Méthodes de diagnostic virologique 2024 PDF

Les méthodes de diagnostic virologique 2ème année de médecine Module de Microbiologie-Immunologie Dr EL KAMOUNI YOUSSEF Professeur de Bactériologie-Virologie. FMPM Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 1  OBJECTIFS Ci...

Les méthodes de diagnostic virologique 2ème année de médecine Module de Microbiologie-Immunologie Dr EL KAMOUNI YOUSSEF Professeur de Bactériologie-Virologie. FMPM Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 1  OBJECTIFS Citer les étapes de la phase pré-analytique en virologie. Différencier les méthodes de diagnostic direct et indirect. Décrire les principales techniques classiques du diagnostic direct et indirect des infections virales. Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 2  PLAN I- Introduction II- Phase pré-analytique en virologie III-Techniques classiques du diagnostic direct IV- Techniques classiques du diagnostic indirect V- Conclusion: Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 3  I- Introduction Diagnostic virologique consiste à identifier le ou les virus responsable d’une infection virale Le principe est de chercher le ou les marqueurs prouvant l’implication d’ un virus dans une infection donnée Les marqueurs viraux recherchés sont de deux types  M. directs: virus en entier ou un de ses composants (antigènes, génome)  M. indirects: ce sont les marqueurs de la réponse immunitaire contre l’infection virale (Anticorps) Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 4  I- Introduction Diagnostic virologique : intérêt majeur en pratique médicale  Diagnostique: c’est la confirmation de l’infection virale  Thérapeutique: traitement adapté et suivi de son efficacité  Prophylactique: permet de prendre des mesures préventives Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 5  I- Introduction Histoire du diagnostic virologique: trois phases Phase pasteurienne: 1949 Culture cellulaire 1 Phase immunologique : 1970 Techniques immuno-enzymatiques 2 Anticorps monoclonaux Phase moléculaire: dés 1983 Amplification génomique: PCR 3 Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 6 Evolution du diagnostic virologique: Phase Pasteurienne Pionnier de la virologie Début 1949 Culture in vitro des poliovirus. Phase immunologique Apogée en 1970 , Avènement des techniques immuno- enzymatiques et les Ac monoclonaux: Développement des techniques du diagnostic direct et indirect rapides, sensibles et spécifiques Phase moléculaire ou génomique: ESSOR de la virologie médicale avec l’amplification et quantification génique , séquençage. PCR: 1983 États-Unis, Kary Mullis Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 7  PLAN I- Introduction II- Phase pré-analytique en virologie III-Techniques classiques du diagnostic direct IV- Techniques classiques du diagnostic indirect V- Conclusion: Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 8  II- Phase pré-analytique en virologie ◾ Diagnostic virologique fiable: Trois phases Pré-analytique: Guidée par les renseignements cliniques Respect des conditions de prélèvement Prescription, Prélèvement, Transport, Enregistrement, Prétraitement échantillon Analytique: Exécution des analyses validation techniques des contrôles et des prélèvements Pertinence et performance de la technique du diagnostic virologique Post-analytique: Interprétation des résultats, Concertation entre praticien et virologue Transmission des résultats, archivage, conservation Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 9  II- Phase pré-analytique en virologie Prescription médicale+++ c’est une demande d’analyse prescrite à un malade par son médecin traitant, elle est porte deux volets d’information  Volet administratif – Identité du patients , – Âge du patient – Coordonnées du prescripteur...  Volet médical – Nature de la demande d’analyse – Motif de la demande: renseignement cliniques – Nature du prélèvement et condition de réalisation – Date et heure du prélèvement Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 10  II- Phase pré-analytique en virologie Prélèvements:  Conditions de réalisation: Respecter et appliquer les mesures d’asepsie +++ Rassurer et expliquer au patient la nature du prélèvement à réaliser Préparer le matériel nécessaire selon le type de prélèvement à faire  La nature du prélèvement à réaliser dépend de plusieurs facteurs Virus recherché, Localisation de l’ infection (neurologique, pulmonaire, digestif, cutanéo-muqueux…) Stade de l’infection: aigue, chronique, réactivation Age du patient, …  Le prélèvement doit être riche en cellules les virus sont des parasites intracellulaire obligatoires Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 11 Exemples de recommandations pré-analytique en virologie: Liquide céphalo-rachidien 2h à T° ambiante LCR Flacon stérile +4°C durant les 24h Congélation -20 Autres - cutanéo-muqueux - liquide amniotique, - humeur aqueuse - placenta….. Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 12 II- Phase pré-analytique en virologie Identification – conditionnement - transport  Les échantillons doivent être bien identifiés et mis dans un emballage étanche pour éviter toute contamination Le prélèvement accompagné de la fiche de prescription doit être immédiatement acheminé au laboratoire si non, conservation : oà +4C° dans les 48H au maximum pour les prélèvements destinés aux examens sérologiques oet à -20C° pour les ceux destinés à la biologie moléculaire -20C° Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 13  PLAN I- Introduction II- Phase pré-analytique en virologie III-Techniques classiques du diagnostic direct IV- Techniques du diagnostic indirect V- Conclusion: Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 14  Isolement du virus: Diagnostic d’une infection aigue ou Cultures cellulaires chronique Visualisation du virus: Détermination du statut immunitaire Microscopie électronique Différentes techniques: Détection des Ag viraux: Techniques immunologiques: Techniques immunologique immuno-enzymatiques; Détection du génome virale: ELISA et apparentés +++ Amplification génique, PCR et Autres: apparenté Séquençage Diagnostic direct Diagnostic indirect Détection du virus ou Détection des Ac anti- viraux: Ig de ses composants G et Ig M Approches complémentaires Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 15 15  Diagnostic direct Détection du virus ou de ses composants Isolement du virus: Cultures cellulaires et ECP Visualisation du virus: Microscopie électronique Détection des Ag viraux+++: Techniques immunologique : Ag soluble: ELISA et apparentés, Immunochromatographie; bandelette Ag associé aux cellules; Immunocytodiagnostic: Détection du génome virale+++: Amplification génique, PCR et apparenté Détection et /ou quantification du génome viral Séquençage Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 16 III-Techniques classiques du diagnostic direct 1. Culture cellulaire C’est un ensemble de techniques de biologie utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme (in vitro) Les virus ne sont cultivables que sur des cellules vivantes (parasites intracellulaires obligatoires) Cette condition est assurée sur des : – Animaux vivant (souris…) – Œufs de poule : actuellement réservés pour la production de vaccins – Cellules en culture: c’est la base de la culture cellulaire actuellement Il n y a pas de cellules de culture universelle : chaque virus a son tropisme particulier Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 17 III-Techniques classiques du diagnostic direct 1. Culture cellulaire Type de cellules origine Cellules d’organes: Cellules primaires - Rein de singe - lymphocytes humaines Durée de vie limitée : une à deux générations cellules transformées : immortelles Cellules en lignées - Humaines: Hela (cancer du col de femme) continues - Animales: +++++  Vero: cellules de rein de singe  MDCK (Madin-Darby canine kidney): rein de chien  MDBK: cellules de rein de bovin nombre infinie de subcultures Cellules fibroblastiques cellules obtenues du tissus fœtaux (fœtus) embryonnaires humaines Quarantaine de générations Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 18 III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire: composition du milieu de culture cellulaire Cellules Eléments nutritifs, facteurs de croissances, antibiotiques…. Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 19 III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire Après inoculation du virus sur une culture de cellules, Incubation à 37°C en atmosphère humide (qqh à ++jours) Observera en microscope optique à faible grossissement :  Absence de réplication virale: cellules non permissives  Réplication abortive ou faiblement cytolytique: effet cytopathique Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 20 III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire L’effet cytopathique: c’est le résultat de la réplication virale entrainant des altérations morphologiques de la nappe cellulaire L’aspect de l’ECP est un élément d’orientation diagnostique d’un virus, de genre ou d’une famille virale : – Destruction de la nappe cellulaire, – Présence des foyers de lyse – Cellules ballonisées ou rétractées – Inclusions nucléaires et ou cytoplasmiques – Formation de syncytium (fusion des cellules entre elles) Délais d’apparition de l’ECP: variable selon les virus Actuellement : culture cellulaire rapide par centrifugation après inoculation qui permet de réduire le délais (appliquée pour les Herpesviridae (CMV++ ) Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 21 III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 22 - Après coloration (inclusions intranucléaire, intracytoplasmique) Entérovirus Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 23  III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire  L’identification du virus après culture cellulaire fait appel aux techniques immunologiques et moléculaires:  Elle consiste à rechercher des Ag et/ou des acides nucléiques viraux  Différentes techniques sont utilisées immunofluorescence /Ac monoclonaux (HSV1/HSV2) séroneutralisation / Ac polyclonaux (sérotypes de poliov) inhibition de l’hémaglutination (Adéno) amplification génomique Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 24  III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire