent une grande sensibilité, ce qui permet de détecter même des quantités infimes de matériel viral. De plus, les processus sont largement automatisés, ce qui réduit les erreurs humaines et améliore l’efficacité globale. Par ailleurs, le délai pour obtenir les résultats est considérablement raccourci, ce qui accélère la prise en charge des patients. Cependant, ces tests présentent aussi certaines limites. Leur mise en œuvre nécessite des équipements spécialisés et des infrastructures de pointe. De plus, un personnel qualifié et expérimenté est indispensable pour garantir la fiabilité des résultats. Enfin, le coût relativement élevé des tests et des équipements peut représenter une contrainte financière importante. Le prof nous a fait visiter le Laboratoire de virologie à Purpan au 3ème étage à travers son diaporama... Page 20 sur 20