Avantages de la CC  c’est la technique de référence pour le diagnostic (majorité des virus) permet l’étude phénotypique de la sensibilité aux antiviraux Permet la description de nouveaux virus Permet l’élaboration des vaccins et des antiviraux Limites de la CC Technique longue (plusieurs jours d’incubation) Difficile : nécessite du personnel expérimenté et des locaux adaptés Couteuse Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 25  III-Techniques classiques du diagnostic direct 2.Microscopie électronique (ME) Permet d’observer directement les virus au sein du prélèvement L’utilisation des Antisérums dirigés contre le virus suspecté facilite la détection des virus sous forme d’agrégats, c’est l’immuno-microscopie. Limites: Appareillage couteux, Technique ne permet pas la distinction entre les virus de la même famille Limitée à certains laboratoires spécialisés Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 26  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux Les techniques des recherche des Ag viraux sont basées sur l’utilisation des Ac monoclonaux qui forment des complexe immuns avec les Ag recherchés Les Ac monoclonaux sont marqués par un marqueurs facilitant leur révélation ou détection Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 27  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux Selon la nature du marqueur utilisé on distingue – techniques d’immunofluorescence (IF): utilisent un fluorochrome (fluorescéine) , La présence du virus se traduit par une fluorescence (vert- pomme) intracellulaire après excitation par des UV, c’est l’IF directe – techniques immuno-enzymatiques (ELISA) : le marqueur utilisé est une enzyme (peroxydase ou autre) – techniques d’agglutination sur microparticules de latex ou sur bandelette Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 28  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux 3-1: Techniques d’immunofluorescence (IF) ▪ L’Ac spécifique de l’Ag est marqué par un fluorochrome (fluorescéine) ▪ Lecture sous microscope à fluorescence ▪ La présence du virus se traduit par une fluorescence vert-pomme intracellulaire L’IF peut être directe (IFD) ou indirecte (IFI) IFD: la molécule indicatrice est fixée sur l’Ac Indirecte: IFI: molécule indicatrice fixée sur un deuxième Ac qui reconnait un premier Ac non marqué Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 29  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux 3-1: Techniques d’immunofluorescence (IF) Exemple d’application: recherche des Ag des virus respiratoire Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 30  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux 3-2: Techniques immuno-enzymatiques (ELISA et apparentés) Principe : l’Ag recherché est détecté par un Ac marqué par une enzyme qui après ajout de son substrat entrainera le formation d’un produit coloré (réaction colorimétrique) L’intensité de la coloration (densité optique DO) mesurée par un spectrophotomètre est proportionnelle à la quantité d’Ag existante dans le prélèvement. Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 31 Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 32  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux 3-2: Techniques immuno-enzymatiques (ELISA et apparentés) Avantages Technique automatisée Microplaques 96 puits (adaptées aux grande série d’échantillon) Rapide: résultat obtenu en 1 à 3 heures Sensible et spécifique Exemple d’application: recherche de l’Ag Hbs du Virus de l’hépatiteB, recherche de l’Ag p24 du VIH Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 33  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3-Recherche des Antigènes viraux 3-3: Techniques d’agglutination sur microparticules de latex Microparticules sensibilisés par des Ac spécifiques qui en présence de l’Ag recherché vont s’agglutiner L’agglutination est visible à l’œil Exemple: recherche des Ag de Rotavirus dans les selles Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 34  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3-Recherche des Antigènes viraux 3-4: Techniques immunochromatographiques: test rapide principe l’Ag recherché est prit en sandwich par un ac spécifique préalablement fixé sur une bandelette de nitrocellulose et un 2eme ac spécifique marqué à l’or colloïdal Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 35  III-Techniques classiques du diagnostic direct 3-Recherche des Antigènes viraux 3-4: Techniques immunochromatographiques: test rapide Avantages Rapide: résultat en 15 mn Facile à réaliser Moins couteux Limites: faible sensibilité ( faux négatif) Exemple d’application: Ag HBs Ag du virus grippal Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 36  III-Techniques classiques du diagnostic direct 4-Recherche du génome viral ◾ Plusieurs techniques automatisables ◾ PCR: Polymérase Chain Reaction +++  Kary Mullis: ▪ Invention PCR 1983 ▪ Prix Nobel 1993  Amplification génique in vitro de l’ADN : ▪ Amplification de l’ADN initial ▪ Un cycle PCR comporte trois étapes: Dénaturation- hybridation-élongation ▪ Répétition des cycles 30 à 40 cycle par PCR: ▪ n cycles: Amplicon: 2n copies ADN initiale Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 37  Principe de la PCR 5’ TGTCAAAGACA TG C TA C ATG C A TG C TAC G ATC G A TAG C TA C ATG AC C T G C TA ATG AC 3’ TG AC AG TTTC TG TAC G ATG TAC G TAC G ATG C TAG C TATC G ATG TAC TG G TACGATTACTG 5’ 95° C  3’ TG AC A G TTTC TG TA C G A TG TA C G TA C G A TG C TAG C TA TC G A TG TA C TG G ACGATTACTG 5’ Dénaturation - 95°C Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 38  Principe de la PCR 5’ TGTCAAAGACA TG C TA C ATG C A TG C TAC G ATC G A TAG C TA C ATG AC C T G C TA ATG AC ACGATTACTG 5’ 5’ TGTCAAAGAC 3’ TG AC AG TTTC TG TAC G ATG TAC G TAC G ATG C TAG C TATC G ATG TAC TG G TACGATTACTG 5’ Hybridation - 55-60°C (spécifique) Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 39  Principe de la PCR P = ADN polymérase ADN dépendante thermorésistante P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P PP 5’ TGTCAAAGACA TG C TA C ATG C A TG C TAC G ATC G A TAG C TA C ATG AC C T G C TA ATG AC AC AG TTTC TG TAC G ATG TAC G TAC G ATG C TAG C TATC G ATG TAC TG G ACGATTACTG 5’ PPP P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P PP 5’ TGTCAAAGACA TG C TA C ATG C A TG C TAC G ATC G A TAG C TA C ATG AC C AG C TA ATG AC 3’ TG AC AG TTTC TG TAC G ATG TAC G TAC G ATG C TAG C TATC G ATG TAC TG G TACGATTACTG 5’ Elongation - 72°C Répétition du cycle 30 à 40 fois Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 40  Préparation du Mix Ajout de la matrice Mélange contenant des nucléotides, des amorces sélectionnées et la polymérase thermorésistante, Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 41 thermocycleurs Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 42 Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 43 Pour les virus à ARN: RT-PCR Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 44  PCR et variantes RT-PCR où la PCR est précédée de transcription inverse dans le cas de virus à ARN PCR en temps réel: suivi de l’avancement de la PCR après chaque cycle par mesure indirecte de l’ADN produit PCR quantitative: permettant d’évaluer approximativement le nombre de copie de génome viral (mesure de charge virale génomique) PCR multiplex: utilisant simultanément plusieurs couples d’amorces, ce qui permet de détecter des virus différents au cours d’une même réaction PCR emboîtée ou nichée: Nested PCR: qui consiste à faire suivre une première série de cycles de PCR par une seconde utilisant des amorces situées à l’intérieur du premier fragment amplifié; cette double amplification accroît encore la sensibilité Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 45  VIII. Séquençage du génome viral Principe Déterminer l’ordre des nucléotides sur la molécule d’ADN Connaitre la séquence exacte du gène recherché Comparaison des séquences obtenues à celles de souches de référence Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 46  Principe: Déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides d’un fragment d’ADN grâce à 1 réaction de polymérisation de l’ADN avec une ADN polymérase et des didésoxyribonucléosides (ddNTP) Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 47  VIII. Séquençage du génome viral les virus à ADN grande stabilité les virus à ARN font preuve d'une grande variabilité : VIH, VHC : intérêt du génotypage Intérêt du génotypage intérêt épidémiologique. intérêt thérapeutique : mutation de résistance résistance aux anti-rétroviraux : recherche de mutation sur les codons de la reverse transcriptase Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 48  Apport de la Biologie moléculaire en virologie ◾ La PCR a révolutionné le diagnostic virologique:  Rapide / détection directe à partir des prélèvements  Sensibles / Prélèvements pauci-viraux  Spécifiques / gène virale recherché  Détection des virus non ou difficilement cultivables  Automatisation et disponibilités des trousses de diagnostic in vitro ◾ Limites:  Cout; complexité variable  Absence de preuve du caractère infectieux du virus Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 49 49  Applications de la Biologie moléculaire en virologie Diagnostic précoce avant séroconversion : ex VIH, VHC , VHB ▪ Primo-infection clinique ▪ Sécurité transfusionnelle ( Diagnostic génomique viral) ▪ Virologie moléculaire « multiplexe » ▪ virus respiratoires ▪ virus neurotropes ▪ Suivi thérapeutique: ▪ Quantification de la charge virale : ▪ Risque de transmission : VIH, VHC, VHB... ▪ PrédictionCours dedel’efficacité thérapeutique VHC,VIH virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 50  IV- Techniques du diagnostic indirect Intérêt du diagnostic indirect Mise en évidence des Ac synthétisés en réponse à une infection virale:  IgM : marqueurs d’une infection aiguë ou récente  IgG : marqueurs d'une infection passée ou ancienne (état immunitaire) Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 51  Rubéole VHB Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 52 5 2  IV- Techniques du diagnostic indirect Principe Le diagnostic indirect (DI) repose sur la spécificité de la réaction Ag-Ac; On utilise un ou plusieurs antigènes viraux comme moyen de de formation des complexes immuns Ag-Ac avec les Ac spécifiques recherchés, Les antigènes viraux utilisés peuvent être :  virus entier purifié  protéines virales extraites ou recombinantes  oligopeptides synthétiques Deux catégories de techniques de DI peuvent être distinguées Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 53  IV- Techniques du diagnostic indirect 1-Techniques ne permettant pas de distinguer l’isotype des Anticorps Techniques d’hémagglutination Techniques d’inhibition de l’hémagglutination Technique de séroneutralisation Techniques de fixation de complément Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 54  IV- Techniques du diagnostic indirect 1-Techniques ne permettant pas de distinguer l’isotype des Anticorps Technique d’hémagglutination Technique d’inhibition de l’hémagglutination Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 55  IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps Ces techniques utilisent un deuxième Ac spécifique permettant de déterminer la classe des immunoglobulines (Ac) humaines détectées: IgM ŔIgG- IgA ou Ig totales. Ce sont les plus utilisées en diagnostic indirect Principe : basé sur la fixation d’un Ag viral sur un support solide Le sérum à tester est mis en contact avec l’Antigène Après une étape de lavage, un Ac anti-Ig humaine est ajouté Cet Ac est couplé à un système de révélation qui détermine le type de la technique Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 56  IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps Selon la nature du marqueur utilisé, on distingue différentes techniques  Fluorochrome dans le cas de l’immunofluorescence indirect  Radio-isotope dans le cas des techniques radio-immunologiques  Enzyme spécifique d’un substrat : tech. immuno-enzymatiques Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 57  IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps Dominées actuellement par les techniques ELISA et apparentés Avantages:  Rapides,  sensibles, spécifiques  automatisables  Résultats qualitatifs et quantitatifs  Distinguent les Ig M et les Ig G Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 58  IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps 2-2: Techniques immuno-enzymatiques (ELISA et apparentés) Enzyme (paroxydase ou autre) qui après ajout de son substrat il y aura production d’un produit coloré, l’intensité de la couleur mesurée par un spectrophotomètre sera proportionnelle à la quantité des Ac recherchés : Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 59  IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps ELISA combinée ou mixte Consiste à rechercher l’antigène et l’Anticorps spécifiques d’un virus en une seule réaction ELISA Applications: VIH: Ag p24 + Ac anti VIH VHC: Ag capsidique + Ac anti VHC Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 60  La réaction chimiluminescente qui en résulte est mesurée en Unités Relatives de Lumière (URL). Il existe une relation directe entre la quantité d'Ac ou d ’ Ag présente dans l ‘ échantillon et les URL détectées par le système optique ARCHITECT i System. Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 61 EIA techniques automatisées- systèmes fermés Autres techniques CLIA Chemi Luminescence ImmunoAssay ELFA Enzyme Linked Fluorescent Assay ELCA Technique immunoenzymatique avec détection finale en chemiluminescence MEIA Microparticle Enzyme immuno Assay Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 62  IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps Technique de Western blot  elle permet de vérifier la spécificité des Anticorps vis-à-vis des antigènes d’un virus donné Avantages : ils sont plus spécifiques que les techniques ELISA Application en virologie : confirmation d’une sérologie positive exp: infection à VIH Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 63 Technique de Western blot Réaction ELISA Sur la bandelette Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 64 IV- Techniques du diagnostic indirect limites du diagnostic indirect Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 65  Conclusion Les techniques classiques: très variées Place importante en pratique médicale Indications dépendent de plusieurs facteurs – Virus recherché – Stade de l’infection – Contexte clinique… Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 66  Isolement du virus: Différentes techniques: Révélation CI Cultures cellulaires: Ag-Ac Visualisation du virus: Techniques immuno-enzymatiques; Microscopie électronique ELISA et apparentés +++ Détection des Ag viraux: Immunofluorescence Techniques immunologique : Immuno-empreinte; Western-Blot (confirmation) ELISA et apparentés Immunochromatographie; bandelette Immunochromatographie; bandelette Autres: Immunocytodiagnostic … Séroneutralisation Détection du génome virale: Fixation du complément Amplification génique, PCR et apparenté Inhibition de l’hémagglutination Détection et /ou quantification du génome viral Agglutination passive ou conditionnée … Séquençage Diagnostic direct Diagnostic indirect Détection du virus ou de ses Détection des Ac anti- composants viraux Approches complémentaires Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 676 7 Cours de virologie 2024 - Pr Y EL KAMOUNI 68